KR20040018179A - 생화학 반응 검출에 사용되는 분자 구조물 및 그 사용방법 - Google Patents

생화학 반응 검출에 사용되는 분자 구조물 및 그 사용방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생화학 반응 검출에 사용되는 분자 구조물 및 그 사용방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 포획부는 시료 매체로부터 상기 구조물을 분리하고, 기질부는 상기 구조물이 검출 및 측정가능한 물리적 변화시 작용되고 견디어낼 수 있는, 포획부 및 기질부를 갖는 분자 구조물에 관한 것이다. 이러한 분자 구조물은 진단 어세이, 개체에서 특정 질병의 잠재적 위험에 대한 유전학적 스크리닝, 및 화합물의 고-처리 스크리닝을 이용한 드럭 개발 및 톡시코제노믹스(toxicogenomics)에 사용될 수 있다.

Description

생화학 반응 검출에 사용되는 분자 구조물 및 그 사용방법{MOLECULAR CONSTRUCTS AND METHODS OF USE FOR DETECTION OF BIOCHEMICAL REACTIONS}
본 발명은 일반적으로 분자생물학 및 생화학에 관한 것이다. 본 발명은 생화학 반응 검출에 개별적으로 또는 다수로 사용되는 분자 구조물 및 방법을 제공한다.
세포내 생화학 반응은 세포 기능 및 활성을 정의한다. 이들 반응은 수용체 리간드 상호작용과 효소 반응사이의 복잡한 상호작용을 포함하며, 세포의 시그날링 및 활성을 주도한다. 생리적 조건은 이러한 반응을 중재하는 효소 및 단백질의 활성수준에 영향을 준다.
예를들어, 펩티드 사슬상의 아미노산 잔기는 세포에서 단백질 기능의 조절에 중요한 역할을 한다. 포스페이트기, 메틸기 또는 탄수화물의 전이는 단백질 기질내 형태적 변화를 포함하며, 이는 차례로 단백질 기능에 변화를 일으킨다. 이러한 반응은 보통 가역적이다. 단백질 변형은 특정 부류의 효소 활성을 포함한다. 예를들어, 메틸화는 일반적으로 메틸트랜스퍼라아제로 알려진 효소 과(family)에 의해 촉진된다. 단백질 변형은 세포질 단백질의 멤브레인 부착을 조절하며 펩타이드의 C-말단 단백질 가수분해의 억제에 기여한다. 메틸화된 시스테인 잔기는 G 단백질의 카르복실 말단에 또는 부근에 위치하며 신호전달을 위하여 펩타이드가 멤브레인에 부착하는 것을 촉진할 수 있다(Rando,Biochim BiophysActa 1300(1):5-12(1996), Hrycyna,Pharmacol.Ther. 59(3):281-300(1993)). 여러 종류의 액틴상의 포지션73에 있는 히스티딘이 또한 메틸화된다. 메틸화는 액틴 분자의 적절한 형태를 유지하기위해 필요한 것으로 알려져 있다(Yao,J. Biol. Chem.274(52):37443-9(1999)). 미오신의 S-1 부위에서 라이신 잔기의 메틸화는 미오피브린 수축에서 감소된 ATP 바인딩을 일으킨다(Bivin,Proc. Nat'l Acad. SciUSA 91(18):8665-9(1994)). 또한 멤브레인 단백질의 메틸화는 당뇨 환자에서 심장 혈관 질병의 발달에 기여할 수 있는 것으로 알려져 있다(Schaffer,Mol. Cell Biochem107(1):1-20(1991)). 또한, 메틸화는 핵 단백질에서 단백질-RNA 상호작용을 감소시키며(Kim, Amino Acids 15(4):291-306(1998)), 그리고 SH3 도메인-매개 단백질-단백질 상호작용을 선택적으로 조절한다(Bedford, J. Biol. Chem, 275(21):16030-6(2000)).
마찬가지로, 탄수화물은 다수의 분비 단백질 또는 세포-표면상에 나타나있는 단백질내의 특정 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 잔기의 측쇄로 이동될 수 있다. 탄수화물이 인간 응고 인자 V상의 포지션 2181에 있는 아스파라긴으로 이동하는 것은 인자 V와 인지질 멤브레인 사이의 상호작용을 감소시킨다(Nicolaes, biochemistry 38(41):13584-91(1999)). 다당류로 알려진 큰 탄수화물은 다수의 당 단량체를 연결함으로써 형성된다.
본 발명은 포획부 및 기질부를 갖는 분자 구조물에 관한 것이다. 포획부는 시험되는 시료로부터 구조물을 분리하는 작용을 하며, 기질부는 관심있는 표적 분자의 존재 혹은 활성을 검출하는 반응부를 제공한다. 바람직한 구체화로, 분자구조물은 포획부로서 펩타이드-핵산(PNA) 및 기질부로서 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 다른 바람직한 기질부는 예를들어, 관심있는 표적 분자상에 작용하거나 관심있는 표적 분자에 대한 기질이 되는 지방산, 스테로이드, 당, 보조-인자(co-factors) 및 다른 실체와 같은 비-펩타이드 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 분자 구조물을 이용하는 방법에 관한 것이다. 상기 분자 구조물의 변형된 기질부를 측정하고 시료내의 하나 또는 그 이상의 효소 활성을 표시함으로써 하나 또는 다수의 효소 활성을 검출하는 방법이 제공된다. 마찬가지로, 세포, 세포 집단에서 또는 조직 시료에서 분석물을 검출하는 방법이 제공된다.
펩타이드-핵산(PNA) 포획부를 갖는 본 발명의 분자 구조물은 종래 기술의 것보다 특히 유익하다. PNA와 이에 상보적인 핵산 서열의 혼성화는 PNA 백본의 비하전된 특성때문에 보다 특이적이며 보다 높은 친화력으로 일어난다. DNA 또는 RNA와 같은 핵산이 소유하지않는 여러가지 PNA 특성때문에 PNA-핵산 서열 혼성화가 보다 우수하다. PNA는 광범위한 pH 및 낮은 이온 강도 조건에서 안정하다. 이러한 특성으로 PNAs가 본 발명의 검출 어세이에 사용하기 적절하다.
정확하면서, 시간 및 비용에서 모두 효율적이며, 그리고 우수한 감도로 하나 또는 다수의 반응을 스크리닝할 수 있는 생화학적 반응의 검출 및 분석용 어세이가 요구된다. 따라서, 사용하기 쉽고, 고 특이적이며, 정확하며, 그리고 질병, 바람직하게는 바이러스, 세균 및 기생충에 의해 발생될 수 있는 질병을 예방 및/또는 치료하기위해, 생화학적 반응을 스크리닝하는데 민감한 하나 또는 그 이상의 생화학적 반응을 검출하는 방법을 갖는것이 유용할 것이다.
도 1은 LEAPS 또는 직접 증착한 후, READ, 플로우 싸이토메트리, 및 침전법을 이용하여 배열상에서 검출하는 방법을 이용한 마이크로입자 검출의 예를 나타낸다.
도 2는 캐리어의 표면에 고정되어있는 다중 어세이에 사용된 PNA-분석물 키메라의 개요도를 나타낸다.
도 3은 항체에 의한 변형된 분석물/기질의 검출을 나타낸다. 고체 표면상에 포획된 변형 분석물은 일차 항체-(A); 2차 항체-(B); 또는 3차 항체-(C) 형태의 형광(f) 또는 페록시다아제(e) 표지 항체에 의해 검출될 수 있다.
도 4는 MAP 카이네이즈 신호전달 경로 및 그 MAP 카이네이즈 경로에서 특정 카이네이즈의 활성을 확인하기위해 사용된 리포터 키메라를 나타낸다.
도 5는 JAK 카이네이즈-매개 신호전달 경호에서 카이네이트 활성을 검출하기위한 PNA-STAT 키메라를 이용한 세포 기초 어세이의 개요도를 나타낸다.
도 6은 PKD1 및 Akt1/PKB 카이네이즈에 대한 특정 카이네이즈 활성을 검출하는 개요도(A) 및 이는 세포-기초 어세이에서 상기 Akt/PKB 신호 경로를 분석하기위해 사용될 수 있음을 나타내는 개요도(B)를 나타낸다.
도 7은 PNA-카스페이즈 키메라를 이용한 다중 카스페이즈 활성을 검출하는 개요도를 나타낸다.
도 8은 세포-기초 어세이에서 PNA-소 분자 키메라를 이용한 새로운 드럭 표적 GPCR을 확인하는 방법에 대한 개요도를 나타낸다.
도 9는 플로우 싸이토메트리에 의해 검출된 색-암호화된 마이크로입자상의 상보적 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 PNA 키메라의 개요도를 나타낸다.
도 10은 PNA-항체 키메라를 이용하여 세포 표면상에 나타난 특정 단백질을 갖는 세포를 검출 및 분리하는 방법을 나타낸다.
도 11은 올리고뉴클레오티드 프로브를 고체 표면에 고정하는 두가지 다른 시도, Biotin-NeutrAvidin 바인딩을 이용한 간접 결합(A) 및 아민-토실 반응을 이용한 직접 결합(B)을 나타낸다. 고체 표면상에서의 biotin-NeutrAvidin 매개 간접 결합 및 고체 표면상에서의 올리고뉴클레오티드의 아민-토실 직접 결합의 직접 접합의 적정 결과를 적절한 도표하에 나타낸다.
도 12는 두 타입의 바이오티닐레이티드 PNA 올리고머의 고-압 액체 크로마토그래피 정제를 나타낸다.
도 13은 정제된 테트라메틸 로다민(TMR) 표지된 PNA-펩타이드 키메라(A) 및 Cy5-표지된 PNA-소 분자 키메라(B) 및 각각 이들의 흡광도측정 프로필을 나타낸다.
도 14는 마이크로입자 배열상에 고정된 여러가지 올리고뉴클레오티드에 대한 바이오티닐레이티드 비스-PNA 올리고머의 서열-특이적 포획을 시험하는 온-칩 혼성화 어세이의 결과를 나타낸다.
도 15는 색-암호화된 마이크로입자상에 고정된 DNA 올리고뉴클레오티드에 대한 비스-PNA 올리고머의 서열-특이적 포획을 시험하는 인-튜브 혼성화 어세이(A)와 온-칩 혼성화 어세이(B)를 비교한 결과를 나타낸다.
도 16은 마이크로입자 배열상에 고정된 DNA 올리고뉴클레오티드(18염기 길이)의 서열-특이적 포획을 시험하는 온-칩 혼성화 어세이의 결과를 나타낸다.
도 17은 색-암호화된 자성 입자상에 고정된 상보적인 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 PNA 올리고머의 결과를 타나낸다(여기서, 칩 B(B)는 칩 A(A)의 음성 대조구임).
도 18은 마이크로입자 배열상에 고정된 DNA 올리고뉴클레오티드(10염기 길이)에 대한 비스-PNA-소 분자 키메라의 서열-특이적 포획을 시험하는 온-칩 혼성화 어세이의 결과를 나타낸다(여기서, 칩 2는 칩 1에 대한 음성 대조구임).
도 19는 농도 증가시 3개의 바이오티닐레이티드 포스포릴레이티드 펩타이드 표준 곡선(펩타이드-P-1, 펩타이드-P-2, 및 펩타이드-P-3)의 결과를 나타낸다(여기서, 상기 펩타이드들은 마이크로입자 배열을 이용하여 NeutrAvidin으로 코팅된 특정 색-암호화된 비드에 결합됨).
도 20은 농도 증사기 두개의 바이오티닐레이티드 포스포릴레이티드 펩타이드 표준 곡선(펩타이드-P-1 및 펩타이드-P-2)의 결과를 나타낸다(여기서, 상기 펩타이드들은 NeutrAvidin으로 코팅된 특정 색-암호화된 비드에 결합됨).
도 21은 마이크로입자 배열상에서 티라마이드 시약을 이용한 포스포릴레이티드 펩타이드(Ty-P-1 및 펩타이드-P-2)의 면역검출 결과를 나타낸다. 상기 어세이에사용된 모노클로날 항체는 포스포릴레이티드 변형에 특이적인 페록시다아제로 표지된다.
도 22는 마이크로입자 배열상에서 포스포릴레이티드 펩타이드-특이 모노클로날 항체를 이용한 포스포릴레이티드 펩타이드(Ty-P-1 및 펩타이드-P-2)의 면역검출 결과를 나타낸다. 결합된 모노클로날 항체는 Cy-5 표지 2차 항체를 이용하여 검출된다.
도 23은 마이크로입자 배열상에서 형광-표지된 항체를 이용한 다중 포스포릴레이티드 펩타이드의 동시 면역검출 결과를 나타낸다.
도 24는 이중-표지된 PNA-분석물 키메라의 일반적 디자인 및 이중-어세이 검출의 비율 정량화(A); 카스페이즈 3 활성의 비율 정량화를 검출하기위하여 형광 염료 및 내부 His6 태그로 표지된 특정 PNA-펩타이드 키메라(B); 및 비율 정량화에 의해 검출된 카스페이즈 3 활성의 결과(C)를 나타낸다.
도 25는 플로우 사이트메트릭 분석에 의해 색-암호화된 마이크로입자상에 혼성화된 PNA 키메라의 검출 결과를 나타낸다. 도 25A에서, 두개의 녹색 비드(그린 A 및 그린 B)는 두 타입의 올리고뉴클레오티드 (A) 및 (B)와 함께 결합된다. 상기 PNA 키메라는 특이적으로 그린 B 비드상의 올리고뉴클레오티드에 결합하며, 이는 오렌지 채널상에서 검출가능하다. 마찬가지로, 도 25B에서, 상기 결과는 pPNA 키메라 서열은 플로우 사이토메트리를 이용하여 검출된 한 타입의 비드에 특이적으로 결합하는 것을 보여준다.
도 26은 프로테아제 활성 검출용 PNA-펩타이드 키메릭 기질의 일반적 디자인을 나타낸다(여기서 키메라의 기능적 도메인은 하나의 형광 염료(I), 두개의 형광 염료(II), 및 내부 His6 태그를 갖는 하나의 형광 염료(III)로 표지됨).
도 27은 마이크로입자 배열상에서 말단-표지된 형광과 함께 바이오티닐레이티드 카스페이즈 3를 이용한 카스페이즈 활성 검출 결과를 나타낸다.
도 28은 마이크로입자 배열상에서 DNA 올리고뉴클레오티드(10 염기 길이)에 대하여 포획되는 PNA 키메라의 특이성을 시험하기위해 수행된 2X2 PNA 키메라 경합 어세이의 결과를 나타낸다. 칩 1은 정의된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 관능화된 색-암호화 비드에 대하여 포획된 바이오티닐레이티드 PNA 클램프(바이오틴-PNA-클램프)(바닥부 패널) 및 테트라메틸 로다민과 접합된 비스-PNA-펩타이드 키메라(비스-PNA-펩타이드-TMR)(상층부 패널)의 결과를 나타낸다. 칩 2는 바이오틴-PNA-클램프(바닥부 패널) 및 비스-PNA-펩타이드-TMR(상층부 패널)에 상응하는 음성 대조구를 나타낸다.
도 29는 색-암호화된 마이크로입자, 합성 비-포스포릴레이티드 펩타이드와 결합된 오렌지 및 그린 비드 및 각각 이에 상응하는 포스포릴레이티드펩타이드(좌 패널)를 해독하는데 사용되는 오렌지 및 녹색 이미지를 나타낸다(좌 패널). 그린 비드상에 포스포릴레이티드 펩타이드는 칩상에서 Cy-5-표지된 항체를 이용하여 검출되었다(우 패널).
도 30은 DNA-펩타이드 키메라(A)의 도해 및 마이크로입자 배열상에서 색-암호화된 비드에 결합된 상보적인 PNA에 대한 DNA-펩타이드 키메라의 혼성화 결과를 나타낸다.
본 발명은 포획부 및 기질부를 포함하는 분자 구조물에 관한 것이다. 포획부는 구조물이 분자 혼합물로부터 분리되도록 하며, 바람직하게 핵산 또는 핵산 유도체를 포함한다. 기질부는 구조물이 변화시 작용 및 견디어내도록 하며, 이는 측정되거나 검출될 수 있다. 상기 변화는 화학적 변형 또는 분리나 상기 기질부에 첨가와 같은 물리적인 것일 수 있다. 택일적으로 상기 변화는 구조물의 기질부에 리간드 혹은 세포의 바인딩일 수 있다.
본 발명의 분자 구조는 PNA 올리고머 및 하나 또는 그 이상의 PNA의 유도체형(예를들어 pPNA와 같은)을 포함하는 공유-결합된 성분, 링커, 및 합성 펩타이드 또는 다른 기질부를 포함하는 PNA-펩타이드 키메라일 수 있다. 키메라의 PNA 부(선형이나 비스-형일 수 있음)는 상보적인 올리고뉴클레오티드에 대한 복합체를 포획하기위한 앵커로 제공되며, 고체 지지체상에 고정된다. PNA 앵커링 도메인의 염기-서열은 키메라의 기질 도메인의 분석물에 고유한 태그를 제공한다. 또한, 고형 지지체는 광학적으로 또는 화학적으로 암호화될 수 있다.
키메라의 기질부는 생화학 어세이에 관여하는 기능적/기질 성분으로 제공된다. 분자 구조물의 기질부는 생화학 반응에서 리간드 또는 효소 기질로 작용하는 분자 구조를 포함한다. 예를들어, 단백질 또는 펩타이드는 효소반응을 위한 기질로 사용되거나 리간드-결합부를 제공할 수 있다. 펩타이드는 또한 리간드-수용체 반응을 검출하는데 유용할 수 있다. 단백질은 특정 세포-표면 마커를 갖는 세포-집단을분리하는데 기질로 사용될 수 있다. 또한, 효소 보조인자는 예를들어, ATP, cAMP, GTP 등과 같이 키메라의 기질부의 모두 또는 일부를 형성할 수 있다. 마찬가지로, 지방, 스테로이드 및/또는 지방산은 키메라의 기질부를 형성할 수 있으며, 여기서 이러한 분자들은 또한 생화학 반응도중 변형될 수 있으며 따라서 본 발명을 이용하여 측정될 수 있다. 탄수화물은 또한 키메라의 기질부의 모두 또는 일부를 형성할 수 있다. 이들 분자는 예를들어, 단순 당, 전분, 다당류, 프로테오글리칸 등을 포함한다.
기질부는 인산기, 당기, 메틸기 등과 같은 검출가능한 표지 혹은 효소 분할 인지부와 같은 하나 또는 그 이상의 부를 함유하도록 변형될 수 있다. 일 구체화로, 키메라의 기질부는 하나 또는 그 이상의 형광 태그를 함유한다. 이러한 태그는 폴리히스티딘, 바이오틴, 디곡시제닌 태그 등의 사용과 함께 결합될 수 있다. 단일-표지된 기질부를 이용함으로써, 효소 분해는 분해된 기질로부터 태그를 제거한다. 이중-표지된 기질부를 이용함으로써, 효소 분해는 기질로부터 퀀칭 염료를 제거하며 이는 분할된 생성물상에 있는 2차 염료로부터 형광이 방출되도록한다. 검출가능한 태그와 내부 폴리히스티딘 태그를 갖는 기질부를 이용함으로써, 효소 분해는 형광 염료를 제거한다. 또한, 잘려지지않은 기질로부터 검출가능한 신호는 내부 폴리히스티딘 태그로부터 생성된 신호를 검출하기위해 표준화될 수 있다. 이러한 구체화는 분자 구조가 관심있는 효소 활성과 관련된 수량적 정보를 제공할 수 있음을 입증하는 실시예 10, 14, 16, 및 17에서 상세히 설명된다. 다른 구체화로, 키메라의 기질부는 관심있는 하나 또는 그 이상의 인산기 또는 다른 부를함유하며, 이는 관심있는 포스파타아제 또는 다른 효소에 대한 효소 분할 자리의 일부로 작용할 수 있다.
본 발명의 구조물은 상기 기질부에서 변화를 검출하는 방법에 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 세포-프리 및 세포-기초 형태로 단백질-단백질 상호작용, 리간드-수용체 바인딩, 단백질 변형, 단백질 발현 및 효소 활성을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 특정 세포 표면 마커를 갖는 세포를 분리하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 여러가지 목적으로 사용될 수 있다. 상기 구조물은 이에 한정하는 것은 아니지만, 암, 기생체 감염, 신경 질환, 조혈 질환, 머스코스켈레탈(muscoskeletal) 질환, 심장혈관 질환, 림프성 질환, 호흡기 질환, 내분비 질환, 및 위장 질환과 관련된 것과 같은 유전학적 스크리닝 분석, 진단, 질병의 치료 및/또는 예방, 드럭 개발 및 질병 또는 조건에 대한 톡시코제노믹스(toxicogenomics) 어세이에 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 분자 구조물에 대한 사용 방법은 시험 시료에서 PNA-기질 키메라를 단백질, 리간드 또는 효소와 반응시키는 것이다. 이 반응은 균질한 용액에서 수행되거나 또는 키메라의 포획부는 반응전에 고체 매트릭스상에 미리 고정화될 수 있다. 이 반응은 만일 시험 반응이 시료의 표면상에서 일어나는 경우, 키메라의 기질부를 변형시킨다. 만일 생화학 반응이 용액에서 일어나는 경우, 키메라는 서열-특이 방식으로 올리고뉴클레오티드-작용화된 고체 지지체에 포획된다. 일 구체화로, 색-암호화된 마이크로입자는 고체 지지체로서 사용된다. 마이크로입자는 LEAPS 또는 직접 증착과 같은 이 기술분야에 알려진 방법을 이용하여 집합될수 있다. LEAPS는 표면부근 입자의 광-조절된 동전기학 어셈블리로서 알려진 기술이며 다중분석물 분자 분석을 위한 입자 배열의 주문형 제조 방법이다. LEAPS는 미국특허 제 6,251,691 및 WO 97/40385에 상세히 기술되어 있다. 생화학 반응이 수행된 후, 키메라는 고체 표면상에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 센서에 포획된다. 그 다음 후속 검출 및 데이타 분석에서 캐리어 표면의 암호(비드의 색 암호와 같은)에 따라 키메라의 정체를 측정한다. 포획후, 표면상의 키메라는 이 기술분야에 알려진 방법에 따라 직접 검출될 수 있다. 이러한 방법의 비-제한적인 예는 침전 반응, 페록시다아제 또는 형광 염료, 표지된 항체, 리간드-바인딩 검출, 또는 플로우 사이트메트리를 포함한다. 분자 구조물의 변형된 기질부는 예를들어, 집합된 입자의 랜덤 암호화 배열 검출(READ)(WO 97/40385), 입자 서스펜션의 플로우 사이트메트리 검출, 공간적으로 한정된 고체 표면상에서의 침전 등과 같이 이 기술분야에 알려진 여러가지 가능한 형태 중 한 가지 방법에 의해 검출될 수 있다.
고체 표면상에 나타나는 DNA 올리고뉴클레오티드는 다중 어세이에서 PNA 키메라의 앵커링 도메인(즉, 포획부)의 서열 특이적 포획을 위한 센서로 제공된다. 규정된 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 결합, 혼성화 및/또는 검출을 촉진시키기위해 스페이서 서열, 화학 기, 리간드(들) 및/또는 표지와 같은 다른 변형을 포함할 수 있다. 고체 표면은 결합을 위해 규정된 화학 기를 또한 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드와 고체 표면의 결합은 직접 혹은 간접 결합일 수 있다. 특정 결합 방법은 이 기술분야에 알려져 있다. 바람직한 구체화로, 올리고뉴클레오티드 결합은 바이오틴-NeutrAvidin 매개 결합 또는 아민-토실 매개 직접 결합을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체화로, 분자 구조물의 포획부는 펩타이드-핵산(PNA)을 포함한다. PNAs는 펩타이드같은 백본을 갖는 DNA의 유사체이다. PNA 백본은 아민 결합으로 연결된 N-(2-아미노에틸)글리신 잔기 반복으로 구성된다. DNA 및 RNA와는 달리, PNA는 어떠한 펜토즈 및 포스페이트기를 갖지 않는다. PNA 백본의 비하전된 특성은 PNA와 이에 상보적인 DNA 또는 RNA 서열이 다른 핵산 물질보다 높은 친화력 및 특이성으로 혼성화되도록 한다. 또한, PNA 및 비스-PNA는 서열 특이적 형식으로 DNA에 혼성화되어 국부적인 DNA/DNA/PNA 트리플렉스를 형성할 수 있다. PNAs의 특성 및 분자의 합성 방법은 예를들어, WO 92/20702(Buchardt 등, 1992, 12, 29)에 이미 개시되어 있다. PNA 혼성화는 매우 특이적이기때문에, PNA 프로브는 혼성화 어세이에서 DNA 프로브보다 짧을 수 있다. PNA는 광범위한 pH에 걸쳐 안정하며 보다 낮은 이온 강도의 조건이 사용될 수 있다. 또한, PNA는 자연적으로 방출하지않는 합성 화합물이다. 따라서, 프로테아제 및 뉴클라아제 모두 PNA 분자의 폴리아미드 백본을 인지할 수 없다. 이 특성은 세포 융해물 또는 세포 또는 조직을 이용하는 혼성화 어세이에 사용하기에 특히 적절하다.
PNA-기질 키메라의 PNAs는 바람직하게 10-25 염기, 보다 바람직하게 약 15 염기 길이이다. 상기 분자의 N-말단에서 첫번째 하나 또는 두개의 염기는 다른 분자와 접합된 스페이서이다. PNA 올리고머의 나머지는 고체 지지체상에 고정화된 올리고뉴클레오티드에 대하여 키메라의 서열-특이적 포획을 매개하는 프로브로서 제공된다. 키메라의 PNA부는 단일-가닥일 수 있으며 또는 비스-PNA일 수 있다.비스-PNA(또한 "PNA 클램프"로 칭하여짐)는 유동적인 "헤어핀" 링커를 통해 함께 연결된 PNA 올리고머의 두 스트레치를 함유한다. 혼성화시, 상기 비스-PNA는 상보적인 DNA와 함께 트리플렉스 구조를 형성한다.
PNAs는 DNA-DNA 및 DNA-RNA 혼성화보다 이들의 상보적인 DNAs에 상당히 보다 높은 서열-특이적 바인딩 친화력 및 특이성을 갖는다. 다중 어세이에 사용되는 경우, PNA 키메라의 앵커링 도메인은 관심있는 캐리어의 한정된 표면상에 고정된 이들의 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 센서에 혼성화된다(도 2). 상기 DNA 올리고뉴크레오티드 센서는 바람직하게 PNA 키메라 라이브러리의 PNA 앵커중 하나(즉, 포획부)에 상보적인 한정된 염기 서열을 함유한다. 캐리어의 표면에 올리고뉴클레오티를 고정화하는 것은 이 기술분야에 알려진 방법에 따라 행해질 수 있으며, 이는 아민기와 토실기 사이의 반응과 같은 화학 반응의 수단에 의해 표면에 직접 결합되거나 또는 바이오티닐레이티드 올리고뉴클레오티드를 표면상의 아비딘, 스트렙타비딘 또는 NeutrAvidin에 바인딩하는 것과 같은 링커 분자를 통해 표면에 간접적으로 결합될 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드 센서는 고정화, 혼성화 또는 검출을 촉진시키기위해 스페이서 분자, 표지, 태그 또는 다른 반응기를 함유할 수 있다. 상기 캐리어는 바람직하게, 고정화된 올리고뉴클레오티드의 해독을 위한 규정된 공간적 및 색 특성을 갖는다. 바람직한 구체화로, 상기 캐리어는 마이크로입자를 포함할 수 있다. n3타입의 DNA 올리고뉴클레오티드 센서 및 n4타입의 색-암호화된 비드가 존재하는 경우, (n3×n4) 올리고뉴클레오티드-작용화된 캐리어의 라이브러리가 합성될 수 있다. 각 타입의 올리고뉴클레오티드-작용화된 마이크로입자는 바람직하게 다중 어세이에서 한 타입의 PNA 키메라만 포획한다.
본 발명의 일 구체화로, 상기 분자 구조물은 PNA-기질 키메라를 포함한다. 이 구체화는 링커 분자를 통해 폴리펩타이드에 접합된 PNA를 포함한다. PNA 올리고머는 이 기술분야에 알려진 방법에 의해 합성될 수 있다. 이러한 방법의 예는 Boc 화학, 및 Fmoc 화학(Nielsen, P.E., Egholm, M, Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications, pp. 21-50, Horizon Scientific Press, 1999)을 포함한다.
본 발명의 다른 구체화로, 키메라의 기질부는 바람직하게, 효소의 기질과 같은 펩타이드이다. 본 발명의 다중 형태에 특히 적절한 효소의 바람직한 종류는 카이네이즈, 카스페이즈, 포스파타아제, 트랜스퍼라아제, 프로테아제, 뉴클라아제 등과 같은 관련된 효소 과의 일부인 효소이다. 본 발명의 비-다중 형태에 있어서, 기질을 이용하는 어느 생화학 반응이 측정될 수 있으며, 여기서 상기 기질 또는 활성부는 키메라의 포획부에 접합될 수 있다. 폴리펩타이드 기질에 있어서, 기질 펩타이드용 아미노산 서열이 일반적으로 이 기술분야에서 이용가능하다.
본 발명에서, 바람직한 접합 방법은 펩타이드의 말단, 즉 합성도중 펩타이드의 N-말단에 시스테인을 편입하는 것이다. 시스테인 잔기의 측쇄상에 있는 설프히드릴기는 키메라의 합성도중 링커 분자에 펩타이드 접합시 이용될 수 있다. 또한, 특정 다중 생화학 어세이에서 검출용으로 사용되는 바이오티닐화용 펩타이드의 다른 말단에 리신이 첨가될 수 있다. 이형이작용성 교차-결합제가 PNA-펩타이드 키메라의 합성에 이용될 수 있다. 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-(카르복시-6-아미노카프로에이트)(LC-SMCC라고도 알려짐)는 관심있는 분석물의 설프리드릴기 및 아민-기와 반응하는 이형이작용성 교차-결합제중 하나이다. 이 기술분야에 알려진 바와 같이, LC-SMCC의 NHS 에스테르는 우선, pH 7-8에서 PNA 올리고머의 N-말단상에 있는 아민기와 반응하여, 그 결과 PNA 분자를 활성화시킨다. 그 다음 LC-SMCC의 말레이미드기는 pH 6.5-7.5에서 펩타이드의 설프히드릴기와 반응하여 작용화된 PNA-펩타이드 키메라를 형성한다. 합성된 PNA-펩타이드 키메라는 이 기술분야에 알려진 여러가지 방법을 이용하여 정제 및 농축된다. 따라서, PNA-기질 키메라의 라이브러리는 다중 생화학 어세이용으로 합성될 수 있다. PNA-기질 키메라 라이브러리에서, 각 펩타이드는 고유한 PNA 올리고머에 접합될 수 있다. 그러나, 주어진 세트의 PNA 올리고머는 PNA-기질 키메라의 여러가지 서브-라이브러리의 구성에 이용될 수 있다.
필수적이지 않지만 본 발명의 바람직한 구체화는 PNA와 기질의 접합시 링커를 사용한다. 교차-결합제는 보다 유동적인 구조를 제공하는 것으로 여겨지며, 이는 PNA와 키메라의 기질부에 대한 입체 힌지로 제공된다. 상기 결합제에 의해 제공되는 부가적인 유동성은 효소 기질 상호작용 뿐만아니라 PNA-올리고뉴클레오티드 혼성화를 촉진시킨다. 또한, PNA 키메라의 합성시 결합제로서 나노입자가 사용될 수 있다. PNA 및 펩타이드 기질은 연속적으로 혹은 동시에 입자의 표면에 접합될 수 있다. 결합제로서 자성 나노입자가 사용되는 경우, 그 결과물인 PNA-기질 키메라는 어세이에서 필요에 따라 정제 혹은 충진될 수 있다.
변형된 PNA-기질 키메라의 검출은 여러가지 방식으로 수행될 수 있다. 만일단일 타입의 PNA-기질 키메라가 이용되는 경우, 이 기술분야에 알려진 어느 검출 수단도 적절하다. 만일 다중 어세이가 사용되는 경우, 다수 집단의 키메라가 사용된다. 이 어세이에서, 주어진 키메라 집단의 포획부는 생화학 반응이 완료된 후, 특정 변형된 키메라가 분류되고 이에 상응하는 서열, 즉, 알려진 앵커 서열에 기초하여 확인될 수 있도록 바람직하게 단일 타입의 기질부와 상응한다. 이러한 키메라 집단의 포획은 각각 그 상부에 PNA-기질 키메라의 주어진 포획부에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 함유하는 다수의 표면에 키메라를 혼성화하여 수행된다. 다수의 표면은 다수의 다른 고체 매트릭스를 포함할 수 있으며, 또는 단일 고체 표면일 수 있으며, 여기서 표면부는 특정한 개별적 타입의 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 다수의 다른 고체 매트릭스는 자성 입자, 마이크로입자, 나노입자, 유기 또는 무기 중합체, 금속 또는 세라믹 멤브레인 등과 같은 입자 형태일 수 있다. 이들은 색, 이온 전하, 형상 또는 굴절율 또는 화학적 또는 물리적 특성에 의한 것과 같이 집단사이를 구분하는 일부 방식으로 변형될 수 있다. 상기 입자는 또한 집단간에 구별하기위해 물리적으로 분리될 수 있다. 만일 단일 고체 매트릭스가 바람직한 경우, 예는 다른 집단의 키메라가 배열의 분리된 부분에 혼성화되는 배열 또는 마이크로배열을 포함한다.
본 발명의 일 구체화로, 올리고뉴클레오티드가 색-암호화된 마이크로입자상에 고정화된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 검출을 위해 용액으로부터 PNA-기질 키메라의 상보적인 포획부에 표적을 혼성화하기위한 프로브로 제공된다. 서열-특이적인 혼성화에 기초한, 마이크로입자의 색 암호는 다중 생화학 어세이에서 특정 펩타이드로부터 신호를 해독하는데 이용될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 바람직하게 15-50 뉴클레오티드를 갖는다. 아민기와 같은 작용기는 임의로 고정을 위해 올리고뉴클레오티드의 말단에 편입될 수 있다. 택일적으로, 상기 프로브의 말단 뉴클레오티드는 적절히 바이오틴화되거나 표지될 수 있다. 이러한 변형된 올리고뉴클레오티드의 합성 방법은 이 기술분야에 알려져 있다. 특정한 상황에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 고유한 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.
색-암호화된 마이크로입자의 표면은 다중 생화학 어세이에 사용되는 생분자의 고정화를 위해 규정된 화학기를 함유할 수 있다. 상기 화학기는 예를들어, 에폭시, 토실, 아민, 카르복실, 클로로메틸, 알데히드기 또는 다른 화학기를 포함할 수 있다. 입자의 표면상에 활성화된 화학기를 생성하기위한 특정 화학 공정은 이 기술분야에 알려져 있다: 예, Polymer Colloids: A Comprehensive Introduction, edited by Fitch, R.M., Academic Press(1997). 올리고뉴클레오티드, DNA 프레그먼트, RNA 분자, 합성 펩타이드, 재조합 단백질, 정제된 고유 단백질 등이 이 기술분야에 알려진 방법에 따라 표면 화학기와의 상호작용을 통해 상기 입자에 고정화될 수 있다: 예, Bioconjugate Techniques, edited Hermanson, G.T., Academic Press(1995). 각 타입의 색-암호화된 마이크로입자는 규정된 타입의 생분자와 접합되어, 다중 생화학 어세이로부터 검출가능한 신호는 접합된 마이크로입자의 색으로부터 해독될 수 있다. 생분자를 이용한 입자의 기능화는 배치-투-배치 변형을 최소화하기위한 자동 장치를 이용하여 병행으로 수행될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 매트릭스의 표면상에 배치될 수 있다. 예를들어, 배치된 올리고뉴클레오티드 배열은 PNA 키메라를 포획하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 올리고뉴클레오티드 프로브는 PNA 키메라를 포획하기위한 고 밀도 올리고뉴클레오티드 배열과 같은 고체 매트릭스의 표면상에 직접 합성될 수 있다.
본 발명의 다른 구체화로, PNA-기질 키메라의 라이브러리를 포획하는 방법이 개시된다. 이 구체화는 마이크로입자 배열상에서 이러한 라이브러리를 포획한다. 여기서, 암호화된 입자의 예비-형성된 평면 배열이 온-칩 생화학 어세이를 수행하기전 이에 상응하는 PNA-기질 키메라를 포획하는데 사용된다. 다른 바람직한 구체화로, PNA-기질 키메라에 나타난 올리고뉴클레오티드를 통해 포획된 암호화된 입자는 생화학 반응이 완료된 후 집합된다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 일 구체화로 캐리어의 고체 표면상에 포획된 변형된 키메라는 이 기술분야에 알려진 바와 같이 항체에 의해 검출될 수 있다. 변형된 키메라는 표지되어있는 변형된 기질-특이 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 항체는 배양 배지, 인간 또는 동물 체내에서 생성된 다른 부류 또는 타입의 면역글로블린 분자로부터 유도될 수 있다. 예를들어, 페록시다아제 표지된 항체와 같이, 효소 표지된 항체로부터의 신호는 티라마이드 강화 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 다른 유사한 표지 및 효소들이 이용될 수 있다. 이러한 분자들은 이 기술분야의 숙련자에게 익숙하다. 형광-염로 표지된 항체는 변형된 기질의 검출에 이용될 수 있다. 도 3A 및 B에 각각 나타낸 단일-항체 및 이중 항체 검출 시스템에 부가적으로, 고체 표면상에 포획된 변형된 키메라는 3-항체 검출 시스템(도 3C)을 이용하여 검출될 수 있다. 간단히 설명하면, 변형된 기질에 결합된 일차 항체는 그 일차 항체에특이적인 2차 항체에 결합될 수 있다. 변형된 기질, 일차 항체 및 2차 항체의 복합체는 표지된 3차 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 더욱이, 변형된 기질은 예를들어, 인산기에 고 친화성을 갖는 갈륨 니트릴로트리아세테이트(갈륨NTA)와 같은 특정 킬레이팅 분자를 이용하여 검출될 수 있다. 따라서, 갈륨-NTA는 PNA 키메라의 인산화된 펩타이드 검출에 이용될 수 있다.
고체 매트릭스상에서 상기 PNA-기질 키메라와 DNA 올리고뉴클레오티드의 혼성화 조건은 이 기술분야에 알려져 있다; 참조예, Peptide Nucleic Acids: Protocols and Application, edited by Nielsen, P. E. & Egholm, M., pg. 87-162, Horizon Scientific Press(1999). 이 기술분야에 알려진 방법은 센서 올리고뉴클레오티드에 대한 키메라를 포획하기위한 광범위한 범위의 적절한 혼성화 조건 및 용액을 제공한다. 바람직한 구체화로, 올리고뉴클레오티드-기능화된 마이크로입자에 대한 PNA-기질 키메라를 포획하는 공정은 하기 기술된 조건을 따른다. 예비-혼성화는 바람직하게 혼성화 버퍼(예, 10mM 소디움 포스페이트, 15mM 소디움 클로라이드, 1mg/ml BSA, 및 0.1mg/ml 열-변성 청어 정자 DNA, 0.1% SDS, 10% 포름아마이드, pH 7.2)내에서 약 45℃, 약 30분동안 일정 교반하에 올리고뉴클레오티드-기능화된 마이크로입자를 배양할 수 있다. BSA는 예비-혼성화도중 마이크로입자의 표면상에 차지되지않은 자리를 블록킹하는 작용을 한다. 다른 거대 비-특이 단백질(비-지방성 건조 우유와 같은)은 BSA의 대체물로 적절하다.
혼성화 단계는 바람직하게 상기 키메라의 포획부에 완전히 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한다. PNA-기질 키메라는 최종 농도10-100nM로 올리고뉴클레오티드-기능화된 입자의 서스펜션에 첨가된다. 혼성화는 적절한 조건, 바람직하게 일정 교반하에 약 1시간동안 약 45℃에서 행하여진다. 혼성화후, 혼성화된 마이크로입자는 바람직하게 세정 버퍼로, 보다 바람직하게는 하이 스트린전시 버퍼(예, 10mM 소디움 포스페이트, 15mM 소디움 클로라이트, 0.1% SDS, pH 7.1)로, 일정한 교반하에 약 30분동안 약 45℃에서 세정된다. 그 다음 상기 마이크로입자는 일차 세정 버퍼(예, 10mM 소디움 포스페이트, 15mM 소디움 클로라이드, pH 7.2)로 세정된 다음 2차 세정 버퍼(예, 100mM 소디움 포스페이트 및 150mM 소디움 클로라이드, pH 7.2)로 약 10분동안 실온에서 세정된다. 혼성화 조건 및 세정 빈도는 키메라의 포획부의 염기 서열에 따라 조절될 수 있다. 일반적인 PNA 혼성화 프로토콜은 Nielsen 및 Egholm(Peptide Nucleic Acids, Protocols and Applications, Edited by Peter E. Nielsen and Michael Egholm, Horizon Scientific Press(1999))에 의해 이미 기술된 바 있다.
본 발명의 다중 어세이는 효소과의 멤버, 관련된 DNA-바인딩 분자, 관련된 수용체-리간드 쌍 등과 같은 관련된 실체의 존재 혹은 활성 수준을 검출하는데 특히 매우-적절하다. 본 발명의 다중 어세이에서 활성이 검출될 수 있는 바람직한 효소 과(family)는 단백질의 인산화 및/또는 탈인반응을 촉진하는 것들이다. 세린, 트레오닌 및 티로신 잔기의 인산화는 일반적으로 세포내 이벤트에 가장 중요한 조절 메카니즘중 하나인 것으로 여겨진다. 세포 멤브레인상에 있는 수용체의 자극은 카이네이즈의 캐스캐이드를 활성화시켜 그 결과 여러가지 세포내 단백질의 인산화를 일으킨다. 이러한 반응은 가역적이며, 세포가 무수히 많은 자극적인 신호에 대하여 역학적인 방식으로 반응할 수 있도록 한다. 통상적인 방법을 이용하여 상호연결된 신호전달 경로에서 다중 키나아제에 대한 활성을 동시에 검출하는 것은 어렵니다. 본 발명의 분자 구조물을 이용하여, 각각의 다중 기질에 대한 고유한 태그가 제조가능하여 다중 분석을 가능하게 한다. 인산화시, 인산화된 PNA 키메라는 예를들어, 인-지질 바인딩 단백질, 인-지질-특이 바인딩 항체 또는 인-지질 바인딩 킬레이트와 같은 인산화된 기질에 특이적으로 반응적인 검출가능한 리간드를 이용하여 검출하는 올리고뉴클레오티드-기능화된 색-암호화된 마이크로입자에 대하여 서열-특이적으로 포획될 수 있다. 따라서, 다중 키나아제의 활성화는 조직과 세포 및 다른 시료에서 동시에 검출될 수 있다.
키나아제 단백질의 활성을 측정하는 일 례는 도 4에 개략적으로 나타낸다. 여기서, Raf 단백질(Raf-1, A-Raf, 및 B-Raf)은 아미노-말단 조절 도메인 및 카르복시-말단 촉매 도메인을 함유하는 PKC 과에 대하여 상동성을 갖는 세린-트레오닌 키나아제이다. Raf 과의 멤버는 Ras 단백질에 바인딩하여 그 결과 이들이 플라즈마 멤브레인으로 변위되도록 하며 후속적인 활성을 일으킨다. 비활성적인 MEK1 카이네이즈의 인산화에 의해, Raf 카이네이즈는 MEK1 카이네이즈를 활성화시키고, 이는 차례로 MAP 카이네이즈 2/Erk2를 활성화시킨다. Raf 카이네이즈는 Ras로부터 MAP 카이네이즈로의 신호전달을 매개한다. 이러한 신호 복합체의 조절은 최근 Kolch에 의해 리뷰된 바 있다(J. Biochem(2000), 35:289-305).
MAP 카이네이즈 2/Erk2의 활성은 PNA-MAP 카이네이즈 기질 펩타이드 키메라를 이용하여 검출될 수 있다. 인산화된 PNA-펩타이드 키메라는올리고뉴클레오티드-기능화된 색-암호 마이크로입자에 대하여 서열-특이적으로 포획된 다음, 인산화된 세린/트레오닌 부의 검출이 이루어진다. 예를들어, 2'-아미노-3'-메톡시플라본(C16H13NO3)과 같은 카이네이즈 억제제를 첨가함으로써, 특정 카이네이즈는 신호전달 경로에서 억제될 수 있다(참조 도 4). 따라서, 세포 시료에서 카이네이즈 활성을 검출하기위해 캐스캐이드 카이네이즈 어세이는 본 발명의 분자 구조물과 함께 사용될 수 있다. 이러한 어세이는 질병 조건 및 질병의 단계와 관련된 이상 카이네이즈 활성을 검출하는데 유용하다. 다수의 중요한 성장 인자는 Ras/Raf 신호 전달 경로를 사용하여 세포를 자극하고 복제하며 그 신호 복합체는 특정 암에서 비정상적인 활성을 갖는 것으로 밝혀져 있다. 이러한 어세이는 또한 드럭 개발 및 신호전달의 연구와 관련된 방법에 유용하다.
다중 카이네이즈 활성을 검출하는 두번째 비-제한적 예는 비-수용체 티로신 카이네이즈의 JAK(Janus-과 티로신 카이네이즈)와 관련된다. JAKs는 세포내부의 사이토카인 수용체와 관련되며, 세포외 사이토카인에 의해 활성화된다. JAK 카이네이즈(JAK1, JAK2, JAK3 및 Tyk2)는 카이네이즈 도메인 및 효소적으로 활성적이지않는 슈도카이네이즈 도메인을 갖는다. 사이토카인 바인딩은 사이토카인 수용체 이합체화를 일으키며, 이는 상기 수용체 자체를 인산화시키는 관련 JAKs를 활성화시킨다. 그 다음 인산화된 수용체는 SH2-함유 STATs(신호 전달자 및 전사 활성자)에 대한 도킹 자리로서 제공된다. JAK1은 IL-2, IL-6(gp130), 및 인터페론(IFN) 수용체로부터의 신호전달에 필수적이다. JAK3는 일반 g 사슬을 공유하는 사이토카인 수용체를통한 신호전달에 필요하다. JAK2는 다른 서브셋의 사이토카인 수용체를 통한 신호전달에 필요하다. 또한, JAKs는 또한 Ras-MAP 카이네이즈 경로를 활성화시키며 세포에서 Tec, PI-3 카이네이즈 경로를 통과한다. JAKs의 일차 영향인자인 STATs는 잠재적인 세포질성 전사인자이다. JAK 카이네이즈에 의해 인산화되면 STATs는 이들의 SH 도메인을 통해 헤드-투-테일 형식으로 이합체화된다. STAT1은 IFN 시그날링의 중요한 매개자이며, STAT4는 IL-12에 특이적이며, STAT6는 IL-4 및 IL-13에 의해 일차적으로 활성화되는 반면, STAT5A 및 STAT5B는 성장 호르몬 및 프롤락틴의 조절에 가장 중요한 것으로 여겨진다. 이러한 STAT-유도 인산화 이벤트는 또한 특정 전사반응을 일으킨다. gp130/JAK/STAT 신호 경로의 조절은 Heinrich 등에 의해 리뷰된 바 있다(Biotech. J. 334:297-314(1998)).
본 발명의 PNA-기질 키메라의 수집은 다중 JAK 또는 STAT 단백질을 동시에 모니터 혹은 검출하는데 이용될 수 있다. PNA-STAT 키메라를 이용함으로써, 다중 STATs의 인산화가 세포-기초 어세이에서 동시에 검출될 수 있다. 다중 STAT 단백질 활성 수준을 측정하는 방법은 세포-침투 PNA 키메라를 포함하는 여러가지 종류의 PNA-STAT 키메라를 관심있는 세포 배양물내에 첨가하는 것으로 시작한다. 사이토카인 혹은 관심있는 다른 화합물로부터의 자극에 대한 반응으로, JAK-STAT 신호 전달 경로가 활성화되며, 그 결과 PNA-STAT 키메라를 포함하는 STAT 단백질의 인산화가 일어난다. 세포가 표준 방법에 의해 융해되는 경우, PNA-STAT 키메라는 용액으로 방출된다. 그 다음 PNA-STAT 키메라는 올리고뉴클레오티드-기능화된 마이크로입자에 대하여 서열-특이적으로 포획되며 검출된다. 마이크로입자상에서 PNA 키메라와올리고뉴클레오티드의 혼성화는 시험관(시험관내 혼성화)에서 또는 마이크로입자 배열을 갖는 실리콘 칩상(온-칩 혼성화)에서 행해질 수 있다. 본 발명의 이러한 구체화는 도 5에 개략적으로 나타내어진다.
PNA-STAT 키메라에 부가적으로, 예를들어, PNA-JAK 키메라 및 관심있는 에피토프를 함유하는 PNA-펩타이드 키메라와 같은 다른 종류의 PNA-단백질 키메라는 다른 신호전달 경로의 다른 영향인자를 검출하기위한 세포-기초 기능 어세이에 사용될 수 있다. 이러한 어세이는 특히 질병 조건을 매개하기위하여 카이네이즈-활성화된 전사 활성을 블록킹하는데 유용하다. 인간에서 JAK/STAT 신호 경로는 특정 백혈병의 발달과 연결되어 있다. 또한, 이러한 어세이는 드럭 개발 어세이 및 기능적 프로테오믹스 어세이에 유용하다.
다중 카이네이즈 활성 검출의 다른 예는 Akt(또한 PKB 및 RAC이라고도 칭하여짐)와 관련되며, 이는 세포사멸(apoptosis)의 조절 및 발생에 활성적인 역할을 하는 단백질이다. Akt/PKB 단백질 카이네이즈는 인슐린 및 여러가지 성장인자에 의해 활성화된다. 이는 PI-3 카이네이즈를 포함하는 Wormannin-센서티브 경로에 작용한다. Akt/PKB는 PI-3 카이네이즈의 활성에 반응하는 멤브레인의 인산화된 리피드에 바인딩하는 아미노 말단 플렉스트린(pleckstrin) 상동성 도메인을 함유한다. Akt/PKB는 활성화 루프의 트레오닌 308 및 C-말단 부위의 세린 473에서의 인지질 바인딩 및 PKD1 인산화에 의해 활성화된다. Akt/PKB는 Bad, Forkhead 전사 인자(FKHR), GSK-3, 및 캐스페이즈-9와 같은 여러가지 표적을 인산화 및 비활성화시키는 능력을 통해 세포사멸을 억제함으로써 세포 생존을 촉진시키는 기능을한다. 기질로서 PNA-PKDtide 키메라 및 PNA-Akt/SGK 펩타이드 키메라를 이용하여 PKD1 및 Akt/PKB의 활성이 조직 및 세포에서 동시에 검출될 수 있다. 이러한 방법은 인산화가 일어나도록 PNA 펩타이드 키메라를 시료에 첨가하는 것을 포함한다. 인산화후, 인산화된 PNA 펩타이드 키메라는 색-암호화된 자성 입자를 포함하는 올리고뉴클레오-기능화된 색-암호화된 마이크로입자에 대하여 서열-특이적으로 포획될 수 있다. 포획된 인산화 펩타이드는 그 다음, 인산화된 펩타이드 특이 리간드 또는 인산화된 펩타이드-특이 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 이러한 공정의 개략적인 도면이 도 6A에 나타내어진다.
또한, 도 6B에 나타낸 바와 같이, Akt/PKB 시그날링은 또한 PNA 키메라 세포-기초 어세이에서 시스템적으로 조사될 수 있다. 이 방법은 예를들어, PKD, Akt/PKB, 캐스페이즈 9, FKHR, Bad, 및 GSK-3과 같은 PKD1/2 및/또는 Akt/PKB의 기질이 되는 기질부를 갖는 하나 또는 그 이상의 PNA 단백질 키메라를 관심있는 세포 시료에 첨가하는 것을 포함한다. 이 시점에서, 내부 카이네이즈 활성은 PNA 키메라를 수집하여 이들 단백질의 활성 상태 및/또는 수준을 측정하여 직접 측정된다. 택일적으로, 상기 세포 시료는 예를들어 인슐린 또는 성장 호르몬과 같은 활성 조절자와 함께 처리될 수 있다. 이러한 조절자의 세포 수용체와의 바인딩은 세포 멤브레인의 내부에 위치하는 PDK1/2를 활성화시킬 수 있다. 활성화된 PDK1/2는 Akt/PKB를 인산화시키며, 이는 차례로 캐스페이즈 9, FKHR, Bad, 및 GSK-3 단백질을 인산화시킨다. 그 다음 상기 세포는 융해되고, 이에 따라 PNA-단백질 키메라를 방출한다. PNA 키메라는 서열-특이적인 올리고뉴클레오티드-기능화된 마이크로입자 혹은다른 고체 매트릭스와 혼성화된다. 그 다음 키메라의 변형된 기질부는 표준 방법에 의해 검출된다. 이 어세이는 도 6B에 개략적으로 나타내어진다. 이 어세이는 질병 조건 및 질병의 단계와 관련된 이상 카이네이즈 활성을 검출하는데 유용하다. 앞선 연구는 알츠하이머 질병을 가진 환자에서 돌연변이 프레세닐린-1 유전자가 세포사멸을 유도하고 Akt/PKB를 하향조절함을 보여준 바 있다(Wehl, et al. J. Neuroscience 19: 5360-5369(1999)). 이 어세이는 또한 질병 조건과 같은 진단에 유용하다.
본 발명의 방법에 의해 분석될 수 있는 다른 과의 단백질은 캐스페이즈이다. 이 과의 효소들은 세포사멸, 프로그램된 세포 죽음의 조절과 관련된다. 미토콘드리아의 사이토크롬 c의 방출과 같은 프로-에이팝토틱 신호는 캐스페이즈 8, 9 및 10과 같은 개시제 캐스페이즈의 자기촉매 활성화를 촉진한다. 활성화된 캐스페이즈는 캐스페이즈 3, 6 및 7과 같은 하향 영향인자를 분할 및 활성화시키며, 차례로 세포사멸 세포의 사이토스켈레털 및 핵 단백질을 분할한다. 다른 프로-에이팝토틱 자극은 세포 표면 수용체에 Fas 리간드와 TNF-α의 바인딩, 세포내부의 소포체(ER)에 대한 DNA 손상 및 스트레스를 포함한다. Fas 및 TNF 수용체는 캐스페이즈 8 및 10을 활성화시키며, 손상된 DNA는 캐스페이즈 9의 활성화를 이끌며, 한편 ER 스트레스는 캐스페이즈 12의 칼슘-매개 활성화를 이끈다. 이러한 복합적인 스킴이 도 7에 나타내어진다. PNA 키메라를 이용한 본 발명의 다중 어세이는 시그날링 이벤트 또는 세포 기능의 영향을 동시에 모니터링하는 효과적인 수단으로 제공된다.
본 발명의 일 구체화로, PNA-캐스페이즈 키메라는 각 키메라가 규정된 프로-캐스페이즈의 분할 사이트를 함유하도록 제조된다. 또한 상기 PNA-캐스페이즈는 검출을 위해 최소 하나의 표지된 태그, 바람직하게 예를들어, 형광 태그 및 폴리히스티딘 태그와 같은 두개의 태그를 함유한다. 이들 두 태그는 펩타이드 기질의 분할 부위의 측면에 위치한다. 세포-투과성 PNA-캐스페이즈 키메라의 혼합물이 관심있는 세포 시료에 첨가된다. TNF-α 또는 Fas 리간드와 같은 프로-에이팝토틱 자극이 선택된 시료에 첨가되어 프로그램된 세포 사멸 신호를 유발시킬 수 있다. 에이팝토틱 경로의 활성화는 PNA-캐스페이즈 키메라를 포함하는 여러가지 캐스페이즈 기질의 분할을 이끈다. 이중-표지된 PNA 키메라에 함유된 형광 염료중 하나는 캐스페이즈-촉매화된 분할에 의해 제거된다. 세포가 융해되는 경우, PNA 키메라가 방출된다. 그 다음 방출된 PNA 키메라는 올리고뉴클레오티드-기능화된 마이크로입자상에 포획된다. 단일 태그된 분할 생성물 또는 이중 태그된 비분할 생성물의 형광이 검출되고 분석된다.
본 발명의 다른 구체화로, 상기 방법은 새로운 드럭의 동정에 유용하다. 이 구체화에서, 소 분자 드럭 캔대데이트는 PNAs에 접합되고 효과에 대하여 시험된다. 이러한 PNA-소 분자 키메라는 드럭 개발을 위한 리간드의 고-처리 스크리닝에 사용될 수 있다. 이러한 방법의 일 례는 도 8에 개략적으로 나타내어진다. 여기서, PNA-소 분자 키메라의 라이브러리는 스크리닝을 위해 준비된다. 각각의 키메라는 기질 도메인으로서 규정된 소 분자 및 앵커링 도메인으로서 알려진 염기 서열을 갖는 PNA 올리고머를 함유한다. PNA-소 분자 키메라의 혼합물은 관심있는 세포 배양물내로 첨가되어지고 키메라와 관심있는 표적의 바인딩이 이루어지게 하며 표적 세포의 활성을 유발시킨다. 도 8은 신호 전달을 유발하는 G-단백질 결합된 수용체(GPCR)를 나타낸다. 활성화 후, 효과적인 PNA-소 분자 키메라는 색-암호화된 마이크로입자상에 나타내어진 이들의 상보적인 올리고뉴클레오티드에 결합된다. 검출은 소 분자상에 태그를 검출하여 또는 검출가능한 소 분자-특이 리간드의 바인딩으로 이루어질 수 있다. 포획 및 앵커 도메인에 의해 형성된 이중가닥의 용융 온도보다 높은 온도로 용액에서 배양함으로써 포획된 소 분자-PNAs를 입자로부터 스트리핑하는 것이 또한 바람직하다. 그 다음 회수된 PNA-소분자 키메라는 더욱 분석될 수 있다.
형광 현미경에 의한 검출에 부가적으로, 색-암호화된 마이크로입자상에 상보적인 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 PNA 키메라의 평면 배열인 각각의 마이크로입자-디스플레이 PNA-키메라는 플로우 사이토메트리에 의해 검출될 수 있다. 이 구체화는 도 9에 나타내어진다. 이에 따라, 색-암호화된 입자상에 고정화된 올리고뉴클레오티드와 PNA 키메라의 서열-특이적 혼성화는 서스펜션내에서 행해질 수 있다. 혼성화후, 입자들은 관심있는 키메라의 변형된 기질부에 고 결합 친화력을 갖는 리간드와 함께 배양된다. 또한, 상기 리간드는 검출을 위한 특정 플로로크롬을 함유할 수 있다. 택일적으로, 이차 검출가능한 리간드가 일차 리간드를 장식할 수 있으며, 이는 키메라에 바인딩하여 검출 플로로크롬의 방출 파장이 색-암호화된 입자의 형광과 구별가능하게하는 것을 확실히 해준다. PNA 혼성화의 검출을 위해, 입자는 플로우 사이토메트리에 의해 분석된다. 다른 타입의 입자는 이들의 특정 형광에 따라 확인된다. 포획된 PNA 키메라를 갖는 입자는 검출 플로로크롬으로부터 특정 형광에 따라 확인될 수 있다.
본 발명의 다른 구체화로, 상기 PNA 키메라는 특정 세포, 즉 세포 프리젠팅 특이 단백질 또는 이들의 세포 표면상에서 다른 인지 실체를 검출 및 분리하는데 사용된다. 예를들어, 관심있는 세포 표면 수용체에 대하여 특이한 PNA-항체 키메라가 제조된다. 상기 항체는 포획 공정을 모니터하기위하여 형광 염료로 표지될 수 있다. 이 방법의 일 례는 도 10에 나타내어진다. 여기서, CD4+ 세포 및 CD8+ 세포가 검출되고 포획된다. Cy3 및 Cy5는 일차 아민을 함유하는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 화합물인 단백질에 대한 형광 표지인 수-용성 시아닌 염료이다.
본 발명의 다른 구체화로, PNA-키메라의 기질부는 핵산 바인딩 도메인을 포함한다. 이 구체화에서, PNA-키메라는 상기 키메라의 기능 도메인과 상호작용가능한 것으로 의심되는 검출가능한 핵산에 노출된다. 그 다음 바인딩된 핵산은 고체 매트릭스상에 포획된 올리고뉴클레오티드상에 포획되고 검출된다. 이 구체화는 또는 다중화될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 제조 및 사용을 설명한다. 이러한 실시예는 설명을 위해 제공되는 것이며, 어느 방식으로 본 발명의 견지를 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
PNA 키메라의 포획용 마이크로입자의 표면에 DNA 올리고뉴클레오티드의 결합
올리고뉴클레오티드 프로브를 고체 표면, 예, 색-암호화된 마이크로입자에 부착시키기위해 두가지 다른 시도가 사용될 수 있다. 첫번째 시도로, 간접 결합 바이오티닐레이티드 올리고뉴클레오티드는 그 고체 표면에 접합된 스트렙타비딘 혹은 그 유도체와 상혹작용한다. 마이크로입자와 같은 고체 표면에 단백질의 접합 공정은 이 기술분야에 알려져 있다(Bioconjugate Techniques, editied by Greg T. Hermanson, Academic Press, 1995). 도 11A에 나타낸 바와 같이, 바이오티닐레이티드 올리고뉴클레오티드는 스트렙타비딘의 변형된 형태인 NeutrAvidin에 효과적으로 결합되며, 이는 상기 마이크로입자에 접합된다. 간단히 설명하면, Cy5-표지 바이오티닐레이티드 올리고뉴클레오티드의 양을 증가시키면서(0.488, 0.977, 1.953, 3.906, 7.813, 15.63, 31.25, 62.5, 125 및 250nM) 주어진 고정된 수의 색-암호화된 NeutrAvidin-기능화된 비드와 함께 배양하였다. 그 결합 반응은 30분동안 실온 PBS에서 이루어졌다. 결합후, 결합되지않은 올리고뉴클레오티드는 PBST를 이용하여 비드를 세정하여 제거되었다. 마이크로입자의 표면상에 차지되지않은 부위는 BSA(100mM 포스페이트 버퍼(pH 7.4)내에 용해된 10mg/ml)를 이용하여 블록킹되었다. 100mM 포스페이트 버퍼(pH 7.4)로 세정한 후, 상기 마이크로입자는 4℃ 저장 버퍼에 보관될 수 있다. 그 다음 다른 타입의 비드를 시험관내에 혼합하여 마이크로입자 배열로 배열하였다. 그 배열은 형광 현미경하에 조사되었다. NeutrAvidin의 적정 시리즈에 대한 결과를 도 11A에 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 농도가 증가함에 따라, 1000ms 인테그레이션 시간으로 기록된 Cy5 신호 강도는 약 100에서 6000으로 증가한 바와 같이, 바이오티닐레이티드 올리고뉴클레오티드 31nM의 결합이 NeutrAvidin-기능화된 비드상에 있는 모든 바인딩 부위(3.2㎛ 직경)를 포화시킬 수 있다. 도 11A에 나타낸 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다.
또한 올리고뉴클레오티드는 공유결합을 형성하는 화학 반응에 의해 고체 캐리어의 표면에 직접 접합될 수 있다. 아민기는 종래 알려진 기술 방법에 따라 올리고뉴클레오티드의 5'말단에 편입될 수 있다. 토실-활성화된 마이크로입자에 올리고뉴클레오티드의 접합은 단일 단계 반응으로 이루어졌다. 아민-토실 매개된 직접 결합의 예는 도 11B에 나타내어진다. 간단히 설명하면, Cy5-표지된 아민-변형된 올리고뉴클레오티드의 양을 증가시키면서(0.977, 1.953, 3.906, 7.813, 15.63, 31.25, 62.5, 125, 250, 및 500 nM) 고정된 수의 색-암호화된 토실-활성화 비드와 함께 배양하였다. 일반적으로, 결합 반응은 100mM 소디움 포스페이트, pH 7.4에서 37℃에서 밤새 이루어졌다. 결합후, 결합되지않은 올리고뉴클레오티드는 PBST를 이용하여 비드를 세정함으로써 제거되었으며, 입자의 표면에 차지되지않은 부위를 블록킹하기위해 마이크로입자는 BSA(100mM 소디움 포스페이트(pH 7.4) 500㎕내에 용해된 10mg/ml)과 함께 배양되었다. 블록킹은 일정한 교반하에 37℃에서 1시간동안 수행되었다. 그 다음 다른 타입의 비드가 시험관내에 혼합되어 마이크로입자 배열로 집합되었다. 그 배열은 형광 현미경하에 조사되었다. 도 11B에서 적정 시리즈에 대한 결과는 올리고뉴클레오티드 농도가 증가함에 따라, 1000ms 인테그레이션에서 기록된 Cy5 신호 강도는 약 100에서 5000으로 증가하였다. 도 11B에 나타낸 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다. 아민-표지된 올리고뉴클레오티드 250nM를 이용한 결합은 토실-활성화된 코팅된 비드상에 있는 모든 바인딩 부위(3.2㎛ 직경)를 포화시킬 수 있다. 100mM 포스페이트 버퍼, pH 7.4로 세정한 후, 상기 올리고뉴클레오티드-기능화된 마이크로입자는 저장 버퍼(100mM 포스페이느, 1mM EDTA, 0.05% 소디움 아지드 함유)에 일정한 교반하 4℃에서 보관될 수 있다.
실시예 2
바이오티닐레이티드 PNA 올리고머의 정제
합성 PNA 키메라는 액체 크로마토그래페에 의해 정제될 수 있다. 두개의 바이오티닐레이티드 PNA 올리고머의 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제의 예가 도 12에 나타내어진다. 바이오티닐레이티드 비스-PNA("PNA 클램프") 및 선형 PNA는 각각 4.3kD 및 7.5kD의 분자량을 갖는다. 상기 PNA 올리고머는 125mM NaCl이 함유된 10mM Tris-버퍼, pH 7.5에서 겔 투과 컬럼상에서 분리되고 260nM의 파장에서 크로마토그래피 프로필을 모니터링하였다. 용출물 0.5ml의 48 분획을 0.5ml/분의 흐름속도로 수집하였다. 각각 4.3KD PNA 클램프(분획 25) 및 7.5KD 선형 PNA(분획 28)에 해당하는 짧고 긴 두개의 고유한 피크가 확인되었다. 정제된 PNA 올리고머의 분자량은 질량 분광법 분석에 의해 확인되었다.
실시예 3
정제된 PNA-펩타이드 키메라의 분광분석학적 프로필
플로로포어로 PNA 키메라의 표지를 확인하기위해, 주사 분광광도계를 이용하여 정제된 PNA 키메라의 분광분석학적 프로필을 기록하였다. 도 13A 및 B에 각각나타낸, 정제된 테트라메틸 로다민(TMR)-표지된 PNA-펩타이드 키메라 및 Cy5-표지된 PNA에 대한 분광분석학적 프로필은 PNA 및 형광 염료에 대한 뚜렷한 흡착 특성을 보여준다. 250-300nm의 파장 범위에서 피크는 펩타이드를 함유하거나 함유하지않은 것에 상응하는 것이며, TMR 표지(도 13A)는 500-550nm 범위에서 피크로 확인되며 그리고 Cy5 표지(도 13B)는 625-675nm 파장범위에서 피크로 확인된다.
실시예 4
마이크로입자 배열상에서 DNA 올리고뉴클레오티드와 비스-PNA 올리고머의 온-칩 혼성화
마이크로입자 배열상에 고정된 DNA 올리고뉴클레오티드에 대한 비스-PNA 올리고머의 서열-특이 포획을 확인하기위해 온-칩 혼성화 어세이를 행하였다. 간단히 설명하면, 비스-PNA 올리고머는 각 암(arm)에 12-13 티민 염기를 가진 바이오티닐레이티드 PNA 클램프이었다. 혼성화전에, 4가지 타입의 바이오티닐레이티드 올리고뉴클레오티드가 NeutrAvidin-기능화 마이크로입자에 결합되었으며, 각각의 올리고뉴클레오티드는 18-mer 올리고아데닌(A-18), 비관련 서열의 18 뉴클레오티드(N-18), 10-mer 폴리아데닌(A-10), 및 비관련 서열의 뉴클레오티드(N-10)를 함유하였다. 결합후, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브를 함유하지않은 음성 대조구 입자와 함께 모든 올리고뉴클레오티드-기능화 마이크로입자를 실리콘 칩상에 마이크로입자 배열의 집합을 위해 하나의 튜브에 혼합하였다.우선 칩을 90mM NaCl, 83mM 구아니딘 티오시아네이트, 8mM MgCl2, 17nM EDTA, 0.1% 바이오틴, 0.1% 트윈-20, 70mM Tris-HCl을 함유하는 버퍼에서 pH7.5, 40℃, 20분동안 예비-혼성화하였다. 그 다음, 바이오티닐레이티드 비스-PNA를 200nM의 최종 농도로 예비-혼성화 버퍼에 첨가하였다. 혼성화는 40℃에서 1시간동안 습 챔버에서 이루어졌다. 음성 대조구에는 혼성화 버퍼에 PNA가 첨가되지않았다. 혼성화 완료시, 칩을 100mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.1% 트윈-20으로 실온에서 10분동안 세정하였다. 입자-표시된 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화된 바이오티닐레이티드 PNAs의 검출을 위해, 칩을 100mM NaCl, 100mM 소디움 포스페이트(pH 7.5)에 용해된 Cy5-접합된 스트렙타비딘(20㎍/ml)과 함께 실온에서 30분간 배양하였다. 15mM NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.5로 세정한 후, 형광 현미경을 사용하여 배열을 조사하였다. 특정 파장을 통과하는 다른 필터를 사용하여 동일한 칩으로부터 여러가지 이미지를 취하였다. 입자의 동정은 이들 각각의 색 암호에 따라 결정되었다. 칩의 CY5 이미지로부터 비드의 어세이 신호는 해독 입자로 통합되었다. 매칭된 A-10 및 A-18 그리고 매칭되지않은 N-10 및 A-18 입자로부터의 어세이 신호가 분석을 위해 추출되었다. Cy5 신호를 갖는 입자는 표준 이미지 분석에 의해 확인되었다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 비스-PNA 클램프는 10-mers 및 18-mers의 폴리아데닌으로 기능화된 입자에 특이적으로 혼성화되는 반면, 비스-PNA 클램프는 PNA를 포힉하지않는 음성 대조구 배열인 비관련 뉴클레오티드 서열(N-10 또는 N-18)에 혼성화되지않는다. 칩의 이미지를 자동적으로 정렬하기위해 컴퓨터 프로그램이 이용되었다. 상기 이미지로부터 다른 파장의 형광 강도가 추출되었으며, 그 칩상에서 상응하는 입자에 할당되었다. 그 다음 염색된 비드의 내부 염료의 형광 강도가 밀집되었다.
실시예 5
색-암호화된 마이크로입자상에서 비스-PNA 올리고머와 DNA 올리고뉴클레오티드의 시험관내 혼성화
색-암호화된 마이크로입자상에서 DNA 올리고뉴클레오티드에 대한 비스-PNA 올리고머의 서열-특이 포획을 확인하기위해 시험관내 혼성화 어세이를 행하였다. 간단히 설명하면, 비스-PNA 올리고머는 각 암(arm)에 12-13 티민 염기를 가진 바이오티닐레이티드 PNA 클램프이었다. 혼성화전에, 4가지 타입의 바이오티닐레이티드 올리고뉴클레오티드가 NeutrAvidin-기능화 마이크로입자에 결합되었으며, 각각의 올리고뉴클레오티드는 18-mer 올리고아데닌(A-18), 비관련 서열의 18 뉴클레오티드(N-18), 10-mer 폴리아데닌(A-10), 및 비관련 서열의 뉴클레오티드(N-10)를 함유하였다. 대조구 미아크로입자는 표면상에 올리고뉴클레오티드를 함유하지않았다. 결합후, 모든 올리고뉴클레오티드-기능화 마이크로입자를 하나의 튜브에 혼합하였다. 우선 상기 올리고뉴클레오티드-기능화된 마이크로입자를 90mM NaCl, 83mM 구아니딘 티오시아네이트, 8mM MgCl2, 17nM EDTA, 0.1% 바이오틴, 0.1% 트윈-20, 70mM Tris-HCl을 함유하는 버퍼에서 pH7.5, 40℃, 20분동안예비-혼성화하였다. 그 다음, 바이오티닐레이티드 비스-PNA를 200nM의 최종 농도로 예비-혼성화 버퍼에 첨가하였다. 혼성화는 40℃에서 1시간동안 습 챔버에서 이루어졌다. 음성 대조구에는 혼성화 버퍼에 PNA가 첨가되지않았다. 혼성화 완료시, 입자를 100mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.1% 트윈-20으로 실온에서 10분동안 세정한 다음, 실리콘 칩상에 마이크로 배열을 집합시켰다. 포획된 바이오티닐레이티드 PNAs의 검출을 위해, 칩을 100mM NaCl, 100mM 소디움 포스페이트(pH 7.5)에 용해된 Cy5-접합된 스트렙타비딘(20㎍/ml)과 함께 실온에서 30분간 배양하였다. 15mM NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.5로 세정한 후, 형광 현미경을 사용하여 배열을 조사하였다. 입자의 동정은 이들 각각의 색 암호에 따라 결정되었다. Cy5 신호를 갖는 입자는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 확인되었다. 도 15A에 나타낸 바와 같이, 비스-PNA 클램프는 A-18로 기능화된 입자에 혼성화되었지만 C-18 및 N-18로 기능화된 입자에는 혼성화되지않았다. 특히, 상기 비스-PNA 클램프는 Cy5.5 채널, 1000ms 인테그레이션에서 약 4750 아비트레리 유니트의 Cy5.5 신호를 생성하는 A-18에 대하여 특이적으로 포힉하였으며, 이에 반해 각각 약 500 및 1000의 Cy5.5 신호를 생성하는 C-18 및 N-18 기능화 입자에 대해서는 포획하지않았다. 시험관내 혼성화에 의해 생성된 Cy5.5 신호 강도(도 15A)는 실시예 4에 나타낸 바와 같이 행하여진 온-칩 혼성화(도 15B)와 비교할 만하였다.
실시예 6
마이크로입자 배열상에 나타난 DNA 올리고뉴클레오티드에 대한 PNA-단백질키메라의 혼성화
마이크로입자 배열상에 고정된 DNA 올리고뉴클레오티드에 대한 비스-PNA-단백질 키메라의 서열-특이 포획을 시험하기위해 온-칩 혼성화 어세이를 행하였다. 간단히 설명하면, PNA 단백질은 Cy5.5-표지된 스트렙타비딘과 바이오티닐레이티드 클램프의 접합체이었다. PNA 클램프는 각 배열상에 12-13 티민염기를 함유한다. 상당한 양의 Cy5.5-표지된 스트렙타비딘 및 바이오티닐레이티드 PNA가 접합에 사용되었으며 접합은 실온에서 30분동안 PBS에서 이루어졌다. 혼성화전, 4가지 타입의 바이오티닐레이티드 올리고뉴클레오티드가 NeutrAvidin-기능화 마이크로입자에 결합되었으며, 각각의 올리고뉴클레오티드는 18-mer 올리고아데닌(A-18), 18-mer의 올리고시토신(C-18) 및 비관련 서열의 18 뉴클레오티드(N-18)를 함유하였다. 결합후, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브를 함유하지않은 음성 대조구 입자와 함께 모든 올리고뉴클레오티드-기능화 마이크로입자를 실리콘 칩상에 마이크로입자 배열의 집합을 위해 하나의 튜브에 혼합하였다. 우선 칩을 90mM NaCl, 83mM 구아니딘 티오시아네이트, 8mM MgCl2, 17nM EDTA, 0.1% 바이오틴, 0.1% 트윈-20, 70mM Tris-HCl( pH7.5)을 함유하는 버퍼에서 40℃, 20분동안 예비-혼성화하였다. 그 다음, 비스-PNA 단백질 키메라를 200nM의 최종 농도로 예비-혼성화 버퍼에 첨가하였다. 혼성화는 40℃에서 1시간동안 습 챔버에서 이루어졌다. 음성 대조구에는 혼성화 버퍼에 PNA가 첨가되지않았다. 혼성화 완료시, 칩을 100mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.1% 트윈-20으로 실온에서 10분동안 세정하였다. 상기 칩은 형광 현미경을이용하여 조상되었다. 특정 파장을 통과하는 다른 필터를 사용하여 동일한 칩으로부터 여러가지 이미지를 취하였다. 입자의 동정은 이들 각각의 색 암호에 따라 결정되었다. Cy5.5 신호를 갖는 입자는 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 표준 이미지 분석에 의해 확인되었다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 비스-PNA 단백질 키메라는 PNA를 함유하지않는 대조구 칩에 비하여, 칩상에서 18-mers의 폴리아데닌과 결합된 입자에 특이적으로 혼성화되었다(1000ms 인테그레이션에서 140Cy5.5 신호 강도). 두가지 모든 예에서, C-18, N-18 및 대조구(표면상에 올리고뉴클레오티드가 함유되지않음)는 단지 약 45 유니트의 Cy5.5(1000ms 인테그레이션에서 신호 강도)를 나타내었다.
실시예 7
자성 색-암호화된 마이크로입자에 고정된 올리고뉴클레오티드에 대한 바이오티닐레이티드 PNS 올리고머의 온-칩 혼성화
색-암호화된 자성 입자상에 고정된 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 표적 분자의 온-칩 혼성화를 행하였다. 특히, 알려진 뉴클레오티드 서열을 가진 바이오티닐레이티드 올리고뉴클레오티드(0.4μM)가 표면상에 NeutrAvidin으로 코팅된 규정된 타입의 색-암호화된 자성 입자(약 6.7×105입자)에 결합되었다. 결합반응은 결합 버퍼 0.1ml(150mM NaCl, 0.05mM 에틸렌디아민 테트라-아세트산(EDTA), 0.5% BSA, 0.5mM Tris-HCl, 및 100mM 소디움 포스페이트, pH7.2)에서 실온하에 30분동안교반하여 행하여졌다. 결합후, 상기 입자들은 자석을 이용하여 수집되었다. 미반응된 NeutrAvidin 부위는 0.05% 트윈-20이 함유된 150mM NaCl 및 100mM 소디움 포스페이트(pH 7.2)내에 용해된 0.1% 바이오틴으로 20분간 교반하여 블록킹되었다. 블록킹후, 상기 입자는 0.05% 트윈-20이 함유된 150mM NaCl 및 100mM 소디움 포스페이트(pH 7.2) 0.2ml로 세정되었다. 이 프로토콜은 또한 다른 타입의 NeutrAvidin-코팅된 입자에 대하여 다른 바이오티닐레이티드 올리고뉴클레오티드가 결합되도록 적용되었다.
자성 입자 및 비-자성 대조구를 포함하는 여러 타입의 색-암호화된 올리고뉴클레오티드-기능화 마이크로입자를 이 기술분야에 알려진 방법에 따라 마이크로입자 배열의 집합을 위해 하나의 튜브에 혼합하였다. 본 실시예에서, 배열은 4,000 사이트의 배열 주형을 함유하는 2.5×2.5mm 실리콘 칩을 형성하였다. 마이크로입자-표시된 상보적 올리고뉴클레오티드 포획 프로브의 배열상에서 바이오티닐레이티드 펩타이드 핵산(PNA) 올리고머의 온-칩 혼성화는 200nM의 농도로 바이오티닐레이티드 PNA 올리고머를 함유하는 혼성화 버퍼(90mM NaCl, 83mM 구아니딘 티오시아네이트, 8mM MgCl2, 17nM EDTA, 0.02% 바이오틴, 0.1% 트윈-20, 70mM Tris-HCl, pH7.5) 30마이크로리터에서 수행되었다. 혼성화는 40℃, 회전 쉐이커상에서 60분동안 행하였다. 혼성화 완료시, 상기 배열은 250mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH7.5), 0.1% 트윈-20으로 이루어진 50마이크로리터로 실온에서 10분간 세정되었다. 150mM NaCl 및 100mM 소디움 포스페이트(pH7.2)내에 용해된 Cy5.5-접합된 스트렙타비딘(18마이크로그램/ml)과 함께 마이크로입자 배열을 실온에서 30분동안 배양하여 포획된 바이오티닐레이티드 PNA 올리고머를 가시화시켰다. 15mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH7.5)로 세정한 후, 배열을 형광 현미경하에 조사하였다. 색-암호화된 마이크로입자 및 Cy5.5=표지된 PNA 올리고머로부터 방출된 형광은 특정 파장을 갖는 광학 필터를 이용하여 측정되었다. 자성 및 비-자성 입자는 이들의 색 암호에 따라 해독되었다. Cy5 신호를 갖는 입자는 실시예 4에 기술된 바와 같은 표준 이미지 분석으로 확인되었다. 도 17에 나타낸 어세이 결과는 PNAs가 색-암호화된 자성 및 비-자성 입자상에 표시된 상보적인 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화됨을 나타내었다. 보다 상세하게, Cy5.5 신호 강도는 온-칩 혼성화 어세이에서 두 마이크로입자 배열(각각 패널 A 및 B에 대하여 칩 A 및 B)로부터 4가지 타입의 색-암호화된 마이크로입자(I, II, III 및 IV)에서 측정되었다. 타입 I 입자는 색-암호화된 자성 입자인 반면, 타입 II, III 및 IV는 자성이 아닌 3가지 다른 타입의 색-암호화된 입자이다. 타입 I 및 II 입자는 PNA 올리고머에 상보적인 바이오티닐레이티드 올리고뉴클레오티드로 고정되었다. 타입 III 입자는 PNA와 관련되지않은 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 결합되었다. 타입 IV 입자는 표면상에 올리고뉴클레오티드를 갖지않았다. 칩 A에 대한 음성 대조구로 제공된 칩 B는 PNA없이 혼성화 혼합물과 함께 배양되었다. "n"은 칩상에 입자의 수를 나타낸다. 타입 I 및 타입 II의 입자는 각각 약 2250 및 1500의 신호 강도를 생성하였으나, 이에 반해 타입 III 및 타입 IV는 약 400 및 250Cy5.5 신호 강도로 현저한 형광을 생성하지 않았다. 바는 평균의 표준편차를 나타낸다.
실시예 8
마이크로입자 배열상에서 올리고뉴클레오티드에 대한 PNA-소분자 키메라의 온-칩 혼성화
색-암호화된 마이크로입자 배열상에 표시된 DNA 올리고뉴클레오티드에 대한 비스-PNA-소분자 키메라의 서열-특이 포획을 확인하기위해 온-칩 혼성화를 행하였다. 간단히 설명하면, 상기 비스-PNA-소분자 키메라는 도 13 및 실시예 3과 관련하여 이미 기술된 바와 같이, 각 암(arm)에 규정된 서열의 10 염기와 Cy5 염료를 함유하는 비스-PNA의 접합체이었다. 혼성화전에, 4가지 타입의 바이오티닐레이티드 올리고뉴클레오티드가 실시예 1에 이미 기술된 바와 같이 NeutrAvidin-기능화 마이크로입자에 결합되었다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 10-mer 폴리아데닌(A-10), 및 상기 비스-PNA 올리고머의 암중 하나에 상보적인 10-mer(P-10)를 함유하였다. 또한 음성 마이크로입자는 올리고뉴클레오티드 포획 프로브를 함유하지않았다. 결합후, 올리고뉴클레오티드 포획 프로브를 함유하지않은 음성 대조구 입자와 함께 모든 올리고뉴클레오티드-기능화 마이크로입자를 실리콘 칩상에 마이크로입자 배열의 집합을 위해 하나의 튜브에 혼합하였다. 우선 칩을 90mM NaCl, 83mM 구아니딘 티오시아네이트, 8mM MgCl2, 17nM EDTA, 0.1% 바이오틴, 0.1% 트윈-20, 70mM Tris-HCl을 함유하는 버퍼에서 pH7.5, 40℃, 20분동안 예비-혼성화하였다. 비스-PNA-Cy5 접합체를 약 200nM의 최종 농도로 예비-혼성화 버퍼에 첨가하였다. 혼성화는 40℃에서 1시간동안 습 챔버에서 이루어졌다. 음성 대조구 칩은 PNA 키메라를 함유하지않은 혼성화 버퍼에 두었다. 혼성화 완료시, 칩을 15mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH 7.5)로 세정한 다음, 형광 현미경하에 조사하였다. 입자의 동정은 이들 각각의 색 암호에 따라 측정되었다. Cy5 신호를 갖는 입자는 실시예 4에 기술된 바와 같이 표준 이미지 분석에 의해 비드로부터 확인되었다. 도 18의 칩에 대한 어세이 결과는 A-10 입자 및 대조구 입자를 제외하고 상보적인 P-10 포획 프로브로 기능화된 입자에 비스-PNA-소분자 키메라가 특이적으로 혼성화되고, 혼성화 신호(500ms 인테그레이션 타임에서 기록됨)를 생성하나, 이에 반해 칩상에서 어떠한 입자도 현저한 신호를 생성하지않았음을 보여준다.
실시예 9
마이크로입자 배열상에 3 인산화된 펩타이드에 대한 표준곡선의 동시 생성
3개의 다른 바이오티닐레이티드 인산화 펩타이드(펩타이드-P-1, P-2, 및 P-3. 펩타이드-P-1: Biotin-CKVEKIGEGT[pY]GVVYK(SEQ ID NO: 1), 여기서 아미노산 11의 티로신은 인산화되며, 인간 티로신 카이네이즈 기질 p34cdc2로부터 유도됨(Cheng, et al. J. Biol. Chem. 267:9248-9256, 1992). 펩타이드-P-2: Biotin-CEGPWLEEEEEA[pY]GWMDFK-Biotin(SEQ ID NO: 2), 13번의 티로신에서 인산화되며, 인간 Gastrin-17임(Baldwin et al, Nature, 301, 435-437, 1983). 펩타이드-P-3: Biotin-CRRLIEDAE[pY]AARGK, 아미노산 10의 티로신에서 인산화되며, Rous 육종 바이러스 변형 단백질의 p60src에서 티로신 인산화 부위로부터유도됨(SEQ ID NO:3)(Casnelli et al, PNAS 79:282-286, 1982). 실시예 1에 기술된 바와 같이 NeutrAvidin으로 기능화된 색-암호화된 마이크로입자에 펩타이드-P-1, 펩타이드-P-2, 및 펩타이드-P-3를 규정된 농도 0, 0.0012, 0.0024, 0.0048, 0.0064, 0.008 및 0.012pg/ml로 결합하였다. 그 다음 실시예 1에 기술된 바와 같이 알려진 방법에 따라 모든 펩타이드-기능화된 마이크로입자를 혼합하여 마이크로입자 배열내로 집합시켰다. 집합된 마이크로입자 배열을 모든 펩타이드상에서 인산화 변형에 특이한 모노클로날 항체와 함께 배양하였다. 신호 증폭 목적으로, 상기 칩을 상기 배열에 결합된 일차 모노클로날 항체에 특이한 형광 염료-표지된 2차 항체와 함께 배양하였다. PBST로 세정한 후, 상기 배열을 READ 어세이와 같이 종래 기술 방법에 따라 형광 현미경을 사용하여 조사하였다. 이 방법을 이용함으로써, 3개의 인산화된 펨타이드 표준 곡선이 하나의 마이크로입자 배열을 이용하여 생성되었다(도 19). 펩타이드 농도가 증가함에 따라, 500ms 인테그레이션 타임에서 Cy5 형광 신호 강도는 일반적으로 3가지 모든 인산화 펩타이드에 대하여 증가할 뿐만아니라 500 타임 인테그레이션에서 약 400-1400 유니트의 Cy5 신호강도범위에서 증가하였다. 도 19에 나타낸 오차 막대는 평균의 표준편차를 나타낸다.
실시예 10
마이크로입자 배열상에서 인산화 펩타이드 표준 곡선의 생성
실시예 9에 기술된 바와 같은 각 타입의 바이오티닐레이티드 인산화 펩타이드(펩타이드-P-1 및 P-2)를 0, 0.002, 0.004, 0.008, 0.01 및 0.12㎍/ml의 규정된농도로 실시예 1에 기술된 방법과 같이 종래 알려진 방법에 따라 표면상에 NeutrAvidin으로 코팅된 규정된 타입의 색-암호화 비드에 결합하였다. 상기 입자의 표면상에 미반응된 부위는 종래 알려진 방법에 따라 블록킹되었다. 그 다음 동일한 타입의 인산화 펩타이드로 기능화된 비드를 시험 튜브에 혼합하여 가출원 제 60/343,621(2001, 12, 28 출원) 및 미국출원 제 10/192,352(2002, 7, 9 출원)에 이미 기술된 LEAPS 및 직접 배치 어셈블리 방법과 같이 종래 알려진 기술 방법에 따라 마이크로입바 배열로 집합시켰다. 집합된 마이크로입자 배열은 상기 모든 펩타이드상에서 인산화 변형에 특이한 모노클로날 항체와 함께 배양되었다. 신호 증폭의 목적으로, 특정 2차 항체 및 형광(Cy5)-표지된 3차 항체를 이용하여 일차 모노클로날 항체를 더욱 결합시켰다. PBST로 세정한 후, READ 어세이와 같이 종래 알려진 기술방법에 따라 형광 현미경을 이용하여 그 배열을 조사하였다. 이 방법을 이용함으로써, 인산화된 펩타이드에 대한 표준 곡선이 마이크로입자 배열을 이용하여 생성되었다(도 20). P-펩타이드-1에 대하여, 500ms 인테그레이션에서 Cy5 신호 강도는 약 500에서 5000유니트로 증가하였으며, 0.008㎍/ml의 농도에서 피크를 나타내었다. 마찬가지로, 펩타이드-P-2에 대하여, 500ms 인테그레이션에서 Cy5 신호강도는 약 500에서 약 4500유니트로 증가하였으며, 역시 0.008㎍/ml의 농도에서 피크를 나타내었다. 도 20에 나타낸 오차 막대는 평균의 표준편차를 나타낸다.
실시예 11
마이크로입자 배열상에서 페록시다아제-접합 항체를 이용한 인산화 펩타이드의 면역검출
각 타입의 바이오티닐레이티드 인산화 펩타이드 또는 바이오티닐레이티드 비-인산화 펩타이드를 실시예 1에 기술된 방법과 같이 종래 알려진 기술방법에 따라 표면상에 NeutrAvidin과 함께 코팅된 규정된 색-암호화된 비드에 결합시켰다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 캐리어 표면상에 펩타이드의 밀도는 최대에 이르렀다. 결합후, 상기 입자들은 0.05% 트윈-20이 첨가된 인산-완충 염수(PBS; 0.1M 소디움 포스페이트, 0.15M 소디움 클로라이드, pH 7.2)(PBST)를 이용하여 세정되었다. 그 다음, 펩타이드-기능화된 모든 비드를 시험 튜브에 혼합하여 가출원 제 60/343,621(2001, 12, 28 출원) 및 미국출원 제 10/192,352(2002, 7, 9 출원)에 이미 기술된 LEAPS(Light-controlled Electrokinetic Assembly of Particles near Surfaces) 및 직접 배치와 같은 종래 알려진 기술방법에 따라 마이크로입자 배열을 집합시켰다. 집합된 마이크로입자 배열은 PBST내에 용해된 1% BSA를 이용하여 블록킹되었다. 상기 배열상에서 인산화된 펩타이드의 면역검출을 위해, 상기 칩은 인산화 변형에 특이적인 페록시다아제-접합된 모노클로날 항체와 함께 배양되었다. 배양은 인산화된 펩타이드에 대한 항체의 결합을 위해 습 챔버에서 행하였다. 항체-결합된 마이크로입자 배열은 PBST를 이용하여 세정된 다음, Molecular Probes(예, 카타로그 # T-20912, T-20916 등)로부터 티라미드 시약을 이용하는 것과 같은 종래 알려진 기술방법에 따라 페록시다아제 기질을 이용하여 검출되었다.
티라미드 시약을 이용한 인산화된 펩타이드의 면역검출 결과를 도 21에 나타낸다. 간단히 설명하면, 각 4타입의 색-암호화된 마이크로입자는 2타입의 인산화펩타이드(Ty-P-1 또는 펩타이드-P-2)중 하나, 1타입의 인산화되지않은 펩타이드(Ty-1)에 결합되거나 혹은 펩타이드 대조구(PBS)에 아무것도 결합되지않았다(여기서, Ty-1은 바이오틴-KVEKIGEGTYGVVYK(SEQ ID NO:4)이며, Ty-P-1은 아미노산 10에 인산화된 티로신을 갖는 Ty-1이며(바이오틴-KVEKIGEGT[pY]GVVYK), 그리고 펩타이드-P-2는 14번 위치의 티로신에 인산화된 바이오틴-CEGPWLEEEEEEA[pY]GWMDFK(SEQ ID NO:2)임). 상기 펩타이드-기능화된 마이크로입자는 그 변형체에 특이적인 알칼린-포스파타아제-접합된 모노클로날 항체를 이용한 면역검출을 위해 입자배열로 집합되었다. 결합된 항체는 티라미드 시약을 이용하여 검출되었다. 비드로부터 형광 신호는 무작위 암호화 배열 검출(READ) 어세이와 같은 종래 알려진 기술방법에 따라 형광 현미경을 이용하여 검출되었다. 간단히 설명하면, 색-암호화된 마이크로입자 및 분석물로부터 방출된 형광은 특정 광학 필터를 이용하여 검출되었다. 상기 입자의 동정은 이들의 고유 색 암호에 따라 해독되었다. 양성 어세이 신호를 갖는 입자는 실시예 4에 기술된 바와 같이 표준 이미지 분석에 의해 확인되었다. 알칼린-포스파타아제-촉진 화학반응으로 생성된 형광 생성물인 플루오레세인 이소티오시네이트(FITC)가 결합된 항체와 함께 비드상에 침전되었다. 도 21은 인산화된 펩타이드에서 Ty-P-1에 대하여 1000ms 인테그레이션에서 11,000 유니트 및 펩타이드-P-2에 대하여 1000ms 인테그레이션에서 15,000 유니트로 보다 높은 FITC 신호를 보여주며, 그리고 인산화되지않은 Ty-1 또는 대조구에 대하여 1000ms 인테그레이션에서 약 700 유니트로 현저히 낮은 신호를 보여준다. 도 21에 나타낸 오차 막대는 평균의 표준편차를 나타낸다.
실시예 12
마이크로입자 배열상에서 형광 염료-표지된 항체를 이용한 인산화 펩타이드의 검출
각 타입의 바이오티닐레이티드 인산화 펩타이드 또는 바이오티닐레이티드 비-인산화 펩타이드를 실시예 1에 기술된 바와 같이 종래 알려진 기술방법에 따라 표면상에 NeutrAvidin으로 코팅된, 규정된 색-암호화 비드에 결합하였다. 캐리어의 표면상 펩타이드 밀도는 실시예 1에 기술된 바와 같이 최대에 이르렀다. 결합후, 상기 입자는 PBST를 이용하여 세정되었다. 그 다음, 모든 펩타이드-기능화된 비드를 시험 튜브에 혼합하여 가출원 제 60/343,621(2001, 12, 28 출원) 및 미국출원 제 10/192,352(2002, 7, 9 출원)에 이미 기술된 LEAPS 및 직접 배치 어셈블리 방법과 같이 종래 알려진 기술 방법에 따라 마이크로입바 배열로 집합시켰다. 집합된 마이크로입자 배열은 PBST내에 용해된 1% BSA를 이용하여 블록킹되었다. 상기 배열상에서 인산화된 펩타이드의 면역검출을 위해, 상기 칩은 인산화 변형에 특이적인 페록시다아제-접합된 모노클로날 항체와 함께 배양되었다. 배양은 인산화된 펩타이드에 대한 항체의 결합을 위해 습 챔버에서 행하였다. 결합된 항체는 PBST를 이용하여 세정되었다. 신호 증폭을 위해, 상기 칩은 배열상에 결합된 일차 모노클로날 항체에 특이적인 2차 항체와 함께 배양되었다. 신호는 상기 2차 항체에 특이적인 형광-표지 항체와 함께 칩을 배양하여 더욱 증폭될 수 있다. PBST로 세정한 다음, 상기 배열은 READ 어세이와 같은 종래 알려진 기술방법에 따라 형광 현미경을 이용하여 조사되었다.
마이크로 배열상에 형광-표지 항체를 이용한 인산화된 펩타이드의 면역검출 결과를 도 22에 나타낸다. 간단히 설명하면, 각 4타입의 색-암호화된 마이크로입자는 실시예 11에 기술된 바와 같이, 2타입의 인산화 펩타이드(Ty-P-1 또는 펩타이드-P-2)중 하나, 1타입의 인산화되지않은 펩타이드(Ty-1)에 결합되거나 혹은 펩타이드 대조구(PBS)에 아무것도 결합되지않았다. 상기 펩타이드-기능화된 마이크로입자는 입자배열로 집합되었다. 상기 칩은 인산화된 펩타이드-특이 모노클로날 마우스 IgG 항체와 함께 배양된 다음, 마우스 IgG-특이 2차 항체와 함께 배양되고 그 다음, 형광 현미경을 이용한 검출을 위해 Cy5-표지된 3차 항체와 함께 배양되었다. 형광은 Cy5 신호에 의해 검출되었다. 도 22는 인산화된 펩타이드에서 Ty-P-1에 대하여 1000ms 인테그레이션에서 15,000 유니트 및 펩타이드-P-2에 대하여 1000ms 인테그레이션에서 15,500 유니트로 보다 높은 Cy5 신호강도를 보여주며, 그리고 인산화되지않은 Ty-1 또는 대조구에 대하여 1000ms 인테그레이션에서 약 1400 유니트로 현저히 낮은 신호를 보여준다. 도 22에 나타낸 오차 막대는 평균의 표준편차를 나타낸다.
실시예 13
마이크로입자 배열상에서 형광 염료-표지 항체를 이용한 다중 인산화 펩타이드의 검출
각 타입의 바이오티닐레이티드 인산화 펩타이드 또는 바이오티닐레이티드비-인산화 펩타이드를 실시예 1에 기술된 바와 같이 종래 알려진 기술방법에 따라 표면상에 NeutrAvidin으로 코팅된, 규정된 색-암호화 비드에 결합하였다. 캐리어의 표면상 펩타이드 밀도는 실시예 1에 기술된 바와 같이 최대에 이르렀다. 결합후, 상기 입자는 PBST를 이용하여 세정되었다. 그 다음, 모든 펩타이드-기능화된 비드를 시험 튜브에 혼합하여 가출원 제 60/343,621(2001, 12, 28 출원) 및 미국출원 제 10/192,352(2002, 7, 9 출원)에 이미 기술된 LEAPS 및 직접 배치 어셈블리 방법과 같이 종래 알려진 기술 방법에 따라 마이크로입바 배열로 집합시켰다. 집합된 마이크로입자 배열은 PBST내에 용해된 1% BSA를 이용하여 블록킹되었다. 상기 배열상에서 인산화된 펩타이드의 면역검출을 위해, 상기 칩은 인산화 변형에 특이적인 모노클로날 항체와 함께 배양되었다. 배양은 인산화된 펩타이드에 대한 항체의 결합을 위해 습 챔버에서 행하였다. 결합된 항체는 PBST를 이용하여 세정되었다. 신호 증폭을 위해, 상기 칩은 배열상에 결합된 일차 모노클로날 항체에 특이적인 2차 항체와 함께 배양되었다. 신호는 상기 2차 항체에 특이적인 형광-표지 항체와 함께 칩을 배양하여 더욱 증폭될 수 있다. PBST로 세정한 다음, 상기 배열은 READ 어세이와 같은 종래 알려진 기술방법에 따라 형광 현미경을 이용하여 조사되었다.
마이크로 배열상에 형광-표지 항체를 이용한 다중 인산화 펩타이드의 면역검출 결과를 도 23에 나타낸다. 간단히 설명하면, 각 6타입의 색-암호화된 마이크로배열은 실시예 9 및 11에 기술된 바와 같이, 4타입의 인산화 펩타이드(펩타이드-P-1, 펩타이드-P-2, 펩타이드-P-3, 또는 Ty-P-1)는 중 하나, 1타입의 인산화되지않은 펩타이드(Ty-1)에 결합되거나 혹은 펩타이드 대조구(PBS)에 아무것도결합되지않았다. 상기 펩타이드-기능화된 마이크로입자는 입자배열로 집합되었다. 상기 칩은 인산화된 펩타이드-특이 모노클로날 마우스 IgG 항체와 함께 배양된 다음, 마우스 IgG-특이 2차 항체와 함께 배양되고 그 다음, 형광 현미경을 이용한 검출을 위해 Cy5-표지된 3차 항체와 함께 배양되었다. 형광은 Cy5 신호에 의해 검출되었다. 도 23은 인산화된 펩타이드에서 펩타이드-P-1, 펩타이드-P-2, 펩타이드-P-3 및 Ty-P-1에 대하여 1000ms 인테그레이션에서 약 14,000 유니트로 보다 높은 Cy5 신호강도를 보여주며, 그리고 인산화되지않은 Ty-1 또는 대조구에 대하여 1000ms 인테그레이션에서 약 1000 유니트로 현저히 낮은 신호를 보여준다. 도 23에 나타낸 오차 막대는 평균의 표준편차를 나타낸다.
실시예 14
이중-표지된 분석물의 비율 수량화
분석물은 두가지 형광 염료로 표지될 수 있다. 형광 염료중 하나는 종래 알려진 기술방법에 따라 내부적으로 혹은 내부적으로 분석물을 표지하며, 다른 하나는 관심있는 생화학 반응에서 분석물에 편입시켰다. 분석물(분석물 신호)의 형광 및 상기 어세이에서 얻은 형광은 READ 어세이와 같은 종래 알려진 기술방법에 따라 형광 현미경을 이용하여 측정될 수 있다. 반응 효율과 관련된 어세이 신호는 비율 수량화, 즉, 상기 어세이에서 분석물 신호에 걸친 어세이 신호의 비율에 의해 평가될 수 있다. 이중-표지된 분석물의 비율 수량화에 대한 일반적인 계획을 도 24A에 나타낸다.
특정 디자인의 이중-표지 PNA-펩타이드 키메라를 도 24B에 나타낸다. PNA-펩타이드 키메라는 PNA 앵커링 도메인 및 합성 펩타이드의 기능적 도메인을 갖는다. 상기 합성 펩타이드는 C-말단에 형광 염료(Cy3) 및 N-말단에 폴리히스티딘(His6)의 측면에 위치하는 캐스페이즈 3 분할 부위를 함유하였다. PNA-캐스페이즈 3 이중-표지된 펩타이드 키메라는 다음과 같다: PNA-링커-Cys(접합용) His His His His His His Asp Ala Lys-(C18-스페이서)-Cy3(SEQ ID NO:5).
키메라의 캐스페이즈 3 분해(아스파르트산 잔기의 3'위치에서 절단에 의한)는 Cy3 형광 염료의 분할을 일으킨다. 분해후, 상기 키메라는 서열-특이 DNA/PNA 혼성화를 통해 규정된 색-암호 마이크로입자의 표면에 포획되었다. 포획된 PNA-펩타이드 키메라를 갖는 마이크로입자는 마이크로입자 배열로 집합되었다. 상기 키메라에 있는 His6 태그는 칩상에서 His6-특이 모노클로날 항체를 이용하여 검출되었다. 일차 모노클로날 항체는 특정 2차 항체 및 형광(Cy5)-표지된 3차 항체를 이용하여 더욱 결합될 수 있다. 상기 마이크로입자 배열의 Cy3 형광 강도는 잘려지지않은 키메라 부분과 관련되는 한편, Cy5 표지의 강도는 마이크로입자 배열상에 포획된 키메라의 총량에 상응하였다. 따라서, 상대적인 캐스페이즈 3 활성은 상기 어세이에서 Cy3와 Cy5 비의 비율을 측정함으로써 수량화되었다(도 24C). 비율 수량화에 의해 측정된 결과는 캐스페이즈 3의 농도가 증가함에따라(0, 0.0625, 0.125, 0.5, 1, 2, 및 4ng/μl), 형광 Cy3/Cy5 신호 비율은 약 1에서 0.6으로 감소함을 보여준다. 도 24에 나타낸 오차 막대는 평균의 표준편차를 나타낸다.
실시예 15
플로우 사오토메트릭 분석에 의한 색-암호화 마이크로입자상에서 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 PNA 키메라의 검출
플로우 사오토메트릭 분석에 의한 색-암호화 마이크로입자상에서 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 PNA 키메라의 검출의 일 례를 도 25A에 나타내었다. 간략히 설명하면, 2타입의 녹색-암호화 비드(Green A 및 Green B)를 각각 규정된 염기서열을 갖는 2종의 올리고뉴클레오티드(Green A 바이오틴-스페이서-AAAAAAAAAA, SEQ ID NO:6; Green B:바이오틴-스페이서-AAGGAGAGAA, SEQ ID NO:7)와 결합하였다. 올리고뉴클레오티드를 비드에 고정화시키는 것을 실시예 1에 기술된 바와 같이 행하였다. 상기 비드에 대하여 오렌지 파장에서 방출 파장이 주로 중복됨에도 불구하고, Green A 및 B 비드는 녹색 채널에서 고유 방출 파장을 갖는다(도 25A). 상기 올리고뉴클레오티드-기능화 마이크로입자는 실시예 5에 기술된 바와 같이 시험관내 PNA 혼성화에 사용되었다. 바이오티닐레이티드 PNA-펩타이드 키메라의 PNA 앵커링 도메인은 Green B 비드상에 고정된 이에 상보적인 올리고뉴클레오티드 센서에 결합되었지만 Green A 비드상에 부합되지않는 올리고뉴클레오티드에는 결합되지않았다. 혼성화후, 상기 입자는 1×PBS내에서 R-Phycoerythrin 접합된 StreptAvidin(1:100)과 함께 배양되었다. 상기 R-Phycoerythrin 접합된 StreptAvidin은 비드상에 혼성화된 바이오티닐레이티드 PNA-펩타이드 키메라에 결합하였다. 혼성화된 PNA 키메라의 검출은 플로우 사이토메트릭 분석에 의해 행하여졌다(도 25C에 그 개요도를 나타내었다.). 도 25A에 나타낸 바와 같이, 어세이후, Green B 비드는 R-Phycoerythrin의방출 파장에 상응하는 현저한 양의 오렌지 형광을 얻었으며, 이는 상기 어세이서 PNA 펩타이드 키메라와 Green B 비드의 혼성화를 나타낸다(도 25A). 플로우 사이토메트리에 의한 검출은 마이크로입자상에 고정된 상보적인 올리고뉴클레오티드와 pPNA의 시험관내 혼성화에 사용될 수 있다. 2타입의 NeutrAvidin-코팅된 마이크로입자중 하나가 바이오틴 스페이스로 고정되었다. A(10), 다른 타입의 마이크로입자는 어느 올리고뉴클레오티드와도 고정되지않았다. 이들 2타입의 비드는 바이오티닐레이티드 비스-pPNA 키메라와 함께 배양되었다. 비스-pPNA의 앵커링 부분은 혼성화를 위한 각 암에 12-13 티민을 함유하였다. 시험관에서 혼성화 및 세정 조건은 상기한 바와 같다. 혼성화후, 상기 비드는 1×PBS에서 플루오레세인(DTAF)-접합 스트렙타비딘(1:300)과 함께 배양되었다. 상기 플루오레세인(DTAF)-접합 스트렙타비딘은 비드상에서 바이오티닐레이티드 pPNA 키메라와 결합하였다. 혼성화된 pPNA 키메라의 검출은 플로우 사이트메트릭 분석에 의해 수행되었다.
실시예 16
마이크로입자 배열을 이용한 프로테아제 활성 검출을 위한 기질 펩타이드의 일반적 디자인
PNA-펩타이드 키메라 기질은 프로테아제 활성의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 합성 펩타이드가 통상적으로 프로테아제 활성 검출에 사용되었다. 이러한 PNA-펩타이드 키메라 기질은 3가지 형태(도 26)중 적어도 하나로 디자인되었다. 키메라의 기능 도메인은 하나의 형광 염료(I), 두개의 형광 염료(II) 및 하나의 형광염료와 내부 His6 태그(III)로 표지되었다. 단백질을 쪼갤 수 있는 효소에 의한 프로테아제 분해는 3가지 다르게 표지된 PNA-펩타이드 키메라 기질을 이용하여 검출되었다. 이러한 프로테아제의 예는 트립신, 키모트립신, 서몰리신, 파핀, 프로나아제, 및 HIV-1 프로테아제를 포함한다. 단일-표지된 PNA-펩타이드 키메라 기질(I)이 사용된 경우, 프로테아제 분해는 분해된 기질로부터 형광 염료의 존재를 제거하였다. 이중-표지된 PNA-펩타이드 키메라 기질(II)이 사용된 경우, 프로테아제 분해는 기질로부터 퀀칭 염료(Dye 1)를 제거하였으며 그 결과 분리된 생성물의 Dye 2로부터 형광 방출이 일어났다. 하나의 형광 태그 및 내부 조절 태그(III)를 갖는 PNA-펩타이드 키메라가 사용된 경우, 프로테아제 분해는 형광 염료를 제거하였다. 잘려지지않은 기질로부터 얻어진 형광 신호는 실시예 16에 나타낸 바와 같이 내부 His6 태그로부터 발생된 검출 신호의 수준으로 표준화되었다.
실시예 17
마이크로입자 배열을 이용한 캐스페이즈 활성의 검출
캐스페이즈 활성과 같은 프로테아제 활성은 고체 표면에 고정된, 말단-표지된 바이오티닐레이티드 캐스페이즈 3 펩타이드 기질을 이용하여 검출되었다. 말단-표지된 형광 염료 Cy5를 갖는 등가량의 바이오티닐레이티드 캐스페이즈 3 펩타이드 기질을 용액내에 용해된 정제된 재조합 캐스페이즈 3의 양을 감소시키면서(8, 4.8, 2.88, 1.728, 1.037, 0.62, 0.373, 0.224, 0.134, 0.081, 0.048 및 0마이코그램/ml) 분해하였다. 분해후, 분해 생성물은 종래 알려진 기술방법에 따라표면상에 NeutrAvidin으로 코팅된, 규정된 색-암호 마이크로입자의 표면에 결합되었다. 그 다음 상기 펩타이드-기능화 마이크로입자는 가출원 제 60/343,621(2001, 12, 28 출원) 및 미국출원 제 10/192,352(2002, 7, 9 출원)에 이미 기술된 LEAPS 및 직접 배치 어셈블리 방법과 같이 종래 알려진 기술방법에 따라 마이크로입자 배열로 집합되었다. 잘려지지않은 펩타이드 기질로부터 얻어진 형광은 READ 어세이와 같은 종래 알려진 기술방법에 따라 형광 현미경을 이용하여 측정되었다. 프로테아제 분해는 분해 생성물로부터 형광 염료를 제거하였다. 도 27에 나타낸 바와 같이, 상기 어세이로부터 캐스페이즈 3 분해에 대한 적정이 이루어졌다. 캐스페이즈 3 농도를 8에서 0마이크로그램/ml범위로 감소시킴에 따라 1000ms 인테그레이션에서 Cy5 신호 강도는 약 2600에서 5200 유니트로 증가되었다. 도 27에 나타낸 오차 막대는 평균의 표준편차를 나타낸다.
실시예 18
마이크로입자 배열상에서 2×2 PNA 키메라 경합 어세이
다른 PNA 키메라의 존재하에 마이크로입자 배열상에서 DNA 올리고뉴클레오티드에 대하여 포획되는 PNA 키메라의 특이성을 시험하기위해 2×2 PNA 키메라 경합 어세이를 행하였다. 간략히 설명하면, 다른 염기서열을 갖는 2타입의 비스-PNA 키메라가 어세이에 사용되었다. 그중 하나는 바이오티닐레이티드 PNA 클램프(바이오틴-PNA-클램프)이며, 다른 하나는 테트라메틸 로다민이 접합된 비스-PNA-펩타이드 키메라(비스-PNA-펩타이드-TMR)이다. 혼성화전에, 2타입의 바이오티닐레이티드 올리고뉴클레오티드가 종래 알려진 기술방법에 따라 표면상에 NeutrAvidin으로 코팅된, 규정된 색-암호 마이크로입자의 표면에 결합되었다. 이들 올리고뉴클레오티드의 서열은 각각 폴리아데닌 10-mer(A-10) 및 규정된 뉴클레오티드 서열 10-mer(P-10)이었다. 대조구 마이크로입자는 표면에 올리고뉴클레오티드를 함유하지않았다. A-10 올리고뉴클레오티드는 바이오틴-PNA-클램프의 PNA에 상보적인 한편, P-10 올리고뉴클레오티드는 비스-PNA-펩타이드-TMR 키메라의 PNA에 상보적이었다. 결합후, 상기 올리고뉴클레오티드-기능화된 모든 마이크로입자는 하나의 튜브에 혼합되어 실리콘 칩상에서 마이크로입자 배열로 집합되었다. 우선 상기 칩을 90mM NaCl, 83mM 구아니딘 티오시아네이트, 8mM MgCl2, 17nM EDTA, 0.1% 바이오틴, 0.1% 트윈-20, 70mM Tris-HCl을 함유하는 버퍼에서 pH7.5, 40℃, 20분동안 예비-혼성화하였다. 그 다음, 동일한 양의 바이오틴-PNA-클램프 및 비스-PNA-펩타이드-TMR 키메라를 상기 칩의 동일한 혼성화 버퍼에 첨가하였다. 음성 대조구에는 혼성화 버퍼에 PNA가 첨가되지않았다. 혼성화는 습 챔버에서 40℃, 1시간동안 이루어졌다. 혼성화 완료시, 칩을 100mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.196 트윈-20으로 실온에서 10분동안 세정하였다. 입자상에 혼성화된 바이오티닐레이티드 PNAs의 검출을 위해, 칩을 100mM NaCl, 100mM 소디움 포스페이트(pH 7.5)에 용해된 Cy5-접합된 스트렙타비딘(20pg/ml)과 함께 실온에서 30분간 배양하였다. 15mM NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.5로 세정한 후, 상기 칩을 형광 현미경을 사용하여 조사하였다. 상기 입자의 동정은 이들의 색 암호에 의해 해독되었다. 로다민에 대하여 Cy5 신호혹은 Cy3 신호를 갖는 입자는 실시예 4에 기술된 바와 같이 컴퓨터 프로그램을 이용하여 확인되었다. 도 28에 나타낸 바와 같이, 상기 칩상에서 바이오틴-PNA-클램프는 Cy5 플루오레센에 의해 검출된 바와 같이 10-mer 폴리아데닌과 결합된 입자에 특이적으로 포획되었으며(500ms 인테그레이션에서 약 2250 유티트 Cy5 신호 강도), 한편 비스-PNA-펩타이드-TMR 키메라는 Cy3 플루오레센에 의해 검출된 바와 같이 P-10 올리고뉴클레오티드를 갖는 입자에 결합되었다(500ms 인테그레이션에서 약 4500 Cy3 신호 강도).
실시예 19
LEAPS에 의한 펩타이드-기능화 마이크로입자 배열의 어셈블리
2타입의 색-암호화 마이크로입자, 오렌지 및 그린 비드를 각각 합성 펩타이드 및 이에 상응하는 인산화 펩타이드와 결합하였다. 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 인산화된 펩타이드의 티로신 잔기에 인산기가 있는 것을 제외하고는 동일하였다. 이들 2타입의 펩타이드-기능화 마이크로입자는 하나의 시험 튜브에 혼합되었다. 상기 마이크로입자는 미국특허 제 6,251,691에 기술된 바와 같이 LEAPS에 의해 실리콘 칩상에서 마이크로입자 배열로 집합되었다. 그 다음 상기 마이크로입자 배열을 상기 펩타이드의 포스포티로신에 특이한 마우스 모노클로날 항체와 함께 배양하였다. 상기 모노클로날 항체의 결합은 실시예 12에 기술된 바와 같이 칩상에서 Cy5-표지된 염소 항-마우스 IgG를 이용하여 검출되었다. 그 다음 상기 칩은 형광 현미경을 이용하여 조사되었다. 오렌지 및 녹색 이미지는 마이크로입자를 해독하는데 사용되었으며, 한편 Cy5 염색은 인산화 펩타이드로 고정된 녹색 비드를 표지하는데 사용되었다. 보다 상세하게, 오렌지색 비드에 대한 이미지는 인산화되지않은 펩타이드를 나타내며, 반면 녹색 비드에 대한 이미지는 인산화된 펩타이드를 나타낸다. 그 결과 어세이 이미지는 도 29에 나타낸 바와 같이 포스포티로신-특이 항체의 Cy5 형광 염색을 보여준다.
실시예 20
마이크로입자 배열상에 색-암호화된 비드에 결합된 PNA와 DNA-펩타이드 키메라의 혼성화
앞서 기술된 PNA-펩타이드 키메라와 마찬가지로, 이작용성 교차-결합체를 이용하여 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성 펩타이드에 접합시킬 수 있다. 그 결과물인 접합체는 DNA-펩타이드 키메라로 알려져 있다. DNA-펩타이드 키메라는 마이크로입자 배열상에 색-암호화된 비드에 고정된 상보적 PNA 올리고머의 혼성화에 이용될 수 있다. 상기 펩타이드부는 비드상에 혼성화된 DNA-펩타이드 키메라의 검출을 위해 바이오틴 혹은 형광 염료와 같은 최소 하나의 태그를 함유할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드에 고 친화성을 갖는 리간드 또는 상기 펩타이드의 변형체가 검출용으로 사용될 수 있다. PNA-기능화 마이크로입자에 DNA-펩타이드 키메라를 혼성화하는 원리를 도 30A에 나타내었다. 본 실시예에서, DNA-펩타이드 키메라는 디옥시-아데닌 올리고머(dA 올리고머)와 교차-결합체, SMCC, 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸, 시클로헥산-2-카르복실레이트)를 갖는 바이오티닐레이티드 합성 펩타이드의 접합체이다. DNA-펩타이드 접합체는 액체 크로마토그래피를 이용하여 정제되었다. 정제된 DNA-펩타이드 키메라는 마이크로입자 배열상에서 색-암호화 비드에 고정된 PNA 티민 올리고머를 혼성화하는데 이용되었다. 혼성화된 DNA-펩타이드 키메라는 Cy3-접합된 StreptAvidin을 이용하여 검출되었다. 상기 마이크로입자 배열은 형광 현미경을 이용하여 조사되었다. 비드 색 및 Cy3 혼성화 신호에 대한 형광 강도가 상기 배열로부터 검출되었다. 상기 마이크로입자의 동정은 이들의 색 암호에 따라 해독되었다. Cy3 형광 염료를 갖는 비드가 검출 및 확인되었다. 도 30B에 나타낸 바와 같이, DNA-펩타이드 키메라는 1000ms 인테그레이션에서 약 1000 유니트의 Cy3 신호 강도로 나타낸 바와 같이 완전한 매치 염기서열과 PNAs에 특이적으로 결합하였으며, 매칭되지않은 완전 염기서열은 1000ms 인테그레이션에서 약 300 유니트 Cy3 신호 강도를 형성하였다.
실시예 21
다중 기질의 캐스페이즈 분해
다중 펩타이드 기질에 대한 캐스페이즈의 반응성을 PNA-펩타이드 키메라를 이용하여 동시에 검출될 수 있다. 이 실시예에서, 3가지 타입의 PNA-펩타이드 키메라, I, II 및 III가 합성되었다. 각각의 키메라는 기능부로서 특정 캐스페이즈 기질과 접합되는 규정된 염기서열을 갖는 고유한 PNA 앵커링부를 함유한다. PNA 키메라 I, II 및 III의 기능부는 각각 아미노산 Asp-Glu-Val-Asp(SEQ ID NO:8), Val-Glu-Ile-Asp(SEQ ID NO:9), 및 Ile-Glu-Thr-Asp(SEQ ID NO:10)를 함유한다. 이러한 합성 펩타이드는 종래 기술에 알려진 캐스페이즈 3, 6, 및 8 기질이다. 상기 펩타이드의 C-말단은 규정된 형광 염료로 표지되었다. 키메라 기질의 캐스페이즈 분해는 PNA 앵커링 부로부터 형광 염료가 제거되는 것을 일으킨다.
다중-기질 캐스페이즈 분해는 다음과 같이 설정되었다: 특정 량의 키메라 I, II 및 III가 하나의 튜브에 함께 혼합되었다. 키메라 기질의 캐스페이즈 분해는 특정 기간동안 수조에서 상기 반응 혼합물을 배양하여 수행되었다. 음성 대조구는 어떠한 캐스페이즈도 없는 반응 혼합물이다. 분해후, 혼성화 혼합물에 구아니딘 HCl 및 세제를 함유하는 동등한 양의 혼성화 버퍼를 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 그 다음 혼성화 혼합물을 프리-어셈블링된 마이크로입바 배열과 함께 배양되었다.
상기 마이크로입자 배열은 이 기술분야에 일반적으로 알려진 방법에 따라 실리콘 칩상에 집합된 4타입의 색-암호화 비드를 함유한다. 상기 비드의 3타입은 각각 PNA-펩타이드 키메라 I, II, 및 III에 서열-특이 방식으로 결합할 수 있는 규정된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 기능화되었다. 색 암호에 부가적으로, 상기 4타입의 비드는 또한 상기 키메라에 표지된 형광 염료에 매칭하는 색을 함유하며, 이는 다른 배열로부터 색 강도를 표준화하는데 사용되었다.
혼성화후, 비특이적 결합을 배열에서 세정하여 제거한 다음 형광 현미경을 이용하여 조사하였다. 혼성화된 PNA 키메라로부터 얻어진 어세이 신호, 색 강도는 배열상에 비드로부터 검출되었다. 상기 비드의 동정은 이들의 미리 규정된 색 암호에 따라 해독되었다. 강도 비율, 어세이 신호의 강도 및 대조구 비드로부터의 신호를 측정하였다. 음성 대조구 반응은 어세이에서 최대 수준의 강도 비율을제공한다. 특정 기질에 대한 캐스페이즈 활성은 각 칩상의 음성 대조군에 상대적인 잔류 어세이 강도 비율의 퍼센트로 표기된다. 이 연구에서 얻어진 어세이 강도 비율에 대한 상대적인 퍼센트를 하기 표에 요약하였다.
효소 PNA-펩타이드 키메라
I II III
캐스페이즈 3 53.48% 82.35% 112.03%
캐스페이즈 6 91.80% 41.18% 79.08%
캐스페이즈 8 73.77% 69.41% 59.89%
굵은 글자체의 숫자는 상기 어세이에서 예측된 것보다 높은 강도 분해를 나타낸다.
실시예 22
PNA를 이용한 효소 어세이용 플로우 챠트
본 명세서에 개시된 PNA 키메라 기질을 이용한 다중 어세이는 종래 알려진 기술보다 여러가지 장점이 있다. PNA 키메라 구조물에서, PNA 앵커링 부는 다중 어세이에서 두가지 중요한 역할을 한다. 우선, PNA의 염기서열은 접합된 기질에 대한 암호로 제공된다. 두번째로, 상기 PNA 올리고머는 암호화된 고체 표면상에 디스플레이된 상보적 올리고뉴클레오티드에 포획될 수 있다. PNA 분해용으로 알려진 프로테아제 및 뉴클레아제는 없다. 따라서, 상기 PNA 올리고머는 조직 융해체에서 매우 안정할 것이다. DNA-DNA 혼성화와 비교하여, PNA는 매우 온화한 조건하에서 상보적 DNA 올리고뉴클레오티드와 혼성화된다. PNA-DNA 복합체는 저염 용액, 즉, DNA-DNA 혼성화에 호의적이지않은 조건하에서 안정하다. 따라서, 다중 PNA 키메라 기질은 단일 혹은 다중 타입의 효소 반응을 위한 일반적인 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.도 31에 나타낸 바와 같이, 본 명세서에 개시된 다중 어세이는 간단한 형태로 수행될 수 있으며, 이는 PNA 키메라 기질의 합성, 다중 어세이의 수행, 색-암호화된 마이크로입자상에 디스플레이된 올리고뉴클레오티드와의 혼성화, 변형된 기질의 검출, 이미지 획득 및 데이타 분석 단계를 포함한다.
실시예 23
다중 어세이
바람직한 구체화중 하나로, PNA-펩타이드 키메라는 카리네이즈 어세이(도 32A), 포스파타아제 어세이(도 32B), 캐스페이즈 어세이(도 32C), 및 리간드 바인딩 어세이(도 32D)와 같은 다중-기질 효소 반응을 위한 이상적인 기질이다. 간략히 설명하면, PNA-펩타이드 키메라의 라이브러리는 관심있는 카이네이즈와 함께 배양될 수 있다. 용액내 인산화 반응후, 인산화된 펩타이드는 포획된 PNA 키메라상에서 검출될 수 있다(도 32A). 따라서, 카이네이즈에 대한 기질 펩타이드는 상기 라이브러리로부터 동정될 수 있다. 이러한 어세이의 디자인은 질병 단계에서 변화된 카이네이즈 활성에 대한 표적 동정을 위한 드럭 개발에 적용될 수 있다. PNA-인산화 펩타이드 키메라를 기질로 사용함으로써, 유사한 디자인이 다중-기질 포스파타아제 어세이(도 32B)에 적용될 수 있으며, 이는 여러가지 질병 단계에 대한 특정 포스파타아제 억제제를 확인하기위한 드럭 개발에 사용될 수 있다. 또한, 실시예 17에 나타낸 바와 같이, PNA-펩타이드 키메라는 시험관내 어세이에서 캐스페이즈 활성을 검출하는데 사용될 수 있다. 도 32C에 나타낸 바와 같이, PNA-펩타이드 키메라의라이브러리는 관심있는 캐스페이즈와 함께 배양될 수 있다. 기질 펩타이드는 분해후 라이브러리로부터 동정될 수 있다. 이러한 어세이의 디자인은 세포사멸 세포에서 캐스페이즈 억제제의 동정에 사용될 수 있다. 더욱이, PNA-펩타이드 키메라는 또한 단백질-단백질 상호작용 또는 단백질-핵산 상호작용의 분석에 바인딩 어세이로 사용될 수 있다. 패널 C(도 32D)에 나타낸 바와 같이, PNA-펩타이드 키메라의 라이브러리는 리간드 바인딩 어세이에서 관심있는 표적과 함께 배양될 수 있다. 특정 표적과 결합한 PNA-펩타이드 키메라는 상기 라이브러리로부터 동정될 수 있다(도 32D).
여러가지 바람직한 구체화의 상기 기술은 예시 및 설명을 위하여 나타낸 것이다. 이는 개시된 특정 형태에 한정하려는 것은 아니다. 자명한 변형 및 변화가 상기 가르침으로 가능하다. 기술된 구체화는 예시 및 그 실제 적용을 제공하기위해 선택되고 기술되었으며 따라서 이 기술분야에 숙련자는 다양한 구체화를 활용할 수 있으며 여러가지 변형이 가능할 것이다. 이러한 모든 변형 및 변화는 공정히, 법률적으로 그리고 정당하게 칭하여진 범위에 따라 해석되는 경우 첨부된 청구항에 의해 정해된 바와 같은 시스템내에 포함된다.
본 발명의 분자 구조물은 진단 어세이, 개체에서 특정 질병의 잠재적 위험에 대한 유전학적 스크리닝, 및 화합물의 고-처리 스크리닝을 이용한 드럭 개발에 사용될 수 있다.

Claims (60)

  1. (a) 핵산 또는 핵산 유도체를 포함하는 포획부; 및
    (b) 기질부;
    를 포함하는 분자 구조물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 지방, 핵산 및 보조-인자로 구성된 그룹으로부터 선택된 실체(entity)를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 단백질을 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 태그로 변형됨을 특징으로 하는 구조물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 태그는 6 히스티딘 잔기, 형광부, 인산기 및 당기로 구성된 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 구조물.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 태그는 검출가능한 부(moiety)를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 캐스페이즈 또는 그 활성 펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 JAK 단백질 또는 그 활성 펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 효소에 대한 기질을 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 핵산에 대한 바인딩 부위를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 효소의 보조-인자를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  13. 제 1항에 있어서, 포획부는 펩타이드 핵산임을 특징으로 하는 구조물.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 STAT 단백질 또는 그 활성 펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 MAP 카이네이즈 또는 그 활성 펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 Akt/SGK 단백질 또는 그 활성 펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 PKD 단백질 또는 그 활성 펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 소분자 드럭 후보물질을 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 기질부는 항체 또는 그 바인딩 프레그먼트를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  20. 제 13항에 있어서, 상기 포획부는 비스-PNA를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  21. 제 13항에 있어서, 상기 포획부는 선형 PNA를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  22. 제 1항에 있어서, 나아가 결합제를 포함함을 특징으로 하는 구조물.
  23. (a) 핵산 또는 핵산 유도체를 포함하는 다수의 포획부 집단, 및
    (b) 각 집단의 기질부가 선택된 집단의 포획부에 접합된, 다수의 기질부
    를 포함하는 다수의 분자 구조물.
  24. (a) 포획부 및 기질부를 갖는 PNA-기질 키메라를 효소 활성을 함유하는 것으로 여겨지는 시료에 첨가하여, 상기 효소를 상기 키메라의 기질부와 반응시키는 단계;
    (b) 상기 시료로부터 반응된 PNA-기질 키메라를 분리하는 단계;
    (c) 고체 매트릭스상에서 상기 키메라의 포획부를 상보적 올리고뉴클레오티드와 혼성화하여, 고체 매트릭스상에서 상기 반응 PNA-기질 키메라를 포획하는 단계; 및
    (d) 효소 활성의 측정으로 포획된 반응 PNA-기질 키메라를 검출하는 단계;
    를 포함하는 시료에서 효소 활성 검출 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 시료는 질병에 걸린 세포로 의심되는 것이며 그리고 검출된 효소 활성은 질병의 존재를 표시하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 효소는 카이네이즈, 캐스페이즈, 포스파타아제, 트랜스퍼라아제 및 프로테아제로 구성된 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25항에 있어서, 상기 질병은 신경 질환, 조혈 질환, 머스코스켈레탈(muscoskeletal) 질환, 심장혈관 질환, 림프성 질환, 호흡기 질환, 내분비 질환, 및 위장 질환으로 구성된 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 24항에 있어서, 상기 PNA-기질 키메라의 포획부는 비스-PNA를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 24항에 있어서, 상기 PNA-기질 키메라의 기질부는 펩타이드임을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 24항에 있어서, 상기 반응된 PNA-기질 키메라는 키메라의 기질부상에서 태그에 의해 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  31. (a) PNA-기질 키메라는 포획부 및 기질부를 가지며 각 집단은 선택된 PNA 서열에 대한 단일 기질을 갖는, 다수의 PNA-기질 키메라 집단을 시료에 첨가하여 상기 효소를 상기 키메라 집단의 기질부와 반응시키는 단계;
    (b) 상기 시료로부터 반응된 PNA-기질 키메라 집단을 분리하는 단계;
    (c) 각 매트릭스는 반응된 PNA-기질 키메라 선택 집단의 포획부와 혼성화되는 올리고뉴클레오티드를 그 상부에 함유하는, 다수의 매트릭스상에서 반응된 PNA-기질 키메라 집단을 포획하는 단계; 및
    (d) 다수 집단에서 효소 활성의 측정으로 포획된 반응 PNA-기질 키메라 집단을 검출하는 단계;
    를 포함하는 단일 시료에서 다수의 효소 활성을 검출하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 다수의 매트릭스는 단일 고체 표면상에 존재함을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 단일 고체 표면은 마이크로배열임을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 31항에 있어서, 상기 다수의 매트릭스는 마이크로입자를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 마이크로입자는 색-암호화됨을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 31항에 있어서, 상기 PNA-기질 키메라는 2개의 태그를 함유함을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 태그는 형광부임을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 31항에 있어서, 상기 PNA-기질 키메라의 기질부는 캐스페이즈의 기질임을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 31항에 있어서, 상기 PNA-기질 키메라의 기질부는 카이네이즈에 의해 인산화됨을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 31항에 있어서, 상기 PNA-기질 키메라의 포획부는 비스-PNA임을 특징으로 하는 방법.
  41. (a) 포획부 및 기질부를 갖는 PNA-기질 키메라를 그 리간드를 함유하는 것으로 의심되는 시료에 첨가하여 상기 리간드를 상기 키메라의 기질부에 바인딩시키는 단계;
    (b) 상기 시료로부터 리간드-바인딩된 PNA-기질 키메라를 분리하는 단계;
    (c) 상기 키메라의 포획부를 고체 매트릭스상에서 상보적인 올리고뉴클레오티드와 혼성화하여 고체 매트릭스상에서 상기 리간드-바인딩된 PNA-기질 키메라를 포획하는 단계; 및
    (d) 시료에서 상기 리간드의 존재를 측정하여 포획된 리간드-바인딩된 PNA-기질 키메라를 검출하는 단계;
    를 포함하는 시료에서 리간드의 존재를 측정하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 리간드는 핵산을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 41항에 있어서, 상기 리간드는 세포 표면 수용체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 41항에 있어서, 상기 PNA-기질 키메라의 기질부는 항체 또는 그 바인딩 프레그먼트를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 43항에 있어서, 상기 세포 표면 수용체는 cd4임을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 41항에 있어서, 상기 시료는 질병에 걸린 세포 시료로 의심되는 것이며 그리고 상기 리간드의 존재는 질병의 존재를 표시하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 46항에 있어서, 상기 질병은 신경 질환, 조혈 질환, 머스코스켈레탈(muscoskeletal) 질환, 심장혈관 질환, 림프성 질환, 호흡기 질환, 내분비 질환, 및 위장 질환으로 구성된 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 41항에 있어서, 검출은 리간드-바인딩된 PNA-기질 키메라에 검출가능한 항체를 바인딩시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 41항에 있어서, 상기 PNA-기질 키메라의 기질부는 탄수화물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 41항에 있어서, 상기 PNA-기질 키메라의 기질부는 지방을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  51. (a) 포획부 및 기질부를 가지며 각 집단은 선택된 PNA 서열에 대한 단일 기질을 갖는, 다수의 PNA-기질 키메라 집단을 시료에 첨가하여 리간드를 상기 키메라 집단의 기질부에 바인딩시키는 단계;
    (b) 상기 시료로부터 반응된 PNA-기질 키메라 집단을 분리하는 단계;
    (c) 각 매트릭스는 리간드-바인딩된 PNA-기질 키메라 선택 집단의 포획부와 혼성화되는 올리고뉴클레오티드를 그 상부에 함유하는, 다수의 매트릭스상에서 리간드-바인딩된 PNA-기질 키메라 집단을 포획하는 단계; 및
    (d) 상기 시료에서 다수의 리간드 존재를 측정으로 포획된 리간드-바인딩된 PNA-기질 키메라 집단을 검출하는 단계;
    를 포함하는 시료에서 다수의 리간드 존재를 검출하는 방법.
  52. 제 51항에 있어서, 상기 리간드는 핵산이며 그리고 상기 PNA-기질 키메라의 기질부는 핵산-바인딩 도메인을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 51항에 있어서, 상기 리간드는 세포 표면 수용체이며 그리고 상기 기질부는 소분자 드럭 후보물질을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 51항에 있어서, 상기 다수의 매트릭스는 마이크로입자임을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 51항에 있어서, 상기 다수의 매트릭스는 단일 고체 표면상에 존재함을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 55항에 있어서, 상기 고체 표면은 실리콘 칩임을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 55항에 있어서, 상기 고체 표면은 마이크로배열임을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 54항에 있어서, 상기 마이크로입자는 색-암호화됨을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 54항에 있어서, 상기 마이크로입자는 자성(magnetic)임을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 51항에 있어서, 상기 PNA-키메라의 포획부는 비스-PNA임을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4034351B2 (ja) 1996-04-25 2008-01-16 バイオアレイ ソリューションズ エルエルシー 粒子近接表面の光制御した動電学的アッセンブリ
US6734420B2 (en) * 2000-04-06 2004-05-11 Quantum Dot Corporation Differentiable spectral bar code methods and systems
WO2001098765A1 (en) 2000-06-21 2001-12-27 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
US7625951B2 (en) * 2000-07-13 2009-12-01 University Of Kentucky Research Foundation Stimuli-responsive hydrogel microdomes integrated with genetically engineered proteins for high-throughput screening of pharmaceuticals
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
WO2003034029A2 (en) 2001-10-15 2003-04-24 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed analysis of polymorphic loci by concurrent interrogation and enzyme-mediated detection
US7041453B2 (en) * 2002-08-22 2006-05-09 Bioarray Solutions Ltd. Molecular constructs and methods of use for detection of biochemical reactions
US7526114B2 (en) 2002-11-15 2009-04-28 Bioarray Solutions Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
WO2005007663A2 (en) * 2003-07-14 2005-01-27 Irm Llc Fluorogenic enzyme substrates and uses thereof
WO2005029705A2 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
EP1664722B1 (en) 2003-09-22 2011-11-02 Bioarray Solutions Ltd Surface immobilized polyelectrolyte with multiple functional groups capable of covalently bonding to biomolecules
US20050089916A1 (en) * 2003-10-28 2005-04-28 Xiongwu Xia Allele assignment and probe selection in multiplexed assays of polymorphic targets
NZ547492A (en) 2003-10-28 2009-12-24 Bioarray Solutions Ltd Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes of different lengths and densities
PT1694859E (pt) 2003-10-29 2015-04-13 Bioarray Solutions Ltd Análise de ácidos nucleicos multiplexada através de fragmentação de adn de cadeia dupla
US7363170B2 (en) * 2004-07-09 2008-04-22 Bio Array Solutions Ltd. Transfusion registry network providing real-time interaction between users and providers of genetically characterized blood products
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
JP2008524600A (ja) * 2004-12-16 2008-07-10 インヴィトロジェン コーポレーション 多重化アッセイの較正及び定量化用の量子ドットコード化ビーズセット、及びその使用方法
JP4543170B2 (ja) * 2005-01-28 2010-09-15 国立大学法人 東京大学 標識製造方法
US8486629B2 (en) * 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
GB2435511A (en) * 2006-02-23 2007-08-29 Mologic Ltd Protease detection
GB2435512A (en) * 2006-02-23 2007-08-29 Mologic Ltd A binding assay and assay device
GB2435510A (en) * 2006-02-23 2007-08-29 Mologic Ltd Enzyme detection product and methods
GB2437311A (en) * 2006-04-07 2007-10-24 Mologic Ltd A protease detection product
CN101421414A (zh) 2006-04-17 2009-04-29 卢米尼克斯股份有限公司 用来测定激酶的活性的方法、颗粒和试剂盒
US8296088B2 (en) 2006-06-02 2012-10-23 Luminex Corporation Systems and methods for performing measurements of one or more materials
EP2038655A2 (en) 2006-06-02 2009-03-25 Luminex Corporation Systems and methods for performing measurements of one or more materials
EP2069534A4 (en) * 2006-08-02 2010-08-11 California Inst Of Techn METHODS AND SYSTEMS FOR DETECTING AND / OR SORTING TARGETS
KR101576565B1 (ko) 2008-10-10 2015-12-10 주식회사 파나진 비스ｐｎａ를 이용한 핵산의 표지, 및 검출 또는 분석 방법및 키트, 및 이를 위한 비스ｐｎａ
WO2010091144A1 (en) * 2009-02-04 2010-08-12 Wake Forest University Health Sciences Compositions, methods, and kits for identifying candidate molecules from encoded chemical libraries
EP2403964B1 (en) * 2009-03-02 2021-09-08 Massachusetts Institute of Technology Methods and products for in vivo enzyme profiling
US9523701B2 (en) 2009-07-29 2016-12-20 Dynex Technologies, Inc. Sample plate systems and methods
GB0913258D0 (en) 2009-07-29 2009-09-02 Dynex Technologies Inc Reagent dispenser
EP2470912A4 (en) * 2009-08-25 2013-04-17 Life Technologies Corp QUANTITATIVE STANDARDS FOR FLUORESCENT PROTEINS
US20140113385A1 (en) * 2010-10-22 2014-04-24 University Of Southern California Compositions and Methods for Identifying Single Antigens or Other Molecules in Cell Preparations
US20120258870A1 (en) * 2010-11-22 2012-10-11 The University Of Chicago Methods, Systems, and/or Use of Oligonucleotide Conjugates to Develop Panels for Use in Assays and Detections
EP3950704A1 (en) 2011-03-15 2022-02-09 Massachusetts Institute Of Technology Multiplexed detection with isotope-coded reporters
WO2013096777A2 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Wake Forest University Health Sciences Integrated compound discovery systems and methods
WO2013177046A1 (en) * 2012-05-21 2013-11-28 Solulink, Inc. Methods and/or use of oligonucleotide conjugates for suppressing background due to cross-hybridization
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
CA2914754A1 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Massachusetts Institute Of Technology Affinity-based detection of ligand-encoded synthetic biomarkers
WO2016069539A1 (en) * 2014-10-27 2016-05-06 Helix Nanotechnologies, Inc. Systems and methods of screening with a molecule recorder
WO2017177115A1 (en) 2016-04-08 2017-10-12 Massachusetts Institute Of Technology Methods to specifically profile protease activity at lymph nodes
CA3022928A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods and uses for remotely triggered protease activity measurements
CA3059358A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Massachusetts Institute Of Technology Methods to spatially profile protease activity in tissue and sections
WO2018218250A2 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
US11054428B2 (en) 2018-03-05 2021-07-06 Massachusetts Institute Of Technology Inhalable nanosensors with volatile reporters and uses thereof
EP3911753A1 (en) 2019-01-17 2021-11-24 Massachusetts Institute of Technology Sensors for detecting and imaging of cancer metastasis
CN114989288A (zh) * 2022-06-27 2022-09-02 电子科技大学 一种基于分子机器的纳米驱动与传感装置及其制备方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6451968B1 (en) 1991-05-24 2002-09-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acids
GB9404709D0 (en) * 1994-03-11 1994-04-27 Multilyte Ltd Binding assay
AU5110096A (en) 1995-03-28 1996-10-16 Novartis Ag Process for the production of combinatorial compound libraries
EP0832287B1 (en) 1995-06-07 2007-10-10 Solexa, Inc Oligonucleotide tags for sorting and identification
JP2001518054A (ja) * 1995-06-07 2001-10-09 パーセプティブ バイオシステムズ，インコーポレーテッド Ｐｎａ−ｄｎａキメラと、このキメラ合成用のｐｎａシントン
CA2189486A1 (en) 1996-11-04 1998-05-04 Yves St-Pierre Analysis of enzyme activity using immobilized fluorescence-labeled substrates
DE69814848T2 (de) 1997-02-27 2004-05-06 Ingeneus Corp. Untersuchung von nukleotiden in loesung mit hilfe von pna-sonden
JP4302780B2 (ja) 1997-05-23 2009-07-29 バイオアレイ ソリューションズ エルエルシー マトリックスで結合された化合物の色別コード化とインシトゥ探索
US6197513B1 (en) 1998-02-11 2001-03-06 Pe Corporation PNA and DNA conjugates and methods for preparation thereof
JP2002510505A (ja) * 1998-04-03 2002-04-09 フィロス インク． 位置特定可能な蛋白質アレイ
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
CA2419159A1 (en) * 2000-08-11 2002-02-21 Agilix Corporation Ultra-sensitive detection systems
EP1314035A1 (en) 2000-08-14 2003-05-28 Surface Logix, Inc. Pathways arrays
WO2003058198A2 (en) 2001-12-27 2003-07-17 Ciphergen Biosystems, Inc. Human breast cancer biomarkers
US7041453B2 (en) 2002-08-22 2006-05-09 Bioarray Solutions Ltd. Molecular constructs and methods of use for detection of biochemical reactions
CN103789311A (zh) * 2005-10-07 2014-05-14 强生研究有限公司 多组分核酸酶及其使用方法

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