SK288074B6 - Use of antibody which binds to AILIM in the treatment of immunological disorders - Google Patents

Abstract

Use of antibody which binds to AILIM (alternatively called JTT-1 antigen, JTT-2 antigen, ICOS and 8F4) or a part thereof for the preparation of a pharmaceutical composition for preventing, treating or prophylaxis of graft versus host reaction, wherein the antibody has an suppressive effect comparable with the effect of hCTLA-Ig.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka použitia protilátky, ktorá sa viaže na AILIM (imunomodulačná lymfocytová molekula indukovateľná aktiváciou), inak nazývanej ako „JTT-1 antigén”, JTT-2 antigén”, „ICOS (indukovaný kostimulátor” alebo „8F4”), alebo jej časti na prípravu farmaceutickej kompozície na prevenciu, liečbu alebo profylaxiu reakcie prijímateľa na transplantát (GVH reakcia), ochorenia vyvolaného prijatím transplantátu (GVHD) alebo imunologického odmietnutia, ktoré sprevádza transplantáciu tkaniva alebo orgánu.

Konkrétne sa predkladaný vynález týka uvedeného použitia, kde protilátka alebo jej časť je účinná pri inhibícii proliferácie AlLIM-expresívnych buniek alebo pri inhibícii tvorby cytokínu (napríklad interferónu γ alebo interleukínu 4) pomocou AILIM-expresívnych buniek.

Doterajší stav techniky

Žijúce cicavce majú imunitné systémy, ktoré vylučujú patogénne mikroorganizmy (vírusy, baktérie, parazity atď.) alebo cudzie telesá (v obidvoch prípadoch sa v nasledujúcom texte budú nazývať „antigén”), ktoré vnikajú do žijúceho organizmu. Jeden z týchto systémov sa nazýva vrodený imunitný systém a druhý sa nazýva získaný imunitný systém. Formovač je vylučovací mechanizmus obsahujúci fagocytózu s použitím fagocytov (polymorfojadrové leukocyty, monocyty, makrofágy atď.), a tak s použitím prirodzených zabíjačov (NK-bunky) a nešpecifické rozpoznanie také ako opsonizácia antigénu s použitím komplementov. Získaný imunitný systém je vylučovací mechanizmus pomocou lymfocytov (hlavne T bunky a B bunky), ktoré nadobudli špecifickosť ku antigénu (menovite, aktivovaných lymfocytov). B bunky sa po kontakte s antigénom existujúcim mimo buniek menia na bunky syntetizujúce protilátky špecifické ku antigénu. T bunky, ktoré získajú špecifický antigén (konkrétne, aktivované T bunky), sa rozdeľujú na T_H-bunky (helper T cells) a cytotoxické T bunky (cytotoxický lymfocyt, CTL). T_H-bunky regulujú diferenciáciu B buniek a produkciu protilátok a ničia antigén kooperujúci s fagocytmi. Cytotoxické T-lymfocyty napádajú vírusom infikované bunky (Experimental Medicíne: SUPPLEMENT, „Bio Science Term Library, Immunity“, Yodosha, pp. 14-17 (1995)).

Získanie antigénovej špecifickosti pomocou T buniek (konkrétne aktivácia T buniek) je vyvolané cez rozpoznanie antigénu T bunkami, čo zabezpečujú bunky prezentujúce antigén (APC) také ako makrofág, B bunky alebo dendritické bunky. Bunky prezentujúce antigén sú schopné upraviť cudzorodý antigén. Táto úprava sa týka najmä proteínových antigénov a jej podstatou je degradácia ich molekúl na imunogénne fragmenty, ktoré sa spájajú do komplexov s antigénmi hlavného histokompatibilného komplexu (MHC). T bunky prijímajú primárny signál na aktiváciu buniek (alebo získanie špecifickosti) prostredníctvom rozpoznania antigénov predstavovaných bunkami prezentujúcimi antigén cez komplex medzi T bunkovým receptorom (TcR) a CD3 antigénom existujúcim na povrchu bunkovej membrány (TcR/CD3 komplex).

Ale TcR/CD3 komplex spracujúci primárny signál sám nemôže dostatočne aktivovať T bunky, čo vedie ku neodpovedaniu alebo klonálnej anergii a bunky nemôžu reagovať na žiadnu stimuláciu. Autokrín interleukínu 2 (IL-2) musí byť pre T bunky nevyhnutne aktivovaný, musí byť diferenciovaný do antigénu špecifických T bunkových klonov a musí byť proliferovaný. V klonálnej anergii sú T bunky inaktivované, teda nedochádza k tvorbe IL-2 a teda ani k bunkovému deleniu. Konkrétne, aktivácia T buniek sprevádzaná produkciou cytokínov takých ako IL-2 vyžaduje sekundárny signál nasledujúci po prvom signály cez TcR/CD3 komplex. Tento sekundárny signál je nazývaný ako kostimulačný signál.

T bunky príjmu tento sekundárny signál a prenesú ho do buniek prostredníctvom interakcie (bunkovej adhézie) s molekulami inými než MHC na bunky prezentujúce antigén cez molekuly iné než TcR/CD3 komplex na T bunkovom povrchu. Tento sekundárny signál zamedzuje bunkovej anergii (klonálnej anergii) a aktivuje bunky.

Ale určitá časť mechanizmu sekundárnej signálnej transmisie medzi bunkami prezentujúcimi antigén a lymfocytmi takými ako t bunky nie je ešte objasnená do detailov, štúdie v súčasnej dobe dokazujú, že dôležitý faktor pre sekundárnu signálnu transmisiu je interakcia CD28 (tiež nazývané Tp44 alebo 9.3 antigén), ktorého bunkový povrch molekuly je exprimovaný hlavne na T bunkách a bunkách týmusu, s CD80 (tiež nazývané B7-1, B7, BB1 alebo B7/BB1), ktorého bunkový povrch molekuly je exprimovaný na bunkách prezentujúcich antigén (makrofágy, monocyty, dendtritické bunky atď.) a s CD86 (tiež nazývané B7-2 alebo B70), ktorého bunkový povrch molekuly je tiež na bunkách prezentujúcich antigén (konkrétne, bunková adhézia cez väzbu medzi týmito molekulami). Okrem toho, experimentálne bolo dokázané, že interakcia, cytolytického T lymfocytu spojeného s antigénom 4 (CTLA-4), ktorých expresia má za cieľ zvýšiť závislosť od sekundárneho signálu, s CD80 (B7-1) a s CD86(B7-2) (konkrétne bunková adhézia cez väzbu medzi týmito molekulami), tiež hrá dôležitú úlohu v regulácii T bunkovej aktivácie prostredníctvom sekundárneho signálu. Inými slovami, regulácia T bunkovej aktivácie prostredníctvom transmisie sekundárneho signálu si vyžaduje najmenej interakciu medzi CD28 a CD80/CD86, zlepšenie CTLA-4 expresie, ktorá je závislá od interakcie, a

SK 288074 Β6 interakciu medzi CTLA-4 a CD80/CD86.

CD28 je známy kostimulátor molekulového prenosu sekundárneho signálu (kostimulačný signál) potrebný na aktiváciu T buniek a na vyhnutie sa anergii. Sekundárny signál prenášaný prostredníctvom viazania tejto molekuly ku molekulám kostimulátora CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2) na bunky prezentujúce antigén (bunková adhézia cez väzbu medzi týmito molekulami) stabilizuje mRNA cytokínov Thl-typu a následne podporuje tvorbu veľkého množstva cytokínov Thl-typu takých ako 1L-2, IFNy a TNFa.

Expresia CTLA-4 je vyvolaná primárnym signálom preneseným cez TcR/CD3 a môže byť takisto zvýšená prenosom sekundárneho signálu pomocou väzby medzi CD28 a CD80. Dokázalo sa, že CTLA-4 prijíma tieto signály a inhibuje funkciu T buniek. Táto funkcia je opakom ku aktivácii T buniek pomocou sekundárneho signálu preneseným pomocou CD28.

Ľudské CD28 a CTLA-4 sú glykoproteíny typu I, pričom ich molekulová hmotnosť je 44 kD a 41 až 43 kD. Obidve majú doménu podobnú imunoglobulínu patriacu do imunoglobulínovej super rodiny. Obidve majú funkciu ako bunková adhézna molekula a funkciu ako molekula prenášajúca signál.

Ľudská CD28 vytvára homodimér s disulfidovou väzbou, zatiaľ čo CTLA-4 existuje ako monomér. Obidva, CD28 a CTLA-4 gény sú lokalizované na „2q33“ na ľudskom chromozóme a „1C“ na myšom chromozóme a sú zložené zo štyroch (4) exónov. Ľudský CD28 a CTLA-4 sú zložené z 220 a 223 aminokyselín zahrnujúcich vodiace sekvencie. Amínokyselinová homológia je medzi nimi 20 až 30 %.

Ligandmi pre CD28 a CTLA-4 pre ľudí a myši sú CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2). CTLA-4 má asi 20-krát vyššiu afinitu ku obidvom ligandom ako CD28. Tiež sa zistilo, že štruktúra sekvencie aminokyselín „MYPPPY (Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr)“ zachovaná u živočíšnych druhov je dôležitá pre väzbu CD28 a CTLA-4 na CD80 (B7-1). Takisto bolo uvedené, že keď je stimulovaná CD28, PI3 kináza (fosfoinozitid 3 kináza, P13K) sa spája s fosforylovaným tyrozínovým zvyškom v čiastočnej sekvencii „YMNM (Tyr-Met-Asn-Met)“ CD28 a CD28 má dôležitú úlohu v medzimolekulovom prenose signálu cez túto „YxxM“ štruktúru. Ďalej bolo zistené, že CTLA-4 má sekvenciu predstavovanú „YxxM“ konkrétne „YVKM (Tyr-Val-Lys-Met)“ v cytoplazmatickej oblasti a že po stimulovaní sa SYP spája s touto sekvenciou.

CD28 je exprimovaná špecificky v tymocytoch a v periférnych krvných T bunkách a CTLA-4 je exprimovaná špecificky v aktivovaných T bunkách (Celí Engineering: SUPPLEMENT, „Handbook of Adhesion Molecule“, Shujunsha, pp. 93-102 (1994); ibid. pp. 120-136; Experimental Medicíne: SUPPLEMENT, „BIO SCIENCE Term Library, Immunity“, Yodosha, pp. 94-98 (1995); Experimental Medicíne: SUPPLEMENT, „BIO SCIENCE Term Library, Intracellular Signál Transduction“, Yodosha, pp. 58-59 (1997); Nihon Rinsho, Vol. 55, No. 6, pp. 215-220 (1997)).

Pri regulácii T bunkovej funkcie (aktivácia a inhibícia funkcie T buniek) by mala byť preštudovaná dôležitosť interakcie medzi molekulami takými ako molekuly kostimulátora (CD28, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), atď.) a CTLA-4, ktoré medzi sebou kooperujú (inými slovami, bunková adhézia cez väzbu medzi týmito molekulami) a mala by sa sústrediť pozornosť na vzťah medzi týmito molekulami a ochoreniami a liečiť ochorenia prostredníctvom regulácie funkcie týchto molekúl.

Ako bolo uvedené, žijúci organizmus aktivuje svoj získaný imunitný systém proti antigénom, ktorými sú jemu cudzie organizmy. Žijúci organizmus má tiež imunologickú toleranciu, teda neprebieha žiadna imunitná odpoveď na jeho vlastné látky (autoantigény). Ak dôjde k narušeniu imunologickej tolerancie, z nejakých dôvodov nastáva imunitná reakcia proti autoantigénu, autoantigén-reaktívne T bunky sa indukujú pomocou uvedeného mechanizmu a nastane abnormálny stav imunity, čím vznikajú rôzne autoimunitné ochorenia.

Inými slovami, keď nestimulované bunky prezentujúce antigén (APC) v normálnych tkanivách neexprimujú molekuly kostimulátora, je imunitný systém živého organizmu normálny, T bunky sú v nereagujúcom stave na udržanie imunitnej tolerancie, aj keď existujú autoantigén-reaktívne T bunky, ktoré reagujú s autoantigénom. Bolo teda dokázané, že v abnormálnom stave imunity je aktivovaný väčší počet autoantigén-reaktívnych T buniek, čo spôsobí ich abnormálny nadbytok a plynulá expresia molekúl kostimulátora tým spôsobí autoimunitné ochorenia.

V súlade s týmto bolo navrhnutých viacero pokusov liečby rôznych autoimunitných ochorení pomocou modulácie prenosu kostimulačných signálov, napríklad spomínané signály prenosu medzi CD28/CTLA-4 a CD80/CD86.

Výsledky takýchto pokusov ešte neobjasňujú detaily mechanizmu T bunkovej aktivácie pomocou interakcie medzi kostimulačnými molekulami a príslušnými molekulami (inými slovami, bunková adhézia cez väzbu medzi týmito molekulami). V tomto mechanizme môžu byť zúčastnené neznáme molekuly.

Predkladaný vynález bol úspešný pri identifikovaní a izolovaní nových molekúl povrchovej bunkovej membrány patriacich cicavcom (človeku, myši a kryse), ktoré sú považované za molekuly, ktoré prenášajú sekundárny signál (kostimulačný signál) nevyhnutný na aktiváciu lymfocytov, napríklad T buniek, a kontrolujú funkciu aktivovaných lymfocytov, napríklad aktivovaných T buniek, pomocou spracovania signálu, tým istým spôsobom, ako bol uvedený pri„CD28“ a „CTLA-4“ a tieto molekuly sa označujú „JTT-1 antigén“ alebo „JTT-2 antigén“ (Japonská patentová prihláška (JP-A) č. Hei 11-29599; WO98/38216; Int. Immunology, Vol. 12, č. 1, pp. 51-55, 2000). Pôvodcovia vynálezu neskôr zmenili ich meno na AILIM (aktiváciou vyvola3

SK 288074 Β6 ná lymfocytová imunomodulačná molekula).

Zo štúdií pôvodcov vynálezu vyplývajú nasledujúce poznatky o novej molekule AILIM.

(1) AILIM má nasledujúcu podobnosť s „CD28“, bunková povrchová molekula lymfocytu, napríklad T buniek, ktorá prenáša kostimulačný signál dôležitý na aktiváciu T buniek, sprostredkovaný pomocou intermolekulámej adhézie a s „CTLA-4“, bunková povrchová molekula lymfocytu, napríklad T buniek, ktorá kontroluje funkciu aktivovaných lymfocytov, takých ako aktivované T-bunky, pracujúca so signálom.

1. 20 alebo viac aminokyselinových zvyškov zahrnujúcich cysteínové zvyšky sú vysoko zachované.

2. Prolínová opakujúca sekvencia „Pro-Pro-Pro (PPP)“ dôležitá ako ligandová väzbová oblasť je konzervovaná v extracelulámej oblasti.

3. Sekvencia „Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM)“ (Xaa a x predstavujú určitú aminokyselinu), sekvecia dôležitá ako signálna prenosová oblasť je konzervovaná v cytoplazmovej oblasti.

4. Lokalizácia génu kódujúceho „myšiu AILIM (myší JTT-1 antigén)“ na myších chromozómoch je „1C3“, tak isto ako pri myších „CD28“ a „CTLA-4“.

(2) Takým istým spôsobom ako v „CD28“ a „CTLA-4“ majúcich funkciu sprostredkovávať intracelulárnu adhéziu, „AILIM (JTT-1 antigén)“ má schopnosť sprostredkovať bunkovú adhéziu medzi bunkami týmusu a lymfoblastovými bunkami a bunkami tymóma stimulovanú pomocou mitogénu, napríklad ConA.

(3) AILIM je silne exprimované aspoň v bunkách týmusu, lymfoblastových bunkách stimulovaných mitogénom takým ako ConA (aktivované T-lymfoblastové bunky a aktivované B-lymfoblastómové bunky), periférne krvné lymfocyty a bunky tymómu.

(4) Protilátky proti AILIM (JTT-1 antigén) jednoznačne proliferujú ľudské periférne krvné lymfocyty a vyššia proliferácia je vyvolaná prostredníctvom ko-existencie s monoklonálnou protilátkou proti CD3 vytvárajúcimi TcR/CD3 komplex na T bunkách, ktorý prijíma prvý signál z buniek predstavujúcich antigén v podstate na aktiváciu T buniek.

(5) Stav experimentálnej alergickej encefalomyelitídy (EAE) sa zlepšil podaním protilátok proti AILIM (JTT-1 antigén).

(6) Podaním protilátky proti AILIM (JTT-1 antigén) sa zlepšil stav glomerulámej základnej membrány (GMB) obličky krýs.

Po správe o identifikácii a charakterizačnej analýze AILIM pôvodcami predkladaného vynálezu, skupina pod vedením Kroczeka a kol. publikovala identifikáciu molekuly pod názvom ICOS (indukujúci kostimulátor) alebo 8F4, ktorá je totožná s molekulou AILIM odvodenej od človeka (Náture, Vol. 397, pp. 263-266, 1999; WO99/15553).

Len uvedená správa o AILIM (alternatívne nazývaná: JTT-1 antigén, JTT-2 antigén, ICOS alebo 8F4) a jej biologické funkcie a vzťah medzi ochoreniami neboli ešte podrobne zverejnené.

Na druhej strane, nové molekuly nazývané B7h, B7RP-1, GL50 alebo LICOS, ktoré sú považované za ligand interagujúci s touto kostimulačnou prenášačovou molekulou AILIM, boli indentifikované veľmi podrobne (Náture. Vol. 402, No. 6763, pp. 827-832, 1999; Náture Medicíne, Vol. 5, No. 12, pp. 1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol. 164, pp. 1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol. 10, No. 6, pp. 333-336, 2000).

Potvrdenie týchto dvoch druhov nových molekúl, konkrétne AILIM (ICOS) a B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), že slúžia ako signálna transdukčná dráha pre kostimulačný signál vhodný na aktiváciu lymfocytov takých ako T bunky a kontrola funkcie aktivovaných T buniek naznačujú, že existuje nová tretia dráha zabezpečujúca interakciu medzi AILIM (ICOS) a B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), okrem toho prvé a sekundárne signálne dráhy, ktorú sú už známymi transdukčnými dráhami medzi CD28 a CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2), a medzi CTLA4 a CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2).

Realizovali sa štúdie biologických funkcií týchto nových molekúl, funkčná kontrola lymfocytov, takých ako T bunky, pomocou tretieho kostimulačného signálu preneseného molekulami, vzťahu medzi novým signálnym prenosom a ochoreniami.

Podstata vynálezu

Konkrétne, predmetom predkladaného vynálezu je objasniť biologické funkcie novej molekuly AILIM, považovanej za podobnú molekulu ako „CD28“ a „CTLA-4“, ako molekuly, ktorá prenáša sekundárny signál (kostimulačný signál) vhodný na aktiváciu lymfocytov, takých ako T bunky, a kontroluje funkcie aktivovaných lymfocytov, takých ako aktivované T bunky; ďalej objasniť vzťahy medzi expresiou AILIM a ochoreniami; poskytnúť spôsob a liečivá, ktoré inhibujú rozvoj rôznych ochorení závislých od expresnej dráhy AILIM alebo liečia ochorenia pomocou kontrolovania biologických funkcií AILIM použitím liečiva a farmaceutických metód (napríklad liečivo také ako nízko molekulová zlúčenina a protilátka).

Pôvodcovia vynálezu študovali biologické funkcie cicavčích AILIM, dráhu expresie AILIM v rôznych bunkách, vzťahy medzi expresiou AILIM a ochoreniami, čo vyústilo do poznatkov skompletizovaných do predkladaného vynálezu.

(I) V T bunkách týmusu, v jednom z lymfoidných tkanív v normálnej myši bola pozorovaná silná expresia AILIM tým istým spôsobom ako v bunkách, ktoré silne exprimujú CD3 potvrdzujúc koreláciu medzi obidvoma expresiami. Oproti tomu expresia CD28 kostimulačnej molekuly je znížená tak, ako je expresia CD3 zvýšená. V T bunkách odvodených od myších normálnych týmusových buniek expresie AILIM a CD28 preukazujú zhoršenie pohybového stavu. V CD4-negatívnych CD8-negatívnych T bunkách nebola pozorovaná expresia ani AILIM, ani CD28. V T bunkách odvodených od normálneho myšieho týmusu expresia CD28 je najvyššia v CD4-pozitívnych CD8-pozitívnych T bunkách a expresia v CD4-negatívnych CD8-pozitívnych bunkách alebo CD4-pozitívnych CD8-negatívnych bunkách, pričom nasledujúca bunková diferenciácia je znížená. Oproti tomu, v normálnych myších týmusových bunkách, expresia AILIM bola len nepatrne detegovaná v CD4-pozitívnych CD8-pozitívnych T bunkách, ale vysoká expresia bola nájdená v CD4-negatívnych CD8-pozitívnych T bunkách, alebo CD4-pozitívnych CD8-negatívnych T bunkách. Expresia AILIM v normálnych myších týmusových T bunkách sa odlišuje od CD28 vo vzťahu nielen ku CD3 expresii, ale aj ku CD4 a CD8.

(II) Expresia AILIM v T bunkách v slezine a v lymfatických uzlinách, ktoré sú jedny z normálnych myších lymfatických tkanív, je menšia v porovnaní s expresiou v T bunkách odvodených od myšieho týmusu. Expresia AILIM sa našla vo veľmi malom počte v CD4-pozitívnych T bunkách.

(III) Bežná expresia AILIM je pozorovaná v T bunkách (mononukleáme bunky) odvodených od pečeňových tkanív v hepatitídovom modeli a je vyvolaná podaním P. acnes (Propionibacterium acnes) a LPS (Lipopolysacharid). Expresia je extrémne vyššia v porovnaní s CD4-pozitívnymi bunkami odvodenými od normálnych myších buniek sleziny alebo T buniek odvodených od lymfatickej uzliny.

(IV) V bunkách odvodených od periférnych krvných buniek od normálnej zdravej osoby, väčšina AILIM-pozitívnych buniek sú CD4-pozitívne CD8- negatívne bunky a väčšina AILIM-pozitívnych buniek sú T bunky. V B bunkách odvodených od periférnych krvných buniek normálnej zdravej osoby je pozorovaná nepatrná expresia AILIM.

(V) V kĺbovom tkanive infiltrujúce T bunky v sinoviálnom toku pacientov z reumatoidnou artritídou (RA) (CD4-pozitívne T bunky a CD4-negatívne bunky) bola nájdená expresia AILIM v podstate vo väčšej miere ako v porovnaní s T bunkami v periférnej krvi od normálnej zdravej osoby.

(VI) V CD4-pozitívnych T bunkách v sinoviálnom toku pacientov z osteoartritídou (OA) je pomer AILIM-pozitívnych buniek tiež zvýšený v CD4- pozitívnych T bunkách od progresívnych systémových sklerotických (PSS) pacientov.

(VII) Zvýšenie expresie AILIM bolo pozorované v T bunkách získaných z myšieho lymfatického tkaniva 3 až 6 hodín po stimulácii s použitím Ionofóru s anti-CD3 protilátkou, Concanavalinom A (ConA) alebo s PMA (forbol myristát acetát). Maximálna expresia AILIM bola potvrdená asi 12 hodín po stimulácii. Vysoká expresia AILIM bola potvrdená 24 hodín alebo viac po stimulácii a expresia je udržiavaná na tejto úrovni už asi 48 hodín po stimulácii.

(VIII) Aktiváciou ľudských periférnych krvných T buniek (CD4-pozitívne bunky a CD8-pozitívne T bunky) s PMA a Ionofórom je AILIM vysoko exprimovaná asi 8 hodín po stimulácii. V ľudských periférnych krvných bunkách vysoká expresia AILIM je taktiež vyvolaná stimuláciou s buď anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou, alebo anti-CD3 protilátkou a anti-CD28 protilátkou.

(IX) Základná expresia AILIM je pozorovaná v T bunkových líniách, ktoré majú vlastnosti cytokínu Th2 typu (napríklad DC10, MS202, CD28KO, EL-4). AILIM expresia v týchto bunkových líniách je vysoká alebo vyššia než expresia CD28.

(X) Keď T bunky získané zo sleziny alebo týmusu z normálnej myši alebo krysy, alebo T bunky získané z periférnej krvi z normálnej zdravej osoby sú kultivované na platni prekrytej anti-AILIM protilátkou a anti-CD3 protilátkou podľa predkladaného vynálezu, je vyvolaná tvorba cytokínu (IFNy, IL-4, TNFa, IL-2, ILΊΟ) z T buniek a proliferácia T buniek.

(XI) Keď T bunky získané z periférnej krvi stimulované ConA alebo PMA sú kultivované na platni prekrytej anti-AILIM protilátkou a anti-CD3 protilátkou podľa predkladaného vynálezu, je vyvolaná tvorba cytokínu od T buniek a tiež bunková proliferácia. Tento výsledok je na tej istej úrovni ako v prípade kultivovaných T buniek získaných z periférnej krvi stimulovaných ConA alebo PMA na platni prekrytej anti-CD28 protilátkou a anti-CD3 protilátkou.

(XII) Keď anti-AILIM protilátka podľa predkladaného vynálezu bola pridaná ku T bunkám, v ktorých odpoveď T buniek bola vyvolaná kultiváciou buniek týmusu a sleziny, ktoré boli izolované z normálnej sleziny a normálneho týmusu (adhezívne bunky sú z nich odstránené) na platni prekrytej anti-CD3 protilátkou, je inhibovaná tvorba cytokínu (napríklad interferón γ (IFN-γ), interleukín 4 (IL-4) z T buniek a proliferácia T buniek.

Ale, inhibícia odpovede T-buniek pomocou anti-AILIM protilátky (napríklad spomínaná cytokínová tvorba, bunková proliferácia) je závislá od koncentrácie protilátky. Naproti tomu, keď je pridaná anti-CD28 protilátka namiesto anti-AILIM protilátky, je odpoveď zvýšená na rozdiel od výsledku, kedy bola použitá anti-AILIM protilátka.

(XIII) Keď anti-AILIM protilátka podľa predkladaného vynálezu bola pridaná do hepatitídového živočíšneho modelu získaného pridaním P. acnes (Propionibacterium acnes) a LPS (lipopolysacharid), je zvýšenie IFN-γ v krvi podstatne inhibované v závislosti od koncentrácie protilátky, taktiež je podstatne inhibované zvýšenie GOP/GPT.

(XIV) Keď anti-AILIM protilátka podľa predkladaného vynálezu bola pridaná ku artritídovému živočíšnemu modelu získaného podaním smrtiaceho tubercule bacillus, bolo svrbenie podstatne inhibované v závislosti od koncentrácie protilátky a taktiež boli významne inhibované rôzne parametre artritídy.

(XV) Keď anti-AILIM protilátka podľa vynálezu bola pridaná ku živočíšnemu modelu ochorenia neprijatia transplantátu (GVHD), tvorba IgC a IgE, ktoré sú produktmi reakcie odmietnutia transplantátu (GVH reakcia), je významne inhibovaná a taktiež je inhibované zvýšenie tvorby anti-dsDNA protilátky, indexu autoprotilátkovej valencie.

(XVI) Keď anti-AILIM protilátka podľa predkladaného vynálezu bola pridaná do živočíšneho modelu, v ktorom je tvorba protilátky proti nadbytočným cudzím antigénom vyvolaná senzibilizáciou červených krviniek (SRBC) ako cudzích antigénov (hneď alebo niekoľko dní po senzibilizácii), je zvýšenie tvorby protilátky proti SRBC významne inhibované. Inhibičný efekt je vyšší než v prípade podania CTLA4-Ig.

(XVII) Keď anti-AILIM protilátka podľa predkladaného vynálezu je pridaná ku živočíšnemu modulu, v ktorom je tvorba protilátky proti nadbytočným cudzím antigénom vyvolaná senzibilizáciou NP-KLH ako cudzích antigénov (hneď alebo niekoľko dní po senzibilizácii), je zvýšenie tvorby protilátky proti NP-KLH, cudziemu antigénu, významne inhibované.

(XVIII) Anti-AILIM protilátka významne inhibuje bunkovú proliferáciu T buniek v alogénovej zmiešanej lymfocytovej reakcii (MLR) s periférnymi krvnými monocytmi (PBMC) a T bunkami získanými z rozličných normálnych darcov.

Farmaceutická kompozícia predkladaného vynálezu obsahujúca protilátku, ktorá sa viaže na AILIM, môže byť použitá ako liečivo na moduláciu rôznych reakcií in vivo, v ktorých je vyvolaná transdukcia kostimulačného signálu na AILIM-exprimované bunky (napríklad bunková proliferácia AILIM-exprimovaných buniek, tvorba cytokínu (cytokínov) pomocou AILIM-exprimovaných buniek, imunitná cytolýza alebo apoptóza AILIM-exprimovaných buniek a účinnosť vo vyvolaní protilátky-závislej bunkovej cytotoxicity proti AlLIM-exprimovaným bunkám) a/alebo ako liečivo na prevenciu siderácie a/alebo progresie rôznych ochorení, v ktorých je vyvolaná signálna transdukcia sprostredkovaná AILIM a na liečenie alebo profylaxiu ochorení.

Konkrétne, farmaceutická kompozícia predkladaného vynálezu môže inhibovať proliferáciu A1LIM-exprimovaných buniek alebo môže inhibovať tvorbu cytokínov AILIM-exprimovanými bunkami (napríklad interferón γ alebo interleukín 4) a tiež môže predchádzať rôznym chorobným stavom, ktoré sú vyvolané rôznymi fyziologickými fenoménmi, v ktorých je vyvolaná signálna transdukcia sprostredkovaná AILIM a tiež môže liečiť alebo predchádzať rôznym ochoreniam.

Použitím farmaceutickej kompozície predkladaného vynálezu môže byť inhibované, liečené alebo predchádzané reakcii transplantát versus hostiteľ, pričom protilátka alebo jej časť má supresívny účinok na reakciu transplantát versus hostiteľ porovnateľný s účinkom hCTLA4-Ig.

Konkrétne je predkladaný vynález opísaný v nasledujúcich bodoch (1) až (3).

(1) Použitie protilátky, ktorá sa viaže na AILIM, alebo jej časti, vybranej zo skupiny pozostávajúcej z F(ab')₂, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv a dAb na prípravu farmaceutickej kompozície na zabránenie, liečbu alebo profylaxiu reakcie transplantát versus hostiteľ, kde protilátka alebo jej čiastočná oblasť má supresívny účinok na reakciu transplantát versus hostiteľ porovnateľný s účinkom hCTLA4-Ig.

(2) Použitie podľa bodu (1), kde protilátka alebo jej časť vybraná zo skupiny pozostávajúcej z F(ab')₂, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv a dAb má aktivitu pri inhibícii proliferácie buniek exprimujúcich AILIM alebo pri inhibícii produkcie cytokínu bunkami exprimujúcimi AILIM.

(3) Použitie podľa bodu (2), kde cytokín je inteferón γ, ktorý je cytokínom produkovaným T bunkami typu Thl alebo interleukín 4, ktorý je cytokínom produkovaným T bunkami typu Th2.

Predkladaný vynález je detailnejšie opísaný pomocou všeobecných metód na získanie protilátok a terminológie používanej v predkladanom vynáleze.

V texte používaný termín „cicavec“ znamená človek, krava, zajac, myš, krysa, škrečok a morča, uprednostňovaný je význam človek, zajac, krysa, myš alebo škrečok a najmä človek.

Termín „AILIM“ v tomto texte je skratka pre imunomodulačnú molekulu indukovateľnú aktiváciou. Termín AILIM predstavuje cicavčiu novú molekulu povrchu bunkovej membrány, ktorá bola presne identifikovaná, izolovaná a opísaná v JP-A Hei 11-29599 (Japonská patentová prihláška č. Hei 10-62217), ktorá zodpovedá prihláške WO98/38216 (PCT/JP98/00837) a v texte predkladaného vynálezu sa nazýva „JTT-1 antigén“ alebo „JTT-2 antigén“.

Konkrétne, v tejto patentovej prihláške „AILIM“ znamená ľudskú AILIM obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID č. 1 (ľudský JTT-1 antigén), krysiu AILIM obsahujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ

SK 288074 Β6

ID č. 4 alebo 6 (krysí JTT-1 antigén) a myšiu AILIM obsahujúcu aminokyselinovú sekveciu SEQ ID č. 5 (myší JTT-1 antigén).

O ľudskej odvodenej molekule kompletne identickej s ľudskou AILIM píšu Kroczek a kol. v dvoch správach publikovaných až po dvoch uvedených patentových prihláškach. Jeho kolektív pomenoval túto ľudskú odvodenú molekulu ICOS (indukovateľný kostimulátor) alebo 8F4 (WO99/15553; Náture Vol. 397, pp. 263266, 1999). Ľudská odvodená molekula volaná ICOS alebo 8F4 je chápaná ako molekula identická s ľudskou AILIM.

Okrem toho, „AILIM“ použitá tu taktiež zahrnuje polypeptid majúci v podstatne rovnakú aminokyselinovú sekvenciu ako AILIM z každého cicavca opísaného v správach a výhodne rovnakú aminokyselinovú sekvenciu ako ľudská AILIM (aminokyselinová sekvencia SEQ ID č. 2 v JP-A Hei 11-29599, ktorá zodpovedá WO98/38216).

Výraz „majúca v podstate rovnakú aminokyselinovú sekvenciu“ znamená, že polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu, v ktorej násobné aminokyseliny, výhodne 1 až 10 aminokyselín, výhodnejšie 1 až 5 aminokyselín, v aminokyselinovej sekvencii uvedenej v správach sú substituované, deletované a/alebo modifikované a polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu, v ktorej násobné aminokyseliny, výhodne 1 až 10 aminokyselín, výhodnejšie 1 až 5 aminokyselín, sú pridané do aminokyselinovej sekvencie uvedenej v správach a sú tiež zahrnuté v „AILIM“ podľa vynálezu, pokiaľ polypeptid má v podstate rovnaké biologické vlastnosti ako polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v správach.

Takáto substitúcia, delécia alebo inzercia aminokyselín môže byť dosiahnutá v súlade s bežnou metódou (Experimental Medicíne: SUPPLEMENT, „Handbook of Genetic Engineering“ (1992) atď.).

Príklady týchto metód sú syntetická oligonukleotidová do miesta smerujúca mutagenéza (gapped duplex method), bodová mutagenéza pomocou ktorej bodová mutácia je zavedená naslepo pri liečbe s dusitanom alebo sulfidom, metóda pomocou ktorej je pripravený mutant s Bal31 enzýmom a podobne, kazetová mutagenéza, linkerová skenovacia metóda, chybu začleňujúca metóda, mismatch primérová metóda, DNA segment syntetická metóda atď.

Syntetická oligonukleotidová do miesta smerujúca mutagenéza (gapped duplex method) sa môže realizovať podľa nasledujúceho postupu. Oblasť požadovaná, aby sa mutagenovala, je klonovaná do M13 fágového vektora majúceho amber mutáciu na prípravu jednovláknového fágu DNA. Potom RF I DNA M13 vektora bez amber mutácie je linearizovaná reštrikčným enzýmovým spracovaním, DNA je zmiešaná s jednovláknovým fágom DNA uvedeným skôr, denaturovaná a týmto vytvára „duplexnú DNA s medzerami“. Syntetický oligonukleotid, do ktorého sú zavedené mutácie, je hybridizovaný medzerovou duplexovou DNA a reakciou s DNA polymerázou a DNA ligázou sú pripravené uzatvorené kruhové dvojvláknové DNA. E. coli mutantné bunky, s nedostatočnou aktivitou pri oprave chýb, sú transfektované do tejto DNA. E. coli bunky bez supresorovej aktivity sú infikované dospelými fágmi a sú vybrané skríningom (preosiatím) len fágy bez amber mutácie.

Princíp metódy, ktorou je bodová mutácia zavedená s použitím dusitanu, je uvedený neskôr. Ak DNA je spracovaná s dusitanom, bázy sú deaminované na účely zmeny adenínu na hypoxantín, cytozínu na uracil a guanínu na xantín. Ak je deaminovaná DNA zavedená do buniek, „A : T“ a „G : C“ sú zamenené s „G : C“ a „A : T“, respektíve hypoxantínová, uracilová a xantínová forma bázového páru s cytozínom, adenínom a tymínom v DNA replikácii. V skutočnosti fragmenty jednovláknovej DNA spracované dusitanom sú hybridizované s „medzerovou duplexnou DNA“ a následne na to sú separované mutantné kmene tým istým spôsobom ako pri syntetickej oligonukleotidovej na miesto smerujúcej mutagenézy (medzerová duplexná metóda).

Termín „mitogén“, ako je používaný v tomto texte, predstavuje mitogénový faktor čiže látku, ktorá vyvoláva bunkové delenie. Imunologický, tento výraz predstavuje látku vyvolávajúcu blastogenézu lymfocytov a bunkové delenie. Ako príklady je možné uviesť lektíny, také ako PHA a PWM, concanavalin A (ConA), lipopolysacharidy, streptolyzín S a anti-lymfocytové protilátky. Je známe, že Concanavalin A a PHA pôsobia len na T lymfocyty, lypopolysacharidy pôsobia len na B lymfocyty a PWM pôsobí na obidva lymfocyty.

Termín „lymfoblastová bunka“ používaný v tomto texte predstavuje veľké lymfocyty, lymfoblast alebo imunoblast a tiež predstavuje lymfocity patriace ku veľkým lymfocytom spoločne s lymfocytami existujúcimi v lymfatických tkanivách (lymfatických uzlinách, v slezine, v týmuse, v kostnej dreni, v mandliach atď.) a krvi.

Termín „aktivované lymfocyty“, používaný v tomto texte, predstavuje také lymfocyty, ako sú uvedené neskôr, ale nielen tie. Napríklad lymfocyty aktivované nejakou stimuláciou. Lymfocyty sa delia na T bunky, B bunky a prirodzené zabíjače buniek. T bunky sa delia na CD4-pozitívne bunky a CD8-pozitívne bunky. Potom termín „aktivované lymfocyty“ podľa vynálezu zahrnuje hlavne aktivované T bunky, aktivované B bunky a aktivované prirodzené zabíjače buniek a aktivované T bunky zahrnujú aktivované CD4-pozitívne bunky a aktivované CD8-pozitívne bunky.

Po reakcii s antigénmi predstavovanými bunkami prezentujúcimi antigén, CD4-pozitívne T bunky vylučujú rôzne cytokíny (IFNy, IL-4 atď.), čerstvo exprimované receptory pre tieto cytokíny; zväčšujú ich vlastnú

SK 288074 Β6 veľkosť, štartujú bunkové delenie, proliferujú a sú aktivované. Aktivované CD4-pozitívne T bunky ich zahrnujú v tomto stave.

CD8-pozitívne T bunky exprimujú IL-2R v prípade, že reagujú s antigénmi. Keď IL-2-pôsobí na IL-2R, bunky sú diferencované na CTL, ktorý má bunkovú toxicitu. CTL ničia cieľové bunky, keď sa stretnú s tým istým komplexom triedy I antigén/MHC. Keď sú CD8-pozitívne T bunky diferencované na CTL, v cytoplazme sa zvyšujú granuly. Tieto granuly obsahujú rôzne proteíny s vysokou molekulovou hmotnosťou, napr. perforín. Perforín sa podobá na MAC, je zložený z piatich až deviatich látok a vytvára diery v bunkovej membráne cieľových buniek. Granuly tiež obsahujú serín proteázy, LT a proteoglykán. Ak CD8-pozitívne bunky prijímajú antigénovú stimuláciu a sú diferenciované na CTL, začnú vylučovať lymfokíny také ako IFNy, LT, TNF alebo IL-2. Aktivované CD8-pozitívne T bunky ich zahrnujú v takomto stave.

T bunky predstavujú fenomén vzniku blastu, v prípade že reagujú s hemaglutinínom (fytohemaglutinín) alebo Concanavalinom A (ConA). Aktivované T bunky ich zahrnujú v takomto stave.

B bunky exprimujú B7 molekuly, aktivujú pomocné T bunky stimuláciou CD28 s TCR na ich povrchu, umožňujú pomocným T bunkám exprimovať CD40L alebo produkovať lymfokíny. Keď bunky prijímajú stimuláciu, dôjde k zväčšeniu ich bunkovej veľkosti alebo sa rozmnožujú. Aktivované B bunky ich zahrnujú v takomto stave. Podľa predkladaného vynálezu aktivované B bunky zahrnujú tieto sekretujúce protilátky (bunky sekretujúce protilátku a plazmatické bunky).

Aktivované prirodzené zabíjače buniek majú cytotoxický účinok na rakovinové bunky alebo na bunky napadnuté vírusom, ako bolo uvedené. V predkladanom vynáleze aktivované lymfocyty zahrnujú bunky týmusu stimulované Concanavalinom A (ConA).

Výraz „aktivovaná lymfoblastová bunka“ použitý v tomto texte zahrnuje aktivovaný „lymfoblast“, ktorý je generovaný v prípade, že spomínaný lymfoblast je stimulovaný uvedeným „mitogénom“, ako je Concanavalin A.

Termín „pokojový lymfocyt“, ako je používaný v tomto texte, predstavuje v určitom prípade neaktivovaný lymfocyt, ktorý neprijal stimuláciu na aktivovanie buniek, oproti uvedenému aktivovanému lymfocytu.

Výraz „cytokín“ v „tvorbe cytokínu pomocou AILIM-exprimovaných buniek“ v kontexte tohto vynálezu predstavuje cytokín, ktorý je produkovaný AILIM-exprimovanými bunkami (konkrétne T bunky). Príkladmi na T bunky sú T bunky Thl typu a Th2 typu a cytokín podľa vynálezu je konkrétne definovaný ako citokín produkovaný T bunkami Thl typu a/alebo cytokín produkovaný T bunkami Th2 typu.

Príklady na cytokíny produkované T bunkami Thl typu sú lFN-γ, 1L-2, TNF, IL-3, a príklady na cytokíny produkované T bunkami Th2 typu sú IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, TNF (Celí, Vol. 30, No. 9, pp. 343-346, 1998).

Pojem „protilátka“ v predkladanom vynáleze môže byť polyklonálna protilátka (antisérum) alebo monoklonálna protilátka proti cicavčiemu AILIM (výhodne ľudskému AILIM) uvedenom skôr a výhodne monoklonálna protilátka.

Protilátka použitá v predkladanom vynáleze je výhodne monoklonálna protilátka, pričom táto monoklonálna protilátka zahŕňa nielen inú ako ľudskú cicavčiu monoklonálnu protilátku, ale tiež rekombinantnú chimérickú monoklonálnu protilátka, rekombinantnú ľudskú monoklonálnu protilátku a ľudskú monoklonálnu protilátku.

Konkrétna protilátka je protilátka účinná pri inhibícii proliferácie AILIM-exprimujúcich buniek prostredníctvom väzby na AILIM alebo pri inhibícii produkcie interferónu γ alebo interleukínu 4 prostredníctvom AILIM-exprimujúcich buniek cez väzbu na AILIM.

Protilátkou podľa predkladaného vynálezu môžu byť prirodzené protilátky získané pomocou imunizácie cicavcov takých ako myši, potkany, škrečky, morčatá a zajace antigénom, bunky (také ako prirodzené bunky, bunkové línie, tumorové bunky atď.) exprimujúce AILIM, transformanty pripravené použitím technológie rekombinantnej DNA s cieľom nadexpresie AILIM na ich povrchu, polypeptidy tvoriace AILIM alebo uvedené fuzované polypeptidy obsahujúce AILIM polypeptid alebo extracelulámu oblasť AILIM. Protilátka predkladaného vynálezu tiež zahŕňa chimérické protilátky a humanizované protilátky (CDR-naočkované protilátky), ktoré môžu byť produkované pomocou technológie rekombinantnej DNA a ľudské protilátky, ktoré môžu byť produkované využitím transgénových cicavcov produkujúcich protilátku.

Monoklonálna protilátka zahrnuje tie, ktoré majú určitý jeden izotyp IgG, IgM, IgA, IgD alebo IgE. IgG alebo IgM sú uprednostňované.

Polyklonálna protilátka (antisérum) alebo monoklonálna protilátka môže byť produkovaná pomocou známych metód. Menovite, je cicavec, výhodne myš, krysa, škrečok, morča, zajac, mačka, pes, prasa, koza, kôň alebo dobytok, alebo výhodnejšie myš, krysa, škrečok, morča alebo zajac imunizovaný, napríklad antigénom uvedeným skôr ak je to nevyhnutné, Freundovým činidlom.

Polyklonálna protilátka môže byť získaná zo séra pochádzajúceho od živočícha tiež imunizovaného. Ďalej monoklonálne protilátky sú produkované nasledovne. Hybridómy sú pripravené z buniek produkujúcich protilátky, ktoré sú získané zo živočíchov, ktoré boli imunizované a z myelómových buniek, ktoré nie sú schopné produkovať protilátky. Hybridómy sú klonované a klony produkujúce monoklonálne protilátky preukazujúce špecifickú afinitu ku antigénu, ktorý je využitý na imunizáciu cicavcov, sú triedené cez sito.

SK 288074 Β6

Konkrétne, monoklonálne protilátky môžu byť produkované nasledovne. Imunizácie sú vykonávané jedným alebo viacerým injikovaním alebo implantovaním antigénu (ako je uvedené) takého ako imunogén, ak je to nevyhnutné, použije sa Freundovo adjuvans, podkožné, vnútrosvalovo, vnútrožilovo alebo vnútrobrušne pri iných cicavcoch, ako je človek a to konkrétne na myš, krysu, škrečka, morča alebo zajaca, výhodne na myš, krysu alebo škrečka (zahrnujúc transgénové živočíchy generované tak, aby produkovali protilátky odvodené od iných živočíchov, také ako transgénové myši, ktoré produkujú ľudské protilátky, čo je spomínané neskôr). Obvykle sú imunizácie vykonávané raz alebo štyrikrát každý prvý až štrnásty deň po prvej imunizácii. Bunky produkujúce protilátku sú získané z cicavcov, ktorí boli imunizovaní asi jeden až päť dní po poslednej imunizácii. Frekvencia a interval imunizácie môže byť vhodne upravený v závislosti od vlastnosti použitého imunogénu. Hybridómy, ktoré vylučujú monoklonálne protilátky, môžu byť pripravené pomocou metódy Kôhlera a Milsteina (Náture, Vol. 256, pp. 495-497 (1975)) a pomocou nimi modifikovanej metódy. Konkrétne, hybridómy sú pripravené fúziou buniek produkujúcich protilátku, ktoré sú lokalizované v slezine, tkanivovom moku, v kostnej dreni alebo v madlách získaných z iných imunizovaných, cicavcov ako je človek, výhodne v slezine, s myelómami bez schopnosti produkcie auto protilátky, ktoré sú odvodené výhodne z takých cicavcov, ako je myš, krysa, morča, škrečok, zajac alebo človek, alebo výhodnejšie myš, krysa alebo človek.

Napríklad, myelóm získaný z myši P3/X63-AG8.653 (653), P3/NSI/1- Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.Ul (P3U1), SP2/0-Agl4 (Sp2/0, Sp2), PAI, FO alebo BW5147, myelóm získaný z krysy 210RCY3-Ag.2.3 alebo myelóm získaný z človeka U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 alebo CEM-T15 môže byť použitý ako myelóm použiteľný na bunkovú fúziu.

Hybridómové klony produkujúce monoklonálne protilátky môžu byť skrinované pomocou kultivácie hybridómov, napríklad v mikrotitrových platniach a pomocou merania reaktivity kultivačného supernatantu v jamke, v ktorej je pozorovaný rast hybridómu na imunogén použitý na imunizáciu spomínanú skôr, napríklad pomocou enzýmového imunotestu takého ako RIA a ELISA.

Monoklonálne protilátky môžu byť produkované hybridómami, kultiváciou hybridómov in vitro alebo in vivo a to v tekutine nahromadenej v podbrušnej dutine myši, krysy, morčaťa, škrečka alebo zajaca, výhodne myši alebo krysy, výhodnejšie myši a izoláciou protilátok z výsledného kultivačného supernatantu alebo tekutiny nahromadenej v podbrušnej dutine cicavca.

Kultivácia hybridómov in vitro môže byť vykonávaná v závislosti od vlastnosti buniek, ktoré sú kultivované, od objektu, ktorý je testovaný a rôznych podmienok kultivačnej metódy. Je vykonávaná použitím známeho výživového média alebo určitého výživového média odvodeného od známeho bazálneho média pre rast, udržovanie a skladovanie hybridómov na pestovanie monoklonálnych protilátok v kultivačnom supematante.

Príkladmi bazálneho média sú médiá s nízkou koncentráciou vápnika, také ako Ham'F12 médium, MCDB153 médium alebo médium s nízkou koncentráciou vápnika MEM a médiá s vysokou koncentráciou vápnika, také ako MCDB104 médium, MEM médium, D-MEM médium, RPMI1640 médium, ASF104 médium alebo RD médium. Bazálne médium môže obsahovať napríklad séra, hormóny, cytokíny a/alebo rôzne anorganické alebo organické látky v závislosti od cieľa ich použitia.

Monoklonálne protilátky môžu byť izolované a čistené z kultivačného supernatantu alebo z tekutiny nahromadenej v podbrušnej dutine, spomínanej skôr, pomocou precipitácie nasýteným síranom amónnym, pomocou euglobulínovej precipitačnej metódy, pomocou metódy kyseliny kaprónovej, pomocou metódy kyseliny kaprylovej, pomocou iónovo výmennej chromatografie (DEAE alebo DE52), pomocou afinitnej chromatografie použitím anti-imunoglobulínovej kolóny alebo kolóny proteínu A.

„Rekombinantná chimérická monoklonálna protilátka“ je monoklonálna protilátka pripravená genetickým inžinierstvom a konkrétne predstavuje chimérickú protilátku takú ako myšia/ľudská chimérická monoklonálna protilátka, ktorej premenlivé oblasti sú získané od imunoglobulínu cicavca okrem človeka (myši, krysy, škrečka atd’.), a ktorej konštantné oblasti sú získané od ľudského imunoglobulínu.

Konštantná oblasť získaná z ľudského imunoglobulínu má aminokyselinovú sekvenciu inherentnú v každom izotype, takom ako IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD a IgE. Konštantná oblasť rekombinantnej chimérickej monoklonálnej protilátky môže byť ten imunoglobulín patriaci do určitého izotypu. Výhodne je to konštantná oblasť ľudského IgG.

Chimérická monoklonálna protilátka môže byť produkovaná, napríklad, nasledovne. Samozrejme, produkčná metóda nie je touto metódou limitovaná.

Myšia/ľudská chimérická monoklonálna protilátka môže byť pripravená podľa referencií v Experimental Medicíne: SUPPLEMENT, Vol. 1.6, No. 10 (1988); a v Japonskej publikovanej patentovej prihláške (JP-B) No. Hei 3-73280. Konkrétne môže byť pripravená vložením inzertného CH génu (C gén kódujúci konštantnú oblasť H reťazca) získaného z DNA kódujúcej ľudský imunoglobulínový tok aktívnych V_H génov (preskupený VDJ gén kódujúci premenlivú oblasť H reťazca) získaných z DNA kódujúcej myšiu monoklonálnu protilátku izolovanú z hybridómu produkujúceho myšiu monoklonálnu protilátku a C_L génu (C gén kódujúci konštantnú oblasť L reťazca) získaného z DNA kódujúcej ľudský imunoglobulínový tok aktívnych V_L génov

SK 288074 Β6 (preskupený VJ gén kódujúci premenlivú oblasť L reťazca) získaných z DNA kódujúcej myšiu monoklonálnu protilátku izolovanú z hybridómu, do tých istých alebo rozdielnych vektorov tak, aby boli exprimované. Potom nasleduje transformovanie hosťovských buniek s vektorom expresie, a potom nasleduje kultivácia transformantov.

Konkrétne, DNA sú najprv extrahované z myších monoklonálnych hybridómov produkujúcich protilátku pomocou zvyčajnej metódy, ďalej sú digerované vhodnými reštrikčnými enzýmami (napríklad EcoRI a Hindlll), ďalej podliehajú elektroforéze (použitím, napríklad, 0,7 % agarózového gélu) a sú analyzované blotingom (Southern blotting). Po elektroforéze je gél zafarbený, napríklad etídium bromidom a fotografovaný, gél je poskytnutý s markérovými polohami, premytý dvakrát vodou a navlhčený v 0,25 M HCI počas 15 minút. Potom je gél navlhčený v 0,4 N roztoku NaOH počas 10 minút za jemného miešania. DNA sú prenesené na filter po štyroch hodinách zvyčajnou metódou. Filter je znova pokrytý a premytý dvakrát 2 x SSC. Potom je filter dostatočne vysušený pri 75 °C počas 3 hodín. Po sušení je filter opracovaný s 0,1 x SSC/0,1 % SDS pri 65 °C počas 30 minút. Potom je navlhčený trikrát s SSC/0,0 % SDS. Získaný filter je opracovaný prehybridizačným roztokom v plastovom vrecku pri 65 °C počas 3 až 4 hodín.

Ďalej, ³²p-označená vzorka DNA a hybridizačný roztok sa pridali do vrecka a prebehla reakcia pri 65 °C asi 12 hodín. Po hybridizácii je filter premytý pri vhodnej koncentrácii soli, reakčnej teplote a času (napríklad 2 x SSC-0,1 % SDS, izbová teplota, 10 minút). Filter je uložený do plastového vrecka s troškou 2 x SSC a podrobí sa autorádiografii, po nej je vrecko uzavreté.

Preskupený VDJ gén a VJ gén kódujúci H reťazec a L reťazec myšej monoklonálnej protilátky je identifikovaný pomocou spomínaného blotingu (Southern blotting). Oblasť obsahujúca identifikovaný fragment DNA je frakcionovaná pomocou centrifugácie s využitím hustotného gradientu sacharózy a vložená do fágového vektora (napríklad Charon 4A, Charon 28, yEMBL3, yEMBL4 atď.). E. coli (napríklad LE392, NM53 9 atď.) je transformovaná fágovým vektorom na vytvorenie genómovej knižnice. Genómová knižnica je skrinovaná pomocou plakovej hybridizácie, takej ako Benton-Davis metóda (Science, Vol. 196, pp. 180-182 (1977)) s využitím vhodných vzoriek (H reťazec J génu, L reťazec (k) J génu atď.) na získanie pozitívnych klonov obsahujúcich preskupený VDJ gén alebo VJ gén. Zhotovením reštrikčnej mapy a určením nukleotidovej sekvencie získaných klonov bolo potvrdené, že prítomné gény sú žiaduce, získali sa preskupené V_H (VDJ) gény alebo V_L (VJ) gény.

Konkrétne je izolovaný ľudský Ch gén a ľudský Cl gén potrebný na chimérizáciu. Napríklad, ak je produkovaná chimérická protilátka, s ľudským IgGl sú izolované Cyl gén ako C_H gén a Ck gén ako C_L gén. Tieto gény môžu byť izolované z ľudskej genómovej knižnice s myším Cyl génom a myším Ck génom zodpovedajúcim ľudskému Cyl génu a ľudskému Ck génu, respektíve ako vzorky majúce výhodu vo vysokej homológii medzi nukleotidovými sekvenciami myšieho imunoglobulínového génu a ľudského imunoglobulínového génu.

Konkrétne, DNA fragmenty obsahujúce ľudský Ck gén a zlepšovacia oblasť sú izolované z ľudskej y Charon 4A HaelII-Alul genómovej knižnice (Celí, Vol. 15, pp. 1 157-1 174 (1978)), napríklad s 3 kb HindlII-BamHI fragmentom klonu Igl46 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 75, pp. 4709-4713 (1978)) a 6,8 kb EcoRI fragmentom klonu MEP10 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 78, pp. 474-478 (1981)) ako vzorkami.

Ďalej je potom, napríklad ľudský fetálny hepatocyt DNA digerovaný s HindlII a frakcionovaný elektroforézou na agarózovom géli, 5,9 kb fragment je vložený do y788 a potom je izolovaný ľudský Cyl gén so vzorkami uvedenými skôr.

Použitím myšieho V_H génu, myšieho V_L génu, ľudského C_H génu a ľudského C_L génu takto získaných a vzatím do úvahy promótorovú oblasť a zlepšovaciu oblasť, ľudský C_H gén je inzertovaný myší V_H gén a ľudský C_L gén je inzertovaný myší V_L gén do exprimovaného vektora takého ako pSV2gpt alebo pSV2neo vhodnými reštrikčnými enzýmami a DNA ligázou pomocou zvyčajnej metódy. V tomto prípade chimérické gény myšieho V_H génu/ľudského C_H génu a myšieho V_L génu/ľudského C_L génu môžu byť vložené do toho istého vektora alebo do rozdielnych vektorov expresie.

Chimérický gén - vložený vektor (vektory) expresie takto pripravené sú zavedené do myelómov, ktoré neprodukujú protilátky, napríklad, P3x63 Ag8 653 bunky alebo SP210 bunky pomocou metódy fúzie protoplastu, metódy DEAE-dextran, metódy kalcium fosfát alebo metódy elektroporácie. Transformanty sú skrinované kultiváciou v médiu obsahujúcom liečivo zodpovedajúce liečivu rezistentného génu vloženého do vektora expresie, a potom sú získané bunky produkujúce požadované chimérické monoklonálne protilátky.

Požadované chimérické monoklonálne protilátky sú získané z kultivačného supematantu buniek produkujúcich protilátku takto skrinovaných.

„Humanizovaná monoklonálna protilátka (CDR-naočkovaná protilátka)“ podľa predkladaného vynálezu je monoklonálna protilátka pripravená genetickým inžinierstvom a konkrétne predstavuje humanizovanú protilátku, pričom časť alebo celé doplnenie určujúce oblasti hyperpremenlivej oblasti sú získané z doplnenie určujúcich oblastí hyperpremenlivej oblasti z monoklonálnej protilátky cicavca okrem človeka (myši, krysy, škrečka atď.), konštrukčné oblasti premenlivej oblasti sú odvodené z konštrukčnej oblasti premenlivej oblasti z ľudského imunoglobulínu a konštantná oblasť je odvodená z ľudskej konštantnej oblasti z imunoglobulínu.

Doplnenie určujúce oblasti hyperpremenlivej oblasti existujú v hyperpremenlivej oblasti v premenlivej oblasti protilátky a znamenajú tri oblasti, ktoré sú priamo a komplementárne viazané na antigén (komplementaritu-určujúce zvyšky, CDR14, CDR2 a CDR3). Konštrukčné oblasti premenlivej oblasti predstavujú štyri komparatívne uchovávajúce oblasti ležiace v hornej časti, v dolnej časti alebo medzi troma komplementaritu určujúcimi oblasťami (konštrukčná oblasť, FR1, FR2, FR3 a FR4).

Inými slovami, humanizovaná monoklonálna protilátka znamená, že v nej všetky oblasti okrem častí alebo celých komplementaritu určujúcich oblastí hyperpremenlivej oblasti monoklonálnej protilátky získanej z cicavca iného ako človek boli nahradené ich zodpovedajúcimi oblasťami získanými z ľudského imunoglobulínu.

Konštantná oblasť získaná z ľudského imunoglobulínu má aminokyselinovú sekvenciu inherentnú v každom izotype takom ako IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD a IgE. Konštantná oblasť humanizovanej monoklonálnej protilátky v predkladanom vynálezu môže byť tá z ľudského imunoglobulínu patriaceho k určitému izotypu. Výhodne je to konštantná oblasť ľudského IgG. Konštrukčné oblasti konštantnej oblasti získanej z ľudského imunoglobulínu nie sú obzvlášť limitované.

Humanizovaná monoklonálna protilátka môže byť produkovaná, napríklad, nasledovne. Samozrejme, produkčná metóda nie je obmedzená len na túto metódu.

Napríklad, rekombinantná humanizovaná monoklonálna protilátka získaná z myšej monoklonálnej protilátky môže byť pripravená genetickým inžinierstvom, čo je zahrnuté v publikovanom preklade japonskej prihlášky (JP- WA) No. Hei 4-506458 a JP-A Sho 62-296890. Teda aspoň jeden myší H reťazec CDR génu a aspoň jeden myší L reťazec CDR génu zodpovedajúceho myšiemu H reťazcu CDR génu je izolovaný z hybridómov produkujúcich myšiu monoklonálnu protilátku a ľudský H reťazec génu kódujúceho celé oblasti okrem ľudského H reťazca CDR zodpovedajúceho myšiemu H reťazcu CDR spomínaného skôr a ľudský L reťazec génu kódujúceho celú oblasť okrem ľudského L reťazca CDR zodpovedajúceho myšiemu L reťazcu CDR spomínanému skôr sú izolované z ľudských imunoglobulínových génov.

Myší H reťazec CDR génu (génov) a ľudský H reťazec génu (génov) takto izolované sú operabilne vložené do vhodného vektora, tak že môžu byť exprimované. Podobne, myší L reťazec CDR génu (génov) a ľudský L reťazec génu (génov) sú operabilne vložené do iného vhodného vektora, tak že môžu byť exprimované. Alternatívne, myší H reťazec CDR génu (génov)/ľudský H reťazec génu (génov) a myší L reťazec CDR génu (génov)/ľudský L reťazec génu (génov) môžu byť operabilne vložené do toho istého vektora expresie tak, že môžu byť exprimované. Hosťovské bunky sú transformované expresným vektorom, teda sú pripravené na získanie transformantov produkujúcich humanizované monoklonálne protilátky. Kultiváciou transformantov požadovaná humanizovaná monoklonálna protilátka je získaná z kultivačného supernatantu.

„Ľudská monoklonálna protilátka“ je imunoglobulín, v ktorom celé oblasti obsahujúce premenlivú a konštantnú oblasť H reťazca a premenlivú a konštantnú oblasť L reťazca vytvárajúce imunoglobulín sú odvodené z génov kódujúcich ľudský imunoglobulín.

Ľudská protilátka (výhodne ľudská monoklonálna protilátka) môže byť produkovaná tým istým spôsobom ako v produkčnej metóde polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok spomínaných skôr, imunizáciou s antigénom transgénového cicavca, v ktorom napríklad aspoň ľudský imunoglobulínový gén (gény) bol integrovaný do cicavca iného ako človek, napr. do myši zvyčajnou metódou.

Napríklad transgénová myš produkujúca ľudské protilátky bola pripravená metódami opísanými v Náture Genetics, Vol. 7, pp. 13-21 (1994); Náture Genetics, Vol. 15, pp. 146-156 (1997); JP-WA Hei 4-504365; JP-WA Hei 7-509137; Nikkei Science, No. 6, pp. 40-50 (1995); W094/25585; Náture, Vol. 368, pp. 856-859 (1994); a JP-WA No. Hei 6-500233.

V poslednej dobe môže byť aplikovaná rozvinutá technika na produkciu proteinov získaných z človeka z mlieka transgénovej kravy alebo prasaťa (Nikkei Science, pp. 78-84 (apríl 1997)).

Výraz „časť protilátky“ použitý v predkladanom vynáleze znamená čiastočnú oblasť monoklonálnej protilátky, ako je spomínané a konkrétne znamená F (ab')₂, Fab', Fab, Fv (premenlivý fragment protilátky), sFv, dsFv (disulfidom stabilizovaný Fv) alebo dAb (jediná doména protilátky) (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol. 6, No. 5, pp. 441-456(1996)).

„F(ab')₂“ a „Fab'“ môžu byť produkované spracovaním imunoglobulínu (monoklonálnej protilátky) s proteázou takou ako pepsín a papaín a znamenajú fragment protilátky získaný digeráciou imunogblobulínu vedľa disulfidových väzieb v závesných oblastiach existujúcich medzi každými dvoma H reťazcami. Napríklad papaín štiepi IgG hornú skupinu disulfidových väzieb v závesných oblastiach existujúcich medzi každými dvoma H reťazcami na vytvorenie dvoch homologických fragmentov protilátky, v ktorej L reťazec zložený z V_L (L reťazec premenlivej oblasti) a C_L (L reťazec konštantnej oblasti) a H reťazec zložený z V_H (H reťazec premenlivej oblasti) a C_Hyl (γ 1 oblasť v konštantnej oblasti H reťazca) sú spojené pri ich C koncových oblastiach cez disulfidovú väzbu. Každá z takýchto dvoch fragmentov homologickej protilátky je nazývaná Fab'. Pepsín tiež štiepi IgG dolnú skupinu disulfidových väzieb v závesných oblastiach existujúcich medzi každými dvoma H reťazcami na vytvorenie fragmentu protilátky o trochu väčšieho než fragment, v ktorom dve spomínané Fab' sú spojené pri závesnej oblasti. Tento fragment protilátky sa nazýva F(ab')₂.

SK 288074 Β6 „Farmaceutická kompozícia“ podľa predkladaného vynálezu je farmaceutická kompozícia obsahujúca „protilátku“ definovanú skôr, konkrétne „protilátku, ktorá má účinnosť pri inhibícii proliferácie AILIM-exprimujúcich buniek alebo pri inhibícii produkcie cytokínu AILIM-exprimujúcimi bunkami“ ako aj farmaceutický prijateľný nosič. Konkrétne, farmaceutická kompozícia predkladaného vynálezu je farmaceutická kompozícia obsahujúca „protilátku“ a farmaceutický prijateľný nosič. Konkrétnejšie, farmaceutická kompozícia predkladaného vynálezu je farmaceutická kompozícia obsahujúca polyklonálnu protilátku, monoklonálnu protilátku alebo časť definovanej monoklonálnej protilátky a farmaceutický prijateľný nosič.

„Farmaceutický prijateľný nosič“ zahrnuje excipient, riedidlo, expander, rozkladné činidlo, stabilizátor, konzervačný prostriedok, pufer, emulgátor, aromatický prostriedok, farbivo, sladidlo, činidlo zvyšujúce vis10 kozitu, aromatický prostriedok, činidlo zvyšujúce rozpustnosť alebo iné prídavky. Použitím jedného alebo viacerých z týchto nosičov sa môže formulovať farmaceutická kompozícia do tabliet, piluliek, práškov, granúl, injekcií, roztokov, kapsúl, pastiliek, elixírov, suspenzií, emulzií alebo sirupov. Farmaceutická kompozícia môže byť podávaná orálne alebo parenterálne. Ďalšie formy na parenterálne podanie zahrnujú roztok na vonkajšiu aplikáciu, čapíky na rektálne podanie a pesary pripravené zvyčajnou metódou, ktoré obsahujú jed15 nu alebo viac aktívnych zložiek.

Dávka môže byť rozdielna v závislosti od veku, pohlavia, váhy a symptómu pacienta, účinku liečby, spôsobu podania, času liečby alebo druhu účinnej zložky (polypeptid alebo protilátka uvedená skôr) obsiahnutej vo farmaceutickej kompozícii. Zvyčajne, farmaceutická kompozícia môže byť podávaná dospelému jedincovi v dávke od 10 pg do 1000 pg (alebo 10 pg až 500 pg) na jedno podanie. V závislosti od rôznych podmie20 nok, menšia dávka ako tá, ktorá bola uvedená skôr, môže byť v určitých prípadoch dostačujúca a dávka väčšia než je tá, ktorá je uvedená skôr, môže byť nevyhnutná v iných prípadoch.

Konkrétne, injekčnú formu možno získať rozpustením alebo suspendovaním protilátky v netoxickom, farmaceutický prijateľnom nosiči, takom ako fyziologický roztok alebo komerčne dostupná destilovaná voda pre injekcie s upravovanou koncentráciou od 0,1 pg protilátky/ml nosiča do 10 mg protilátky/ml nosiča. Tak25 to získaná injekcia môže byť podávaná človeku, ktorý si vyžaduje liečbu v dávke 1 pg až 100 mg/kg telesnej váhy, výhodne 50 pg až 50 mg/kg telesnej váhy jeden alebo viackrát za deň. Príklady na spôsoby podania sú medicínsky vhodné spôsoby podania, také ako intravenózna injekcia, podkožná injekcia, vnútrokožná injekcia, vnútrosvalová injekcia alebo intraperitoneálna injekcia, výhodne vnútrožilová injekcia.

Injekcia môže byť pripravená s nevodným riedidlom (napríklad propylénglykol, polyetylénglykol, ras30 tlinný olej, taký ako olivový olej a alkohol, taký ako etanol) a ako suspenzia alebo emulzia.

Injekcia môže byť sterilizovaná filtráciou cez filter zachytávajúci baktérie, primiešaním bakteriocídu alebo ožiarením. Injekcia môže byť pripravená vo forme, ktorá sa pripraví pred použitím. Konkrétne sú to mrazením vysušené sterilné tuhé kompozície, ktoré môžu byť pred použitím rozpustené v sterilnej destilovanej vode určenej pre injekciu alebo v inom rozpúšťadle.

Farmaceutická kompozícia predkladaného vynálezu je vhodná na liečbu alebo profylaxiu rôznych autoimunitných ochorení, alergických ochorení alebo zápalových ochorení spôsobených aktiváciou lymfocytov takých ako T bunky a abnormalitou regulácie aktivovaných lymfocytových funkcií.

Terapeutický účinok farmaceutickej kompozície predkladaného vynálezu na symptómy rôznych ochorení môže byť testovaný zvyčajnou metódou podaním tejto kompozície známym chorým modelovým živočíchom.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje dráhu expresie pre CD3, CD28 a AILIM (alternatívne nazývanej ThA) v normál45 nom myšom týmuse získanom z T buniek.

Podobrázok (a) znázorňuje dráhu expresie CD3 a AILIM (alternatívne nazývanej ThA).

Podobrázok (b) znázorňuje dráhu expresie CD3 a CD28.

Obrázok 2 znázorňuje dráhu expersie CD28 a AILIM v normálnom myšom týmuse získanom z T buniek v každom štádiu diferenciácie T buniek, stupňovanú využitím expresie CD4 a CD8 ako indexu.

R2 až R8 znázorňujú nasledovné:

R2: Dráhu expresie pre AILIM a CD28 v CD4-negatívnych CD8- negatívnych T bunkách.

R3: Dráhu expresie pre AILIM a CD28 v CD4-slabo pozitívnych CD8- slabo pozitívnych T bunkách.

R4: Dráhu expresie pre AILIM a CD28 v CD4-pozitívnych CD8- pozitívnych bunkách.

R5: Dráhu expresie pre AILIM a CD28 v CD4-pozitívnych CD8-slabo pozitívnych T bunkách.

R6: Dráhu expresie pre AILIM a CD28 v CD4-pozitívnych CD8- negatívnych bunkách.

R7: Dráhu expresie pre AILIM a CD28 v CD4-slabo pozitívnych CD8- pozitívnych T bunkách.

R8: Dráhu expresie pre AILIM a CD28 v CD4-negatívnych CD8- pozitívnych T bunkách.

Obrázok 3 znázorňuje dráhu expresie pre AILIM v CD4-pozitívnych T bunkách obsiahnutých v normálnom myšom tkanive sleziny.

Obrázok 4 znázorňuje dráhu expresie pre AILIM v pečeňovom tkanive infiltrovanom CD4-pozitívnymi T

SK 288074 Β6 bunkami v hostiteľovi, ktorý trpí na hepatitídu.

Obrázok 5 znázorňuje dráhu expresie pre AILIM a CD28 vo všetkých CD4-pozitívnych T bunkách a CD4-negatívnych T bunkách obsiahnutých v periférnych krvných T bunkách a synoviálnych tekutinou infiltrovaných T bunkách pochádzajúcich z pacienta, ktorý trpí na reumatoidnú artritídu.

Obrázok 6 predstavuje dráhu expresie pre AILIM cez lymfatické tkanivo získané T bunky z normálnej myši aktivovanej stimuláciou rôznymi stimulátormi.

Obrázok 7 schematicky predstavuje dráhu expresie a rôzne vlastnosti pre AILIM v rôznych kmeňoch T buniek a hybridómoch získaných z T buniek z myši.

Obrázok 8 znázorňuje aktiváciu (indukciu IFNy produkcie) myších T buniek získaných zo sleziny pomocou prekríženia CD3 a AILIM realizovanú s využitím plante pokrytej anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou.

Obrázok 9 znázorňuje aktiváciu (indukciu IFNy produkcie) T buniek získaných z krysej sleziny pomocou prekríženia CD3 a AILIM realizovanú s využitím platne pokrytej anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou.

Obrázok 10 znázorňuje aktiváciu (indukciu IFNy produkcie) ľudských T buniek získaných z periférnej krvi pomocou prekríženia CD3 a AILIM realizovanú s využitím platne pokrytej anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou.

Obrázok 11 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na zvýšenie produkcie IFN γ, jedna z Τ’bunkových odpovedí, v T bunkách získaných z ľudskej periférnej krvi aktivovaných stimuláciou s anti-CD3 protilátkou.

Obrázok 12 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na zvýšenie produkcie IL-4, jedna z Tbunkových odpovedí, v T bunkách získaných z ľudskej periférnej krvi aktivovaných stimuláciou s anti-CD3 protilátkou.

Obrázok 13 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na zvýšenú produkciu IL-4, jedna z Tbunkových odpovedí, v T bunkách získaných z myšieho týmusu aktivovaných stimuláciou s anti-CD3 protilátkou.

Obrázok 14 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na zvýšenie produkcie IL-4, jedna z Tbunkových odpovedí, v T bunkách získaných z myšej sleziny aktivovaných stimuláciou s anti-CD3 protilátkou.

Obrázok 15 znázorňuje terapeutický účinok na opuchnutie končatiny, ktoré je parametrom artrózy v hostiteľovi, ktorý trpí na artrózu pomocou podávania anti-AILIM protilátky niekoľkokrát.

Obrázok 16 znázorňuje terapeutický účinok anti-AILIM protilátky na zvýšenú tvorbu IFNy, ktorý je parametrom zhoršeného stavu hostiteľa, ktorý trpí na hepatitídu.

Obrázok 17 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na zvýšenú tvorbu GPT a GOT, ktoré sú parametrom zhoršeného stavu hostiteľa, ktorý trpí na hepatitídu.

Obrázok 18 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na zvýšenú tvorbu IgG, ktorá je jednou z reakcií hostiteľ versus transplantát (GVH reakcie) pri ochorení hostiteľ versus transplantát (GVHD).

Obrázok 19 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na zvýšenú tvorbu IgE, ktorá je jednou z reakcií hostiteľ versus transplantát (GVH reakcie) pri ochorení hostiteľ versus transplantát (GVHD).

Obrázok 20 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na zvýšenie titra anti-dsDNA protilátky, ktoré je jednou z reakcií transplantát versus hostiteľ (GVH reakcie) v ochorení transplantát versus hostiteľ (GVHD).

Obrázok 21 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky in vivo pri imunizácii so SRBC, ktorá je cudzím antigénom pri tvorbe protilátky (podanej hneď po senzibilácii) proti cudziemu antigénu.

Obrázok 22 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky in vivo pri senzibilácii so SRBC, ktorá je cudzí antigén pri tvorbe protilátky (podanej 7. deň po antigénovej senzibilizácii) proti cudziemu antigénu.

Obrázok 23 schematicky znázorňuje dráhu expresie AILIM a CD28 v normálnych tkanivách (týmus, lymfatická uzlina a periférna krv) a v častiach s léziami.

Obrázok 24 znázorňuje dráhy expresie pre AILIM, CD28, CD4, CD8, CD 19 a CTLA-4 v T bunkách získaných z periférnej krvi normálnej zdravej osoby a v AILIM-pozitívnych bunkách separovaných z T buniek.

Podobrázok (a) znázorňuje distribúciu rôznych T buniek získaných z periférnej krvi.

Podobrázok (b) znázorňuje distribúciu AILIM-pozitívnych buniek izolovaných z T buniek získaných z periférnej krvi.

Podobrázok (c) znázorňuje dráhu expresie CD4 a CD8 v T bunkách získaných z periférnej krvi.

Podobrázok (d) znázorňuje dráhy expresie CD4 a CD8 v AILIM- pozitívnych bunkách separovaných z T buniek získaných z periférnej krvi.

Podobrázok (e) znázorňuje dráhy expresie AILIM a CD4 v T bunkách získaných z periférnej krvi.

Podobrázok (f) znázorňuje dráhy expresie AILIM a CD4 v AILIM- pozitívnych bunkách separovaných z T buniek získaných z periférnej krvi.

Podobrázok (g) znázorňuje dráhy expresie AILIM a CD28 v T bunkách získaných z periférnej krvi.

SK 288074 Β6

Podobrázok (h) znázorňuje dráhy expresie AILIM a CD28 v AILIM- pozitívnych bunkách separovaných z T buniek získaných z periférnej krvi.

Podobrázok (i) znázorňuje dráhy expresie AILIM a CTLA-4 v T bunkách získaných z periférnej krvi.

Podobrázok (j) znázorňuje dráhy expresie AILIM a CTLA-4 v AILIM- pozitívnych bunkách separovaných z T buniek získaných z periférnej krvi.

Podobrázok (k) znázorňuje dráhy expresie AILIM a CD 19 v T bunkách získaných z periférnej krvi.

Podobrázok (1) znázorňuje dráhy expresie AILIM a CD 19 v AILIM- pozitívnych bunkách separovaných z T buniek získaných z periférnej krvi.

Obrázok 25 znázorňuje intenzitu AILIM expresiu v T bunkách získaných z periférnej krvi normálnej zdravej osoby, v CD4-pozitívnej T bunke, v CD8- pozitívnych T bunkách, a v každých AILIM-pozitívnych bunkách separovaných z každých T buniek.

Podobrázok (a) znázorňuje intenzitu AILIM expresie v T bunkách periférnej krvi a v AILIM-pozitívnych bunkách separovaných z T buniek, respektíve.

Podobrázok (b) znázorňuje intenzitu AILIM expresie v CD4-pozitívnych T bunkách periférnej krvi, a v CD4-pozitívnych AILIM-pozitívných T bunkách separovaných z T buniek, respektíve.

Podobrázok (c) znázorňuje intenzitu AILIM expresie v CD8 pozitívnych T bunkách periférnej krvi a v CD8-pozitívnych AILIM-pozitívnych T bunkách separovaných z T buniek, respektíve.

Obrázok 26 znázorňuje dráhy expresie AILIM v T bunkách získaných z periférnej krvi a v T bunkách získaných zo synoviálnej tekutiny z pacienta trpiaceho na chronickú reumatoidnú artritídu (RA) a osteoartritídu (OA) a v T bunkách periférnej krvi z pacienta trpiaceho na progresívnu systémovú sklerózu (skleroderma; PSS) a systémový lupus erythemtosus (SLE), respektíve.

Obrázok 27 znázorňuje dráhy expresie AILIM v T bunkách (CD4- pozitívne T bunky, CD8-pozitívne T bunky) získaných z týmusu, sleziny, lymfatickej uzliny a periférnej krvi v modeli krysej artritídy vyvolanej prídavnou látkou.

Obrázok 28 znázorňuje dráhy expresie každej AILIM a CTLA-4 v T bunkách získaných z periférnej krvi normálnej zdravej osoby aktivovanej rôznymi stimulmi.

Podobrázok (a) znázorňuje intenzitu expresie AILIM v T bunkách aktivovaných stimuláciou s PMA a Ionofórom.

Podobrázok (b) znázorňuje intenzitu expresie CTLA-4 v T bunkách aktivovaných stimuláciou s PMA a Ionofórom.

Podobrázok (c) znázorňuje intenzitu expresie pre AILIM v CD4- pozitívnych T bunkách aktivovaných stimuláciou PMA a Ionofórom.

Podobrázok (d) znázorňuje intenzitu expresie pre CTLA-4 v CD4- pozitívnych T bunkách aktivovaných stimuláciou s PMA a Ionofórom.

Podobrázok (e) znázorňuje intenzitu expresie AILIM v T bunkách aktivovaných stimuláciou s buď antiCD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou alebo anti-CD3 protilátkou a anti-CD28 protilátkou.

Podobrázok (f) znázorňuje intenzitu expresie CTLA-4 v T bunkách aktivovaných stimuláciou buď anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou, alebo anti-CD3 protilátkou a anti-CD28 protilátkou.

Obrázok 29 znázorňuje indukciu produkcie rôznych cytokínov z T bunky periférnej krvi stimuláciou rôznymi protilátkami.

Obrázok 30 znázorňuje indukciu bunkovej proliferácie T bunky ľudskej periférnej krvi stimuláciou rôznymi protilátkami v rôznych koncentráciách.

Obrázok 31 znázorňuje indukciu bunkovej proliferácie v jej priebehu v T bunkách ľudskej periférnej krvi stimuláciou rôznymi protilátkami.

Obrázok 32 znázorňuje stupne bunkovej proliferácie v myších bunkách sleziny a v T bunkách získaných z myšej sleziny kultivovaných na mikroplatni pokrytej anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou.

Podobrázok (a) znázorňuje stupne proliferácie myších buniek sleziny.

Podobrázok (b) znázorňuje stupne proliferácie myších T buniek získaných zo sleziny.

Obrázok 33 znázorňuje stupne proliferácie myšej bunky sleziny kultivovanej s využitím mikrojamiek (konštantná koncentrácia) prekrytých anti-CD3 protilátkou (konštantná koncentrácia) a anti-AILIM protilátkou (rôzna koncentrácia).

Obrázok 34 znázorňuje stupne proliferácie myšej bunky sleziny kultivovanej s využitím mikrojamiek (rôzne koncentrácie) prekrytých anti-CD3 protilátkou (konštantná koncentrácia) a anti-AILIM protilátkou (konštantná koncentrácia).

Obrázok 35 znázorňuje stupne proliferácie každej T bunky získanej z myšej sleziny kultivovanej s využitím mikrojamiek (rôzne koncentrácie) prekrytých anti-CD3 protilátkou (konštantná koncentrácia) a antiAILIM protilátkou (konštantná koncentrácia).

Obrázok 36 znázorňuje indukciu bunkovej proliferácie T bunky získanej z krysej lymfatickej uzliny stimuláciou rôznymi protilátkami v rôznych koncentráciách.

Obrázok 37 znázorňuje terapeutický účinok jednotlivého podania (konštantná koncentrácia) anti-AILIM

SK 288074 Β6 protilátky na opuchnutie končatiny, ktoré je parametrom pre artrózu u hostiteľa trpiaceho na artrózu.

Obrázok 38 znázorňuje terapeutický účinok jednotlivého podania (rôzna koncentrácia) anti-AlLIM protilátky na opuchnutie končatiny, ktoré je parametrom pre artrózu u hostiteľa trpiaceho na artrózu.

Obrázok 39 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na zvýšenú produkciu IgG, ktorá je jednou z reakcií transplantát versus hostiteľ (GVH reakcie) v ochorení transplantát versus hostiteľ (GVHD).

Obrázok 40 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na zvýšenie tvorby IgE, ktorá je jednou z reakcií transplantát versus hostiteľ (GVH reakcie) v ochorení transplantát versus hostiteľ (GVHD).

Obrázok 41 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na zvýšenie titra anti-dsDNA protilátky, ktorá je jednou z reakcií transplantát versus hostiteľ (GVH reakcie) v ochorení transplantát versus hostiteľ (GVHD).

Obrázok 42 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky v hostiteľovi in vivo senzibilizovanom s NP-KLH, ktorá je cudzím antigénom pri tvorbe IgGl protilátky proti cudziemu antigénu.

Obrázok 43 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky v hostiteľovi in vivo senzibilizovanom s NP-KLH, ktorá je cudzí antigénom pri tvorbe IgM protilátky proti cudziemu antigénu.

Obrázok 44 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky v hostiteľovi in vivo senzibilizovanom s NP-KLH, ktorá je cudzím antigénom pri tvorbe IgGl protilátky proti cudziemu antigénu.

Obrázok 45 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky v hostiteľovi in vivo senzibilizovanom s NP-KLH, ktorá je cudzím antigénom pri tvorbe IgG2b protilátky proti cudziemu antigénu.

Obrázok 46 znázorňuje inhibičný účinok anti-AILIM protilátky v hostiteľovi in vivo senzibilizovanom s NP-KLH, ktorá je cudzím antigénom pri tvorbe IgG2a protilátky proti cudziemu antigénu.

Obrázok 47 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálnej zdravej osoby „donor A“ s PBMC normálnej zdravej osoby „donor D“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek počas zmiešaných lyfocytových reakcií (MLR).

Vertikálna os naznačuje množstvo inkorporácie (³H) tymidínu ako index ukazujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os naznačuje koncentráciu testovaných vzoriek.

Každý opis v obrázkoch predstavuje nasledovné:

„CD80+86“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „mlgGl“: Anti-ľudská CD34/IgGl myšia monoklonálna protilátka „CTLA4-Ig“: Ľudská CTLA4-IgFc chimérová molekula „SA 12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka.

Obrázok 48 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálnej zdravej osoby „donor D“ s PBMC normálnej zdravej osoby „donor B“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek počas zmiešanej lymfocytovej reakcii (MLR).

Vertikálna os naznačuje množstvo inkorporácie (³H) tymidínu ako index ukazujúci hladinu bunkovej proliferácie a horizontálna os naznačuje koncentráciu testovaných vzoriek.

Každý opis v obrázkoch predstavuje nasledovné:

„CD80+86“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „mlgGl“: Anti-ľudská CD34/IgGl myšia monoklonálna protilátka „CTLA4-Ig“: Ľudská CTLA4-IgFc chimérová molekula „SA 12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka.

Obrázok 49 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálnej zdravej osoby „donor C“ s PBMC normálnej zdravej osoby „donor A“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek počas zmiešanej lymfocytovej reakcie (MLR).

Vertikálna os naznačuje množstvo inkorporovaného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os naznačuje koncentráciu testovaných vzoriek.

Každý opis v obrázkoch naznačuje nasledovné:

„CD80+86“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „mlgGl“: Anti-ľudská CD34/IgGl myšia monoklonálna protilátka „CTLA4-Ig“: Ľudská CTLA4-IgFc chimérová molekula „SA 12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka

Obrázok 50 naznačuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálnej zdravej osoby „donor E“ s PBMC normálnej zdravej osoby „donor G“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek počas zmiešanej lymfocytovej reakcie (MLR).

Vertikálna os naznačuje množstvo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os naznačuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Každý opis v obrázkoch znamená nasledovné:

„kontrolné mlgG“: Anti-ľudská CD34/IgGl myšia monoklonálna protilátka „CD80+86Ab“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „SA12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka „CTLA4-Ig“: Ľudská CTLA4-IgFc chimérová molekula.

SK 288074 Β6

Obrázok 51 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálnej zdravej osoby „donor F“ s PBMC normálnej zdravej osoby „donor E“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek počas zmiešanej lymfocytovej reakcie (MLR).

Vertikálna os naznačuje množstvo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os naznačuje koncentráciu testovacích vzoriek.

Každý opis v obrázkoch znázorňuje nasledovné:

„kontrolná mlgG“: Anti-ľudská CD34/IgGl myšia monoklonálna protilátka „CD80+86Ab“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „SA 12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka „CTLA4-Ig“: Ľudská CTLA4-IgFc chimérová molekula.

Obrázok 52 znázorňuje inhibičný účinok na T bunkovú proliferáciu v prípade kultivácie T buniek z normálnej zdravej osoby „donor G“ s PBMC normálnej zdravej osoby „donor F“ pomocou rôznych testovacích vzoriek v proliferačnom teste T buniek počas zmiešanej lymfocytovej reakcie (MLR).

Vertikálna os naznačuje množstvo začleneného (³H) tymidínu ako index znázorňujúci stupeň bunkovej proliferácie a horizontálna os naznačuje koncentráciu testovaných vzoriek.

Každý opis v obrázkoch predstavuje nasledovné:

„kontrolná mlgG“: Anti-ľudská CD34/IgGl myšia monoklonálna protilátka „CD80+86Ab“: Zmes anti-CD80 protilátky a anti-CD86 protilátky „SA 12“: Anti-ľudská AILIM myšia monoklonálna protilátka „CTLA4-Ig“: Ľudská CTLA4-IgFc chimérová molekula.

Najlepší spôsob na vysvetlenie vynálezu

Predkladaný vynález je objasnený detailnejšie pomocou odkazov na príklady, ale tieto príklady nie sú uvedené, aby limitovali predkladaný vynález.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava experimentálnych materiálov

Pokiaľ nie inak uvedené, experimentálne materiály (živočíchy, protilátky, bunky) používané v opísaných testoch boli pripravené nasledovne.

(1-1) Živočíchy

C57BL/6 myš (samec, 5 až 8 týždňov starý) a BALB/c myš (samec, 5 až 8 týždňov starý) boli zakúpené z JAPAN SLC. Wistar krysy (samec, 5 až 6 týždňov starý) boli zakúpené z Charles River Japan Inc.

(1-2) Príprava anti-krysích AILIM monoklonálnych protilátok

Hybridómy označené „JTT-1“ a JTT-2“ vhodné na produkciu myšej anti- krysej AILIM monoklonálnej protilátky (myší anti-krysí JTT-1 antigén monoklonálnej protilátky), ktoré boli skôr vytvorené a publikované pôvodcami, boli uložené medzinárodne (11. októbra 1996, obidva hybridómy boli uložené medzinárodne v The National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, The Agency of Industrial Science and Technology, The Ministry of International Trade and Industry (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan (Zip code: 305-8566), ktoré sú medzinárodné depozitáme autority pod Budapeštianskou zmluvou). Monoklonálne protilátky čistené z kultivačných supematantov „JTT-1“ (medzinárodné prístupové číslo FERM BP-5707) a „JTT-2“ (medzinárodné prístupové číslo FERM BP-5708) in vitro alebo in vivo, alebo z tekutiny nahromadenej v pobrušnicovej dutine boli použité v opísaných testoch (JP-A 11-29599 (príklady 1 a 2), a WO98/38216 (príklady 1 a 2).

Neskôr sa tieto myšie anti-krysie AILIM monoklonálne protilátky označili ako „JTT-1 protilátka“ a „JTT-2 protilátka“ alebo respektíve (IgGl). V niektorých prípadoch, „JTT-1 protilátka“ a „JTT-2 protilátka“ sa tiež označujú ako „JMab49“ a „JMab50“.

Pokiaľ nie je uvedené inak, anti-krysia AILIM protilátka používaná v nasledujúcich testoch je „JTT-2 protilátka“ (tiež označovaná ako JMab50; IgGl).

(1-3) Príprava anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky

Všetky hybridómy menovite „SA12“ a „SG430“ produkujúce myšiu anti- ľudskú AILIM monoklonálnu protilátku (myšia anti-ľudský JTT-1 antigén monoklonálnej protilátky), ktoré boli skôr vytvorené a uvedené pôvodcami, boli dané na 1CR nu/nu myš (samica, 7 až 8 týždňov stará) pomocou intraperitoneálnej injekcie (10⁶ až 10⁷ buniek/0,5 ml/myš pre každý hybridom). Po 10 až 20 dňoch po injekcii sa zozbierala tekutina nahromadená v pobrušnici z každej myši pomocou laparotómie pod anestéziou v súlade s bežne používanou metódou. Respektíve myšie anti-ľudské AILIM monoklonálne protilátky boli pripravené vo veľkom rozsahu (JP-A11-29599 (príklad 12) a WO 98/38216 (príklad 12)).

Neskôr, tieto dva typy myších anti-ľudských AILIM monoklonálnych protilátok boli označené ako „SA 12 protilátka“ (IgGl) a „SG430 protilátka“ (IgGl). Boli použité v testoch opísaných neskôr.

SK 288074 Β6 (1-4) Príprava anti-myších AIL1M monoklonálnych protilátok

Protilátky boli pripravené nasledovne:

V súlade s bežne používanou metódou využívajúcou sa v technikách génovej rekombinácie, transformovaná bunka vhodná na expresiu myšej AILIM bola pripravená použitím cDNA kódujúcej celú dĺžku aminokyselinovej sekvencie myšej AILIM (myší JTT-1 antigén) (JP-A 1 1-29599 (SEQ ID NO: 5), a WO98/38216 (SEQ ID NO: 5)), ktorá mal byť predtým klonovaná pôvodcami.

Transformované bunky boli homogenizované, a potom vystavené ultracentrifugácii (100 000 x g). Výsledný precipitát obsahujúci frakciu bunkovej membrány bol opätovne získaný, a potom suspendovaný v PBS. Spoločne s Freundovým komplentným prostriedkom získaná frakcia bunkovej membrány bola daná Wistar krysám pomocou injekcie na primárnu imunizáciu (0 deň). Bunkovo membránový antigén bol opakovane daný krysám pomocou injekcie na siedmy deň, štrnásty deň a dvadsiaty ôsmy deň po primárnom podaní. Dva dni po konečnej imunizácii sa získali bunky lymfatickej uzliny z krýs.

Bunky lymfatickej uzliny boli zmiešané s myšími bunkami myelómu PAI (JCR No. B0113; Res. Disclosure, Vol. 217, pp.155, 1982) v pomere 5 : 1. Bunky boli fuzované na každú inú použitím polyetylén glykolu 4000 (Boehringer Mannheim) ako fúzneho činidla na vytvorenie hybridómov schopných produkovať monoklonálne protilátky. Selekcia hybridómu bola vykonávaná kultiváciou fuzovaných buniek v ASF104 médiu (Ajinomoto) obsahujúcom v HAT, 10 % teľacieho séra a aminopterín.

Reaktivita proti myšiemu AILIM (myší JTT-1 antigén) každej monoklonálnej protilátky v kultivačnom supematante hybridóma bola testovaná nasledovne: kultivačný supematant sa nechal reagovať s transformovanými bunkami exprimujúcimi spomínanú rekombinantnú myšiu AILIM, a potom boli bunky ďalej nechané reagovať s FITC-označeným anti-krysím IgG (Cappel); fluorescenčné intenzity sfarbených buniek boli merané v EPICS- ELITE prietokovom cytometri. Skríning priniesol mnohonásobné hybridómy schopné produkovať monoklonálne protilátky reagujúce na myší AILIM (myší JTT-1 antigén).

Z nich vybrané dva odlišné hybridómy boli označené „B 10.5“ a „B9B6“. Každý z hybridómov (10⁶ až 10⁷ buniek/0,5 ml/myš) bol pridaný ku ICR nu/nu myši (samica, 7 až 8 týždňov stará) pomocou intraperitoneálnej injekcie. 10 až 20 dní po injekcii sa zozbierala tekutina nahromadená v pobrušnici myši pomocou laparotómie pod anestéziou v súlade s bežne používanou metódou. Krysie anti-myšie AILIM monoklonálne protilátky boli pripravené vo veľkom rozsahu. Neskôr tieto dva typy krysích anti-myších AILIM monoklonálnych protilátok produkovaných „B 10.5“ a „B9B6“ hybridómami boli označené ako „B 10.5 protilátka“ (IgG2a) a „B9B6 protilátka“ (IgG2a). Dve protilátky boli použité v testoch opísaných neskôr.

(1-5) Príprava lymfocytov

Myši boli usmrtené dekapitáciou. Potom sa odstránili v súlade s bežne používanou metódou týmus a periférne lymfatické tkanivá (slezina a lymfatická uzlina). Tkanivá boli narezané na malé štvorčeky pomocou sita z nehrdzavejúcej ocele. Bunková suspenzia bola pripravená suspendovaním tkanivových štvorčekov v RPMI1640 médiu obsahujúcom 10 % fetálneho teľacieho séra (FCS). Suspenzie bunky (1 x 10⁷ až 3 x 10⁷ buniek/ml) boli umiestnené na platňu, a potom kultivované počas 2 hodín v CO₂ inkubátore. Po kultivácii boli zozbierané, neadhezívne bunky boli opatrne premiestnené z platne, a potom premyté RPMI 1640 médiom. Myšie bunky boli teda získané z rôznych tkanív.

Krysie bunky z rôznych tkanív boli takisto pripravené z týmusu a periférnych lymfatických tkanív (slezina a lymfatická uzlina) tou istou metódou, ako bola opísaná skôr.

Ľudské periférne krvné T bunky (z normálnych zdravých osôb a pacientov) boli pripravené v súlade s bežne používanou metódou. Konkrétne, heparínová krvná vzorka získaná z normálnej zdravej osoby alebo pacienta bola vystavená spracovaniu separáciou s lymfoprep (Nycomed) na získanie periférnych krvných monojadrových buniek. Následne, T bunky boli premiestnené použitím Pan T Celí Izolačného kitu (Miltenyi).

(1-6) Príprava zavedených T bunkových línií

Nasledujúce testy boli vykonávané použitím rôznych línií myšej T bunky (D 10, MS202, CD28KO, EL-4, 2L2 a BC3C13) rovnako ako rôznych hybridómov získaných z T bunky (KV24, DO.l 1.10, 8-4-31, 3H10-11, 61-21-25, 1-2-66 a 6-13-64), ktoré vznikli z myšieho hybridómu získaného z T bunky BW5147, všetky boli stanovené týmito pôvodcami.

Príklad 2

Analýza AILIM expresie v bunkách z rôznych tkanív a rôznych bunkových línií

Experimenty bunky farbením a prietokovým cytometrom boli uskutočňované na analyzovanie rozdielov v expresii AILIM v bunkách normálnych a chorých tkanív živočíchov (myš, krysa alebo človek), rozdielov v expresii AILIM medzi nestimulovanými T bunkami a stimulovanými T bunkami (aktivované T bunky) rovnako ako medzi rôznymi T bunkovými líniami bežne dostupnou metódou.

Na základe výsledkov získaných v opísanom teste, expresia AILIM v tkanivách a bunky boli porovnané s CD28. Porovnanie je schematicky znázornené na obrázku 23. Ale, treba brať do úvahy, že schematická ilustrácia je len ako príklad; pričom ilustrácia by mala byť braná len ako limitované objasnenie údajov získa17

SK 288074 Β6 ných z uvedených testov.

(2-1) Bunkové farbenie a prietoková cytometria

Pokiaľ nie je uvedené inak, analýzy pomocou bunkového farbenia a prietokovej cytometrie boli vykonávané nasledovne:

Bunky pripravené z rôznych tkanív pomocou opísaných metód rovnako ako T bunky alebo rôzne t bunkové línie nestimulované alebo stimulované pomocou stimulujúcich látok (anti-CD3 protilátka, ConA alebo PMA a ionofór atď.) boli resuspendované vo fosfátovom pufri (Ca²⁺, Mg²⁺- voľné PBS; PBS-) obsahujúcom 0,5 % hovädzí sérový albumín (BSA) a 5 mM EDTA. Následne, primárna protilátka vybraná z tých, ktoré sú uvedené, (A) alebo (B), bola pridaná ku bunkovej suspenzie a zmes bola inkubovaná pri 4 °C počas 30 minút:

(A) Označené protilátky spomínaných rôznych AILIM protilátok (anti- myšie AILIM protilátky, antikrysie AILIM protilátky, anti-ľudské AILIM protilátky), ktoré sú označené s FITC alebo fycoerytrínom (PE).

(B) Neoznačené protilátky spomínaných rôznych AILIM protilátok (anti-myšie AILIM protilátky, antikrysie AILIM protilátky, anti-ľudské AILIM protilátky).

Následne boli bunky premyté 3-krát so spomínaným fosfátovým pufrom, a potom boli resuspendované v tom istom pufri.

Keď použitá primárna protilátka bola neoznačená anti-AILIM protilátka (konkrétne, jedna zo spomínaných (B) protilátok), potom ďalej bola pridaná FITC-, PE- alebo biotínom označená anti-myšia protilátka alebo anti-krysia lg protilátka ako sekundárna protilátka ku bunkovej suspenzii. Suspenzie boli inkubované tým istým spôsobom, ako je opísané skôr.

Ak sekundárna protilátka bola biotínom označená protilátka, potom bol pridaný PE označený streptavidín (Pharmingen) ku bunkovým suspenziám, ktoré boli potom inkubované tým istým spôsobom, ako je opísané. Potom sa bunky resuspendovali v spomínanom fosfátovom pufri.

Veľkosti sfarbených buniek pomocou spomínanej metódy a ich fluorescenčné intenzity boli merané vo FACSort (Becton Dekinson). Distribúcia AILIM expresie bola analyzovaná použitím Lysis II softvéru.

(2-2) Analýza AILIM expresie v myších T bunkách odvodených od týmusu

Expresia AILIM v T bunkách izolovaných z myšieho týmusu, čo je normálne lymfatické tkanivo, bola analyzovaná v súlade s tou istou metódou, ako bola opísaná v bode (2-1). V tom istom čase boli uskutočňované podobné merania na analýzu korelácie medzi expresiou AILIM a expresiou iných molekúl (CD3 molekula pracujúca v primárnej signalizácii na T bunku, CD28 molekula pracujúca v sekundárnej stimulačnej signalizácii, CD4 a CD8, ktoré sú T bunkové povrchové markery).

Výsledky sú znázornené na obrázkoch 1 a 2. Nové závery naznačované neskôr boli získané na základe tohto výsledku.

Prvý záver bol získaný s ohľadom na koreláciu medzi expresiou CD3 molekuly a AILIM molekuly a to, že stupne expresie AL1M sú vysoké v bunkách, kde stupne CD3 expresie sú vysoké; a teda stupne expresie dvoch molekúl sú korelačné ku iným (obrázok l(a)). V kontraste k prvej menovanej molekule stupeň expresie kostimulačnej molekuly CD28 bol nižší, tak ako stupeň expresie CD3 bol vyšší (obrázok l(b)). Tieto výsledky poukazujú na to, že expresia AILIM a CD28 prejavuje recipročnú koreláciu s CD3 aspoň v normálnych T bunkách týmusu.

Diferenciáciu a maturáciu týmusovej T bunky je možné dosiahnuť prostredníctvom nasledujúcich hlavných krokov.

(1) CD4-negatívna CD8-negatívna bunka (R2 v obrázku 2) diferencuje na CD4-slabo pozitívnu CD8-slabo pozitívnu bunku (R3 v obrázku 2), pričom expresia každej molekuly je zreteľne slabá.

(2) CD4-slabo pozitívna CD8-slabo pozitívna bunka (R3 v obrázku 2) diferencuje na CD4-pozitívnu CD8-pozitívnu bunku (R.4 v obrázku 2), pričom obidve molekuly sú silno exprimované.

(3) Expresia ktorýchkoľvek CD4 a CD8 molekúl je znížená (R5 alebo R7 v obrázku 2) prostredníctvom pozitívnej selekcie; každý typ bunky eventuálne diferencuje na CD4-pozitívnu CD8-negatívnu (R6 v obrázku 2) alebo na CD4-negatívnu CD8-pozitívnu (R8 v obrázku 2) bunku a maturácia je teda kompletná.

Ani AILIM, ani CD28 boli zreteľne exprimované v CD4-negatívnych CD8-negatívnych bunkách, ale slabé stupne expresie boli pozorované v CD4 slabo pozitívnych CD8 slabo pozitívnych bunkách. Expresia CD28 bola maximalizovaná v CD4-pozitívnych CD8-pozitívnych bunkách, a potom bola znížená, ak bunky boli ďalej diferenciované na zrelé.

Inými slovami, v CD4-pozitívnych CD8-pozitívnych bunkách bola prítomná len nízko-stupňová expresia AILIM. Stupeň AILIM expresie bol však zvýšený v priebehu následných bunkových diferenciačných procesoch; konkrétne ak stupeň CD4 alebo CD8 expresie je znížený, stupeň AILIM expresie bol zvýšený, a potom maximalizovaný v konečnom diferenciačnom štádiu lymfocytu, ktorého pozitívna selekcia je kompletná; zrelý lymfocyt sa nazýva SP bunka (CD4-pozitívna CD8-negatívna bunka alebo CD4-negatívna CD8-pozitívna bunka).

Experimentálne výsledky naznačujú, že expresia AILIM je rozdielna od CD28 s ohľadom na koreláciu expresie CD4 a CD8 tak ako aj CD3.

(2-3) Analýza AILIM expresie v T bunkách získaných z myších normálnych lymfatických tkanív.

Expresia AILIM v T bunkách sleziny a lymfatickej uzline, ktoré sú myšie normálne lymfatické tkanivá, bola analyzovaná uvedenou metódou.

Výsledok je znázornený na obrázku 3.

Populácia AILIM-pozitívnej T bunky vnútri T buniek získaných zo sleziny je menšia než v týmuse; a percentuálna hodnota bola asi 1 až 3 %. Väčšina AILIM-pozitívnych buniek bola CD4-pozitívne a CD8-negatívne.

Expresia AILIM v T bunkách lymfatickej uzliny a percentuálna hodnota populácie bola porovnateľná s tými, ktoré sú uvedené v T bunkách odvodených zo sleziny.

(2-4) Analýza AILIM expresie v T bunkách získaných z infikovaných tkanív modelu hepatitídy myši.

Hepatitídový model bol pripravený nasledovne:

Suspenzia Propionibacterium acnes (P. acnes; 5 mg/ml) vo fosfátovom pufri (PBS-; 0,2 ml) bola intravenózne injektovaná do chvosta C57BL/6 myši. Po jednom týždni roztok LPS (lipopolysacharid; 1,5 gg/ml) vo fosfátovom pufri (PBS-; 0,2 ml) bol intravenózne injektovaný do myši na vyvolanie hepatitídy. Myš bola použitá ako hepatitídový živočíšny model.

6,5 hodín po podaní LPS bola odstránená pečeň z myši; T bunky boli pripravené z buniek pomocou spomínanej metódy na analyzovanie AILIM expresie.

Výsledok je znázornený na obrázku 4.

Stupeň expresie AILIM bol vysoko zvýšený v T bunkách (monojadrové bunky) získaných z pečeňového tkaniva hepatitídového myšieho modelu; väčšina T buniek bola exprimovaných AILIM v zreteľne vysokých stupňoch. Stupeň AILIM expresie v T bunkách získaných z pečene hepatitídového modelu bol značne vyšší než v T bunkách získaných z lymfatickej uzliny normálnej myši.

(2-5) Analýza AILIM expresie v T bunkách získaných z periférnej krvi z normálnych zdravých osôb.

Analýzy využívajúce prietokový cytometer boli uskutočňované na odhadnutie stupňov expresie AILIM v T bunkách získaných z periférnej krvi z normálne zdravých osôb a v ľudských monojadrových bunkách izolovaných zo vzoriek periférnej krvi získaných z normálne zdravých osôb a rovnako tiež expresie rôznych bunkových povrchových markérov na bunkách. Periférne krvné T bunky z normálne zdravých osôb boli pripravené pomocou uvedenej metódy.

Na druhej strane, AILIM-exprimujúce T bunky (AILIM-pozitívne bunky) boli získané nasledovne: frakcia monojadrových buniek separovaných z periférnej krvi zo zdravej osoby bola suspendovaná v PBS, ktoré obsahovalo 0,5 % BSA a 5mM EDTA a k nej bola pridaná anti-AILIM protilátka (SG430; 50 gg). Zmes bola inkubovaná pri 4 °C počas 30 minút. Následne potom boli bunky premyté 3-krát tým istým pufrom a k tomu boli pridané mikrokvapky s imobilizovaným kozím anti-myším IgG (100 až 500 gl; Miltenyi). Zmes bola inkubovaná tým istým spôsobom, a potom premytá tým istým pufrom. V nasledujúcom kroku bunky boli spracovávané použitím magnetickej separačnej kolóny (dvakrát) v súlade so zvyčajnou metódou izolácie AILIM-pozitívnych buniek. Izolované AILIM-pozitívne bunky boli zafarbené každou z rôznych označených protilátok a anti-AILIM protilátok; zafarbené bunky boli analyzované prietokovým cytometrom.

Výsledky sú znázornené na obrázku 24.

Periférne krvné T bunky sú primáme zoskupené do CD4-pozitívnych CD8-negatívnych buniek a CD4-negatívnych CD8-pozitívnych buniek. V dvojnásobnom farbiacom teste s FITC-označenou anti-AILIM protilátkou (SA 12) a anti-CD4 protilátkou bola prítomná hlavne expresia AILIM v CD4- pozitívnych bunkách. Dvojnásobné farbenie test s anti-AILIM protilátkou a anti-CD28 protilátkou ukázalo, že takmer všetky AILIM-pozitívne bunky získané z periférnej krvi exprimovali CD28. Percentuálna hodnota populácie AILIM-pozitívnej bunky v periférnych krvných T bunkách bola zhruba odhadnutá na 0,5 až 5 %.

Na druhej strane, nasledujúce závery boli získané na základe analytických výsledkov pre povrchové markery AILIM-pozitívnych buniek priamo separovaných z frakcie mononukleámych buniek ľudskej periférnej krvi:

(1) väčšina AILIM-pozitívnych buniek boli CD4-pozitívne CD8-negatívne bunky;

(2) medzi AILlM-pozitívnymi bunkami bola zreteľná prítomnosť CD4- negatívnych CD8-negatívnych buniek ako aj CD4-negatívnych CD8- negatívnych buniek, ale ich populácie boli malé;

(3) dvojnásobé farbenie anti-AILIM protilátkou a anti-CD28 protilátkou dokazuje, že väčšina AILIM-pozitívnych buniek exprimuje CD28, a preto väčšina AILIM-pozitívnych buniek bola pridelená k triede T bunky;

(4) niektoré AILIM-pozitívne bunky boli sfarbené protilátkou proti CD 19, ktorá je B bunkový povrchový marker. Toto naznačuje, že B bunky tiež slabo exprimujú AILIM;

(5) expresia CTLA4, ktorá je kostimulačnou molekulou, bola dokázaná vo viacerých AILIM-pozitívnych bunkách.

Okrem toho bola vykonávaná analýza na odhadnutie stupňa expresie AILIM v T bunkách periférnej krvi a AILIM-pozitívnych bunkách.

Výsledok je znázornený na obrázku 25.

SK 288074 Β6

Keď bola porovnávaná expresia AILIM v AILIM-pozitívnych bunkách s v T bunkách periférnej krvi, piky boli posunuté pri rozdielnych pozíciách, z ktorých vyplýva, že stupeň expresie AILIM je vyšší v AILIM-pozitívnych bunkách.

Ďalej, podobná porovnávacia analýza bola vykonávaná medzi CD4- pozitívnymi bunkami a CD8-pozitívnymi bunkami. Podobné stupne AILIM expresie boli pozorované medzi dvoma frakciami. Populácia CD8-pozitívnych buniek medzi AlLIM-pozitívnymi bunkami bola malá, ale stupeň expresie AILIM v CD8-pozitívnych bunkách bol podobný s tým vo zvyšných bunkách.

(2-6) Analýza AILIM expresie v T bunkách z pacientov trpiacich na rôzne artritídy alebo autoimunitné ochorenia

Expresia AILIM a časť AILIM-exprimujúcich buniek boli analyzované v T bunke pacientov s artritídou (reumatoidná artritída (RA) a osteoartritída (OA)) alebo autoimunitnými ochoreniami (progresívna systémová skleróza (PSS) a systémový lupus erythematosus (SLE)) v súlade so spomínanou metódou.

T bunky boli separované zo synoviálnej tekutiny a periférnej krvi pacientov s artritídou; T bunky boli tiež izolované z periférnej krvi pacientov s autoimunitným ochorením. T bunky periférnej krvi zo zdravých normálnych osôb boli použité ako kontrola.

Výsledok je znázornený na obrázkoch 5 a 26.

Expresia AILIM v T bunkách získaných z periférnej krvi z RA pacientov bola porovnaná s bunkami zo zdravých normálnych osôb. Stupne expresie neboli jednoznačne rozdielne medzi pacientmi a normálnymi osobami v CD4- pozitívnych T bunkách a tiež v CD4-negatívnych T bunkách (konkrétne CD4- negatívne CD8-pozitívne T bunky).

Ale, populácia AILIM-exprimujúcich buniek bola jednoznačne zvýšená medzi CD4-pozitívnymi T bunkami a tiež medzi CD4-negatívnymi T bunkami v T bunkách získaných zo synoviálnych tekutín RA pacientov. Obzvlášť, priemerný podiel AILIM-exprimujúcich buniek bol zvýšený na asi 20 % z celkových CD4-pozitívnych buniek. Ďalej bolo nájdené, že stupeň expresie AILIM bol jednoznačne zvýšený v CD4-pozitívnych T bunkách a CD4- negatívnych T bunkách zo synoviálnych tekutín RA pacientov v porovnaní s tou v CD4-pozitívnych bunkách a CD4-negatívnych T bunkách získaných z periférnej krvi zdravých normálnych osôb. Stupeň expresie CD28 nebol zmenený v CD4-pozitívnych T bunkách z RA pacientov.

Na druhej strane, v jedinom prípade OA pacienta, populácia AILIM- pozitívnej bunky bola zreteľne zvýšená medzi CD4-pozitívnymi bunkami získanými zo synoviálnej tekutiny.

Populácia AILIM-pozitívnych buniek medzi CD4-negatívnymi T bunkami z periférnej krvi pacientov s autoimunitným ochorením bola porovnateľná s tou medzi bunkami zo zdravých normálnych osôb. Ale, populácia AILIM- pozitívnej bunky bola jednoznačne zvýšená medzi CD4-pozitívnymi T bunkami PSS pacientov v porovnaní s tou medzi bunkami zo zdravých normálnych osôb.

(2-7) Analýza AILIM expresie v krysom modeli artritídy vyvolanej adjuvans.

Ako adjuvans boli použité mŕtve tuberkulózne bacily (M. Tuberculosis H37Ra; Difco) 10 mg/ml v kvapalnom parafíne (Wako čistá chemikália). Adjuvans bolo intravenózne injikované do Wistar krýs (samec, 5 týždňov starý, Charles River) v koncentrácii 1 mg/0,1 ml/jednotlivo do zadnej časti chvosta na vyvolanie artritídy. Objem zadných nôh bol meraný použitím pletysmometra. Určený objem bol použitý ako index na začiatok artritídy.

Týmus, slezina, lymfatická uzlina a periférna krv boli zachytávané po podaní adjuvans (0 deň). Suspenzie T bunky boli pripravené v súlade s uvedenou metódou. T bunky boli sfarbené anti-CD4 protilátkou, anti-CD8 protilátkou a anti-AILIM protilátkou pomocou uvedenej metódy. Potom bola analyzovaná expresia CD4, CD8 a AILIM prietokovým cytometrom.

Kontrolné T bunky boli získané z týmusu, sleziny, lymfatickej uzliny a periférnej krvi normálnych krýs.

Výsledok je znázornený na obrázku 27.

V expresii AILIM v CD4-pozitívnych T bunkách a CD8-pozitívnych T bunkách z týmusu, sleziny a periférnej krvi neboli zreteľné rozdiely v porovnaní s kontrolnými bunkami.

Na druhej strane, populácia AILIM-pozitívnej bunky bola podstatne zvýšená medzi CD4-pozitívnymi T bunkami získanými z lymfatickej uzliny ako aj medzi CD8-pozitívnymi T bunkami v porovnaní s tou medzi kontrolnými bunkami. Konkrétne, expresia AILIM dosiahne úroveň piku na piaty deň po podaní adjuvans v CD4-pozitívnych T bunkách.

(2-8) Analýza odlišného stupňa AILIM expresie spojená s myšou T bunkovou aktiváciou.

Myšie T bunky získané z lymfatických tkanív boli aktivované za rôznych podmienok. Bol analyzovaný rôzny stupeň AILIM expresie spojený s T bunkovou aktiváciou.

T bunky boli aktivované pomocou pridania anti-CD3 protilátky (konečná koncentrácia: 1 až 10 pg/ml), konkanavalínu A (ConA; konečná koncentrácia: 1 až 5 pg/ml) alebo PMA (forbol myristát acetát; konečná koncentrácia: 20 ng/ml) a Ca ionofóru (konečná koncentrácia: 200 ng/ml) do suspenzie T buniek v 10 % FCS obsahujúcom RPMI1640 médium na stimuláciu. Expresia AILIM bola analyzovaná v čase (po 0, 6, 12, 24 a 48 hodinách) po podaní aktivujúceho činidla.

Výsledok je znázornený na obrázku 6.

SK 288074 Β6

AILIM expresia začala byť regulovaná asi 3 až 6 hodín po stimulácii za určitých aktivačných podmienok a bola maximalizovaná 12 hodín po stimulácii. Stupeň AILIM expresie zostal vysoký asi 24 hodín po stimulácii a vysoký stupeň bol tiež udržiavaný 48 hodín po stimulácii.

(2-9) Analýza indukcie AILIM expresie spojená s ľudskou T bunkovou aktiváciou

T bunky boli získané z periférnej krvi zdravých normálnych osôb tým istým spôsobom, ako je opísané; boli aktivované spôsobom (A) alebo (B), ako je opísané neskôr. Analýza bola vykonávaná pre T bunkovú aktiváciu- spojenú expresiu AILIM a CTLA-4, ktorá je kostimulačnou molekulou.

(A) T bunková aktivácia pomocou PMA a Ca ionofóru

PMA (konečná koncentrácia: 20 ng/ml) a Ca ionofór (konečná koncentrácia: 200 ng/ml) boli pridané ako aktivujúce činidlá do suspenzie ľudských T buniek (1 x 10⁵ buniek) v 10 % FCS-obsahujúcom RPMI1640 médium na stimuláciu. Osem hodín po pridaní aktivujúcich činidiel expresia AILIM a CTLA-4 bola analyzovaná pomocou prietokového cytometra.

(B) T bunková aktivácia pomocou anti-CD3 protilátky/anti-AILIM protilátky alebo anti-CD3 protilátky/anti-CD28 protilátky

Alikvoty roztokov (1) anti-CD3 protilátky (kloň OKT3; 200 ng/jamka) a anti-AILIM protilátky (kloň SA12; 1 pg/jamka) alebo roztokov (2) anti-CD3 protilátky (kloň OKT3; 200 ng/jamka) a anti-CD28 protilátka (kloň CD28.2; 1 pg/jamku) boli zriedené v D-PBS a boli pridané do každej jamky z 96 jamkovej mikroplatne a platňa bola inkubovaná pri izbovej teplote 3 hodiny. Platňa bola teda prekrytá každou protilátkou.

Suspenzia ľudských T buniek získaných z periférnej krvi (1 x 10⁵ buniek/ml, 0,1 ml/jamku) v 10 % FCS obsahujúcom RPMI1640 médium bola pridaná do každej platne. Bunky boli zbierané po kultivácii po 2 až 3 dňoch. Expresia AILIM a CTLA-4 bola analyzovaná použitím prietokového cytometra v súlade so spomínanou metódou.

Výsledok je znázornený na obrázku 28.

Značne vysoký stupeň AILIM expresie bol vyvolaný 8 hodín po stimulácii T bunkovej aktivácie s PMA a ionofórom. Stupeň expresie bol oveľa vyšší než CTLA-4 expresia, ktorá bola tiež vyvolaná stimuláciou. Ďalej, AILIM expresia bola vyvolaná skoro vo všetkých T bunkách. Ďalej, dvojnásobný farbiaci test pre CD4 a AILIM alebo pre CD8 a AILIM ukázal, že aktivácia vyvolala podstatný stupeň AILIM expresie v CD4-pozitívnych T bunkách rovnako ako v CD8-pozitívnych T bunkách.

Na druhej strane, nasledujúce výsledky boli získané v aktivačnom teste s použitím mikroplatne, ktorá bola prekrytá anti-CD3 protilátkou/anti-AILIM protilátkou alebo anti-CD3 protilátkou/anti-CD28 protilátkou.

(1) Značne vysoký stupeň AILIM expresie bol vyvolaný v T bunkách aktivovaných pomocou anti-CD3 protilátky/anti-AILIM protilátky rovnako ako v T bunkách aktivovaných pomocou anti-CD3 protilátky/antiCD28 protilátky. Stupeň indukcie expresie bol vyšší v T bunkách aktivovaných pomocou anti-CD3 protilátky/anti-CD28/ protilátky než v T bunkách aktivovaných pomocou anti-CD3 protilátky/anti-AILIM protilátky.

(2) Expresia CTLA-4 bola vyvolaná v T bunkách aktivovaných anti-CD3 protilátkou/anti-AILIM protilátkou rovnako ako v T bunkách aktivovaných anti-CD3 protilátkou/anti-CD28 protilátkou. Ale v stupni indukovanej expresie medzi T bunkami aktivovanými anti-CD3 protilátkou/anti-AILIM protilátkou a bunkami aktivovanými anti-CD3 protilátkou/anti-CD28 protilátkou neboli významnejšie rozdiely.

(2-10) Analýza AILIM expresie v rôznych T bunkových líniách

T bunkové línie sú známe tým, že sú získané značnou spontánnou imortalizáciou alebo ako T bunkové línie sú imortalizované chemickým činidlom alebo ako T bunkový hybridom pomocou fúzie T bunky s bunkou myelómu. T bunkové línie sú zoskupované do dvoch tried založených na vlastnosti cytokínovej produkcie, konkrétne Thl-typ T bunkových línií a Th2-typ T bunkových línií.

Expresia AILIM a CD28 v rôznych známych myších T bunkových líniách, ako je opísané v (1-6), bola analyzovaná prietokovým cytometrom pomocou tej istej metódy, ako je opísaná skôr.

Výsledok je znázornený na obrázku 7.

AILIM dokázateľne exprimovaný konštitutívne v T bunkových líniách prejavujúcich vlastnosť Th2-typu T bunkovej línie s ohľadom na produkciu cytokínu (D 10, MS202, CD28KO, EL-4 atd’.). Stupeň AILIM expresie bol porovnateľný alebo vyšší vzhľadom na CD28 v týchto bunkových líniách.

Na druhej strane, expresia AILIM nebola potvrdená, aj keď stupeň CD28 expresie bol vyšší v Thl-type T bunkových líniách okrem 6-13-64.

Príklad 3

Analýza aktivity modulujúcej T bunkovú odpoveď anti-AILIM protilátky

Bolo analyzované, či anti-AILIM protilátka predkladaného vynálezu účinná v modulácii (zvýšení a/alebo supresii) T bunkovej odpovede (tvorba cytokínu takého ako IFN-γ a IL-4, bunková proliferácia atď.) alebo nie, konkrétne bolo analyzované, či protilátka má schopnosť regulovať transdukciu AILIM-sprostredkovanú kosimulačným signálom do bunky. Analýza bola vykonávaná použitím množstiev cytokínov (IFN-γ a IL-4) produkovaných bunkami.

(3-1) Metóda testovania

V závislosti od cieľa testu boli pripravené jedna alebo dva typy protilátok (anti-CD3 protilátka samotná, anti-CD28 protilátka samotná, anti-CD3 protilátka a anti-AILIM protilátka, alebo anti-CD3 protilátka a antiCD28 protilátka), ďalej boli selektované a pridané do jamiek 96-jamkovej mikroplatne. Platňa bola inkubovaná pri 37 °C počas 1 hodiny alebo viacerých, aby sa pokryla platňa jednou alebo dvoch protilátok. Platňa bola potom dostatočne premytá PBS. Následne, bunky týmusu (5 x 10⁵ bunky/jamku), bunky sleziny (2 x 10⁵ bunky/jamka) alebo čisté T bunky (1 x 10⁵ až 3 x 10⁵ bunky/jamku), ktoré boli pripravené uvedenou metódou, boli pridané do platne.

V teste, v ktorom platňa nebola predtým pokrytá anti-AILIM protilátkou alebo anti-CD28 protilátkou, ale akékoľvek protilátky boli jednoducho pridané do platne neskôr, protilátka bola pridaná do plame po vytvorení povlaku buniek. Ďalej, CTLA4-Ig (fuzny proteín medzi rozpustnou oblasťou CTLA4 a IgFc) bola pridaná ako kontrolná namiesto anti-AILIM protilátky v teste. Test bol vykonávaný v súlade s tou istou metódou.

Platňa bola inkubovaná počas 2 až 4 dní v CO₂ inkubátore. Koncentrácie cytokínov (IFN-λ alebo IL-4) v kultivačnom supematante boli určené pomocou bežnej metódy ELISA. Ďalej, stupeň bunkovej proliferácie v priebehu kultivácie bol vyhodnotený pomocou bežnej metódy s použitím tymidínu označeného tríciom (³H-TdR).

(3-2) Analýza indukcie cytokínovej produkcie z T buniek cez transdukciu kostimulačného signálu sprostredkovanú anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou do buniek.

Bolo dokázané, že T bunky produkujú špecifické cytokíny v odpovedi na T bunkový receptorom sprostredkovaný primárny signál a sekundárny signál sprostredkovaný kostimulačnými molekulami takými ako CD28 a CTLA-4.

Tvorba rôznych cytokínov indukovaná stimuláciou rôznymi protilátkami bola analyzovaná použitím periférnych krvných T buniek, buniek týmusu alebo buniek sleziny izolovaných z myši, krysy a človeka v súlade s uvedenou spomínanou testovacou metódou, ako je opísaná v (3-1).

(3-2-1) Indukcia IFNy v T bunkách získaných z myšej sleziny.

T bunky získané z myšej sleziny boli pridané ku (1) mikroplatni prekrytej anti-CD3 protilátkou (kloň 145-201; Pharmingen: 0 až 3 pg/ml) a anti-CD28 protilátkou (kloň CD28.2; 1 pg/jamku); (2) ku mikroplatni prekrytej anti CD3-protilátkou a anti-myšou AILIM protilátkou (kloň B 10.5; 1 pg/jamku) a (3) ku mikroplatni prekrytej len anti-CD3 protilátkou.

Platne boli inkubované na kultiváciu buniek, a potom množstvá IFNy v kultivačnom supematante boli určené ELISA.

V teste (2) roztok anti-AILIM protilátky bol pridaný potom, ako sa pridali bunky.

Výsledok je znázornený na obrázku 10.

Dokonca ak sa koncentrácia anti-AILIM protilátky zvýšila až na 20 pg/ml, nebola dokázaná indukcia IFNy produkcie v bunkách v teste, v ktorom boli pridané T bunky do mikroplatne prekrytej anti-CD3 protilátkou s konštantnou koncentráciou a po pridaní buniek sa pridal roztok anti-AILIM protilátky.

Na druhej strane bol nájdený značne vysoký stupeň indukcie v produkcii IFNy v ľudských T bunkách kultivovaných na mikroplatni prekrytej aj anti-CD3 protilátkou a aj anti-AILIM protilátkou, keď koncentrácia anti-AILIM protilátky bola 5 pg/ml alebo vyššia.

Taktiež sa zistilo, že produkcia cytokínu a bunková proliferácia boli zvýšené v T bunkách v prípade, ak T bunky získané z periférnej krvi boli stimulované Con A alebo PMA, a potom boli kultivované na platni prekrytej aj anti-AILIM protilátkou a anti-CD3 protilátkou tým istým spôsobom, ako bol uvedený. Výsledok bol v podstatne ten istý ako ten, čo sa získal, ak T bunky získané z periférnej krvi boli stimulované Con A alebo PMA, a potom kultivované na platni prekrytej aj anti CD28 protilátkou, aj anti CD3 protilátkou.

(3-2-4) Indukcia produkcie TNFa, IFNy, IL-2, IL-4 a IL-10 v T bunkách získaných z periférnej krvi človeka.

T bunky získané z periférnej krvi z dvoch nesúvisiacich zdravých normálnych donorov boli pridané do (1) mikroplatne prekrytej samotnou anti- CD3 protilátkou (kloň OKT3; 200 ng/jamku); do (2) mikroplatne prekrytej samotnou anti-CD28 protilátkou (kloň CD28.2; 1 pg/jamku); do (3) mikroplatne prekrytej antiľudskou AILIM protilátkou (kloň SA 12; 1 pg/jamku); do (4) mikroplatne prekrytej anti-CD3 protilátkou a anti-CD28 protilátkou; do (5) mikroplatne prekrytej anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou; do (6) mikroplatne prekrytej anti-CD3 protilátkou, anti-AILIM protilátkou a anti-CD28 protilátkou. Platne boli inkubované na kultiváciu buniek a potom množstvo TNFa (faktor tumorovej nekrózy -a), IFNy (interferón-y), IL-2 (interleukín-2), IL-4 (interleukín-4) a IL-10 (interleukín-10) v kultivačnom supematante bolo merané v čase (18, 40 a 64 hodín) pomocou testu ELISA.

Malo by byť zrejmé, že TNFa, IFNy a IL-2 sú cytokíny produkované T bunkami Thl typu a IL-4 a IL-10 sú cytokíny produkované bunkami typu Th2.

Výsledok je znázornený na obrázku 29. Bol získaný nasledujúci výsledok:

(1) Medzi donormi neboli rozdiely v stupňoch indukcie TNFa, IFNy a IL-2 produkcie.

(2) Stupne TNFa a IFNy produkcie boli indukované, ak stimulácia bola vykonaná samotnou anti-CD3 protilátkou.

SK 288074 Β6 (3) Stupne indukcie TNFa a IFNy produkcie boli zvýšené pomocou stimulácie anti-CD3 protilátky a antiCD28 protilátky alebo pomocou anti-CD3 protilátky a anti-AILIM protilátky v porovnaní s tými, ktoré boli stimulované pomocou samotnej anti-CD3 protilátky.

(4) Vzhľadom na IL-2, produkcia bola indukovaná pomocou stimulácie s anti-CD3 protilátkou a antiCD28 protilátkou, s anti-CD3 protilátkou a anti- AILIM protilátkou alebo s anti-CD3 protilátkou, anti-CD28 protilátkou a anti-AILIM protilátkou. Stupeň indukovanej IL-2 produkcie bol najvyšší pomocou stimulácie s anti-CD3 protilátkou, anti-CD28 protilátkou a anti-AILIM protilátkou.

(5) Vzhľadom na IL-4 a IL-10, ktoré sú Th2 cytokíny, sú rozdiely v indukcii produkcie medzi dvoma donormi. Toto naznačuje možnosť, že rozdiely odrážajú rozdiel v populácii T buniek medzi ľudskými jednotlivcami.

(6) Vzhľadom na IL-4 produkcia bola indukovaná pomocou stimulácie s anti-CD3 protilátkou a anti-CD28 protilátkou, s anti-CD3 protilátkou a anti- AILIM protilátkou alebo s anti-CD3 protilátkou, anti-CD28 protilátkou a anti-AILIM protilátkou. Stupeň indukcie v IL-4 produkcii bol najvyšší pomocou stimulácie s anti-CD3 protilátkou, anti-CD28 protilátkou a anti-AILIM protilátkou.

(7) Vzhľadom na IL-10 produkcia bola indukovaná pomocou stimulácie s anti-CD3 protilátkou a anti-CD28 protilátkou, s anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou alebo s anti-CD3 protilátkou, anti-CD28 protilátkou a anti-AILIM protilátkou. Stimulácia anti-CD28 protilátkou a anti-AILIM protilátkou viedla k produkcii IL-10 v značne vysokom stupni. Ďalej, stupeň indukcie v 1L-10 produkcii bol najvyšší pomocou stimulácie s troma protilátkami a to anti-CD3 protilátkou, anti-CD28 protilátkou a anti-AILIM protilátkou.

Spomínaný test naznačuje, že anti-CD3 protilátka imobilizovaná na platni fungovala ako MHC na bunku s prítomným antigénom a tiež anti-AILIM protilátka imobilizovaná na platni fungovala ako AILIM ligand, čo viedlo k tomu, že primárny signál a sekundárny stimulačný signál (kostimulačný signál), ktoré sú zodpovedné za aktiváciu T bunky, boli transdukované do pridaných T buniek.

(3-3) Inhibícia, pomocou anti-AILIM protilátky, indukcie cytokínovej produkcie ako T bunková odpoveď vyvolaná pomocou CD3-sprostredkovaného signálu

Bolo testované, či každá anti-AILIM protilátka a anti-CD28 protilátka by bola schopná inhibovať indukciu IFNy a IL-4 produkcie ako T bunkovú odpoveď vyvolanú, ak T bunky boli kultivované na mikroplatni prekrytej anti-CD3 protilátkou alebo nie.

T bunky získané z periférnej krvi, T bunky získané z týmusu alebo T bunky získané zo sleziny boli premiestnené na mikroplatňu prekrytú samotnou anti-CD3 protilátkou, a potom jedna z anti-AILIM protilátky (rôzne koncentrácie), anti-CD28 protilátky (rôzne koncentrácie) alebo CTLA4-IgFc (kontrola) bola k nim pridaná. Množstvá IFNy alebo IL-4 v kultivačnom supematante boli určené v súlade so spôsobom opísaným skôr v (3-1).

Výsledok je znázornený na obrázkoch 11 až 14.

Prídavok anti-AILIMm protilátky značne inhiboval produkciu aj IFNy a aj IL-4 indukovanú pomocou stimulácie anti-CD3 protilátky v T bunkách získaných z periférnej krvi (obrázky 11 a 12). Prídavok anti-AILIM protilátky tiež inhiboval proliferáciu buniek. Na druhej strane, prídavok anti-CD28 protilátky neinhiboval ani cytokínovú produkciu, ani bunkovú proliferáciu.

Prídavok anti-AILIM protilátky zreteľne inhiboval produkciu IL-4 indukovanú anti-CD3 protilátkou v T bunkách získaných z týmusu (obrázok 13). Prídavok anti-AILIM protilátky tiež inhiboval bunkovú proliferáciu. Na druhej strane, prídavok CTLA4-IgFc ako kontroly tiež neviedol ani k významnej inhibícii IL-4 produkcie, ani k inhibícii bunkovej proliferácie.

Prídavok anti-AILIM protilátky výrazne inhiboval produkciu IL-4 vyvolanú anti-CD3 protilátkou v T bunkách získaných zo sleziny (obrázok 14). Prídavok anti-AILIM protilátky tiež inhiboval bunkovú proliferáciu. Na druhej strane, prídavok CTLA4-IgFc ako kontroly neviedol k ani významnej inhibícii IL-4 produkcie, ani k významnej inhibícii bunkovej proliferácie.

(3-4) Analýza indukcie T bunkovej proliferácie cez transdukciu kostimulačného signálu sprostredkovaného anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou do T bunky.

T bunky sa proliferujú ako odpoveď na primárny signál sprostredkovaný T bunkovým receptorom a na sekundárny signál sprostredkovaný kostimulačnými molekulami takými ako CD28 a CTLA-4.

Proliferácia buniek vyvolaná pomocou stimulácie rôznymi protilátkami bola analyzovaná použitím T buniek získaných z periférnej krvi zdravých normálnych osôb, z buniek myšej sleziny, z T buniek získaných z myšej sleziny a z T buniek získaných z krysej lymfatickej uzliny v súlade s uvedenou testovacou metódou, ako je opísaná v (3-1).

(3-4-1) Indukcia proliferácie ľudských T buniek získaných z periférnej krvi.

Ľudské T bunky získané z periférnej krvi boli pridané do (1) mikroplatne prekrytej samotnou anti-CD3 protilátkou (kloň OK.T3; 200 ng/jamku; Ortho Diagnostic Systems); do (2) mikroplatne prekrytej anti-CD3 protilátkou a anti- CD28 protilátkou (kloň CD28.2; rôzne koncentrácie; Pharmingen); do (3) mikroplatne prekrytej anti-CD3 protilátkou (200 ng/jamku) a anti-AILIM protilátkou (kloň SA12; rôzne koncentrácie); a do (4) mikroplatne prekrytej anti-CD3 protilátkou (200 ng/jamku), anti-ľudskou protilátkou (rôzne koncen23

SK 288074 Β6 trácie) a anti-CD28 protilátkou (1 pg/jamku). Platne boli inkubované na kultivovanie buniek, a potom stupeň bunkovej proliferácie bol zisťovaný v čase pomocou testu s tymidínom označeným tríciom (³H-TdR), ktorý bol do tymidínu začlenený bežne používanou metódou.

Výsledok je znázornený na obrázku 30. Výsledok tohto testuje nasledovný:

(i) Proliferácia ľudských T buniek získaných z periférnej krvi nebola významne zvýšená žiadnou z uvedených stimulácií (2) až (4). Proliferácia bola závislá od koncentrácie anti-AILIM protilátky alebo anti-CD28 protilátky imobilizovanej na platni.

(ii) Maximálne stupne indukovanej T bunkovej proliferácie boli porovnateľné so stimuláciami v uvedených platniach (2) až (4) prekrytých protilátkou.

Následne na to stupeň T bunkovej proliferácie bol zisťovaný použitím mikroplatní, ako je naznačené neskôr v (5), (6) a (7) tým istým spôsobom, ako bol opísaný, na účely zistenia časového priebehu proliferácie T buniek získaných z ľudskej periférnej krvi indukovaných pomocou stimulácie uvedenými rôznymi protilátkami.

(5) Mikroplatňa prekrytá anti-CD3 protilátkou (200 ng/jamku) a anti-CD28 protilátkou (1 pg/jamku); (6) mikroplatňa prekrytá anti-CD3 protilátkou (200 ng/jamku) a anti-AILIM protilátkou (1 pg/jamku); a (7) mikroplatňa prekrytá anti-CD3 protilátkou (200 ng/jamku), anti-ľudskou AILIM protilátkou (1 pg/jamku).

Výsledok je znázornený na obrázku 31.

Proliferácia T buniek bola sledovaná 18 hodín po stimulácii nejakými kombináciami protilátky. Stimulácia kombináciou anti-CD3 protilátky a anti-CD28 protilátky (ako je opísaná v (5)) vyvolala najvyšší stupeň T bunkovej proliferácie 40 hodín po protilátkovej stimulácii, ale aktivita vyvolanej T bunkovej proliferácie skôr dosiahla rovnováhu kombináciou.

Na druhej strane, stupeň T bunkovej proliferácie vyvolaný stimuláciou anti-CD3 protilátkou a anti-A1LIM protilátkou (ako je opísané v (6)) alebo trojicou protilátok (ako je opísané v (7)) dosiahol pík 60 hodín po stimulácii. V týchto dvoch typoch kombinácií T bunková proliferácia vyvolaná 60 hodín po stimulácii protilátkami bola významne vyššia než tá proliferácia vyvolaná kombináciou anti-CD3 protilátkou a anti-CD28 protilátkou.

(3-4-2) Indukcia proliferácie myších buniek sleziny a myších T buniek získaných z myšej sleziny.

(3-4-2-1) Indukcia bunkovej proliferácie v mikroplatniach s imobilizovanou protilátkou.

jamkové mikroplatne boli prekryté anti-CD3 protilátkou (kloň 145- 2C11; Pharmingen; 50 ng/jamku). Potom boli ďalej platne prekryté rôznymi koncentráciami anti-myšej AILIM protilátky (kloň B 10.5) alebo anti-NP-KLH protilátkou ako kontrolnou protilátkou. Bunky myšej sleziny alebo T bunky získané z myšej sleziny boli pridané do jamiek platní prekrytých každou protilátkou. Platne boli inkubované na kultiváciu buniek, a potom stupeň bunkovej proliferácie bol monitorovaný pomocou testu s tymidínom označeným tríciom (³H-TdR) začleneným v súlade s bežne používanou metódou.

Anti-NP-KLH protilátka použitá ako kontrolná protilátka bola pripravená použitím antigénu NP-KLH, ktorý je KLH (keyhole limpet hemocyanín; PIERCE) spojený väzbou s NP (Nitrophenol), ktorý je haptén. Výsledok je znázornený na obrázku 32.

Stimulácia anti-NP-KLH protilátkou použitou ako kontrolná protilátka neviedla ani k proliferácii myších buniek sleziny, ani k prolyferácii T buniek získaných z myšej sleziny. Na druhej strane, významná proliferácia v závislosti od koncentrácie anti-AILIM protilátky bola pozorovaná vo všetkých bunkách, ak boli stimulované anti-AILIM protilátkou.

(3-4-2-2) Indukcia bunkovej proliferácie použitím protilátkou imobilizovaných mikrokvapiek (Časť 1)

Namiesto mikroplatne bola použitá ako nosič latexová mikrokvapka, na ktorej je imobilizovaná protilátka. Test bunkovej proliferácie bol vykonávaný použitím kvapky tým istým spôsobom, ako je opísaný skôr.

V D-PBS, 1 x 10⁷ mikrokvapky boli spracované po (1) 1 pg/ml anti-CD3 protilátkou (kloň 145-201; Pharmingen) a rôznymi koncentráciami anti-AILIM protilátky (kloň B 10.5) alebo po (2) 1 pg/ml anti-CD3 protilátkou a rôznymi koncentráciami anti-NP-KLH protilátky. Zmesi obsahujúce kvapky boli inkubované 1 alebo viac hodín, a potom kvapky boli premyté D-PBS. Protilátky boli teda imobilizované na kvapkách.

C57BL/6 myšie bunky sleziny (1 x 10⁵/bunku) suspendované v 10 % FCS- obsahujúcom RPMI1640 médiu boli pridané do každej jamky 96-jamkovej mikroplatne a k nim boli potom pridané kvapky (1 x 10⁵ častíc/jamku). Zmes bola inkubovaná 56 hodín. Stupeň bunkovej proliferácie po reakcii bol určovaný pomocou tymidínu, ktorý bol označený tríciom (³H-TdR) začleneným do tymidínu bežným spôsobom.

Výsledok je znázornený na obrázku 33.

Proliferácia C57BL/6 myších buniek sleziny bola vyvolaná buď stimuláciou anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou, alebo stimuláciou anti-CD3 protilátkou a anti-CD28 protilátkou. Stupeň bunkovej proliferácie bol zvýšený v závislosti od zvýšenej koncentrácie anti-AILIM protilátky alebo anti-CD28 protilátky imobilizovanej na kvapkách (zvýšenie pomeru koncentrácie anti-AILIM protilátky alebo anti-CD28 protilátky oproti koncentrácii anti-CD3 protilátky). Stupeň bunkovej proliferácie bol maximalizovaný, keď pomer koncentrácie anti-CD3 protilátky oproti koncentrácii anti-AILIM protilátky a pomer koncentrácie anti-CD3 protilátky oproti koncentrácii anti-CD28 bol 1 : 9.

(3-4-2-3) Indukcia bunkovej proliferácie pomocou využitia protilátky imobilizovanej mikrokvapkami (Časť

SK 288074 Β6

2)

Vychádzajúc z výsledku opísaného v (3-4-2-2), proliferácia myších buniek bola analyzovaná tým istým spôsobom, ako bol opísaný použitím latexových kvapiek prekrytých protilátkami za podmienky, kedy obidva pomery koncentrácie anti-CD3 protilátky oproti koncentrácii anti-AILIM protilátky a koncentrácie anti-CD3 protilátky oproti koncentrácii anti-CD28 protilátky boli 1 : 9.

Tento test bol realizovaný použitím rôznych koncentrácií protilátky, ktorá prekrýva mikrokvapky, ktorá bola pridaná do suspenzie bunky myšej sleziny (1 x 10⁵ buniek/jamku).

Ďalej, myšie bunky použité v teste boli BALB/C myšie bunky sleziny a BALB/C T bunky získané z myšej sleziny.

V tomto teste bol kontrolný experiment podobne vykonávaný použitím mikrokvapiek, na ktorých bola imobilizovaná samotná anti-CD3 protilátka.

Výsledok je znázornený na obrázkoch 34 a 35.

Proliferácia obidvoch BALB/C myších buniek sleziny a BALB/C T buniek získaných z myšej sleziny bola indukovaná buď po (1) stimuláciou samotnou anti-CD3 protilátkou; po (2) stimuláciou anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou; alebo po (3) stimuláciou anti-CD3 protilátkou a anti-CD28 protilátkou.

Stupeň bunkovej proliferácie sa zvýšil v závislosti od zvýšenej koncentrácie mikrokvapiek (konkrétne, koncentrácie protilátky) pridanej do bunkovej kultúry.

Proliferácia obidvoch BALB/C myšej bunky sleziny a BALB/C T bunky získanej z myšej sleziny bola maximalizovaná, ak koncentrácia mikrokvapky pridanej do bunkovej kultúry bola 30 000 častíc/jamku. Ten istý výsledok bol získaný použitím mikrokvapiek prekrytých anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou rovnako ako použitím mikrokvapiek prekrytých anti-CD3 protilátkou a anti-CD28 protilátkou.

(3-4-3) Indukcia proliferácie T buniek krysej lymfatickej uzliny

T bunky krysej lymfatickej uzliny (1 x 10⁵ bunky/jamku) suspendované v RPMI1640 médium obsahujúcom 10 % FCS sa pridali do (1) mikroplatne prekrytej anti-CD3 protilátkou (kloň G4.18; 50 ng/jamku) a anti-CD28 protilátkou (kloň JJ319; rôzne koncentrácie; Pharmingen); do (2) mikroplatne prekrytej anti-CD3 protilátkou (50 ng/jamku) a anti-AILIM protilátkou (rôzne koncentrácie) a do (3) mikroplatne prekrytej anti-CD3 protilátkou (50 ng/jamku) a negatívnou kontrolnou protilátkou MOPC21 (rôzne koncentrácie; Pharmingen). Platne boli inkubované na účely kultivácie buniek pri 37 °C počas 44 hodín. Šesť hodín pred koncom kultivácie sa pridal tymidín označený tríciom (³H-TdR) do každej jamky v koncentrácii 0,5 pCi/jamku. Potom sa získala kultúra, zozbierali sa bunky a vykonala sa kvantitatívna analýza množstva tymidínu označeného tríciom (³H-TdR), ktoré sa začlenilo do buniek v zariadení TOPCOUNT (PACKARD). Stupeň bunkovej proliferácie bol analyzovaný na základe začleneného množstva ako indexu.

Výsledok je znázornený na obrázku 36. Nasledujúci výsledok bol získaný v tomto teste.

Aj keď proliferácia T buniek krysej lymfatickej uzliny nebola indukovaná pomocou samotnej anti-CD3 protilátky, proliferácia bola podstatne zvýšená dokonca buď stimuláciou anti-CD3 protilátkou a anti-AILIM protilátkou, alebo stimuláciou anti-CD3 protilátkou a anti-CD28 protilátkou. Proliferácia závisí od koncentrácie anti-AILIM protilátky alebo anti-CD28 protilátky, ktoré boli imobilizované na platni.

Príklad 4

Terapeutický účinok anti-AILIM protilátky na artrózu (4-1) Test s mnohonásobným podaním anti-AILIM protilátky 10 mg/ml mŕtveho tuberkulózneho bacilu (M. Tuberculosis H37Ra; Difco) v kvapalnom parafíne bol použitý ako adjuvans. Adjuvans bol podkožné injektovaný do krýs Wistar (samce, 5 týždňov staré, Charles River Inc.) v dávke 0,1 ml/jednotlivca (1 mg/0,1 ml/jednotlivca) do zadnej časti chvosta na vyvolanie artrózy. Sedem dní po podaní adjuvans (0 deň) objem obidvoch zadných nôh bol meraný použitím plethysmometra. Krysy boli rozdelené do skupín (8 jedincov v každej skupine) na základe objemu obidvoch zadných nôh ako indexu.

Siedmy deň po podaní adjuvans (0 deň), anti-krysia AILIM protilátka (JTT-2 protilátka; tiež označená ako JMab50; 20 mg/kg) bola vnútrožilne podaná krysám patriacim do jednej zo skupín. Po primárnom podaní bola protilátka opakovane podávaná dvakrát za týždeň v priebehu časovej periódy začínajúcej na 20 deň. Použitím plethysmometra bol meraný objem zadných nôh v čase od primárneho podania adjuvans.

Kontrolný experiment bol vykonávaný v skupine normálnych krýs (4 jedince), ktorým neboli podané ani adjuvans, ani protilátka a v negatívnej kontrolnej skupine krýs, ktorým bola podaná myšia anti-ľudská CETP protilátka (kloň JHC1; tiež označený ako JMablO9; JP-A 9-20800) namiesto anti-krysej AILIM protilátky. Objem zadných nôh bol meraný použitím plethysmometra tým istým spôsobom.

Výsledok je znázornený na obrázku 15.

Neočakávane bolo úplne potlačené svrbenie labiek v skupine, ktorej bola podaná anti-AILIM protilátka; pozorovaný výsledok je v podstate ten istý ako ten, ktorý bol pozorovaný v skupine normálnych krýs, v ktorej nebola vyvolaná artritída.

(4-2) Test s jednotlivým podaním anti-AILIM protilátky (časť 1)

Na základe uvedeného výsledku terapeutický účinok jednotlivého podania anti-AILIM protilátky na artri25 tídu bol pozorovaný tým istým spôsobom, ako je opísaný skôr.

V tomto teste anti-AILIM protilátka alebo negatívna kontrolná protilátka bola vnútrožilovo podaná len raz na tretí, piaty alebo siedmy deň po podaní adjuvans (0 deň); boli použité anti-AILIM protilátka a negatívna kontrolná protilátka, respektíve anti-krysia AILIM protilátka (JTT-2 protilátka; tiež označená ako JMab50; 20 mg/kg) a anti-krysia CETP protilátka (JHC1; 20 mg/kg).

Výsledok je znázornený na obrázku 37.

Podanie anti-AILIM protilátky prebehlo len raz, ale svrbenie labiek bolo podstatne potlačené v určitých prípadoch, kde protilátka bola podaná raz na tretí, piaty alebo siedmy deň po podaní adjuvans. Konkrétne, v skupine, ktorej bola podaná anti-AILIM protilátka na siedmy deň po podaní adjuvans, bolo svrbenie labiek skoro úplne inhibované. Stupeň inhibície bol v podstate ten istý ako v skupine normálnych krýs, ktorým nebola vyvolaná artritída.

(4-3) Test s jednotlivým podaním anti-AILIM protilátky (časť 2)

Na základe výsledku opísaného v odseku (4-2), účinné dávkovanie anti-AILIM protilátky v terapii artritídy bolo skúmané na modeli artritídy v teste podľa toho istého spôsobu, ako je opísaný skôr.

V tomto teste anti-krysia AILIM protilátka (JTT-2 protilátka; tiež označovaná ako JMab50) 1, 3, 10 alebo 20 mg/kg bola vnútrožilovo podaná len raz na siedmy deň po podaní adjuvans.

Ďalej, okrem JTT-2, ďalšia anti-krysia AILIM protilátka (JTT-1; tiež označovaná ako JMab-49; 20 mg/kg) bola podávaná len raz tým istým spôsobom na porovnanie.

Ako negatívna kontrola anti-krysia CETP protilátka (JHC 1; 20 mg/kg) bola vnútrožilovo podaná len raz.

Výsledok je znázornený na obrázku 38.

Vždy keď bola anti-AILIM protilátka podaná len raz v dávke 1,3, 10 alebo 20 mg/kg, svrbenie labiek bolo skoro úplne inhibované. Stupeň svrbenia labiek bol inhibovaný v podstate na tej istej úrovni v skupine normálnych krýs, ktorým nebola vyvolaná artritída. Neočakávane, protilátka preukázala inhibičný účinok vždy pri veľmi nízkej dávke 1 mg/kg.

Príklad 5

Terapeutický účinok anti-AILIM protilátky na hepatitídu

Roztok P. acnes (Propionibacterium acnes) vo fosfátovom pufŕi (PBS) bol vnútrožilovo podaný C57BL/6 myšiam. Jeden týždeň po podaní P. acnes (0 deň) roztok LPS (Lipopolysacharid) v PBS bol vnútrožilovo podaný myši na vyvolanie hepatitídy. 6,5-hodín po LPS podaní bola zachytená krv z očného pozadia, a potom plazmatická koncentrácia IFN-γ bola určená pomocou testu ELISA. Koncentrácie plazmatického GOT (glutámová-oxaloctová transamináza) a GPT (glutámová-pyruvátová transamináza) boli merané v biochemickom analyzére (Fara).

1, 2 a 3 dni po podaní P. acnes (0 deň), anti-myšia AILIM monoklonálna protilátka (B 10.5 protilátka; 5, 50 alebo 500 pg/jednotlivca) bola intraperitoneálne podaná myši, a potom bol skúmaný zmierňujúci účinok anti- AILIM protilátky na hepatitídu.

Anti-myšia AILIM protilátka nebola podávaná kontrolnej skupine.

Výsledok je znázornený na obrázkoch 16 a 17.

Podanie anti-AILIM protilátky v podstate inhibuje zvýšenie hladiny IFN-γ v krvi. Podanie anti-AILIM protilátky (50 pg/jednotlivec) tiež podstatne inhibovalo zvýšenie hladín GOT a GPT.

Príklad 6

Terapeutický účinok anti-AILIM protilátky na ochorenie transplantát versus hostiteľ (GVHD) (6-1) Test 1

Indukované GVHD, BALB/c myšie bunky sleziny (8 x 10⁷ buniek/jednotlivec) boli vnútrožilovo podané F1 myšiam (8 až 10 týždňov staré, 3 jedince), pričom boli získané vykrvácaním BALB/c myši a C57BL/6 myši. Hneď a 12 hodín po podaní buniek sleziny (0 hodina), anti-myšia AILIM monoklonálna protilátka (B 10.5 protilátka; 400 pg/jednotlivec) bola vnútrožilovo podaná myši. 24, 48 a 72 hodín po podaní buniek sleziny, B 10.5 protilátka (200 pg/jedinec) bola intraperitoneálne podaná myši.

Hneď, 1, 2, 3 a 6 týždňov po podaní buniek sleziny (0 deň) bola získaná krv z myši. IgGl, IgE a anti-dsDNA protilátkový titer v sére bol určený v súlade so zvyčajnou metódou. Hodnoty anti-dsDNA protilátkového titra boli normalizované použitím anti-dsDNA protilátky v sére zo spontánneho autoimunitného ochorenia myši ako štandardu.

Namiesto anti-AILIM protilátky hCTLA4-Ig (fúzny proteín medzi rozpustnou oblasťou ľudského CTLA4 a konštantnou oblasťou imunoglobulínu) bola pridaná do pozitívnej kontrolnej skupiny myši tým istým spôsobom. Namiesto anti-AILIM protilátky PBS bola pridaná do negatívnej kontrolne skupiny tým istým spôsobom.

Výsledok je znázornený na obrázkoch 18 až 20.

Zvýšenie sérového IgG, IgE a anti-dsDNA protilátkového titra ako indexu GVH reakcie (reakcia transplantát versus hostiteľ) bolo podstatne potlačené v skupine, ktorej bola podaná anti-AILIM protilátka v po26

SK 288074 Β6 rovnaní s negatívnou kontrolou. Ďalej, potláčací účinok bol porovnateľný s pozorovanou pozitívnou kontrolnou skupinou, ktorej bola podaná hCTLA4-Ig.

(6-2) Test 2

Indukované GVHD, BALB/c myšie bunky sleziny (1 x 10⁸ bunky/jedinec) boli vnútrožilovo podané F1 myšiam (8 až 10 týždňov staré, 3 jedince) a získali sa vykrvácaním BALB/c myši a C57BL/6 myši. Hneď a 12 hodín po podaní buniek sleziny (0 hodina) anti-myšia AILIM monoklonálna protilátka (B 10.5 protilátka; 200 pg/jedinca) bola vnútrožilovo podaná myši. 24, 48 a 72 hodín po podaní buniek sleziny, B 10.5 protilátka (100 pg/jedinec) bola intraperitoneálne podaná myši.

Hneď, 1, 2, 3, 6, 9 a 12 týždňov po podaní buniek sleziny (0 deň) sa získala krv z myši. IgGl, IgE a anti-dsDNA protilátkový titer v sére bol určený v súlade so zvyčajnou metódou. Hodnoty anti-dsDNA protilátkového titra boli normalizované použitím anti-dsDNA protilátky v sére zo spontánneho autoimunitného ochorenia myši ako štandardu.

Namiesto anti-AILIM protilátky hCTLA-Ig (íuzny protein medzi rozpustnou oblasťou ľudského CTLA4 a konštantnou oblasťou imunoglobulínu) bola podaná pozitívnej kontrolnej skupine myši tým istým spôsobom. Namiesto anti-AILIM protilátky PBS bola pridaná do negatívnej kontrolnej skupiny tým istým spôsobom.

Výsledok je znázornený na obrázkoch 39 až 41.

Zvýšenie sérového IgG, IgE a anti-dsDNA protilátkového titra ako indexu GVH reakcie (reakcia transplantát versus hostiteľ) bolo podstatne zvýšené v skupine, ktorej bola podaná anti-AILIM protilátka v porovnaní s negatívnou kontrolnou skupinou. Ďalej, potláčací účinok bol porovnateľný s tým, ktorý bol pozorovaný v pozitívnej kontrolnej skupine, ktorej bol podaný hCTLA4-Ig.

Príklad 7

Inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na produkciu anti-cudzieho antigénu protilátky (7-1) Inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na tvorbu anti-SRBC protilátky v myši imunologický senzibilizovanej ovčou krvnou bunkou (SRBC)

Ovčie červené krvné bunky (SRBC; 1 x 10⁸ bunky/jedinec) boli vnútrožilovo podané BALB/c myšiam (samice, 5 týždňov staré). Hneď alebo 7 dní po podaní SRBC (0 deň) anti-myšia AILIM monoklonálna protilátka (B 10.5 protilátka; 50 alebo 500 pg/jedinca) bola vnútrožilovo podaná myši. Krv bola zachytená po podaní SRBC. Anti-SRBC protilátka produkovaná v sére bola kontrolovaná bežnou metódou ELISA.

Namiesto anti-AILIM protilátky hCTLA4-Ig (íuzny protein medzi rozpustnou oblasťou ľudskej CTLA4 a konštantnou oblasťou imunoglobulínu) bola podaná pozitívnej kontrolnej skupine myši tým istým spôsobom. Namiesto anti-AILIM protilátky PBS bola podaná negatívnej kontrolnej skupine tým istým spôsobom. Výsledok je znázornený na obrázkoch 21 a 22.

Tvorba IgG protilátky špecifickej ku cudziemu antigénu SRBC bola podstatne inhibovaná v skupine, v ktorej bola podaná anti-AILIM protilátka, hneď po SRBC senzibilizovaní alebo ak bola podaná 7 dní po senzibilizovaní, v porovnaní s negatívnou kontrolnou skupinou. Inhibičný účinok bol silnejší než v pozitívnej kontrolnej skupine, ktorej bola podaná hCTLA4-Ig.

Na druhej strane, tvorba anti-SRBC protilátky bola podstatne zvýšená v skupine, v ktorej bola podaná hCTLA4-Ig, v prípade ak hCTLA4-Ig bola podaná hneď po SRBC senzibilizácii v porovnaní s negatívnou kontrolnou skupinou. Ale, nevýznamná inhibícia bola nájdená v prípade, že táto bola podaná 7 dní po SRBC senzibilizácii.

(7-2) Inhibičný účinok anti-AILIM protilátky na tvorbu anti-NP-KLH protilátky v myši imunologický senzibilovanej NP-KLH.

CFA (Freunďs Complete Adjuvant) a NP-KLH (KLH(keyhole limpet hemocyanín) chemicky naviazaný na haptén NP (Nitrofenol); 100 pg/myš) boli intraperitoneálne podané C57BL/6 myši. Hneď a 12 hodín po podaní antigénu (0 hodina) anti-myšia AILIM protilátka (buď kloň B 10.5 a B9.B6; 200 pg/myš) bola podaná do chvostovej žily. 24 a 48 hodín po podaní antigénu, buď dve anti-AILIM protilátky boli intraperitoneálne podané myši.

Krv bola zozbieraná po podaní NP-KLH. Množstvo NP-KLH-špecifickej protilátky (IgGl, IgG2a, IgG2b alebo IgM) produkované v sére bolo určované bežne používanou metódou ELISA. V tomto ELISA experimente NP- konjugovaný hovädzí sérový albumín (BSA) bol použitý ako zachycovací antigén.

V tomto teste negatívne a pozitívne kontrolné experimenty boli vykonávané použitím fosfátového pufra a hCTLA4-Ig (fúzny protein medzi rozpustnou oblasťou ľudského CTLA4 a konštantnou oblasťou imunoglobulínu) tým istým postupom, ako je opísaný skôr.

Výsledok je znázornený na obrázkoch 42 až 46.

Množstvo produkovanej anti-NP-KLH protilátky bolo zvýšené po určitom čase v skupine, v ktorej bola podaná negatívna-kontrolná protilátka. Teda negatívna kontrolná protilátka neinhibovala tvorbu anti-NP-KLH protilátky.

Na druhej strane, produkcia anti-NP-KLH protilátky bola podstatne inhibovaná v skupine, v ktorej bola podaná anti-AILIM protilátka. Stupeň inhibície bol skoro porovnateľný s účinkom inhibovanej produkcie an27

SK 288074 Β6 ti-NP-KLH protilátky vyvinutej pomocou CTLA4-IgFc, ktorá bola pozitívna kontrola.

Tvorba určitých anti-NP-KLH protilátok patriacich do tried protilátok IgGl, IgG2a, IgG2b alebo IgM bola podstatne inhibovaná v skupine, v ktorej bola podaná anti-AILIM protilátka.

Príklad 8

Analýza aktivity anti-AILIM protilátky modulujúcej zmiešanú lymfocytovú reakciu (MLR)

Analyzovalo sa, či anti-AILIM protilátka mala účinnosť v modulácii (zvýšení a/alebo potlačení) T bunkovej odpovede (produkcia cytokínu takého ako IFN-γ a IL-4, bunková proliferácia atď.) alebo nie, konkrétne či protilátka mala schopnosť modulácie transdukcie AILIM-sprostredkovaného kostimulačného signálu do bunky. Analýza bola uskutočňovaná použitím ako indexu prítomnosti alebo absencie účinnosť v modulujúcej T bunkovej proliferácii (konkrétne, DNA syntéza v bunke) v odpovedi na alogénovú zmiešanú lymfocytovú reakciu (alogénové MLR).

(8-1) Príprava ľudského PBMCs a T buniek

Periférne krvné bunky (200 ml) zbierané z normálne zdravých jedincov (7 jedincov, označovaných ako donory A, B, C, D, E, F a G) boli premiestnené na vrstvy lymfoprep (15 ml; Nycomed) v mikroskúmavkách (50 ml; Falcon). Následne boli skúmavky centrifugované (pri 1600 rpm počas 10 minút), a potom sa získali výsledné medziproduktové vrstvy. Získané bunky boli zriedené 2-krát alebo viac fosfátovým pufrom, a potom boli centrifugované (pri 1 800 rpm počas 10 minút) na prípravu PBMC (periférne krvné mononukleáme bunky; 2 x 10⁸ až 5 x 10⁸ buniek). Bunkový počet bol určený hemocytometrom. Alikvot buniek (1,08 x 10⁸ buniek v 9 mikroplatniach) bol získaný pre MLR test a skladoval sa v ľade. Zostávajúce bunky boli použité na separáciu T buniek nasledovne:

Separácia T buniek z PBMCs bola uskutočňovaná použitím Pan T izolačného kitu (Miltenyi Biotech). V súlade s inštrukciami v návode priloženom ku kitu zvyšné PBMCs boli pridané a ponechané reagovať v roztoku, ktorý obsahoval kit. Následne, bunky boli premyté PBS, ktorý obsahoval 5 mM EDTA a 0,5 % BSA, a potom boli resuspendované v PBS. Bunková suspenzia bola potom pridaná na Pozitívnu selekčnú kolónu VS+ (Miltenyi Biotech) napustenej PBS. Zachytila sa neadsorbovaná frakcia. Kolóna sa premyla PBS. Premývací roztok bol odstránený. Premytie bolo opätovne vykonané. Získané roztoky sa spojili, spoločne poskytli výťažok T bunkovej frakcie. T bunková frakcia bola centrifugovaná, a potom sa bunky resuspendovali v PBS. Výsledné T bunky boli spočítané pomocou hemocytometra. Bunky boli použité v nasledujúcom teste. (8-2) Zmiešaná lymfocytová reakcia (MLR)

Ako bolo opísané skôr, dve signálne dráhy medzi CD28 a CD80 (B7- l)/CD86(B7-2) a medzi CTLA4 a CD80(B7-l)/CD86(B7-2), ktoré boli predtým detailne analyzované, sú známe ako kostimulačné signálne dráhy potrebné na aktiváciu lymfocytov takých ako T bunka atď.

Konkrétne, proliferácia T bunky v odpovedi na zmiešanú lymfocytovú reakciu (MLR) môže byť tiež indukovaná signálnou transdukciou cez každú z dvoch známych dráh.

Teda, použitím látok, ako sú uvedené neskôr, tento test bol podrobený analýze po (1) inhibície MLR pomocou blokovania CTLA4-sprostredkujúcej signálnej dráhy; po (2) inhibície MLR pomocou blokovania CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2)-sprostredkujúcej signálnej dráhy a po (3) inhibície MLR pomocou blokovania terciálnej signálnej dráhy spojenej s AILIM.

Nasledujúce boli použité ako testovacie látky.

(1) Myšia anti-ľudská AILIM monoklonálna protilátka SA 12 (rovnaká ako v predchádzajúcom príklade).

(2) Myšia IgG protilátka (anti-ľudská CD34 protilátka; negatívna kontrola; Immunotech).

(3) Zmes anti-ľudskej CD80 monoklonálnej protilátky (Pharmingen) a anti-ľudskej CD86 monoklonálnej protilátky (Pharmingen).

(4) Ľudská CTLA4-IgFc chimérická molekula (Ancell).

Zmiešaná lymfocytová reakcia (MLR) bola vykonávaná v nasledujúcich šiestich kombináciách s použitím PBMCs a T buniek pripravených z opísaných donorov v (8-1).

(i) T bunka (donor A)/PBMC (donor D) (ii) T bunka (donor D)/PBMC (donor B) (iii) T bunka (donor C)/PBMC (donor A) (iv) T bunka (donor E)/PBMC (donor G) (v) T bunka (donor F)/PBMC (donor E) (vi) T bunka (donor G)/PBMC (donor F)

Koncentrácie PBMCs a T buniek použité v teste boli upravené tak, ako je opísané neskôr.

PBMCs boli suspendované v PBS, a potom transferované do kultivačných nádob (60 mm). Bunky boli ožiarené X-ray žiarením (50 Gy) s ožarovačom (Hitachi MEDICO). Bunky boli centrifugované, a potom sa pridali do 10 % FCS obsahujúceho RPMI1640 média. Bunkový počet bol upravený na 2 x 10⁵ buniek/50 μΐ.

Výsledné T bunky z každého donoru boli tiež pridané do 10 % FCS- obsahujúceho RPMI1640 média a bunkový počet bol upravený na 1 x 10⁵ buniek/50 μΐ.

(8-2-1) Inhibícia MLR pomocou anti-AILIM protilátky

SK 288074 Β6

PRMI 1640 médium obsahujúce 10 % FCS sa pridalo do každej jamky 96 jamkovej mikroplatne majúcej jamky v tvare U. Roztok myšej anti-ľudskej AILIM monoklonálnej protilátky SA12 bol zriedený RPM11640 médiom obsahujúcim 10 % FCS na prípravu roztokov s rôznymi koncentráciami protilátky. Zriedené protilátkové roztoky boli pridané do jamiek (konečná koncentrácia: 0, 0,31, 1,25, 5 a 20 pg/ml). Následne, T bunky (50 μΐ) boli pridané do jamiek. Platňa bola inkubovaná pri 37 °C počas 1 hodiny v CO₂ inkubátore (NAPCO). Potom reakcia prebehla úplne, PBMCs (50 μΐ) získané z rozdielnych donorov bolo pridané do jamiek na začatie MLR.

Ak MLR bol vykonaný použitím látky inej než anti-ľudská AILIM protilátka ako testovacej látky, T bunky získané z rozdielnych donorov boli ponechané reagovať po inkubácii PBMCs s testovacou substanciou.

Na piaty deň kultivácie sa do každej bunky pridal tymidín označený tríciom (³H-Tymidín; 20 μΐ; 1 pCi/jamku) zriedený RPMI1640 médiom obsahujúcim 10 % FCS. Kultivácia pokračovala jeden deň. Potom ako bola kultivácia úplná, sa bunky zozbierali použitím bunkového zberača (Packard). Rádioaktivita ³H začleneného v bunkách bola meraná β počítačom (TOP COUNT; Packard) na analýzu rýchlosti T bunkovej proliferácie po kultivácii.

Výsledok je znázornený na obrázkoch 47 až 52.

Výsledok je sumarizovaný do nasledujúcich bodov:

(1) CTLA4-IgFc blokuje signálnu transdukciu sprostredkovanú CTLA-4 a tým inhibuje alogénovú proliferáciu T bunky vyvolanú MLR.

(2) Anti-CD80 protilátka a anti-CD86 protilátka inhibujú signálnu transdukciu sprostredkovanú CD80/CD86, ktorý je ligand pre CTLA4 a CD28 a tým inhibujú alogénovú proliferáciu T bunky vyvolanú MLR.

(3) Protilátka proti ľudskému AILIM, CTLA4-IgFc, anti-CD80 protilátka a anti-CD86 protilátka inhibuje alogénovú proliferáciu T bunky vyvolanú MLR cez signálnu transdukciu sprostredkovanú AILIM v spôsobe závislom od koncentrácie anti-AILIM protilátky.

(4) Významná inhibícia MLR pomocou anti-AILIM protilátky môže byť dosiahnutá určitou kombináciou PBMCs alebo T buniek získaných z donorov.

Inými slovami, tieto výsledky naznačujú, že kostimulačné signálne dráhy potrebné na T bunkovú aktiváciu zahrnujú terciámu dráhu prostredníctvom ktorej je signál sprostredkovaný AILIM a jeho ligandom a okrem toho známe dráhy sprostredkované CTLA4/CD80/CD86 a sprostredkované CD28/CD80/CD86 rovnako ako signálna dráha sprostredkovaná AILIM sú inhibované protilátkou proti AILIM.

Ďalej, toto zvyšuje možnosť, že prispenie dráhy sprostredkovanej AILIM ku signálnej transdukcii môže byť porovnateľné s dráhou sprostredkovanou CTLA4/CD80/CD86 a s dráhou sprostredkovanou CD28/CD80/CD86.

Priemyselná využiteľnosť

Farmaceutická kompozícia predkladaného vynálezu je užitočná pri liečbe alebo profylaxii spomínaných rôznych ochorení.

Príklady ochorení sú reakcia transplantát versus hostiteľ, imunitné odmietnutie sprevádzajúce reakciu transplantát versus hostiteľ alebo transplantácia tkaniva (tkanív) a orgánu (orgánov).

Farmaceutická kompozícia obsahujúca ľudskú protilátku proti AILIM, ktorá je zahrnutá do farmaceutickej kompozície predkladaného vynálezu, je veľmi užitočná ako liečivo, pretože je bez akýchkoľvek vedľajších účinkov, napríklad alergie pri podaní protilátky získanej z myši človeku.

Claims (3)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie protilátky, ktorá sa viaže na AILIM, alebo jej časti, vybranej zo skupiny pozostávajúcej z F(ab')₂, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv a dAb na prípravu farmaceutickej kompozície na zabránenie, liečbu alebo profylaxiu reakcie transplantát versus hostiteľ, kde protilátka alebo jej časť má supresívny účinok na reakciu transplantát versus hostiteľ porovnateľný s účinkom hCTLA4-Ig.

2. Použitie podľa nároku 1, kde protilátka alebo jej časť vybraná zo skupiny pozostávajúcej z F(ab')₂, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv a dAb má aktivitu pri inhibícii proliferácie buniek exprimujúcich AILIM alebo pri inhibícii produkcie cytokínu bunkami exprimujúcimi AILIM.

3. Použitie podľa nároku 2, kde cytokín je inteferón γ, ktorý je cytokínom produkovaným T bunkami typu Thl alebo interleukín 4, ktorý je cytokínom produkovaným T bunkami typu Th2.