JP4813011B2 - 分子構築体および生化学反応を検出するための使用法 - Google Patents

分子構築体および生化学反応を検出するための使用法 Download PDF

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Description

本発明は、一般に分子生物学および生化学に関する。本発明は、分子構築体および、個々のまたは複数の生化学反応の検出に分子構築体を使用する方法を提供する。
細胞内での生化学反応は細胞の機能と活性を規定する。これらの反応は、受容体リガンド相互作用と酵素反応との間での複雑な相互作用を含み、細胞のシグナル伝達や活性を調整している。生理的条件は、これらの反応を媒介する酵素やタンパク質の活性レベルに影響を与える。
例えば、ペプチド鎖のアミノ酸残基の修飾は、細胞内でのタンパク質機能の制御に重要な役割を果たしている。リン酸基、メチル基または炭水化物を移動させると、タンパク質基質のコンフォメーションの変化が誘導され、その結果タンパク質の機能が変化することになる。これらの反応は通常、可逆的である。タンパク質の修飾には、特別の種類の酵素活性が必要である。例えば、メチル化は一般に、メチルトランスフェラーゼとして知られている酵素群により触媒される。タンパク質のメチル化はサイトゾルタンパク質の膜への結合を制御し、ペプチドのC末端でのタンパク質分解による分解の防止に寄与している。例えば、多くのGタンパク質はメチル化される。メチル化されたシステイン残基は、Gタンパク質のカルボキシ末端またはその近くにあり、シグナル伝達のためのペプチドの膜への結合を促進させることができる(Rondo, Biochim Biophys Acta 1300(l):5-12 (1996)、Hrycyna, Pharmacol. Ther. 59(3):281-300 (1993))。数種のアクチンの73位にあるヒスチジンもメチル化される。アクチン分子の適切なコンフォメーションを維持するためにメチル化が必要であることも明らかにされている(Yao, J. Biol. Chem. 274(52):37443-9 (1999))。ミオシンのS-1領域のリジン残基のメチル化により、筋原線維(myofibrine)収縮時のATPの結合が低下する(Bivin, Proc. Nat'l Acad. Sci USA 91(18):8665-9 (1994))。膜タンパク質のメチル化が糖尿病患者での心血管疾患の発症に寄与する可能性があることも明らかにされている(Schaffer, Mol. Cell Biochem 107(1):1-20 (1991))。さらに、メチル化は、核タンパク質内のタンパク質-RNA相互作用を減少させ(Kim, Amino Acids 15(4):291-306 (1998))、SH3ドメインを介したタンパク質-タンパク質相互作用を選択的に調整する(Bedford, J. Biol. Chem, 275 (21):16030-6 (2000))。
同様に、炭水化物は、多くの分泌されたタンパク質または細胞表面に提示されたタンパク質中の特異的なアスパラギン、セリンまたはスレオニン残基の側鎖に転移させることができる。ヒト凝固第V因子の2181位のアスパラギンに炭水化物を転移させると、第V因子とリン脂質膜との相互作用が損なわれる(Nicolaes, Biochemistry 38(41):13584-91 (1999))。多糖類として知られている大きな炭水化物は多くの糖モノマーを結合して形成される。
米国特許第6251691号 WO国際公開97/40385 WO国際公開92/20702 仮出願第60/343,621号 米国出願番号第10/192352号 Rondo, Biochim Biophys Acta 1300(l):5-12 (1996) Hrycyna, Pharmacol. Ther. 59(3):281-300 (1993) Yao, J. Biol. Chem. 274(52):37443-9 (1999) Bivin, Proc. Nat'l Acad. Sci USA 91(18):8665-9 (1994) Schaffer, Mol. Cell Biochem 107(1):1-20 (1991) Kim, Amino Acids 15(4).-291-306 (1998) Bedford, J. Biol. Chem, 275 (21):16030-6 (2000) Nicolaes, Biochemistry 38(41):13584-91 (1999) Nielsen, P.E., Egholm, M, Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications, pp. 21-50, Horizon Scientific Press, 1999 Polymer Colloids: A Comprehensive Introduction, Fitch, R. M.編, Academic Press (1997) Bioconjugate Techniques, Hermanson, G.T.編, Academic Press (1995) Peptide Nucleic Acids: Protocols and Application, Nielsen, P. E. & Egholm, M.編, pp. 87-162, Horizon Scientific Press (1999) Peptide Nucleic Acids, Protocols and Applications, Peter E. Nielsen and Michael Egholm編, Horizon Scientific Press (1999) J. Biochem (2000), 35:289-305 Heinrich他,Biotech. J. 334:297-314 (1998) Wehl他,J. Neuroscience 19: 5360-5369 (1999) Bioconjugate Techniques, Greg T. 編,Hermanson, Academic Press, 1995 Cheng, 他, J. Biol. Chem. 267.,9248-9256,1992 Baldwin他, Nature, 301, 435-437,1983 Casnelli他, PNAS 79:282-286, 1982
本発明は、捕捉部分と基質部分を有する分子構築体に関する。捕捉部分は、被験サンプルから構築体を分離する働きをし、一方、基質部分は対象とする標的分子の存在または活性レベルを決定するための反応部位を提供する。好ましい実施形態では、分子構築体は、捕捉部分としてのペプチド-核酸(PNA)と基質部分としてのペプチドまたはタンパク質を含む。別の好ましい基質部分は、例えば、脂肪酸、ステロイド、糖、コファクターおよび対象とする標的分子に作用するまたはその基質である他の実体などの非ペプチド分子を含む。
本発明は、この分子構築体を使用する方法にも関する。1つまたは複数の酵素活性を検出する方法は、分子構築体の修飾された基質部分を測定することにより実施され、この測定はサンプル中の1つまたは複数の酵素の活性を示す。同様に、細胞、細胞集団または組織サンプル中の分析物を検出する方法も提供する。
ペプチド核酸(PNA)捕捉部分を有する本発明の分子構築体は、従来技術のものに比べて特に有益である。PNA骨格は非荷電の性質を有しているため、相補的核酸配列へのPNAのハイブリダイゼーションはより特異的であり、より高い親和性で起こる。DNAやRNAなどの核酸が有していない様々なPNAの特性により、PNAと核酸配列のハイブリダイゼーションははるかに優れている。PNAは広いpH域およびイオン強度の低い条件に安定である。これらの特性により、PNAは本発明の検出アッセイに使用するのに特に適している。
正確であるが、時間および費用効率が高く、高い感受性で1つまたは複数の反応をスクリーニングすることができる、生化学反応を検出し、分析するアッセイが必要とされている。したがって、ウイルス、細菌および寄生虫で誘発される疾患、特にヒトの疾患を予防および/または治療するために、生化学反応をスクリーニングするための、使用が容易で、特異性が高く、正確で、感受性の高い、1つまたは複数の生化学反応を検出する方法を有することは有用であろう。
本発明は、捕捉部分と基質部分を有する分子構築体に関する。捕捉部分は、分子の混合物からの構築体の分離を可能にし、好ましくは、核酸または核酸誘導体を含む。基質部分は、構築体に対して作用するまたは構築体を変化させることができ、これを測定または検出することができる。この変化は、化学的修飾、基質部分の切断または基質部分への付加などの物理的変化であってよい。また、変化は、構築体の基質部分へのリガンドまたは細胞の結合であってもよい。
本発明の分子構築体は、PNAオリゴマーおよび1つまたは複数のPNAの誘導体(例えばpPNA)、リンカーおよび合成ペプチドまたは他の基質部分を含む共有結合した成分を含むPNA-ペプチドキメラとすることができる。キメラのPNA部分(線状であっても、ビスフォーマットであってもよい)は、固体支持体に固定化されている相補的なオリゴヌクレオチドに複合体を捕捉するアンカーとして働く。PNAアンカードメインの塩基配列は、キメラの基質ドメインの分析物にユニークなタグを提供する。この固体支持体は規定の物理特性を有していてもよい。さらに、固体支持体は光学的または化学的にコード化することもできる。
キメラの基質部分は生化学アッセイに参加する官能性/基質部分として作用する。分子構築体の基質部分は、生化学反応でリガンドまたは酵素基質として作用する分子構築体を含む。例えば、タンパク質またはペプチドは酵素反応の基質として使用する、あるいはタンパク質またはペプチドがリガンド結合部位を提供することができる。ペプチドもリガンド-受容体反応を検出するのに有用である。タンパク質を特異的な細胞表面マーカーを有する細胞集団を分離する基質として使用することができる。また、例えばATP、cAMP、GTPなどの酵素のコファクターは、キメラの基質部分の全体または一部を形成することができる。同様に、脂質、ステロイドおよび/または脂肪酸も、生化学反応中に修飾され、したがって本発明を用いて測定することができるので、キメラの基質部分を形成することができる。炭水化物もキメラの基質部分の全体または一部を形成することができる。これらの分子は、例えば、単純糖、デンプン、多糖、プロテオグリカンなどが含まれる。
基質部分は、検出可能な標識またはリン酸基、糖基、メチル基などの酵素切断認識部位などの1つまたは複数の部位を含むよう、修飾することができる。1実施形態では、キメラの基質部分は1つまたは複数の蛍光タグを含んでいる。これらのタグは、ポリヒスチジン、ビオチン、ジゴキシゲニンタグなどを組み合わせて使用することができる。一重標識基質部分を使用することによって、酵素消化は消化された基質からタグを除く。二重標識基質部分を使用することによって、酵素消化は基質からクエンチング染料を除き、切断された生成物に残存している第2の染料からの蛍光を放射させる。1つの検出可能なタグと内部ポリヒスチジンタグを有する基質部分を使用することによって、酵素消化は蛍光染料を除く。さらに、切断されていない基質からの検出可能な信号を正規化して、内部ポリヒスチジンタグから生成した信号を検出することができる。これらの実施形態は実施例10、14、16および17に詳述するが、これらの実施例は、このような分子構築体が対象とする酵素活性に関する定量的情報を提供できることを示している。別の実施形態では、キメラの基質部分は1つまたは複数のリン酸基または他の対象とする部分を含み、これはホスファターゼまたは他の対象とする酵素の酵素切断部位の部分として作用することができる。
本発明の構築体は、基質部分の変化を検出する方法に使用することができる。本明細書に開示の方法は、無細胞または細胞ベースのフォーマットでタンパク質-タンパク質相互作用、リガンド-受容体結合、タンパク質の修飾、タンパク質の発現および酵素活性を決定するために使用することができる。本発明の方法は、特異的な細胞表面マーカーを有する細胞を分離するためにも使用することができる。これらの方法は様々な目的に使用することができる。構築体は、遺伝子スクリーニング分析、疾患の診断、治療および/または予防、創薬ならびにがん、寄生虫感染症、神経障害、造血障害、筋骨格障害、心血管障害、リンパ障害、呼吸器障害、内分泌障害および胃腸障害などであるが、これらに限定されない疾患または状態のトキシコゲノミクスアッセイに使用することができる。
一般に、本発明の分子構築体の使用方法は、PNA-基質キメラを被験サンプル中のタンパク質、リガンドまたは酵素と反応させる。この反応は均一な溶液中で実施することができ、あるいはキメラの捕捉部分を固体マトリックスに予め固定化してから反応を行うこともできる。試験反応がサンプルの表面で起こる場合には、この反応はキメラの基質部分を修飾させる。生化学反応を溶液内で実施した場合、次いで、キメラを配列特異的に、オリゴヌクレオチド官能化した固体支持体に捕捉させる。1実施形態では、色でコード化したミクロ粒子を固体支持体として使用する。ミクロ粒子は、例えば、LEAPSまたは直接付着などの当技術分野で公知の方法を使用して集合させることができる。LEAPS近表面粒子の光制御電気運動アセンブリ(Light-controlled Electrokinetic Assembly of Particles near Surface)として知られている技術であり、多分析物分子分析用の粒子アレイのオンデマンド製造法である。LEAPSは米国特許第6251691号およびWO国際公開97/40385に詳述されており、これらはそのすべてを参照として本明細書に組み込むものとする。生化学反応を実施した後、キメラを固体表面上の相補的なDNAオリゴヌクレオチドセンサに捕捉させる。次いで、次の検出およびデータ解析で、担体表面上の(ビーズの色コードなどの)コードにより、キメラの同一性を決定する。捕捉後、表面上のキメラを当技術分野で公知の方法により直接検出することができる。このような方法の非限定例には、沈殿反応、ペルオキシダーゼまたは蛍光染料、標識した抗体、リガンド結合検出またはフローサイトメトリーが含まれる。分子構築体の修飾された基質部分は、例えば、集合した粒子の無作為コード化アレイ検出(Random Encoded Array Detection (READ))、粒子懸濁液のフローサイトメトリー検出、空間的に規定した固体表面上の沈殿などの当技術分野で公知のいくつかの可能なフォーマットの1つで検出することができる。
固体表面上に提示されるDNAオリゴヌクレオチドは、マルチプレックスアッセイでPNAキメラのアンカードメイン(すなわち捕捉部分)を配列特異的に捕捉するためのセンサとして働く。規定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、結合、ハイブリダイゼーションおよび/または検出を促進するためにスペーサー配列、化学基、リガンドおよび/または標識などの他の修飾を含むことができる。固体表面は結合用の規定の化学基も含むことができる。オリゴヌクレオチドの固体表面への結合は直接または間接結合とすることができる。結合の具体的な方法は当技術分野で公知である。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドの結合は、ビオチン-ニュートロアビジンを介した間接結合またはアミン-トシルを介した直接結合により実施することができる。
本発明の1実施形態では、分子構築体の捕捉部分はペプチド核酸(PNA)を含む。PNAはペプチド様骨格をもつDNA類似体である。PNAの骨格はアミド結合で結合した反復N-(2-アミノエチル)グリシン残基からなる。DNAおよびRNAとは異なり、PNAはペントースとリン酸基を含んでいない。PNA骨格が非荷電の性質を有しているため、PNAは他の核酸材料よりかなり高い親和性および特異性で相補的なDNAまたはRNA配列とハイブリダイズすることができる。さらに、PNAおよびビスPNAはDNAと配列特異的にハイブリダイズして、局所的なDNA/DNA/PNAトリプレックスを形成することもできる。PNAの特徴およびこの分子を合成する方法は既に、例えば、1992年11月29日のBuchardtらのWO国際公開92/20702に開示されており、これはすべて参照として本明細書に組み込むものとする。PNAのハイブリダイゼーションが非常に特異的であるため、ハイブリダイゼーションアッセイでPNAプローブはDNAプローブより短くてよい。PNAは広範なpH域にわたって安定であり、イオン強度のより低い条件を使用することができる。さらに、PNAは天然には存在しない合成化合物である。したがって、プロテアーゼおよびヌクレアーゼのいずれもPNA分子のポリアミド骨格を認識することができない。この特性により、PNAは細胞溶解物または細胞または組織を使用するハイブリダイゼーションアッセイに使用するのに特に適している。
PNA-基質キメラのPNAは好ましくは10〜25塩基長、より好ましくは約15塩基長である。この分子のN末端側の最初の1つまたは2つの塩基は他の分子と結合するスペーサーである。PNAオリゴマーの残りの部分は、固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドへのキメラの配列特異的捕捉を仲介するプローブとして機能する。キメラのPNA部分は一本鎖であってもビスPNAであってもよい。「PNAクランプ」とも呼ばれるビスPNAは、柔軟な「ヘアピン」リンカーを介して結合した2列のPNAオリゴマーを含んでいる。ハイブリダイゼーションにより、ビスPNAは相補的なDNAとトリプレックス構造を形成する。
PNAは相補的なDNAに対して、DNA-DNAおよびDNA-RNAハイブリダイゼーションよりかなり高い配列特異的結合親和性および特異性を有している。マルチプレックスアッセイに使用すると、PNAキメラのアンカードメインが、対象とする担体の規定の表面に固定化してある相補的なDNAオリゴヌクレオチドセンサにハイブリダイズする(図2)。DNAオリゴヌクレオチドセンサは好ましくは、PNAキメラライブラリーのPNAアンカー(すなわち捕捉部分)の1つに相補的な規定の塩基配列を含んでいる。オリゴヌクレオチドの担体表面への固定化は当技術分野で公知の方法で実施することができ、アミノ基とトシル基の間の反応などの化学反応により表面に直接結合することも、表面上のアビジン、ストレプトアビジンまたはニュートロアビジンへのビオチニル化オリゴヌクレオチドの結合などのようにリンカー分子を介して表面に間接的に結合することもできる。DNAオリゴヌクレオチドセンサは、固定化、ハイブリダイゼーションまたは検出を促進するためのスペーサー分子、標識、タグまたは他の反応基を含むことができる。担体は好ましくは、固定化されたオリゴヌクレオチドを解読するための、規定の空間および色の特性を含んでいる。好ましい実施形態では、担体はミクロ粒子を含むことができる。n3個の種類のDNAオリゴヌクレオチドセンサおよびn4個の種類の色でコード化したビーズがある場合、(n3×n4)のオリゴヌクレオチド官能化担体のライブラリーを合成することができる。マルチプレックスアッセイでは、各種類のオリゴヌクレオチド官能化ミクロ粒子が1種のPNAキメラのみを捕捉することが好ましい。
本発明の1実施形態では、分子構築体はPNA-基質キメラを含んでいる。この実施形態は、リンカー分子を介してポリペプチドに結合しているPNAを含んでいる。PNAオリゴマーは当技術分野で公知の方法で合成することができる。このような方法の例には、Boc化学およびFmoc化学が含まれ(Nielsen, P.E., Egholm, M, Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications, pp. 21-50, Horizon Scientific Press, 1999)、これはすべて参照として本明細書に組み入れるものとする。
本発明の別の実施形態では、キメラの基質部分は好ましくは、酵素の基質などのペプチドである。本発明のマルチプレックス型に特に好ましい酵素の1つの好ましいクラスは、キナーゼ、キャスパーゼ、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼなどの関連酵素ファミリーの一部である酵素である。本発明の非マルチプレックス型では、基質を使用するすべての生化学反応を測定することができ、この基質または活性部位をキメラの捕捉部分に結合することができる。ポリペプチド基質では、基質ペプチドのアミノ酸配列は従来技術で一般的に入手することができる。
本発明では、結合の1つの好ましい方法は、ペプチドの合成の間にペプチドの末端、例えば、ペプチドのN末端にシステインを組み入れる。キメラ合成の間、ペプチドをリンカー分子に結合するのに、システイン残基の側鎖のスルフヒドリル基を使用することができる。さらに、ある種のマルチプレックス生化学アッセイで検出に使用するビオチニル化のために、ペプチドの別の末端にリシンを加えることもできる。ヘテロ二官能性架橋結合剤をPNA-ペプチドキメラの合成に使用することができる。LC-SMCCとしても知られているサクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-(カルボキシ-6-アミノカプロアート)は、対象とする分析物のスルフヒドリル基およびアミン基と反応するヘテロ二官能性架橋結合剤の1つである。当技術分野で知られているように、LC-SMCCのNHSエステルは先ず、pH7〜8でPNAオリゴマーのN末端のアミン基と反応して、PNA分子を活性化させる。次いで、LC-SMCCのマレイミド基がpH6.5〜7.5でペプチドのスルフヒドリル基と反応して、官能化されたPNA-ペプチドキメラを形成する。合成されたPNA-ペプチドキメラを、当技術分野で知られている様々な方法で精製、濃縮する。したがって、マルチプレックス生化学アッセイ用にPNA-基質キメラのライブラリーを合成することができる。PNA-基質キメラライブラリーでは、各ペプチドを特有のPNAオリゴマーに結合させることができる。しかし、所与のPNAオリゴマーのセットを使用して、いくつかのPNA-基質キメラのサブライブラリーを構築することができる。
必要ではないが、本発明の好ましい実施形態では、PNAと基質の結合にリンカーを使用する。架橋結合剤はキメラのPNAと基質部分の立体的なヒンジとして機能するので、より柔軟な構造を提供するように思われる。リンカーによって提供された追加の柔軟性は、酵素と基質の相互作用とPNA-オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを促進することができる。さらに、PNAキメラ合成のリンカーとしてナノ粒子を使用することができる。PNAとペプチド基質は逐次的または同時に粒子の表面に結合させることができる。磁性ナノ粒子をリンカーとして使用する場合、得られるPNA-基質キメラはアッセイでの要求に応じて、精製または高濃度化することができる。
修飾されたPNA-基質キメラは様々な方法で検出することができる。1種のPNA-基質キメラを使用する場合、当技術分野で公知の検出手段のいずれも適切である。マルチプレックスアッセイを使用する場合、複数のキメラ集団を使用する。このアッセイでは、好ましくは、所与のキメラ集団の捕捉部分は1種の基質部分に対応して、生化学反応終了後、対応の配列、すなわち、公知のアンカー配列に基づいて特異的な修飾キメラを選別し、同定することができる。これらのキメラ集団の捕捉は、各表面がPNA-基質キメラの所与の捕捉部分に相補的なオリゴヌクレオチドを含む複数の表面にキメラをハイブリダイズさせることにより実施する。複数の表面は、複数の異なる固体マトリックスを含んでもよく、表面の各部分が特異的な個々の種類のオリゴヌクレオチドを含んでいる1つの固体表面であってもよい。複数の異なる固体マトリックスは、磁気粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子などの粒子、有機または無機ポリマー、金属またはセラミック膜などの形態であってよい。これらは、色、イオン強度、形状もしくは反射率またはその化学特性もしくは物理特性などで集団間を識別するために、いくつかの方法で修飾することができる。粒子を物理的に分離して、集団間を識別することもできる。1つの固体マトリックスが好ましい場合、例としてアレイまたはマイクロアレイが挙げられ、種々のキメラ集団をアレイの別々の場所にハイブリダイズさせる。
本発明の1実施形態では、色でコード化したミクロ粒子上にオリゴヌクレオチドを固定化する。これらのオリゴヌクレオチドは、検出のために、溶液からPNA-基質キメラの標的相補的捕捉部分とハイブリダイズするプローブとして機能する。配列特異的ハイブリダイゼーションに基づいて、マルチプレックス生化学アッセイでは、ミクロ粒子の色コードを使用して特異的なペプチドからのシグナルを解読することができる。オリゴヌクレオチドプローブは好ましくは15〜50個のヌクレオチドを含む。固定化するために、任意選択で、オリゴヌクレオチドの末端にアミン基などの官能基を取り込むことができる。また、プローブの末端ヌクレオチドをビオチニル化するか適当に標識することができる。これらの修飾オリゴヌクレオチドの合成手順は当技術分野で公知である。ある場合には、オリゴヌクレオチドプローブが特有の塩基配列を有することが望ましいことがある。
色でコード化したミクロ粒子の表面は、マルチプレックス生化学アッセイに使用する生体分子を固定化するために、規定の化学基を有していてよい。この化学基には、例えば、エポキシ、トシル、アミン、カルボキシル、クロロメチル、アルデヒド基または他の化学基が含まれる。粒子の表面に活性化した化学基を生成する具体的な化学プロセスは当技術分野で公知であり、例えば、Polymer Colloids: A Comprehensive Introduction, Fitch, R. M.編, Academic Press (1997)参照のこと。当技術分野で公知の方法、例えば、Bioconjugate Techniques, Hermanson, G.T.編, Academic Press (1995)によって、オリゴヌクレオチド、DNA断片、RNA分子、合成ペプチド、組換えタンパク質、精製した天然タンパク質などを、表面の化学基との相互作用を介して、粒子に固定化することができる。個々の種類の色でコード化したミクロ粒子を規定の種類の生体分子と結合させることができ、そのため、マルチプレックス生化学アッセイからの検出可能なシグナルを、結合したミクロ粒子の色から解読することができる。
生体分子による粒子の官能化は、バッチ間のばらつきを小さくするために自動装置を用いて並行して実施することができる。さらに、オリゴヌクレオチドプローブを固体マトリックス表面に点在させることもできる。例えば、点在させたオリゴヌクレオチドアレイを使用して、PNAキメラを捕捉することができる。さらに、PNAキメラを捕捉するための高密度オリゴヌクレオチドアレイなどの固体マトリックスの表面で、オリゴヌクレオチドプローブを直接合成することもできる。
本発明の別の実施形態では、PNA-基質キメラのライブラリーを捕捉する方法を開示する。この実施形態は、ミクロ粒子アレイ上でこれらのライブラリーを捕捉する。ここでは、予め形成したコード化した粒子の平面アレイを使用して対応のPNA-基質キメラを捕捉してから、オンチップ生化学アッセイを実施する。別の好ましい実施形態では、生化学反応が完了した後、提示されたオリゴヌクレオチドによってPNA-基質キメラに捕捉されたコード化した粒子を集合させる。
1実施形態では、図3に示したように、担体の固体表面に捕捉された修飾キメラを、当技術分野で公知のように、抗体で検出することができる。修飾キメラは、標識してある修飾基質特異抗体を使用して検出することができる。抗体は、培地、ヒトまたは動物の体で生成した様々なクラスまたは種類の免疫グロブリン分子に由来するものであってよい。例えば、ペルオキシダーゼ標識した抗体などの酵素標識した抗体からの信号は、チラミド強化法を使用して検出することができる。他の同様の標識および酵素を使用することができる。このような分子は当業者に周知である。蛍光染料で標識した抗体を使用して、修飾された基質を検出することができる。それぞれ図3AおよびBに示した一抗体または二抗体検出系の他に、三抗体検出系を使用して固体表面に捕捉された修飾キメラを検出することができる(図3C)。簡単に述べると、修飾基質に結合した一次抗体を、一次抗体に特異的な二次抗体に結合させることができる。修飾基質、一次抗体および二次抗体の複合体は、標識した三次抗体を使用して検出することができる。さらに、修飾基質は、特異的なキレート分子、例えば、リン酸基に高い親和性を有するニトリロ三酢酸ガリウム(ガリウムNTA)を使用して検出することができる。したがって、ガリウム-NTAをPNAキメラのリン酸化ペプチドの検出に使用することができる。
固体マトリックス上のDNAオリゴヌクレオチドにPNA-基質キメラをハイブリダイズさせる条件は当技術分野で公知である。例えば、Peptide Nucleic Acids: Protocols and Application, Nielsen, P. E. & Egholm, M.編, pp. 87-162, Horizon Scientific Press (1999)参照のこと。当技術分野で公知の方法により、広範なセンサーオリゴヌクレオチドへキメラを捕捉する好適なハイブリダイゼーション条件および溶液が提供される。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドで官能化したミクロ粒子にPNA-基質キメラを捕捉する方法は、本明細書の下記の条件と合致する。プレハイブリダイゼーションは、好ましくは、約45℃で、約30分間、常に回転させながら、ハイブリダイゼーションバッファ(例えば、10mMリン酸ナトリウム、15mM塩化ナトリウム、1mg/ml BSA、0.1mg/ml熱変性ニシン精子DNA、0.1%SDS、10%ホルムアミド、pH7.2)中で、オリゴヌクレオチド官能化ミクロ粒子をインキュベートすることができる。プレハイブリダイゼーションの間、BSAはミクロ粒子表面の非占有部位をブロックするよう作用する。(脱脂粉乳などの)他の大きな非特異的タンパク質がBSAの代替として適切でありうる。
ハイブリダイゼーションステップは好ましくは、キメラの捕捉部分と完全に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用する。PNA-基質キメラは、オリゴヌクレオチド官能化粒子の懸濁液に最終濃度10〜100nMまで加える。ハイブリダイゼーションは、適切な条件、好ましくは約45℃で約30分間、常に回転させながら実施することができる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしたミクロ粒子を好ましくは洗浄バッファ、より好ましくはハイストリンジェンシーバッファ(例えば、10mMリン酸ナトリウム、15mM塩化ナトリウム、0.1%SDS、pH7.2)で、約45℃で約1時間、常に回転させながら洗浄する。次いで、ミクロ粒子を第1の洗浄バッファ(例えば、10mMリン酸ナトリウム、15mM塩化ナトリウム、pH7.2)で洗った後、ほぼ室温で約10分間、第2の洗浄バッファ(例えば、10mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH7.2)で洗う。ハイブリダイゼーション条件および洗浄頻度はキメラの捕捉部分の塩基配列にしたがって調整することができる。PNAハイブリダイゼーションの一般的なプロトコールはNielsenおよびEgholmが既に開示している(Peptide Nucleic Acids, Protocols and Applications, Peter E. Nielsen and Michael Egholm編, Horizon Scientific Press (1999))。
本発明のマルチプレックスアッセイは特に、酵素ファミリーのメンバー、関連するDNA結合分子、関連する受容体リガンド対などの関連する実体の存在または活性レベルを決定するのに特に適している。本発明のマルチプレックスアッセイで活性を決定できる1つの好ましい酵素ファミリーは、タンパク質のリン酸化および/または脱リン酸化を触媒するものである。セリン、スレオニンおよびチロシン残基のリン酸化は一般に、細胞内事象の最も重要な制御機構の1つであると考えられている。細胞膜上の受容体を刺激すると、キナーゼのカスケードが活性化され、様々な細胞内タンパク質がリン酸化される。これらの反応は可逆的であり、細胞が無数の刺激シグナルに動的に反応できるようになる。従来の方法を使用して、相互に関連するシグナル伝達経路の複数のキナーゼの活性を同時に決定することは難しい。本発明の分子構築体を使用すると、複数の基質のそれぞれに特有のタグを調製することができ、マルチプレックス分析が可能になる。リン酸化が起こると、例えば、リン-基質結合タンパク質、リン-基質特異抗体またはリン-基質結合キレートなどのリン酸化した基質と特異的に反応する検出可能なリガンドを用いて検出するために、リン酸化PNAキメラを、オリゴヌクレオチド官能化した色でコード化したミクロ粒子に配列特異的に捕捉させることができる。したがって、組織および細胞ならびに他のサンプルで、複数のキナーゼの活性を同時に決定することができる。
キナーゼタンパク質ファミリーの活性を測定する一例を図4に模式的に示す。ここで、Rafタンパク質(Raf-1、A-RafおよびB-Raf)は、PKCファミリーに相同性を有するセリン-スレオニンキナーゼであり、アミノ末端制御ドメインとカルボキシ末端制御ドメインを含んでいる。RafファミリーのメンバーはRasタンパク質に結合して、形質膜に移動させ、次いで活性化する。Rafキナーゼは不活性なMEK1キナーゼをリン酸化することにより、MEK1キナーゼを活性化し、次いで、MEK1キナーゼはMAPキナーゼ2/Erk2を活性化する。RafキナーゼはRasからMAPキナーゼへのシグナル伝達を媒介する。これらのシグナル伝達複合体の制御については、最近Kolchが総説を書いている(J. Biochem (2000), 35:289-305)。
MAPキナーゼ2/Erk2の活性は、PNA-MAPキナーゼ基質ペプチドキメラを使用して決定することができる。リン酸化されたPNA-ペプチドキメラを、オリゴヌクレオチド官能化した色でコード化したミクロ粒子に配列特異的に捕捉させた後、リン酸化されたセリン/スレオニン部分を検出することができる。例えば、2'-アミノ-3'-メトキシフラボン(C16H13NO3)などのキナーゼ阻害剤を加えることにより、シグナル伝達経路で特異的なキナーゼを阻害することができる(図4参照)。したがって、カスケードキナーゼアッセイを本発明の分子構築体と共に使用して、細胞サンプルのキナーゼ活性を検出することができる。このようなアッセイは、疾患状態や疾患のステージに関係する異常なキナーゼ活性を検出するのに有用である。多くの重要な成長因子はRas/Rafシグナル伝達経路を使用して、細胞を刺激して増殖させており、シグナル伝達複合体はある種のがんで異常な活性を有していることが発見されている。これらのアッセイはまた、創薬に関係する方法やシグナル伝達の研究にも有用である。
複数のキナーゼ活性を決定する第2の非限定的な例は、非受容体チロシンキナーゼのJAK(ヤーヌスファミリーチロシンキナーゼ)ファミリーに関連している。JAKは細胞内でサイトカイン受容体と結合しており、細胞外サイトカインにより活性化される。JAKキナーゼ(JAK1、JAK2、JAK3およびTyk2)はキナーゼドメインと酵素的に活性ではないシュードキナーゼドメインを有している。サイトカインの結合により、サイトカイン受容体の二量体化が起こり、結合JAKを活性化して、受容体自体をリン酸化する。次いで、リン酸化された受容体はSH2含有STAT(シグナルトランスデューサと転写活性化因子)のドッキング部位として機能する。JAK1はIL-2、IL-6(gp130)およびインターフェロン(IFN)受容体からのシグナル伝達に不可欠である。JAK3はg鎖を共有するサイトカイン受容体を介したシグナル伝達に必要である。JAK2はサイトカイン受容体の様々なサブセットを介したシグナル伝達に必要である。さらに、JAKはRas-MAPキナーゼ経路を活性化し、Tecを介して細胞内のPI-3キナーゼ経路も活性化する。JAKの主要なエフェクターであるSTATは潜在的なサイトゾル転写因子である。JAKキナーゼでリン酸化されると、STATはそのSHドメインにより一列に二量体になる。STAT1はIFNシグナル伝達の重要なメディエータであり、STAT4はIL-2に特異的であり、STAT6はIL-4およびIL-13で主として活性化され、その一方、STAT5AおよびSTAT5Bは成長ホルモンやプロラクチンの制御に最も重要であると考えられている。これらのSTATで誘導されたリン酸化事象も特異的な転写反応を促進する。gp130/JAK/STATシグナル伝達経路の制御についてはHeinrichらが総説に述べている(Heinrich他、Biotech. J. 334:297-314 (1998))。
本発明のPNA-基質キメラの集合を用いて、複数のJAKまたはSTATタンパク質の活性レベルを同時にモニターまたは検出することができる。PNA-STATキメラを使用することによって、細胞ベースのアッセイで複数のSTATのリン酸化を同時に決定することができる。複数のSTATタンパク質の活性レベルを測定する方法は、細胞侵入性PNAキメラを含む種々のPNA-STATキメラを対象とする細胞培養物に加えることから開始する。対象とするサイトカインまたは他の化合物からの刺激に応答して、JAK-STATシグナル伝達経路が活性化され、PNA-STATキメラを含むSTATタンパク質のリン酸化が起こる。標準的な手段で細胞を溶解させると、PNA-STATキメラが溶液中に放出される。次いで、このPNA-STATを配列特異的にオリゴヌクレオチド官能化ミクロ粒子に捕捉し、検出することができる。試験管内(インチューブハイブリダイゼーション)またはミクロ粒子アレイを有するシリコンチップ上(オンチップハイブリダイゼーション)で、PNAキメラのミクロ粒子上のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを実施することができる。本発明のこの実施形態を図5に模式的に示す。
PNA-STATキメラの他に、例えば、PNA-JAKキメラおよび対象とするエピトープを含むPNA-ペプチドキメラなどの他の種類のPNA-タンパク質キメラを他のシグナル伝達経路の他のエフェクターを決定するための細胞ベースの機能性アッセイで使用することもできる。このようなアッセイは、疾患状態を媒介するためにキナーゼ活性化転写活性をブロックするのに有用である。ヒトのJAK/STATシグナル伝達経路はある種の白血病の発症と関連づけられている。また、これらのアッセイは創薬アッセイおよび機能性プロテオミクスアッセイに有用である。
複数のキナーゼ活性を検出するさらに別の例は、アポトーシスの制御や発生に能動的な役割を有しているPKBおよびRACとも呼ばれるAktに関連する。Akt/PKBタンパク質キナーゼは、インスリンおよび様々な成長因子により活性化される。Akt/PKBタンパク質キナーゼは、PI-3キナーゼを含むウォルマリン(Wormannin)感受性経路で作用する。Akt/PKBは、PI-3キナーゼが活性化されると膜のリン酸化脂質に結合するアミノ末端プレックストリン相同(PH)性ドメインを含んでいる。Akt/PKBは、リン脂質の結合ならびに活性化ループのスレオニン308およびC末端領域のセリン473でのPKD1リン酸化により活性化される。Akt/PKBは、Bad、フォークヘッド型転写因子(FKHR)、GSK-3およびキャスパーゼ9などのいくつかの標的に対するリン酸化および不活化能によってアポトーシスを阻害することにより、細胞の生存を促進する作用を有する。PNA-PKDtideキメラおよびPNA-Akt/SGKペプチドキメラを基質として使用して、組織および細胞のPKD-1およびAkt/PKBの活性を同時に決定することができる。このような方法は、PNAペプチドキメラをサンプルに加えて、リン酸化を起こさせることを含む。リン酸化後に、リン酸化したPNAペプチドキメラを、色でコード化した磁気粒子を含むオリゴヌクレオチド官能化した色でコード化したミクロ粒子に配列特異的に捕捉させることができる。次いで、捕捉されたリン酸化ペプチドを、リン酸化ペプチド特異リガンドまたはリン酸化ペプチド特異抗体を使用して検出することができる。このプロセスを図6Aに模式的に示す。
さらに、図6Bに示すように、PNAキメラ細胞ベースアッセイで、Akt/PKBシグナル伝達を系統的に研究することもできる。この方法は、例えば、PKD、Akt/PKB、キャスパーゼ9、FKHR、BadおよびGSK-3などのPKD1/2および/またはAkt/PKBの基質である基質部分を有する1種または複数のPNAタンパク質キメラを、対象とする細胞サンプルに加えることを含む。この時点で、PNAキメラを採取することにより内部キナーゼ活性を直接測定して、これらのタンパク質の活性化の状態および/またはレベルを決定することができる。また、細胞サンプルを、例えば、インスリンまたは成長ホルモンなどの活性モジュレータで処理することもできる。これらのモジュレータの細胞表面受容体への結合により、細胞膜の内側にあるPDK1/2を活性化することができる。活性化されたPDK1/2はAkt/PKBをリン酸化し、これが次いでキャスパーゼ9、FKHR、BadおよびGSK-3タンパク質をリン酸化する。次いで、細胞を溶解し、それによってPNAタンパク質キメラを放出させる。PNAキメラを配列特異的なオリゴヌクレオチド官能化ミクロ粒子または他の固体マトリックスにハイブリダイズさせる。次いで、キメラの修飾された基質部分を標準的な手段で検出する。図6Bにこのアッセイを模式的に示す。このアッセイは、疾患状態および疾患のステージに関係する異常なキナーゼ活性を検出するのに有用である。これまでの研究で、変異プレセニリン-1遺伝子がアルツハイマー病患者で、アポトーシスを誘導し、Akt/PKBをダウンレギュレートすることが示されている(Wehl他、J. Neuroscience 19: 5360-5369 (1999))。このアッセイはこのような疾患状態を診断するにも有用である。
本発明の方法で分析できる別なタンパク質ファミリーはキャスパーゼである。この酵素ファミリーはアポトーシスすなわちプログラムされた細胞死に関係している。ミトコンドリアチトクロームcの放出などのプロアポトーシスシグナルは、キャスパーゼ8、9および10などの開始キャスパーゼの自己触媒的活性化を促進する。これらのキャスパーゼは活性化されると、キャスパーゼ3、6および7などの下流のエフェクターを切断して、活性化し、これらが次いでアポトーシス細胞の細胞骨格タンパク質および核タンパク質を切断する。他のプロアポトーシス刺激には、FasリガンドおよびTNF-αの細胞表面受容体への結合、DNA損傷、細胞内の小胞体(ER)へのストレスがある。FasおよびTNF受容体はキャスパーゼ8および10を活性化し、損傷を受けたDNAはキャスパーゼ9の活性化を招くが、ERへのストレスはカルシウムを介したキャスパーゼ12の活性化を招く。この複雑なスキームを図7に示す。PNAキメラを使用する本発明のマルチプレックスアッセイは、シグナル伝達事象の作用または細胞機能を同時にモニターする有効なツールを提供する。
本発明の1実施形態では、PNA-キャスパーゼキメラを、各キメラが規定のプロキャスパーゼの切断部位を含むように調製する。PNA-キャスパーゼキメラは、検出のために、例えば蛍光タグおよびポリヒスチジンタグなどの少なくとも1つの標識タグ、好ましくは2つのタグも含んでいる。これらの2つのタグはペプチド基質の切断部位の両側に位置している。細胞透過性PNA-キャスパーゼキメラの混合物を対象となる細胞サンプルに加える。TNF-αまたはFasリガンドなどのプロアポトーシス刺激を選択したサンプルに加えて、プログラムされた細胞死の信号を誘発することができる。アポトーシス経路を活性化すると、PNA-キャスパーゼキメラを含む様々なキャスパーゼ基質が切断される。二重標識PNAキメラに含まれる蛍光染料の1つは、キャスパーゼが触媒する切断により除かれる。細胞が溶解されると、PNAキメラが放出される。放出されたPNAキメラは次いで、オリゴヌクレオチド官能化ミクロ粒子上に捕捉される。1つのタグをつけた切断産物または2つのタグをつけた非切断生成物からの蛍光を決定し、分析する。
本発明の別の実施形態では、この方法は新薬を同定するのに有用である。この実施形態では、小分子の薬剤候補をPNAと結合させ、効果を調べる。このようなPNA-小分子キメラは、創薬のためのリガンドのハイスループットスクリーニングに使用することができる。この方法の1例を図8に模式的に示す。ここで、スクリーニングのためにPNA-小分子キメラのライブラリーを調製する。個々のキメラは、基質ドメインとして規定の小分子およびアンカードメインとして公知の塩基配列を有するPNAオリゴマーを含んでいる。PNA-小分子キメラの混合物を対象となる細胞培養物に加え、対象とする標的にキメラを結合させ、標的細胞の活性化を引き起こす。図8は、シグナル伝達を誘発するGタンパク質結合受容体(GPCR)を示す。活性化後、有効なPNA-小分子キメラを、色でコード化したミクロ粒子上に提示された相補的なオリゴヌクレオチドに捕捉させる。小分子上のタグを検出することによって、あるいは検出可能な小分子に特異的なリガンドの結合によって、検出を実施することができる。捕捉とアンカードメインによって形成されたデュプレックスの融点より高い温度の溶液中でインキュベートすることにより、粒子から捕捉された小分子-PNAを取り外すことも望ましいことがある。次いで、回収されたPNA-小分子キメラをさらに分析することができる。
蛍光顕微鏡、色でコード化したミクロ粒子上の相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたPNAキメラの平面アレイによる検出の他に、各ミクロ粒子に提示されたPNA-キメラをフローサイトメトリーで検出することができる。この実施形態を図9に示す。したがって、色でコード化した粒子に固定化したオリゴヌクレオチドへのPNAキメラの配列特異的ハイブリダイゼーションは懸濁液中で実施することができる。ハイブリダイゼーション後、対象とするキメラの修飾した基質部分に対して高い結合親和性を有するリガンドと共に粒子をインキュベートする。さらに、リガンドは検出のための特異的な蛍光色素を含むこともできる。また、キメラに結合する第1のリガンドに第2の検出リガンドをつけて、色でコード化した粒子の蛍光から検出蛍光色素の放出波長を確実に識別できるようにすることができる。PNAのハイブリダイゼーションを検出するために、粒子をフローサイトメトリーで分析する。異なる種類の粒子をその特異的な蛍光によって同定する。捕捉されたPNAキメラを有する粒子は検出蛍光色素からの特異的な蛍光によって同定することができる。
本発明の別の実施形態では、PNAキメラを使用して特異的な細胞、すなわち特異的なタンパク質を提示する細胞または細胞表面上の他の同定実体を検出、分離する。例えば、抗体が対象とする細胞表面受容体に特異的であるPNA-抗体キメラを作製する。捕捉プロセスをモニターするために、抗体を蛍光染料で標識することができる。この方法の1例を図10に示す。この図では、CD4+細胞およびCD8+細胞を検出し、捕捉する。Cy3およびCy5は、タンパク質、修飾オリゴヌクレオチドおよび第1級アミン含有化合物用の蛍光標識である水溶性シアニン染料である。
本発明の別の実施形態では、PNAキメラの基質部分は核酸結合ドメインを含んでいる。この実施形態では、PNAキメラを、キメラの官能性ドメインと相互作用できると思われる検出可能な核酸に曝露する。次いで、結合した核酸を、固体マトリックス上に捕捉したオリゴヌクレオチド上に捕捉し、検出する。この実施形態はマルチプレックスであってもよい。
以下の実施例は本発明の作製と使用を説明する。これらの実施例は例示のために提供するものであって、本発明の範囲をいかなる意味でも限定することを意図するものではない。本明細書に示したすべての参考文献はすべて参照として本明細書に組み込むものとする。
実施例１
PNAキメラ捕捉のためのミクロ粒子表面へのDNAオリゴヌクレオチドの結合
2種の方法を使用して、固体表面、例えば、色でコード化したミクロ粒子にオリゴヌクレオチドプローブを結合させることができる。第1の方法である間接結合では、ビオチニル化オリゴヌクレオチドが固体表面に結合させたストレプトアビジンまたはその誘導体と相互作用する。タンパク質をミクロ粒子などの固体表面に結合させるプロセスは当技術分野で公知である(Bioconjugate Techniques, Greg T. 編,Hermanson, Academic Press, 1995)。図11Aに示すように、ビオチニル化オリゴヌクレオチドを、ミクロ粒子に結合させてある修飾型ストレプトアビジンのニュートロアビジンに効率的に結合させた。簡単に述べると、漸増量(0.488、0.977、1.953、3.906、7.813、15.63、31.25、62.5、125および250nM)のCy5標識ビオチニル化オリゴヌクレオチドを、所与の固定数の色でコード化したニュートロアビジン官能化ビーズとインキュベートした。この結合反応はPBS中、室温で30分間実施した。結合後、ビーズをPBSTで洗浄することにより結合していないオリゴヌクレオチドを除去した。ミクロ粒子の表面の非占有部分はBSA(100mMリン酸バッファ(pH7.4)中10mg/ml)を使用してブロックした。100mMリン酸バッファ(pH7.4)で洗浄した後、ミクロ粒子は4℃の保存バッファ中で保存することができる。次いで、様々な種類のビーズを試験管内で合わせ、ミクロ粒子アレイに集合させた。このアレイを蛍光顕微鏡下で調べた。ニュートロアビジンの一連の滴定結果を図11Aに示す。31nMのビオチニル化オリゴヌクレオチドの結合により、ニュートロアビジン官能化ビーズ(直径3.2.m)のすべての結合部位を飽和させることができ、オリゴヌクレオチド濃度が上昇するにつれて、1000msの積分時間で記録されたCy5信号強度は約100から6000に上昇した。図11Aに示した誤差バーは、平均の標準偏差を示している。
共有結合を形成する化学反応によって、オリゴヌクレオチドを固体担体の表面に直接結合させることもできる。公知の従来技術の方法に従って、アミン基をオリゴヌクレオチドの5'末端に導入することができる。オリゴヌクレオチドのトシル活性化ミクロ粒子への結合は1段階反応で実施した。アミン-トシルを介した直接結合の例を図11Bに示す。簡単に述べると、漸増量(0.977、1.953、3.906、7.813、15.63、31.25、62.5、125、250および500nM)のCy5標識アミン修飾オリゴヌクレオチドを、所与の固定数の色でコード化したトシル活性化ビーズと共にインキュベートした。一般に、結合反応は100mMリン酸ナトリウム(pH7.4)中、37℃で終夜実施した。結合後、ビーズをPBSTで洗浄して結合していないオリゴヌクレオチドを除去し、ミクロ粒子をウシ血清アルブミン(BSA)(100mMリン酸バッファ(pH7.4)中10mg/mlで500μl)と共にインキュベートして、粒子表面の非占有部分をブロックした。ブロッキングは、常に回転させながら37℃で1時間実施した。次いで、様々な種類のビーズを試験管内で合わせ、ミクロ粒子アレイに集合させた。このアレイを蛍光顕微鏡下で調べた。図11Bの一連の滴定結果は、オリゴヌクレオチド濃度が上昇するにつれて、1000msの積分で記録されたCy5信号強度は約100から5000に上昇したことを示している。図11Bに示した誤差バーは、平均の標準偏差を示している。250nMのアミン標識オリゴヌクレオチドを使用した結合により、トシル活性化したコーティングされたビーズ(直径3.2.m)のすべての結合部位を飽和させることができる。100mMリン酸バッファ(pH7.4)で洗浄した後、オリゴヌクレオチド官能化ミクロ粒子は、常に回転させながら、4℃で保存バッファ(100mMリン酸、1mMEDTAおよび0.05%アジ化ナトリウム)中に保存することができる。
実施例２
ビオチニル化PNAオリゴマーの精製
合成PNAキメラは液体クロマトグラフィーで精製することができる。2種のビオチニル化PNAオリゴマーの高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)精製の1例を図12に示す。ビオチニル化ビスPNA(「PNAクランプ」)および線状PNAの分子量はそれぞれ4.3kDおよび7.5kDである。PNAオリゴマーは、125mM NaClを含む10mMトリスバッファ(pH7.5)でゲル濾過カラムで分離し、クロマトグラフィープロファイルは波長260nMでモニターした。流量0.5ml/分で、0.5mlの溶出液画分を48本集めた。それぞれ4.3kDのPNAクランプ(画分25)と7.5kDの線状PNA(画分28)に対応する低いピークと高いピークの2つの特有のピークが同定された。精製されたPNAオリゴマーの分子量は質量分析で確認した。
実施例３
精製PNA-ペプチドキメラの分光光度プロファイル
PNAキメラの蛍光色素による標識を確認するために、精製PNAキメラの分光光度プロファイルを走査分光光度計で記録した。図13AおよびBに示した精製したテトラメチルローダミン(TMR)標識PNA-ペプチドキメラおよびCy5標識PNAの分光光度プロファイルはそれぞれ、PNAと蛍光染料の明確な吸収特性を示している。波長域250〜300nmのピークはペプチドを有するまたは有していないPNAに対応し、一方、TMR標識(図13A)は500から550nmの範囲のピークで同定され、Cy5標識(図13B)は625〜675nmの波長範囲で同定される。
実施例４
ミクロ粒子アレイ上のDNAオリゴヌクレオチドへのビスPNAオリゴマーのオンチップハイブリダイゼーション
オンチップハイブリダイゼーションを実施して、マイクロアレイに固定化したDNAオリゴヌクレオチドへのビスPNAオリゴマーの配列特異的捕捉を確認した。簡単に述べると、ビスPNAオリゴマーは各アームに12〜13個のチミン塩基を有するビオチニル化したPNAクランプであった。ハイブリダイゼーションの前に、4種のビオチニル化オリゴヌクレオチドをニュートロアビジン官能化ミクロ粒子に結合させた。各オリゴヌクレオチドは、18マーのオリゴアデニン(A-18)、無関係な18ヌクレオチドの配列(N-18)、10マーのポリアデニン(A-10)および、無関係なヌクレオチドの配列(N-10)を含んでいた。結合後、オリゴヌクレオチド官能化ミクロ粒子すべてを、オリゴヌクレオチド捕捉プローブを含まない陰性対照粒子と共に、1本の試験管で合わせて、シリコンチップ上にミクロ粒子アレイを集合させた。チップを先ず、90mM NaCl、83mMグアニジンチオシアナート、8mM MgC12、17nM EDTA、0.1%ビオチン、0.1%Tween-20、70mM Tris-HClを含むバッファ(pH7.5)中、40℃で20分間プレハイブリダイズさせた。次いで、ビオチニル化したビスPNAを最終濃度200nMとなるようにプレハイブリダイゼーションバッファに加えた。ハイブリダイゼーションは加湿チャンバ内、40℃で1時間実施した。陰性対照チップにはハイブリダイゼーションバッファにPNAを入れなかった。ハイブリダイゼーションが終了したら、チップを室温で10分間、100mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.1%Tween-20で洗浄した。粒子に提示されたオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたビオチニル化PNAを検出するために、チップを室温で30分間、100mM NaCl、100mMリン酸ナトリウム(pH7.5)中のCy5結合ストレプトアビジン(20μg/ml)と共にインキュベートした。15mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.5)で洗浄した後、蛍光顕微鏡を使用してアレイを調べた。特定の波長を通す様々なフィルターを使用して同じチップからいくつかの画像を得た。粒子の本質(identity)はそれぞれの色コードで決定した。チップのCY5画像からのビーズのアッセイ信号を解読粒子と合わせ
た。適合するA-10粒子およびA-18粒子ならびに不適合のN-10粒子およびA-18粒子からのアッセイ信号を抽出して分析した。Cy5信号を有する粒子は標準的画像分析により同定した。図14に示すように、ビスPNAクランプは10マーおよび18マーのポリアデニンで官能化した粒子に特異的にハイブリダイズするが、ビスPNAクランプは無関係のヌクレオチド配列(N-10またはN-18)にはハイブリダイズせず、対照的に、陰性対照アレイはPNAを捕捉しない。コンピュータプログラムを使用してチップからの画像を自動的に配列させた。種々の波長での蛍光強度を画像から抽出し、チップ上の各粒子に割り当てた。次いで、染色されたビーズの内部染料の蛍光強度を密集させた。
実施例５
色でコード化したミクロ粒子上のDNAオリゴヌクレオチドに対するビスPNAオリゴマーのインチューブハイブリダイゼーション
インチューブハイブリダイゼーションアッセイを実施して、色でコード化したミクロ粒子上のDNAオリゴヌクレオチドへのビスPNAオリゴマーの配列特異的捕捉を確認した。簡単に述べると、ビスPNAオリゴマーは各アームに12〜13個のチミン塩基を有するビオチニル化したPNAクランプであった。ハイブリダイゼーションの前に、4種のビオチニル化オリゴヌクレオチドをニュートロアビジン官能化ミクロ粒子に結合させた。各オリゴヌクレオチドは18マーのオリゴアデニン(A-18)、無関係な18ヌクレオチドの配列(N-18)、10マーのポリアデニン(A-10)、無関係なヌクレチドの配列(N-10)を含んでいた。対照のミクロ粒子は表面にオリゴヌクレオチドを含んでいなかった。結合後、オリゴヌクレオチド官能化ミクロ粒子をすべて、1本の試験管内で合わせた。オリゴヌクレオチド官能化ミクロ粒子を先ず、90mM NaCl、83mMグアニジンチオシアナート、8mM MgC12、17nM EDTA、0.1%ビオチン、0.1%Tween-20、70mM Tris-HClを含むバッファ(pH7.5)中、40℃で20分間プレハイブリダイズさせた。次いで、ビオチニル化したビスPNAを最終濃度200nMとなるようにプレハイブリダイゼーションバッファに加えた。ハイブリダイゼーションは加湿チャンバ内、40℃で1時間実施した。陰性対照はハイブリダイゼーションバッファにPNAを入れずにアッセイした。ハイブリダイゼーションが終了したら、粒子を室温で10分間、100mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.5)、0.1%Tween-20で洗浄した後、シリコンチップ上にミクロ粒子アレイを集合させた。捕捉されたビオチニル化PNAを検出するために、チップを室温で30分間、100mM NaCl、100mMリン酸ナトリウム(pH7.5)中のCy5.5結合ストレプトアビジン(20μg/ml)と共にインキュベートした。15mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.5)で洗浄した後、蛍光顕微鏡を使用してアレイを調べた。粒子の本質はそれぞれの色コードで決定した。Cy5.5信号を有する粒子をコンピュータプログラムを用いて同定した。図15Aに示すように、ビスPNAクランプはA-18で官能化した粒子に特異的にハイブリダイズしたが、C-18およびN-18で官能化した粒子にはハイブリダイズしなかった。具体的には、特異的にA-18に捕捉されたビスPNAクランプは、Cy5.5チャネルで1000msの積分で約4750の任意の単位のCy5.5信号を生じたが、C-18およびN-18で官能化した粒子はそれぞれ約500および1000のCy5.5信号を生じた。インチューブPNAハイブリダイゼーションで生じたCy5.5信号強度(図15A)は実施例4で実施したオンチップハイブリダイゼーションの信号強度(図15B)とほぼ等しかった。
実施例６
ミクロ粒子アレイ上に提示されたDNAオリゴヌクレオチドに対するPNA-タンパク質キメラのハイブリダイゼーション
オンチップハイブリダイゼーションアッセイを実施して、マイクロアレイに固定化したDNAオリゴヌクレオチドへのビスPNA-タンパク質キメラの配列特異的捕捉を確認した。簡単に述べると、PNAタンパク質キメラはCy5.5標識ストレプトアビジンとビオチニル化PNAクランプの結合体であった。PNAクランプは各アレイに12〜13個のチミン塩基を有している。同等の量のCy5.5標識ストレプトアビジンとビオチニル化PNAクランプを結合に使用し、結合は室温、PBS中で30分間実施した。ハイブリダイゼーションの前に、4種のビオチニル化オリゴヌクレオチドをニュートロアビジン官能化ミクロ粒子に結合させた。各オリゴヌクレオチドは18マーのオリゴアデニン(A-18)、18マーのオリゴシトシン(C-18)、無関係な18ヌクレオチドの配列(N-18)を含んでいた。結合後、オリゴヌクレオチド官能化ミクロ粒子すべてを、オリゴヌクレオチド捕捉プローブを含まない陰性対照粒子と共に、1本の試験管内で合わせて、シリコンチップ上にミクロ粒子アレイを集合させた。チップを先ず、90mM NaCl、83mMグアニジンチオシアナート、8mM MgC12、17nM EDTA、0.1%ビオチン、0.1%Tween-20、70mM Tris-HClを含むバッファ(pH7.5)中、40℃で20分間プレハイブリダイズさせた。次いで、ビスPNA-タンパク質キメラを最終濃度200nMとなるようにプレハイブリダイゼーションバッファに加えた。ハイブリダイゼーションは加湿チャンバ内、40℃で1時間実施した。陰性対照チップにはハイブリダイゼーションバッファにPNAを入れなかった。ハイブリダイゼーションが終了したら、チップを室温で10分間、100mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.5)、0.1%Tween-20で洗浄した。蛍光顕微鏡を使用してチップを調べた。特定の波長を通す様々なフィルターを使用して同じチップからいくつかの画像を得た。粒子の本質はそれぞれの色コードで決定した。Cy5.5信号を有する粒子を実施例4に記載のように標準的な画像分析で同定した。図16に示すように、PNAを含まない対照チップと比較して、ビスPNAタンパク質キメラはチップ上の18マーのポリアデニンと結合した粒子と特異的にハイブリダイズする(1000msの積
分でCy5.5信号強度140)。いずれの場合も、C-18、N-18および対照(ナシ、表面上のオリゴヌクレオチドなし)は1000msの積分でCy5.5信号強度約45単位が得られただけであった。
実施例７
色でコード化した磁性ミクロ粒子に固定化したオリゴヌクレオチドへのビオチニル化PNAオリゴマーのオンチップハイブリダイゼーション
標的分子のオンチップハイブリダイゼーションのオリゴヌクレオチドプローブは、色でコード化した磁性粒子に固定化した。具体的には、既知のヌクレオチド配列を有するビオチニル化オリゴヌクレオチド(0.4μM)を、表面をニュートロアビジンでコーティングした規定の種類の色でコード化した磁性粒子(約6.7×105個)と結合させた。結合反応は、攪拌しながら、室温で、30分間、0.1mlの結合バッファ(150mM NaCl、0.05mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、0.5%ウシ血清アルブミン、0.5mM Tris-HClおよび100mMリン酸ナトリウム、pH7.2)中で実施した。結合後、磁石を用いて粒子を集めた。攪拌しながら、室温で、20分間、0.05%Tween-20を含む150mM NaClおよび100mMリン酸ナトリウム(pH7.2)に溶かした0.1%ビオチンで、未反応のニュートロアビジン部位をブロックした。ブロック後、0.05%Tween-20を含む150mM NaClおよび100mMリン酸ナトリウム(pH7.2)0.2mlで粒子を洗浄した。このプロトコールは他のビオチニル化オリゴヌクレオチドを他の種類のニュートロアビジンコーティング粒子に結合させるときにも適応した。
従来技術で公知の方法に従って、磁性粒子および非磁性粒子を含む種々の色でコード化したオリゴヌクレオチド官能化ミクロ粒子を1本の試験管内で合わせて、ミクロ粒子アレイを集合させた。この実施例では、アレイは4000部位のアレイテンプレートを含む2.5×2.5mmのシリコンチップでアレイを形成した。ミクロ粒子に提示された相補的オリゴヌクレオチド捕捉プローブのアレイ上へのビオチニル化ペプチド核酸(PNA)のオンチップハイブリダイゼーションは、濃度200nMのビオチニル化PNAオリゴマーを含むハイブリダイゼーションバッファ(90mM NaCl、83mMグアニジンチオシアナート、8mM MgC12、17nM EDTA、0.02%ビオチン、0.1%Tween-20、70mM Tris-HCl、pH7.5)30μl中で実施した。ハイブリダイゼーションは40℃で60分間、回転シェーカで実施した。ハイブリダイゼーションが終了したら、アレイを室温で10分間、50mlの250mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.5)、0.1%Tween-20で洗浄した。室温で、30分間、150mM NaClおよび100mMリン酸バッファ(pH7.2)中のCy5.5結合ストレプトアビジン(18μg/ml)と共にミクロ粒子アレイをインキュベートして、捕捉されたビオチニル化PNAオリゴマーを可視化した。15mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.5)で洗浄した後、アレイを蛍光顕微鏡下で調べた。色でコード化したミクロ粒子およびCy5.5標識PNAオリゴマーから放射された蛍光を、特定の波長を有する光学フィルターを使用して決定した。磁性粒子および非磁性粒子はその色コードに従って解読した。Cy5信号を有する粒子を、実施例4に記載のように標準的な画像分析で同定した。図17に示すアッセイの結果は、PNAは、色でコード化された磁性粒子および非磁性粒子上に提示された相補的なオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることを示した。より具体的には、オンチップハイブリダイゼーションアッセイで、2つのミクロ粒子アレイ(パネルAおよびBに対しそれぞれチップAおよびB)からの4種の色でコード化したミクロ粒子(I、II、IIIおよびIV)からCy5.5信号強度を決定した。タイプIの粒子は色でコード化した磁性粒子で
あり、一方、タイプII、IIIおよびIVは3種の磁性ではない色でコード化した粒子である。タイプIおよびIIの粒子は、PNAオリゴマーに相補的なビオチニル化オリゴヌクレオチドに固定化させた。タイプIIIの粒子はPNAと無関係の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと結合させた。タイプIVの粒子は表面にオリゴヌクレオチドを有していなかった。チップBはチップAの陰性対照として機能し、PNAを含まないハイブリダイゼーション混合物と共にインキュベートした。「n」はチップ上の粒子の数を示している。タイプIおよびタイプIIの粒子はそれぞれ信号強度約2250および1500を生じ、一方、タイプIIIおよびタイプIVの粒子は約400および250のCy5.5信号強度で、顕著な信号は生じなかった。バーは平均の標準偏差を表している。
実施例８
ミクロ粒子アレイ上のオリゴヌクレオチドに対するPNA-小分子キメラのオンチップハイブリダイゼーション
色でコード化したミクロ粒子アレイ上に提示されたDNAオリゴヌクレオチドに対するビスPNA-小分子キメラの配列特異的捕捉を確認するため、オンチップハイブリダイゼーションアッセイを実施した。簡単に述べると、図13および実施例3に関連して上記したように、ビスPNA-小分子キメラは、各アームに規定の配列の10個の塩基を含むビスPNAとCy5染料の結合体であった。実施例1に上記したように、ハイブリダイゼーションの前に、4種のビオチニル化オリゴヌクレオチドをニュートロアビジン官能化ミクロ粒子に結合させた。各オリゴヌクレオチドは以下の配列を有している:10マーのポリアデニン(A-10)およびそれぞれがビスPNAオリゴマーのアームの1つに相補的な10マー(P-10)。オリゴヌクレオチド捕捉プローブを提示しない対照のミクロ粒子も含んだ。結合後、オリゴヌクレオチド官能化ミクロ粒子すべてを、オリゴヌクレオチド捕捉プローブを含まない陰性対照粒子と1本の試験管内で合わせて、シリコンチップ上にミクロ粒子アレイを集合させた。チップを先ず、90mM NaCl、83mMグアニジンチオシアナート、8mM MgC12、17nM EDTA、0.1%ビオチン、0.1%Tween-20、70mM Tris-HClを含むバッファ(pH7.5)中、40℃で20分間プレハイブリダイズさせた。ビスPNA-Cy5結合体を最終濃度200nMとなるようにプレハイブリダイゼーションバッファに加えた。ハイブリダイゼーションは加湿チャンバ内、40℃で1時間実施した。陰性対照チップはPNAキメラを含まないハイブリダイゼーションバッファに入れた。ハイブリダイゼーションが終了したら、チップを15mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH 7.5)、で洗浄した後、蛍光顕微鏡下で調べた。粒子の本質はそれぞれの色コードにより決定した。Cy5信号を有する粒子は実施例4に記載の標準的な画像分析によりビーズから同定した。図18のチップに関するアッセイの結果は、ビスPNA-小分子キメラは、相補的なP-10捕捉プローブで官能化した粒子に特異的にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション信号(500msの積分時間で記録)を生じたが、A-10粒子および対照粒子ではハイブリダイゼーションは起こらず、チップの粒子のいずれも顕著な信号は生じなかった。誤差
バーは平均の標準偏差を示している。
実施例９
ミクロ粒子アレイ上の3種のリン酸化ペプチドの標準曲線の同時作成
3種のビオチニル化リン酸化ペプチド(ペプチド-P-1、P-2およびP-3、ペプチド-P-1:ビオチン-CKVEKIGEGT[pY]GVVYK(配列番号1)、アミノ酸11のチロシンがリン酸化されており、ヒトチロシンキナーゼ基質p34cdc2由来である(Cheng, 他, J. Biol. Chem. 267:9248-9256,1992)。ペプチド-P-2:ビオチン-CEGPWLEEEEEA[pY]GWMDFK-ビオチン(配列番号2)、13位のチロシンがリン酸化されており、ヒトガストリン-17である(Baldwin他, Nature, 301, 435-437,1983)。ペプチド-P-3:ビオチン-CRRLIEDAE[pY]AARGK、アミノ酸10のチロシンがリン酸化さており、ルイス肉腫ウイルス形質転換タンパク質からのp60srcのチロシンリン酸化部位由来である(配列番号3)(Casnelli他, PNAS 79:282-286, 1982)。規定の濃度0、0.0012、0.0024、0.0048、0.0064、0.008および0.012pg/mlのペプチド-P-1、ペプチド-P-2およびペプチド-P-3を、実施例1に記載のように、ニュートロアビジンで官能化してある色でコード化したミクロ粒子と結合させた。次いで、実施例1に記載の方法などの公知の方法に従って、ペプチド官能化ミクロ粒子をすべて合わせて、ミクロ粒子アレイに集合させる。集合したミクロ粒子アレイを、すべてのペプチドのリン酸化修飾に特異的なモノクローナル抗体と共にインキュベートした。信号増幅のために、チップを、アレイに結合した一次モノクローナル抗体に特異的な、蛍光染料で標識した二次抗体と共にインキュベートした。PBSTで洗浄した後、READアッセイなどの公知の従来技術の方法に従って蛍光顕微鏡を使用してアレイを調べた。この方法を使用することによって、1つのミクロ粒子アレイを使用して3種のリン酸化ペプチドの標準曲線を作成した(図19)。ペプチド濃度が上昇するにつれて、500msの積分時間でのCy5蛍光信号強度も3種すべてのリン酸化ペプチドについて、500回の積分でCy5信号強度約400から約1400単位の範囲で一般に上昇した。図19に示す誤差バーは平均の標準偏差を示している。
実施例１０
ミクロ粒子アレイでのリン酸化ペプチド標準曲線の作成
規定の濃度0、0.002、0.004、0.008、0.01および0.12μg/mlの実施例9に記載の各種のビオチニル化リン酸化ペプチド(ペプチド-P-およびP-2)を、例えば実施例1に記載の手順などの公知の従来技術の方法に従って、表面をニュートロアビジンでコーティングしてある規定のタイプの色でコード化したビーズに結合させた。粒子表面の未反応部位を公知の従来技術の方法に従ってブロックした。次いで、LEAPSおよび2001年12月28日出願の暫定出願第60/343,621号および2002年7月9日出願の米国出願番号第10/192352号に既に記載されている直接付着集合法などの公知の従来技術の方法に従って、同じ種類のリン酸化ペプチドを有する官能化ビーズを試験管内で合わせて、ミクロ粒子アレイに集合させた。集合させたミクロ粒子アレイを、すべてのペプチドのリン酸化修飾に特異的なモノクローナル抗体と共にインキュベートした。信号増幅の目的で、一次モノクローナル抗体をさらに、特異的な二次抗体および蛍光(Cy5)標識三次抗体を使用して結合させた。PBSTで洗浄した後、READアッセイなどの公知の従来技術の方法に従ってアレイを蛍光顕微鏡を使用して調べた。この方法を使用することによって、ミクロ粒子アレイを使用してリン酸化ペプチドの標準曲線を作成した(図20)。P-ペプチド-1では、500msの積分でCy5信号強度は約500から約5000単位に上昇し、0.008μg/mlの濃度で最高となった。同様に、ペプチド-P-2では、500msの積分でCy5信号強度は約500から約4500単位に上昇し、0.008μg/mlの濃度で最高となった。図20に示す誤差バーは平均の標準偏差を示している。
実施例１１
ミクロ粒子アレイ上のペルオキシダーゼ結合抗体を使用するリン酸化ペプチドの免疫検出
各種のビオチニル化リン酸化ペプチドまたはビオチニル化非リン酸化ペプチドを、例えば実施例1に記載の手順などの公知の従来技術の方法に従って表面をニュートロアビジンでコーティングしてある規定の色でコード化したビーズに結合させた。担体表面のペプチドの密度は実施例1に記載のように最高に達する。結合後、0.05%Tween-20を加えたリン酸緩衝食塩水(PBS;0.1Mリン酸ナトリウム、0.15M塩化ナトリウム、pH7.2)(PBST)を使用して粒子を洗浄した。次いで、近表面粒子の光制御電気運動アセンブリ(LEAPS)および2001年12月28日出願の仮出願第60/343,621号および2002年7月9日出願の米国出願番号第10/192352号に既に記載されている直接付着集合法などの公知の従来技術の方法に従って、ペプチド官能化ビーズをすべての試験管内で合わせて、ミクロ粒子アレイを集合させた。集合させたミクロ粒子アレイを、PBST中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)を使用してブロックした。アレイ上のリン酸化ペプチドを免疫検出するために、リン酸化修飾に特異的なペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗体と共にチップをインキュベートした。加湿チャンバー内でインキュベーションして、抗体をリン酸化ペプチドに結合させた。抗体結合ミクロ粒子アレイをPBSTを使用して洗浄した後、Molecular Probesのチラミド試薬(例えば、カタログ番号T-20912、T-20916など)を使用するなど、公知の従来技術の方法を使用して、ペルオキシダーゼ基質を使用して検出を行った。
チラミド試薬を使用したリン酸化ペプチドの免疫検出の結果を図21に示す。簡単に述べると、4種の色でコード化したミクロ粒子のそれぞれを、2種のリン酸化ペプチド(Ty-P-1またはペプチド-P-2)の1つ、1種の非リン酸化ペプチド(Ty-1)またはナシすなわちペプチド対照(PBS)と結合させた。ここでTyはビオチン-KVEKIGEGTYGVVYK(配列番号4)であり、Ty-P-1はアミノ酸10にリン酸化チロシンを有するTy-1(ビオチン-KVEKIGEGT「pY」GVVYK)であり、ペプチド-P-2はビオチン-CEGPWLEEEEEEA[pY]GWMDFK(配列番号2)で、14位のチロシンがリン酸化されている。修飾に特異的なアルカリ性ホスファターゼ結合モノクローナル抗体を使用して、ペプチド官能化ミクロ粒子を免疫検出用の粒子アレイに集合させた。結合した抗体はチラミド試薬を使用して検出した。ビーズからの蛍光信号は、ランダムコード化アレイ検出(READ)アッセイなどの公知の従来技術の方法に従って、蛍光顕微鏡を使用して検出した。簡単に述べると、色でコード化したミクロ粒子および分析物から放射された蛍光を特異的な光学フィルターを使用して決定した。粒子の本質はその特有の色コードで解読した。正のアッセイ信号を有する粒子は、実施例4に記載のように標準的な画像分析により同定した。アルカリ性ホスファターゼが触媒する化学反応により生成された蛍光生成物、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)を結合抗体ビーズ上に沈殿させた。図21は、リン酸化ペプチドでは、より高いFITC信号強度を示し、Ty-P-1について1000msの積分で11000単位、ペプチド-P-2について1000msの積分で15000単位であり、非リン酸化Ty-1または対照では、1000msの積分で約700単位の有意に低い信号を示している。図21の誤差バーは平均の標準偏差を表している。
実施例１２
ミクロ粒子アレイ上の蛍光染料標識抗体を使用するリン酸化ペプチドの検出
各種のビオチニル化リン酸化ペプチドまたはビオチニル化非リン酸化ペプチドを、例えば実施例1に記載の手順などの公知の従来技術の方法に従って表面をニュートロアビジンでコーティングしてある規定の色でコード化したビーズに結合させた。担体表面のペプチドの密度は実施例1に記載のように最高に達する。結合後、PBSTを使用して粒子を洗浄した。次いで、LEAPSおよび2001年12月28日出願の暫定出願第60/343,621号および2002年7月9日出願の米国出願番号第10/192352号に既に記載されている直接付着集合法などの公知の従来技術の方法に従って、ペプチド官能化ビーズをすべて1つの試験管内で合わせて、ミクロ粒子アレイを集合させた。集合させたミクロ粒子アレイを、PBST中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)を使用してブロックする。アレイ上のリン酸化ペプチドを免疫検出するために、リン酸化修飾に特異的なモノクローナル抗体と共にチップをインキュベートする。加湿チャンバー内でインキュベートして、抗体をリン酸化ペプチドに結合させる。PBSTを使用して、結合していない抗体を洗い流す。信号増幅のために、チップを、アレイに結合した一次モノクローナル抗体に特異的な二次抗体と共にインキュベートする。二次抗体に特異的な蛍光標識抗体と共にチップをインキュベートして信号をさらに増強することができる。PBSTで洗浄した後、READアッセイなどの公知の従来技術の方法に従って、蛍光顕微鏡を使用してアレイを調べた。
ミクロ粒子アレイ上の蛍光標識抗体を使用したリン酸化ペプチドの免疫検出の結果を図22に示す。簡単に述べると、4種の色でコード化したミクロ粒子をそれぞれ、2種のリン酸化ポリペプチド(Ty-P-1またはペプチド-P-2)の1つ、実施例11に記載の1種の非リン酸化ペプチド(Ty-1)、ナシ、ペプチド対照(PBS)と結合させる。ペプチド官能化したミクロ粒子を粒子アレイに集合させる。チップを、リン酸化ペプチド特異的モノクローナルマウスIgG抗体と共にインキュベートした後、マウスIgG特異二次抗体、次いで蛍光顕微鏡で検出するためにCy5標識した三次抗体と共にインキュベートした。Cy5信号により蛍光を検出した。図22は、リン酸化ペプチドでは、Ty-P-1では1000msの積分で15000単位、ペプチド-P-2では1000msの積分で15500単位とより高いCy5信号強度を、非リン酸化Ty-1または対照では、1000ms積分で約1400単位の有意に低い信号を示している。図22の誤差バーは、各平均強度の標準偏差を示している。
実施例１３
ミクロ粒子アレイ上の蛍光染料標識抗体を使用した複数のリン酸化ペプチドの検出
各種のビオチニル化リン酸化ペプチドまたはビオチニル化非リン酸化ペプチドを、例えば実施例1に記載の手順などの公知の従来技術の方法に従って表面をニュートロアビジンでコーティングしてある規定の色でコード化したビーズに結合させた。担体表面のペプチドの密度は実施例1に記載のように最高に達した。結合後、PBSTを使用して粒子を洗浄した。次いで、LEAPSおよび2001年12月28日出願の暫定出願第60/343,621号および2002年7月9日出願の米国出願番号第10/192352号に既に記載されている直接付着集合法などの公知の従来技術の方法に従って、ペプチド官能化ビーズをすべて1つの試験管内で合わせて、ミクロ粒子アレイを集合させた。集合させたミクロ粒子アレイを、PBST中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)を使用してブロックした。アレイ上のリン酸化ペプチドを免疫検出するために、リン酸化修飾に特異的なモノクローナル抗体と共にチップをインキュベートした。加湿チャンバー内でインキュベートして、抗体をリン酸化ペプチドに結合させた。PBSTを使用して、結合していない抗体を洗い流した。信号増幅のために、チップを、アレイに結合した一次モノクローナル抗体に特異的な二次抗体と共にインキュベートした。二次抗体に特異的な蛍光標識抗体と共にチップをインキュベートして信号をさらに増強することができる。PBSTで洗浄した後、READアッセイなどの公知の従来技術の方法に従って、蛍光顕微鏡を使用してアレイを調べた。
ミクロ粒子アレイ上での蛍光標識抗体を使用した複数のリン酸化ペプチドの免疫検出の結果を図23に示す。簡単に述べると、6種の色でコード化したミクロ粒子それぞれを、4種のリン酸化ペプチド(ペプチド-P-1、ペプチド-P-2、ペプチド-P-3またはTy-P-1)の1つ、実施例9および11に記載の1種の非リン酸化ペプチド(Ty-1)、または非ペプチド対照(PBS)に結合させた。ペプチド官能化ミクロ粒子を粒子アレイに集合させた。チップをリン酸化ペプチド特異的モノクローナルマウスIgG抗体と共にインキュベートした後、マウスIgG特異的二次抗体、次いで蛍光顕微鏡で検出するためのCy5標識三次抗体と共にインキュベートした。蛍光はCy5信号で検出した。図23は、リン酸化ペプチドについては、ペプチド-P-1、ペプチド-P-2、ペプチド-P-3およびTy-P-1では1000msの積分で約14000単位のより高いCy5信号を、非リン酸化Ty-1および対照についてはそれぞれ1000msの積分で約500単位および1000単位の有意に低い信号を示している。図23の誤差バーは平均の標準偏差を示している。
実施例１４
二重標識した分析物の比の数量化(ratio quantification)
分析物を2種の蛍光染料で標識することができる。蛍光染料の1つは公知の従来技術の方法に従って分析物を内部または外部標識し、一方、他の染料は対象とする生化学反応中に分析物に取り入れた。分析物からの蛍光(分析物信号)とアッセイからの蛍光を、READアッセイなどの公知の従来技術の方法に従って蛍光顕微鏡を使用して決定することができる。反応効率に関係するアッセイ信号は、比の数量化、すなわちアッセイにおける分析物の信号に対するアッセイ信号の比で評価することができる。二重標識した分析物の比の数量化の一般デザインを図24Aに示す。
二重標識PNA-ペプチドキメラの具体的なデザインを図24Bに示す。PNA-ペプチドキメラはPNAアンカードメインと合成ペプチドの官能性ドメインを含んでいた。合成ペプチドはC末端の蛍光染料(Cy3)およびN末端のポリヒスチジン(His6)に隣接したキャスパーゼ3切断部位を含んでいた。PNA-キャスパーゼ3二重標識ペプチドキメラは次の通りである:PNA-リンカー-Cys(結合用)His His His His His His Asp Glu Val Asp Ala Lys-(C18-スペーサー)-Cy3(配列番号5)。
キメラのキャスパーゼ3消化(アスパラギン酸残基の3'位での切断による)により、Cy3蛍光染料が切断される。消化後、配列特異的DNA/PNAハイブリダイゼーションを介して、規定の色でコード化したミクロ粒子の表面にキメラを捕捉させた。PNA-ペプチドキメラが捕捉されたミクロ粒子をミクロ粒子アレイに集合させた。チップ上のHis6特異的モノクローナル抗体を使用することにより、キメラ上のHis6タグを検出した。特異的二次抗体および蛍光(Cy5)標識した三次抗体を使用して、一次モノクローナル抗体をさらに結合させた。ミクロ粒子アレイからのCy3蛍光強度は切断されていないキメラの部分に関連し、一方、Cy5標識の強度はミクロ粒子アレイに捕捉されたキメラの全量に相当した。したがって、相対的なキャスパーゼ3活性は、アッセイにおけるCy3とCy5の比を決定することによって定量された(図24C)。比の数量化によって決定された結果は、キャスパーゼ3の濃度が上昇する(0、0.0625、0.125、0.5、1、2および4ng/μl)と、蛍光Cy3/Cy5信号比は約1から0.6に低下することを示している。図24Cの誤差バーは平均の標準偏差を示している。
実施例１５
フローサイトメトリー分析による色でコード化したミクロ粒子上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたPNAキメラの検出
フローサイトメトリー分析による色でコード化したミクロ粒子上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたPNAキメラの検出の1例を図25Aに示す。簡単に述べると、2種の緑色でコード化したビーズ(グリーンAおよびグリーンB)をそれぞれ、規定の塩基配列を有する2種のオリゴヌクレオチドと結合させる(グリーンA ビオチン-スペーサー-AAAAAAAAAA(配列番号6);グリーンB:ビオチン-スペーサー-AAGGAGAGAA(配列番号7))。オリゴヌクレオチドのビーズへの固定化は実施例1に記載のように、あるいは従来の公知技術に従って実施した。グリーンAおよびグリーンBのビーズはグリーンチャネルでは特有の放射波長を有しているが、オレンジの波長の放射波長は主として2つのビーズで重複している(図25A)。オリゴヌクレオチド官能化したミクロ粒子を、実施例5に記載のインチューブPNAハイブリダイゼーションに使用した。ビオチニル化PNA-ペプチドキメラのPNAアンカードメインはグリーンBビーズに固定化された相補的オリゴヌクレオチドセンサーに結合したが、グリーンAビーズ上の不適合オリゴヌクレオチドには結合しなかった。ハイブリダイゼーション後、粒子を1×PBS中のR-フィコエリトリン結合ストレプトアビジン(1:100)と共にインキュベートした。R-フィコエリトリン結合ストレプトアビジンは、ビーズにハイブリダイズしたビオチニル化PNA-ペプチドキメラに結合した。ハイブリダイズしたPNAキメラの検出はフローサイトメトリー分析で実施した。(図25Cに模式的に示す)。図25Aに示すように、アッセイ後、グリーンBビーズはR-フィコエリトリンの放射波長に対応するオレンジの蛍光をかなりの量で獲得し、アッセイでは、グリーンBビーズにPNAペプチドキメラがハイブリダイゼーションしたことを示した(図25A)。フローサイトメトリーによる検出を、ミクロ粒子の固定化した相補的なオリゴヌクレオチドに対するインチューブpPNAハイブリダイゼーションに使用することができる。2種のニュートロアビジンコーティングミクロ粒子の1つをビオチンスペースA(10)に固定化し、もう一方のミクロ粒子にはオリゴヌクレオチドを固定化しなかった。これらの2種のビーズをビオチニル化ビスpPNAキメラと共にインキュベートした。ビスpPNAのアンカー部分は、ハイブリダイゼーションのために各アームに12〜13個のチミン塩基を含んでいた。インチューブ条件でのハイブリダイゼーションおよび洗浄は上記の通りである。ハイブリダイゼーション後、ビーズを1×PBS中のフルオレセイン(DTAF)結合ストレプトアビジン(1:300)と共にインキュベートした。フルオレセイン(DTAF)結合ストレプトアビジンは、ビーズ上にハイブリダイズしたビオチニル化pPNAキメラに結合した。ハイブリダイズしたpPNAキメラの検出はフローサイトメトリー分析で実施した。
実施例１６
ミクロ粒子アレイを使用したプロテアーゼ活性の検出用の基質ペプチドの一般的なデザイン
PNA-ペプチドキメラ基質をプロテアーゼ活性の存在を決定するために使用することができる。合成ペプチドはプロテアーゼ活性の決定に日常的に使用されている。これらのPNA-ペプチドキメラ基質は、3つのフォーマットの少なくとも1つで設計した(図26)。キメラの官能性ドメインは1種の蛍光染料(I)、2種の蛍光染料(II)および1種の蛍光染料と内部His6タグで標識した。タンパク質を切断することができる酵素によるプロテアーゼ消化を、この3種の異なる標識をもつPNA-ペプチドキメラ基質を使用して検出した。このようなプロテアーゼの例には、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼおよびHIV-1プロテアーゼが含まれる。一重標識PNA-ペプチドキメラ基質(I)を使用すると、プロテアーゼ消化により消化された基質から蛍光染料の存在が除かれた。二重標識PNA-ペプチドキメラ基質(II)を使用すると、プロテアーゼ消化により基質からクエンチング染料(染料1)が除かれ、切断産物の染料2からの蛍光が放射された。1種の蛍光タグと内部対照タグを有するPNA-ペプチドキメラ(III)では、プロテアーゼ消化により蛍光染料が除かれた。切断されていない基質からの蛍光信号は、実施例16に示したように、内部His6タグから生じた検出信号のレベルに正規化した。
実施例１７
ミクロ粒子アレイを使用するキャスパーゼ活性の決定
固体表面に固定化した、末端標識したビオチニル化キャスパーゼ3ペプチド基質を使用してキャスパーゼ活性などのプロテアーゼ活性を決定した。等量の末端標識した蛍光染料Cy5を有するビオチニル化キャスパーゼペプチド基質を、溶液中の漸減量(8、4.8、2.88、1.728、1.037、0.62、0.373、0.224、0.134、0.081、0.048および0μg/ml)の精製組換えキャスパーゼ3で消化した。消化した後、消化産物を、公知の従来技術の方法に従って、表面をニュートロアビジンでコーティングしてある規定した色でコード化したミクロ粒子の表面に結合させた。次いで、LEAPSおよび2001年12月28日出願の暫定出願第60/343,621号および2002年7月9日出願の米国出願番号第10/192352号に既に記載されている直接付着集合法などの公知の従来技術の方法に従って、ペプチド官能化ミクロ粒子をミクロ粒子アレイに集合させた。切断されていないペプチド基質からの蛍光は、ランダムコード化アレイ検出(READ)アッセイなどの公知の従来技術の方法に従って蛍光顕微鏡を使用して決定した。プロテアーゼ消化により消化産物から蛍光染料が除かれた。図27に示すように、キャスパーゼ3消化について滴定してアッセイを行った。8から0μg/mlの範囲の漸減的なキャスパーゼ3濃度で、1000msの積分でのCy5信号強度が約2600単位から5200単位に上昇した。図27に示す誤差バーは平均の標準偏差を示している。
実施例１８
ミクロ粒子アレイ上での2×2PNAキメラ競合アッセイ
他のPNAキメラの存在下での、ミクロ粒子アレイ上のDNAオリゴヌクレオチドに捕捉されたPNAキメラの特異性を調べるために、2×2PNAキメラ競合アッセイを実施した。簡単に述べると、異なる塩基配列を有する2種のビスPNAをアッセイに使用した。その1つはビオチニル化PNAクランプ(ビオチン-PNA-クランプ)であり、もう一方は、テトラメチルローダミンと結合したビスPNA-ペプチドキメラ(ビスPNA-ペプチド-TMR)であった。ハイブリダイゼーションの前に、実施例1に記載のように公知の従来技術の方法に従って表面をニュートロアビジンでコーティングしてある規定の色でコード化したミクロ粒子に、2種のビオチニル化オリゴヌクレオチドを結合させた。これらのオリゴヌクレオチドの配列はそれぞれ、10マーのポリアデニン(A-10)および10マーの規定のヌクレオチド配列(P-10)であった。対照のミクロ粒子(ナシ)は表面にオリゴヌクレオチドを含まなかった。A-10オリゴヌクレオチドはビオチン-PNA-クランプのPNAに相補的であり、P-10オリゴヌクレオチドはビスPNA-ペプチド-TMRキメラのPNAに相補的であった。結合後、すべてのオリゴ官能化ミクロ粒子を1本の試験管内で合わせて、シリコンチップ上にミクロ粒子アレイを集合させた。チップは先ず、90mM NaCl、83mMグアニジンチオシアナート、8mM MgC12、17nM EDTA、0.1%ビオチン、0.1%Tween-20、70mM Tris-HClを含むバッファ(pH7.5)中、40℃で20分間プレハイブリダイズさせた。次いで、チップ用の同じハイブリダイゼーションバッファ中にほぼ等しい量のビオチン-PNA-クランプとビスPNA-ペプチド-TMRキメラを加えた。陰性対照のチップには、ハイブリダイゼーションバッファにPNAを加えなかった。ハイブリダイゼーションは加湿チャンバ内、40℃で1時間実施した。ハイブリダイゼーションが終了したら、チップを室温で10分間、100mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.5)、0.1%Tween-20で洗浄した。粒子にハイブリダイズしたビオチニル化PNAを検出するために、チップを室温で30分間、100mM NaCl、100mMリン酸ナトリウム(pH7.5)中のCy5結合ストレプトアビジン(2
0pg/ml)と共にインキュベートした。15mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.5)で洗浄した後、チップを蛍光顕微鏡を使用して調べた。粒子の本質はその色コードで解読した。Cy5信号またはローダミンのCy3信号を有する粒子を、実施例4に記載のようにコンピュータプログラムを使用して同定した。図28に示すように、ビオチン-PNA-クランプは、Cy5蛍光で検出されるように、10マーポリアデニンと結合した粒子に特異的に捕捉された(500msの積分でCy5信号強度約2250単位)のに対し、ビスPNA-ペプチド-TMAキメラは、チップ上のCy3蛍光で検出されるようにP-10オリゴヌクレオチドを有する粒子に結合していた(500msの積分でCy3信号強度約4500)。
実施例１９
LEAPSによるペプチド官能化ミクロ粒子アレイの集合
2種の色でコード化したミクロ粒子、すなわちオレンジのビーズと緑色のビーズをそれぞれ、合成ペプチドとその対応するリン酸化ペプチドに結合させた。リン酸化ペプチドのチロシン残基にリン酸基がある以外は、ペプチドのアミノ酸配列は等しい。これらの2種のペプチド官能化ミクロ粒子を1本の試験管内で混合した。ミクロ粒子を、米国特許第6251691号に開示のLEAPSにより、シリコンチップ上にミクロ粒子アレイを集合させた。次いで、ミクロ粒子アレイを、ペプチドのホスホチロシンに特異的なマウスモノクローナル抗体と共にインキュベートした。モノクローナル抗体の結合は、実施例12に記載のように、チップ上のCy5標識ヤギ抗マウスIgGを使用して検出した。次いで、蛍光顕微鏡を使用してチップを調べた。オレンジ色と緑色の画像をミクロ粒子の解読に使用したが、Cy5染色はリン酸化ペプチドを固定化した緑色のビーズを標識する。より具体的には、オレンジ色のビーズの画像はリン酸化されていないペプチドを表すのに対し、緑色のビーズはリン酸化されたペプチドを表す。得られたアッセイ画像は、図29に示すようにホスホチロシン特異的な抗体のCy5蛍光染色を示している。
実施例２０
ミクロ粒子アレイ上の色でコード化されたビーズに結合したPNAへのDNA-ペプチドキメラのハイブリダイゼーション
上記のPNA-ペプチドキメラと同様に、二官能性架橋結合材を使用することにより、DNAオリゴヌクレオチドを合成ペプチドに結合させることができる。得られた結合体はDNA-ペプチドキメラとして知られている。DNA-ペプチドキメラは、ミクロ粒子アレイ上の色でコード化されたビーズに固定化した相補的PNAオリゴマーのハイブリダイゼーションに使用することができる。このペプチド部分は、ビーズにハイブリダイズしたDNA-ペプチドを検出するために、ビオチンまたは蛍光染料などの1つ以上のタグを含むことができる。さらに、ペプチドまたはペプチドの修飾に高い親和性を有するリガンドも検出に使用することができる。DNA-ペプチドキメラをPNA官能化ミクロ粒子にハイブリダイズさせる原理を図30Aに示す。この実施例では、二官能性架橋結合剤であるSMCC、4-(N-マレイミドメチル,シクロへキサン-1-カルボン酸)サクシンイミジルによる、DNA-ペプチドキメラは、デオキシアデニンオリゴマー(dAオリゴマー)とビオチニル化合成ペプチドとの結合体である。DNA-ペプチド結合体は液体クロマトグラフィーで精製した。精製DNA-ペプチドキメラを使用して、ミクロ粒子アレイ上の色でコード化したビーズに固定化したRNAチミンオリゴマーをハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたDNA-ペプチドキメラはCy3結合ストレプトアビジンを使用して検出した。ミクロ粒子アレイは蛍光顕微鏡を使用して調べた。ビーズの色の蛍光強度およびCy3ハイブリダイゼーション信号をアレイから決定した。ミクロ粒子の本質はその色コードから解読した。Cy3蛍光染料を有するビーズを検出し、同定した。図30Bに示すように、1000msの積分で約1000単位のCy3信号強度と、1000msの積分でCy3信号強度約300単位になる不適合完全塩基配列で示されるように、DNA-ペプチドキメラは、完全に合う塩基配列を有するPNAと特異的に結合する。
実施例２１
複数の基質のキャスパーゼ消化
PNA-ペプチドキメラを使用して、複数のペプチド基質に対するキャスパーゼの反応性を同時に検定することができる。この実施例では、3種のPNA-ペプチドキメラI、IIおよびIIIを合成した。各キメラは、規定の塩基配列を有する特有のPNAアンカー部位を有し、これは官能性部分としての特異的なキャスパーゼ基質ペプチドと結合する。PNAキメラI、IIおよびIIIの官能性部分はそれぞれ、アミノ酸Asp-Glu-Val-Asp (配列番号8)、 Val-Glu-Ile-Asp(配列番号9)およびlle-Glu-Thr-Asp(配列番号10)を含んでいる。これらの合成ペプチドは従来技術から知られているようにキャスパーゼ3、6および8の基質である。このペプチドのC末端を規定の蛍光染料で標識した。キメラ基質をキャスパーゼで消化すると、PNAアンカー部位から蛍光染料が除かれる。
多基質キャスパーゼ消化を以下のように設定した。ある量のキメラI、IIおよびIIIを1本の試験管内で混合した。キメラ混合物のアリコートをそれぞれ、キャスパーゼ3、6および8を含む反応溶液に加えた。キメラ基質のキャスパーゼ消化は、反応混合物を水浴中で、ある時間インキュベートすることによって実施した。陰性対照はキャスパーゼを含まない反応混合物である。消化後、ハイブリダイゼーション混合物は、グアニジンHClおよび界面活性剤を含む等量のハイブリダイゼーションバッファを反応混合物に加えることによって得た。次いで、ハイブリダイゼーション混合物を、予め集合させたミクロ粒子アレイと共にインキュベートした。
ミクロ粒子アレイは、当技術分野で一般的に知られている方法に従ってシリコンチップ上に集合させた4種の色でコード化したビーズを含んでいる。3種のビーズは規定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで官能化し、これらはそれぞれ、配列特異的にPNA-ペプチドキメラI、IIおよびIIIに結合することができた。コード化の色の他に、4種目のビーズはキメラ上を標識する蛍光染料に合う色も含んでおり、様々なアレイからの色の強度を正規化するのに使用した。
ハイブリダイゼーションの後、非特異的な結合をアレイから洗い流してから、蛍光顕微鏡を使用して調べた。バイブリダイズしたPNAキメラからのアッセイ信号である色の強度を、アレイ上のビーズから決定した。ビーズの本質は、予め規定した色コードに従って解読した。強度比、すなわち、アッセイ信号と対照ビーズからの信号の比を決定した。陰性対照の反応では、アッセイで最高レベルの強度比が得られるべきである。特定の基質に対するキャスパーゼの活性は、各チップの陰性対照に対する残留アッセイ強度の比の百分率で表した。この試験からのアッセイ強度比の相対百分率を下表にまとめる。
Figure 0004813011
実施例２２
PNAを使用した酵素アッセイのためのフローチャート
本明細書に開示のPNAキメラ基質を使用するマルチプレックスアッセイには公知の従来技術に比べていくつかの利点がある。PNAキメラ構築体では、PNAアンカー部分はマルチプレックスアッセイで2つの重要な働きをしている。先ず、PNAの塩基配列は結合した基質のコードとして働く。第2に、PNAオリゴマーは、コード化した固体表面上に提示された相補的なオリゴヌクレオチドに捕捉することができるキメラに対する特異的なアンカーとして機能する。PNAを分解する公知のプロテアーゼおよびヌクレアーゼは存在しない。したがって、PNAオリゴマーは組織溶解物中で非常に安定であろう。DNA-DNAハイブリダイゼーションと比べて、PNAは非常に緩和な条件下で相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。PNA-DNA複合体は、低塩溶液、すなわちDNA-DNAハイブリダイゼーションに好ましくない条件で安定である。したがって、複数のPNAキメラ基質を、1種または数種の酵素反応用の一般的な反応混合物に加えることができる。図31に示すように、本明細書に開示のマルチプレックスアッセイは、PNAキメラ基質を合成するステップ、マルチプレックスアッセイを実施するステップ、色でコード化したミクロ粒子上に提示されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションするステップ、修飾された基質を検出するステップ、画像を取得するステップおよびデータ解析のステップを含む単純なフォーマットで実施することができる。
実施例２３
マルチプレックスアッセイ
好ましい実施形態の1つとして、PNA-ペプチドキメラは、キナーゼアッセイ(図32A)、ホスファターゼアッセイ(図32B)、キャスパーゼアッセイ(図32C)およびリガンド結合アッセイ(図32D)などの多基質酵素反応の理想的な基質である。簡単に述べると、PNA-ペプチドキメラのライブラリーを、対象とするキナーゼと共にインキュベートすることができる。溶液内(in-solution)リン酸化反応の後、リン酸化されたペプチドを、捕捉PNAキメラ上で決定することができる(図32A)。したがって、キナーゼの基質ペプチドをライブラリーから同定することができる。このアッセイのデザインは、疾患のステージで変化するキナーゼ活性を標的同定とする創薬に応用することができる。PNA-リン酸化ペプチドキメラを基質として使用することによって、このようなデザインを多基質ホスファターゼアッセイに使用することができ(図32B)、これを創薬に使用して、様々な疾患の段階に特異的なホスファターゼ阻害剤を同定することができる。さらに、実施例17に示すように、PNA-ペプチドキメラを使用してin vitroアッセイでキャスパーゼ活性を決定することができる。図32Cに示すように、PNA-ペプチドキメラのライブラリーを、対象とするキャスパーゼと共にインキュベートすることができる。消化後、基質ペプチドをライブラリーから同定することができる。このアッセイのデザインは、アポトーシス細胞でキャスパーゼ阻害剤を同定するのに使用することができる。さらに、PNA-ペプチドキメラは、タンパク質-タンパク質相互作用またはタンパク質-核酸相互作用の分析での結合アッセイにも使用することができる。パネルC(図32D)に示すように、リガンド結合アッセイで、対象とする標的と共に、PNA-ペプチドキメラのライブラリーをインキュベートすることができる。特異的な標的と結合したPNA-ペプチドキメラをライブラリーから同定することができる(図32D)。
上記の様々な好ましい実施形態の記述は説明および記述の目的で示したものであり、排他的なものでも、開示の正確な形態を限定することを意図するものでもない。上記の教示に鑑みて明白な修飾または変更を実施することができる。考察した実施形態は説明のために選択し、記述したものであって、その実際的な応用はしたがって、当業者には、様々な実施形態の利用を可能にし、企図した特定の用途に適した様々な変更を加えることができる。添付の特許請求の範囲の正当に、法的に、公正に権利を与えられた範囲に従って解釈したとき、このような修飾および変更はすべて、添付の特許請求の範囲で定められたシステムに含まれる。
LEAPSまたは直接付着後、READ、フローサイトメトリーおよび沈殿法を使用してアレイ上で検出することによる方法を使用してマイクロ粒子を検出する例を示す図である。 担体表面に固定化した、マルチプレックスアッセイに使用するPNA分析物キメラの模式図である。 抗体による、修飾分析物/基質の検出を示す図である。固体表面に捕捉された修飾分析物は、1抗体(A)、2抗体(B)、または3抗体(C)フォーマットで、蛍光(f)またはペルオキシダーゼ(E)標識抗体により検出できる。 MAPキナーゼシグナル伝達経路と、MAPキナーゼ経路の特異的なキナーゼの活性を同定するために使用するレポータキメラを示す図である。 JAKキナーゼを介したシグナル伝達経路のキナーゼ活性を決定する、PNA-STATキメラを使用する細胞ベースのアッセイの模式図である。 PKD1およびAkt1/PKBキナーゼの特異的キナーゼ活性の検出の模式図(A)である。、細胞ベースのアッセイでAkt/PKBシグナル伝達経路を分析するのに使用できることを示す図である(B)。 細胞ベースのアッセイでAkt/PKBシグナル伝達経路を分析するのに使用できることを示す図である(B)。 PNA-キャスパーゼキメラを使用した複数のキャスパーゼ活性の検出を示す模式図である。 細胞ベースのアッセイでPNA-小分子キメラを使用して、GPCRを標的とする新薬を同定する方法を示す模式図である。 フローサイトメトリーで検出される色でコード化したミクロ粒子上の相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたPNAキメラを示す模式図である。 細胞表面に提示された特異的タンパク質を有する細胞を検出および分離するためのPNA抗体キメラの使用法を示す図である。 固体表面にオリゴヌクレオチドプローブを固定化する2種の方法、すなわち、ビオチン-ニュートロアビジン結合を用いる間接結合(A)およびアミン-トシル反応を用いる直接結合(B)を示す図である。ビオチン-ニュートロアビジンを介した固体表面へのオリゴヌクレオチドの間接結合およびアミン-トシル直接結合による固体表面へのオリゴヌクレオチドの直接結合の滴定結果は対応する図の下に示す。 2種のビオチニル化PNAオリゴマーの高圧液体クロマトグラフィーによる精製を示す図である。 精製したテトラメチルローダミン(TMR)標識したPNA-ペプチドキメラ(A)とその各分光分析プロファイルを示す図である。 Cy5標識したPNA-小分子キメラ(B)とその各分光分析プロファイルを示す図である。 ミクロ粒子アレイに固定化した様々なオリゴヌクレオチドへの、ビオチニル化ビスPNAオリゴマーの配列特異的捕捉を調べるオンチップハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す図である。 色でコード化したミクロ粒子上に固定化したDNAオリゴヌクレオチドへのビスPNAオリゴマーの配列特異的捕捉を調べる、インチューブハイブリダイゼーションアッセイ(A)の結果をオンチップハイブリダイゼーションアッセイ(B)と比較した図である。 ミクロ粒子アレイ上に固定化したDNAオリゴヌクレオチド(18塩基長)へのビスPNA-タンパク質キメラの配列特異的捕捉を調べるオンチップハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す図である。 色でコード化した磁気粒子上に固定化した相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたPNAオリゴマーの結果を示す図であり、チップ(B)はチップ(A)の陰性対照である。 ミクロ粒子アレイ上に固定化したDNAオリゴヌクレオチド(10塩基長)へのビスPNA-小分子キメラの配列特異的捕捉を調べるオンチップハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す図であり、チップ2はチップ1の陰性対照である。 漸増濃度での3種のビオチニル化リン酸化ペプチド(ペプチド-P-1、ペプチド-P-2、ペプチド-P-3)の標準曲線を示す図であり、ペプチドは1つのミクロ粒子アレイを使用してニュートロアビジンでコーティングした特異的な色でコード化したビーズに結合させる。 漸増濃度での2種のビオチニル化リン酸化ペプチド(ペプチド-P-1およびペプチド-P-2)の標準曲線を示す図であり、ペプチドはニュートロアビジンでコーティングした特異的な色でコード化したビーズに結合させる。 ミクロ粒子アレイ上でチラミド試薬を使用してリン酸化ペプチド(Ty-P-1およびペプチド-P-2)を免疫検出した結果を示す図であり、このアッセイで使用したモノクローナル抗体はリン酸化修飾に特異的なペルオキシダーゼで標識してある。 ミクロ粒子アレイ上でリン酸化ペプチド特異的モノクローナル抗体を使用してリン酸化ペプチド(Ty-P-1およびペプチド-P-2)を免疫検出した結果を示す図であり、結合したモノクローナル抗体はCy-5標識した二次抗体で検出する。 ミクロ粒子アレイ上の蛍光標識抗体を使用して複数のリン酸化ペプチドを同時に免疫検出した結果を示す図である。 二重標識PNA-分析物キメラの一般的なデザインと二重アッセイ信号検出の比の数量化を示す図(A)である。 キャスパーゼ3活性の比の数量化を決定するための、蛍光染料および内部His6タグで標識した特異的なPNA-ペプチドキメラを示す図(B)である。 比の数量化によって決定したキャスパーゼ3活性の結果を示す図(C)である。 フローサイトメトリー分析により、色でコード化したミクロ粒子上にハイブリダイズしたPNAキメラを検出した結果を示す図である。図25Aでは、2種の緑色ビーズ(グリーンAおよびグリーンB)を2種のオリゴヌクレオチド(A)および(B)と結合させる。PNAキメラはグリーンBビーズ上のオリゴヌクレオチドに特異的に結合し、これはオレンジチャネルで検出できる。 フローサイトメトリー分析により、色でコード化したミクロ粒子上にハイブリダイズしたPNAキメラを検出した結果を示す図である。図25Aと同様に、図25Bでは、結果は、pPNAキメラ配列は、フローサイトメトリーで検出される1種のビーズに特異的に結合することを示している。 プロテアーゼ活性を決定するためのPNA-ペプチドキメラ基質の一般的なデザインを示す図であり、キメラの官能性ドメインは1種の蛍光染料(I)、2種の蛍光染料(II)および内部His6タグと1種の蛍光染料(III)で標識されている。 ミクロ粒子アレイ上の末端標識蛍光染料により、ビオチニル化キャスパーゼ3ペプチド基質を使用してキャスパーゼ活性を決定した結果を示す図である。 ミクロ粒子アレイ上のDNAオリゴヌクレオチド(10塩基長)に捕捉されたPNAキメラの特異性を調べるために実施した2×2PNAキメラ競合アッセイの結果を示す図であり、チップ1は、規定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで官能化した、色でコード化したビーズに捕捉された、ビオチニル化PNAクランプ(ビオチン-PNA-クランプ)(下のパネル)およびテトラメチルローダミンと結合したビスPNA-ペプチドキメラ(ビスPNA-ペプチド-TMR)-(上のパネル)の結果を示し、チップ2は、ビオチン-PNA-クランプ(下のパネル)およびビスPNA-ペプチド-TMR-(上のパネル)に対応する陰性対照を示す。 合成の非リン酸化ペプチドおよび対応のリン酸化ペプチドと結合した、色でコード化したミクロ粒子、オレンジビーズおよび緑色ビーズの解読に使用するオレンジおよび緑色の画像(左のパネル)と、グリーンビーズ上のリン酸化ペプチドをチップ上のCy-5標識抗体により検出した(右のパネル)図である。 DNA-ペプチドキメラ(A)を示す図である。 ミクロ粒子アレイ上の色でコード化したビーズに結合した相補的PNAへのDNA-ペプチドキメラのハイブリダイゼーションの結果(B)を示す図である。 本明細書に開示のマルチプレックスアッセイのフォーマットを示す。 PNA-ペプチドキメラのライブラリーを、対象とするキナーゼと共にインキュベートすることができ、溶液内(in-solution)リン酸化反応の後、リン酸化されたペプチドを、捕捉PNAキメラ上で決定することができることを示す図である。 PNA-リン酸化ペプチドキメラを基質として使用することによって、このようなデザインを多基質ホスファターゼアッセイに使用できることを示す図である。 PNA-ペプチドキメラのライブラリーを、対象とするキャスパーゼと共にインキュベートできることを示す図である。 リガンド結合アッセイで、対象とする標的と共に、PNA-ペプチドキメラのライブラリーをインキュベートすることができ、特異的な標的と結合したPNA-ペプチドキメラをライブラリーから同定できることを示す図である。

Claims (26)

  1. 二重に標識された酵素基質に連結したPNA配列を含む二重標識キメラであって、
    前記標識の少なくとも1つは蛍光染料であり、
    前記酵素基質は、酵素切断認識部位を含み、酵素切断により前記標識の1つが切断され、
    前記PNA配列は、捕捉プローブの部分配列と相補的な部分配列を含み、かつ、
    前記捕捉プローブは、固体支持体に結合するように設計されている、
    二重標識キメラ。
  2. 前記酵素基質が、タンパク質またはペプチドである、請求項１に記載の二重標識キメラ。
  3. 前記酵素基質が、そのN末端に結合した標識1つと、そのC末端に結合したもう1つの標識とを有する、請求項１に記載の二重標識キメラ。
  4. 前記標識の両方が蛍光染料である、請求項１に記載の二重標識キメラ。
  5. 前記標識の少なくとも1つがポリヒスチジンタグである、請求項１に記載の二重標識キメラ。
  6. 前記標識の一方がCy3であり、他方がCy5である、請求項１に記載の二重標識キメラ。
  7. 前記酵素切断認識部位がキャスパーゼによって認識される、請求項１に記載の二重標識キメラ。
  8. 前記酵素切断認識部位がプロテアーゼによって認識される、請求項１に記載の二重標識キメラ。
  9. 前記プロテアーゼが、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、またはHIV-1プロテアーゼである、請求項８に記載の二重標識キメラ。
  10. 前記固体支持体がミクロ粒子である、請求項１に記載の二重標識キメラ。
  11. 前記ミクロ粒子が、固体支持体に付着している、請求項１０に記載の二重標識キメラ。
  12. 前記ミクロ粒子がコード化されることによって、そのミクロ粒子に結合している捕捉プローブを識別するための情報が備えられている、請求項１に記載の二重標識キメラ。
  13. 酵素基質に連結したPNA配列を含む標識キメラであって、
    前記酵素基質は、蛍光染料と、前記蛍光染料から特定の近接範囲内にあるクエンチング分子とを標識として含み、前記クエンチング分子によって前記蛍光染料からの信号が除去されており、
    前記酵素基質が特定の酵素で切断された場合には、前記染料を含み且つクエンチング分子から分離された切断生成物が検出可能であり、
    前記PNA配列は、捕捉プローブの部分配列と相補的な部分配列を含み、かつ、
    前記捕捉プローブは、固体支持体に結合されている、
    標識キメラ。
  14. 前記酵素基質が、タンパク質またはペプチドである、請求項１３に記載の標識キメラ。
  15. 前記標識が、前記酵素基質のN末端またはC末端に結合している、請求項１３に記載の標識キメラ。
  16. ポリヒスチジンタグで標識されている、請求項１３に記載の標識キメラ。
  17. Cy3およびCy5で標識されている、請求項１３に記載の標識キメラ。
  18. 前記酵素がキャスパーゼである、請求項１３に記載の標識キメラ。
  19. 前記酵素がプロテアーゼである、請求項１３に記載の標識キメラ。
  20. 前記プロテアーゼが、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、またはHIV-1プロテアーゼである、請求項１９に記載の標識キメラ。
  21. 前記固体支持体がミクロ粒子である、請求項１３に記載の標識キメラ。
  22. 前記ミクロ粒子が、固体支持体に付着している、請求項２１に記載の標識キメラ。
  23. 前記ミクロ粒子がコード化されることによって、そのミクロ粒子に結合している捕捉プローブを識別するための情報が備えられている、請求項２２に記載の標識キメラ。
  24. 酵素活性を測定する方法であって、
    (a)請求項１〜２３のいずれか一項に記載のキメラの、既知の濃度の溶液を準備するステップであって、
    前記キメラは、第一の標識および第二の標識で標識されており、前記キメラが、特定の酵素で切断された場合には、キメラから放出された切断生成物が第二の標識を有し、切断されたキメラが第一の標識を有するように標識されている、ステップ；
    (b) 前記酵素を含有するサンプルを前記溶液に添加するステップ；
    (c) 前記溶液をアニーリング条件下で、固体支持体に結合した捕捉プローブに曝露するステップ；
    (d) 標識された前記切断生成物を洗い流すステップ；
    (e) 捕捉されたキメラについて、第一の標識に対する第二の標識の相対量を測定し、それによって前記酵素によって切断されたキメラの基質の割合を評価するステップ；および
    (f) 前記切断されたキメラの基質の割合もしくは百分率として酵素活性を記録するステップ
    を含む、方法。
  25. 切断されていない前記基質が、第二の標識で標識されている、請求項２４に記載の方法。
  26. 各キメラが請求項１〜２３のいずれか一項に記載のキメラであるPNAペプチドキメラのライブラリー中で、溶液中の1種以上の酵素を同定する方法であって、
    (a)前記PNAペプチドキメラのライブラリーと、興味の対象である溶液中の酵素とを、酵素-基質反応が起こるのに適した条件下でインキュベートするステップ；
    (b) 前記溶液を、アニーリング条件下で、前記固体支持体に結合した捕捉プローブに曝露するステップ；
    (c) 標識された切断生成物を洗い流すステップ；および
    (d) 捕捉されたキメラであって、その基質が前記酵素によって切断されたキメラを検出し、それによって前記酵素を同定するステップ
    を含む、方法。
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