KR20030040148A - 모발성장을 촉진시키는 올리고펩타이드 - Google Patents

모발성장을 촉진시키는 올리고펩타이드 Download PDF

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KR20030040148A
KR20030040148A KR1020020070514A KR20020070514A KR20030040148A KR 20030040148 A KR20030040148 A KR 20030040148A KR 1020020070514 A KR1020020070514 A KR 1020020070514A KR 20020070514 A KR20020070514 A KR 20020070514A KR 20030040148 A KR20030040148 A KR 20030040148A
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Abstract

본 발명은 형태형성 촉진활성 특히, 모발촉진활성을 가지는 올리고펩타이드를 제공한다. 전기 올리고펩타이드는 동종이량체; 이종이량체; 동종삼량체; 또는 이종삼량체와 같은 다량체이며, 반응물질을 결합한 단량체 형태이다. 본 발명은 또한 상피의 신생 모발 소낭의 220 kDa의 항원을 특이적으로 인식하는 단클론항체; 전기 항체를 생산하는 융합세포종; 및 포유동물 대상에서 모발성장을 분석하기 위한 방법 및 키트를 제공한다.

Description

모발성장을 촉진시키는 올리고펩타이드{OLIGOPEPTIDES FOR PROMOTING HAIR GROWTH}
본 발명은 형태형성(morphogenesis) 활성을 가지는 올리고펩타이드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 모발성장(hair growth) 촉진활성(promoting activity)을 가지는 올리고펩타이드를 포함하는 조성물(composition) 및 인간의 모발성장을 촉진시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상피세포(epithelial)의 신생 모발 소낭(follicle) 항원에 특이적인 단일클론 항체(monoclonal antibody)와 이러한 단일클론 항체를 이용한 모발성장 촉진활성을 평가하는 방법에 관한 것이다.
상피조직의 정상적인 형태형성은 상피조직 주위에 존재하는 간엽세포(mesenchymal cell)로부터 유도된 요소들에 의해 조절된다고 알려져 있다. 상피조직의 비정상적인 형태형성으로 발생하는 질병은 주로 비정상적인 간엽세포에 기인한다. 따라서, 간엽세포가 상피조직의 형태형성을 조절하는 작용을 이해하려는 관심이 증가되고 있다.
일본특허 공개번호 25295/94에서 발표한 에피몰핀(Epimorphin)은 코아 단백질(core protein)로 277 개 내지 289 개의 아미노산을 가지며, 상피세포의 에피몰핀 활성을 통해 상피 조직의 형태형성을 촉진시키는 역활을 한다.
그리고, 정상조직 형성은 에피몰핀 기능이 상실되었을 때는 진행하지 않았다.
히라이(Hirai) 등(참조: 1992,Cell, 69:471-481); 히라이(참조: 1994,Eur. J. Biochem, vol. 225, 1133-1139); 히라이 등(참조: 1998,J. Cell. Biol., 140:159-169); 및, 히라이 등(참조: 2001,J. Cell. Biol., 153:785-794)의 연구에서 에피몰핀을 설명하고 있다.
EP 0698666 A2에서는 N-말단으로 부터 시작해서, 감겨진 코일 도메인(1), 기능적 도메인(2), 감겨진 코일 도메인(3), 및 C-말단의 소수성(hydrophobic) 도메인으로 크게 네개의 부분으로 나누어 에피몰핀 전 길이 구조를 설명한다. EP0698666A에서는 기능적인 도메인(인간 에피몰핀에서 104 번에서 187 번 아미노산에 특이적인 도메인)은 세포 부착에 관여하며 그리고 에피몰핀의 생리적 활성의 발현과 관계가 있다고 기술하고 있다.
1998년 3월 10일에 공포된 미국특허 번호 5,726,298에서는 인간 및 쥐 에피몰핀의 뉴클레오타이드(nucleotide) 및 아미노산 서열을 기재하고 있다. WO98/22505 및 EP1008603A1에서는 인간 에피몰핀의 1 번째 내지 103 번째 아미노산의 N-말단 서열 및 쥐 에피몰핀의 1 번째 내지 104 번째 아미노산의 N-말단 서열에 특이적인 폴리펩타이드를 설명하고 있다.
포유동물 에피몰핀은 생리식염수(saline)와 같은 수용성배지에서는 거의 녹지 않으므로, 인간 치료를 위한 조성물로는 에피몰핀의 사용이 어렵다. 일본특허 공개번호 25295/1994에서는 C-말단의 소수성 부위를 제거함으로써 얻어지는 에피몰핀의 변형된 형태를 기술하고 있다.
에피몰핀 및 상피조직의 형태형성에 대한 많은 이해가 되어 왔지만, 상피조직의 형태형성은 특히 질병 또는 질환과 관계가 되기 때문에, 상피세포의 형태형성을 변형하는 방법이 필요하다.
본 발명은 비 정상적인 형태형성과 관계된 질병 또는 질환의 증상 치료 또는 경감시키는데 유용한 올리고펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 올리고펩타이드는 형태형성, 맥관재생(revascularization) 효과, 재생효과, 심장혈관의 재생 및 내피세포 성장을 유도하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 올리고펩타이드는, 예를 들어, 화상 혹은 상처의 증상를 치료 및/또는 경감시키고 모발성장을 촉진하고, 모발 손실을 예방하는데 이용 될 수 있다. 특히, 본 발명은 모발성장 촉진활성을 가지는 올리고펩타이드 및 모발성장을 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상피세포의 신생 소낭의 220 kDa 항원에 특이적인 단일클론항체을 이용해서 모발 성장을 분석하는 방법 및 본 발명의 단일클론항체를 포함하는 키트(kits)와 관한 것이다.
도 1는 에피몰핀(EPM) pep7 기본 라이브러리의 분석 결과를 보여준다. 변이율은 pep7 부위를 가지는 쥐 에피몰핀의 자발적인 발생부위의 퍼센트를 100%로 나타낸다.
도 2는 에피몰핀(EMP) pep7 기본 라이브러리의 조성을 분석한 결과를 보여준다.
도 3은 에피몰핀(EMP) pep7 기본 라이브러기의 이론가치를 보여준다.
도 4는 예 9-10에서 설명하고 있는 동종이량체(homodimer) 올리고펩타이드을 이용해서 모발성장 촉진활성을 분석한 결과를 보여준다.
도 5는 예 9-10에서 설명하고 있는 이종이량체(heterodimer) 올리고펩타이드 및 동종이량체 올리고펩타이드을 이용해서 모발성장 촉진활성을 실험한 결과를 보여준다.
도 6A-6B는 본 발명의 올리고펩타이드(아미노산 잔기가 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu와 같은)의 모발성장 촉진활성을 보여준다. 도 6(A)는 비오틴화한(biotinylated) 올리고펩타이드에 의해 얻어진 결과를 보여준다. 큰 정사각형은 올리고펩타이드 b7(SIEQSCDQDE)에 의해 얻어진 결과를 보여주며 그리고 작은 정사각형은 대조군에 의해 얻어진 결과를 보여준다. 도 6(B)는 황-황 결합(S-S bridged) 및 비오틴화한 올리고펩타이드에 의해 얻어진 결과를 보여준다. 큰 원은 올리고펩타이드 ssb7(교차-결합한 b7)에 의해 얻어진 결과를 보여주며, 작은 원은 대조군에 의해 얻어진 결과를 보여준다. 수직축은 모발성장 수를 나타내며, 수평축은 적용 시작 부터 지난 날짜를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 올리고펩타이드(이황화결합 그리고 비오틴화한 올리고펩타이드:ssb7)의 모발성장 촉진활성을 보여준다. 이 도에서, ■는 황-황 결합 및 비오틴화한 올리고펩타이드를 나타내며, □는 첫번째 대조군(도 6.에서의 대조군과 동일)으로 부터 얻어진 결과를 나타내고 그리고는 두번째 대조군(무작위 7-mer 올리고펩타이드)의 결과를 보여준다. 수직축은 모발성장 수를 나타내며, 그리고 수평축은 적용 시작 부터 지난 날짜를 나타낸다.
도 8은 b7△C1, b7△C2, b7△C3, b7△C4, b7△C5, b7△N1, b7△N2 및 b7△N3의 IL-8유도 활성 평가 결과를 보여준다. b7△C1은 올리고펩타이드 서열(SIEQSCDQD)을 나타내며; b7△C2은 올리고펩타이드 서열(SIEQSCDQ)을 나타내고; b7△C3은 올리고펩타이드 서열(SIEQSCD)을 나타내며; b7△C4는 올리고펩타이드 서열(SIEQSC)을 나타내고; b7△C5는 올리고펩타이드 서열(SIEQS)을 나타내며; b7△N1은 올리고펩타이드 서열(IEQSCDQDE)을 나타내고; b7△N2는 올리고펩타이드 서열(EQSCDQDE)을 나타내며; b7△N3은 올리고펩타이드 서열(QSCDQDE)을 나타낸다. 이 도에서, 스콘트(Scont)는 블러킹 시약의 결과를 나타내며, PBS는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)의 결과를 나타내고 그리고 수직축은 IL-8의 분비양과 관계되는 가치를 나타낸다.
도 9는 아미노산 서열이 Lys-Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu인 올리고펩타이드의 N-말단에 비오틴을 결합함으로써 얻어지는 올리고펩타이드 bk7 및, 도 17 및 도 18에서 설명하고 있는 올리고펩타이드 b7(SIEQSCDQDE)의 IL-8 유도 활성 평가 가치를 보여준다. 이 도에서, PBS는 인산 완충 식염수의 결과를 나타내고, 그리고 수직축은 IL-8의 분비양과 관계되는 가치를 나타낸다.
도 10A-10C는 예 12에서 기술된 젤 투과 컬럼(gel permeation column)을 가지고 올리고펩타이드와 교차-연결제(cross-linking agent)의 반응 생성물 분석 결과를 보여준다.
도 11은 예 13에 기술된 변형 및 비변형 올리고펩타이드의 모발성장 촉진활성의 평가 결과를 보여준다. 하나의 레터 코드에서 올리고펩타이드는 SIEQSXDQDE이며, X는 표시한 것과 같이 비변형 또는 변형된 Cys 또는 Lys이다.
도 12A-12C는 본 발명에서 얻어진 단일클론항체 mAb27을 이용한 면역 분석 결과를 보여준다. 도 12(A)는 웨스턴 블러팅(Western blotting)에 의한 mAb27의 항원을 검출한 결과를 보여준다. 왼쪽에서부터 오른쪽까지의 각 줄은 수염의 아나젠(anagen) 그리고 텔로젠(telogen)단계 및 등피부의 아나젠 그리고 텔로젠단계에서 추출한 각각의 단백질을 전기영동(electrophoresis)과 웨스턴 블러팅으로 나타낸것과 이 항원을 단일클론항체 mAb27을 이용해서 검출한 결과를 보여준다. 도 12B는 14일 지난 쥐의 배(embryo)의 12C 턱(maxilla) 및 성체(adult)의 모발을 이용한 조직학적 염색 결과를 보여준다.
도 13은 단일클론 항체 mAb27을 이용한 올리고펩타이드의 모발성장 촉진활성 평가의 결과를 보여준다.
도 14는 EP 0698666A2에 기술된 아미노산 잔기 1에서 아미노산 잔기 103까지의 인간 에피몰핀의 감겨진 코일 도메인 아미노산 서열(서열번호 1)을 보여준다. "pep7" 부분은 밑줄을 그어 구분하였다.
도 15는 EP 0698666A2에 기술된 아미노산 잔기 1에서 아미노산 잔기 104까지의 인간 에피몰핀의 감겨진 코일 도메인 아미노산 서열(서열번호 2)을 보여준다. "pep7" 부분은 밑줄을 그어 구분하였다.
본 발명은 하기의 아미노산 서열을 포함하며, 모발성장 촉진활성을 가지는,약 5개 내지 104개의 아미노산 잔기 길이의 분리된 올리고펩타이드를 제공한다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;
상기에서, X1은 Ser, Ara, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val, Gly, Leu,
Ile 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드
로부터 결실되고;
X2는 Ile, Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe, Leu, Ala, Pro,
Cys 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부
터 결실되며;
X3는 Glu, Lys, Gln, Arg, Ala, Val, Trp, Cys 또는 Asp 잔
기이고;
X4는 Gln, Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His, Cys 또는 Lys 잔
기이며;
X5는 Ser, Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro, Ala, Gly, Val,
Leu, Ile 또는 Met 잔기이고;
X6는 Cys 잔기; 반응성 물질이 결합된(reactive
substance-bound) Cys 또는 반응성 물질이 결합된 Lys이
며; 및,
X7은 Asp, Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr, Arg 또는
Leu 이거나, 또는 올리고펩타이드가 서열번호 1 또는 서
열번호 2와 동일하지 않고, Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp
또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드와 동일
하지 않는 조건에서 전기 올리고펩타이드로부터 결실된
다.
본 발명은 하기의 아미노산 서열을 포함하며, 모발성장 촉진활성을 가지는,약 5개 내지 104개의 아미노산 잔기 길이의 분리된 올리고펩타이드를 제공한다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;
상기에서, X1은 Ser, Tyr, Thr 또는 Pro 잔기이거나, 또는 전기
올리고펩타이드로부터 결실되고;
X2는 Ile, Asn, Thr 또는 Ser 잔기이거나, 또는 전기
올리고펩타이드로부터 결실되며;
X3는 Glu, Ala, Trp 또는 Asp 잔기이고;
X4는 Gln 잔기이며,
X5는 Ser, Cys 또는 Tyr 잔기이고,
X6는 Cys 잔기; 반응성 물질이 결합된 Cys 또는
반응성 물질이 결합된 Lys이며; 및,
X7은 Asp, Ala, Gly 또는 Leu 잔기이거나 또는 올리
고펩타이드가 서열번호 2와 동일하지 않고,
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는 Ser-
Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드와 동일하지않은 조건에서 전기 올리고펩타이드로부터 결실된
다.
본 발명은 하기의 아미노산 서열을 포함하며, 모발성장 촉진활성을 가지는,약 7개 내지 100개의 아미노산 잔기 길이의 분리된 올리고펩타이드를 제공한다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;
상기에서, X1은 Ser, Ala, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val, Gly, Leu,
Ile 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부
터 결실되고;
X2는 Ile, Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe, Leu, Ala, Pro,
Cys 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부
터 결실되며;
X3는 Glu, Lys, Gln, Arg, Ala, Val, Trp, Cys 또는 Asp 잔
기이고;
X4는 Gln, Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His, Cys 또는 Lys 잔
기이며;
X5는 Ser, Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro, Ala, Gly, Val,
Leu, Ile 또는 Met 잔기이고;
X6는 Cys 잔기; 반응성 물질이 결합된 Cys 또는 반응성 물
질이 결합된 Lys이며; 및,
X7은 Asp, Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr, Arg 또는
Leu이거나, Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또
는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드와 동일하
지 않은 조건에서 전기 올리고펩타이드로부터 결실된다.
본 발명은 하기의 아미노산 서열을 포함하며, 모발성장 촉진활성을 가지는,약 7개 내지 100개의 아미노산 잔기 길이의 분리된 올리고펩타이드를 제공한다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;
상기에서, X1은 Ser, Tyr, Thr 또는 Pro 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부터 결실되고;
X2는 Ile, Asn, Thr 또는 Ser 잔기이거나, 또는 전기
올리고펩타이드로부터 결실되며;
X3는 Glu, Ala, Trp 또는 Asp 잔기이고;
X4는 Gln 잔기이며;
X5는 Ser, Cys 또는 Tyr 잔기이고;
X6는 Cys 잔기이며;
X7은 Asp, Ala, Gly 또는 Leu 잔기이거나, 또는 올리
고펩타이드 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드와 동일
하지 않은 조건에서 전기 올리고펩타이드로 부터
결실된다.
어떤 실시예에서는, 모발성장 촉진활성을 가지는 올리고펩타이드는 T/Y-S/N-E-Q-S-C-A(서열번호 3)을 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 발명은 1개 내지 3개의 아미노산 잔기가 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 쥐의 pep7 부위의 아미노산 서열에서 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Glu-Gln-Ser-Cys를 제외한 다른 잔기인 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 모발성장 촉진활성을 가지는 올리고펩타이드를 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 0 내지 2개의 아미노산 잔기가 Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 치환되고; 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Glu-Gln-Ser-Cys를 제외한 다른 잔기인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 첫번째 Ser이 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 소수성 아미노산 잔기 또는 중성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 첫번째 Ser이 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Ala, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val 또는 Gly로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 두번째 Ile이 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 추가된 실시예에서, 본 발명은 두번째 Ile이 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 다섯번째 Ser이 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 다섯번째 Ser이 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro 또는 Ala로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 추가된 실시예에서, 본 발명은 일곱번째 Asp이 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 친수성 아미노산 잔기인 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 일곱번째 Asp이 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 세번째 Glu가 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Lys, Gly, Gln, Arg, Ala, Val, Asp 또는 Trp로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 네번째 Gln가 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His 또는 Lys로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser이 Thr 또는 Tyr로 치횐되고, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되며, 세번째 Glu은 Ala, Asp 또는 Trp로 치환되고, 다섯번째 Ser은 Cys 또는 Tyr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 추가된 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 내지 여섯번째 잔기인 Glu-Gln-Ser-Cys를 제외한 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 치환되고, 첫번째 Ser이 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile는 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp는 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다.
어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp(Cys가 그 부위의 5번째 아미노산 위치인 것을 특징으로 하는 쥐의 pep7 부위의 변이)인 아미노산 서열에서 1 개 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 잔기인 Glu-Gln-Cys-Ser를 제외한 다른 잔기인 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로하며 모발성장 촉진활성을 가지는 올리고펩타이드를 제공한다. 추가된 실시예에서, 본 발명은 Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 0 내지 2 개의 아미노산 잔기가 치환되고; 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 잔기인 Glu-Gln-Cys-Ser를 제외한 다른 잔기인 것을 특징으로하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본발명은 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser이 소수성 아미노산 잔기 또는 중성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로하는 올리고펩타이드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser이 Ala, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val 또는 Gly로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile이 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 추가된 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile이 Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 첨가된 예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser이 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser이 Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro 또는 Ala로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp이 친수성 아미노산 잔기, Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp이 Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 Glu이 Lys, Gly, Gln, Arg, Ala, Val, Asp 또는 Trp로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 네번째 Gln이 Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His 또는 Lys로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser이 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고, 세번째 Glu은 Ala, Asp 또는 Trp로 치환되며, 여섯번째 Ser은 Cys 또는 Tyr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp가 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Glu-Gln-Cys-Ser을 제외한 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 첫번째 Ser이 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp(Cys가 그 부위의 4번째 아미노산 위치인 것을 특징으로 하는 쥐의 pep7 부위의 변이)인 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 잔기인 Glu-Cys-Gln-Ser를 제외한 다른 잔기인 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 추가된 실시예에서, 본 발명은 Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 0 내지 2 개의 아미노산 잔기가 치환되고; 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Glu-Cys-Gln-Ser를 제외한 다른 잔기인 것을 특징으로하는 올리고펩타이드를 제공한다. 추가된 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser이 소수성 아미노산 잔기 또는 중성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser이 Ala, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val 또는 Gly로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 본 발명은 추가로 Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile이 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile이 Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser이 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser이 Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro 또는 Ala로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 지금까지 추가된 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp이 친수성 아미노산 잔기, Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다.
첨가된 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp이 Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr 또는 Leu로 치환되는것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 Glu이 Lys, Gly, Gln, Arg, Ala, Val, Asp 또는 Trp로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 다섯번째 Gln이 Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His 또는 Lys로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 지금까지 추가된 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser이 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고, 세번째 Glu은 Ala, Asp 또는 Trp로 치환되며, 여섯번째 Ser은 Cys 또는 Tyr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Glu-Cys-Gln-Ser을 제외한 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 첫번째 Ser이 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다.
어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp(Cys가 그 부위의 3번째 아미노산 위치인 것을 특징으로 하는 쥐의 pep7 부위의 변이)인 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기가 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Cys-Glu-Gln-Ser를 제외한 다른 잔기인 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 추가된 실시예에서, 본 발명은Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 0 내지 2 개의 아미노산 잔기가 치환되고; 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Cys-Glu-Gln-Ser를 제외한 다른 잔기인 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser이 소수성 아미노산 잔기 또는 중성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser이 Ala, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val 또는 Gly로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile이 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 첨가된 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile이 Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser이 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser이 Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro 또는 Ala로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 추가된 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp이 친수성 아미노산 잔기, Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp이 Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 첨가된 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 네번째 Glu이 Lys, Gly, Gln, Arg, Ala, Val, Asp 또는 Trp로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 다섯번째 Gln이 Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His 또는 Lys로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 추가된 실시예에서, 본 발명은 Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser이 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고, 네번째 Glu은 Ala, Asp 또는 Trp로 치환되며, 여섯번째 Ser은 Cys 또는 Tyr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Cys-Glu-Gln-Ser를 제외한 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 첫번째 Ser이 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다.
어떤 실시예에서, 본 발명은 Glu-Gln-Ser-Cys-Asp로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 Glu-Gln-Cys-Ser-Asp로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되는 것을 특징으로하는 올리고펩타이드를 제공한다. 어떤 실시예에서, 본 발명은 Glu-Cys-Gln-Ser-Asp로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다. 다른 실시예에서. 본 발명은 Cys-Glu-Gln-Ser-Asp로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되는 것을 특징으로 하는 올리고펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한 약 8 내지 20개의 아미노산 잔기를 가지며 하기의 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 올리고펩타이드를 제공한다:
Ser-Ile-Glu-Gln-Xaa-Ser-Asp-Gln;
Ser-Ile-Glu-Xaa-Gln-Ser-Asp-Gln; 및,
Ser-Ile-Xaa-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln,
상기에서, Xaa는 Cys 또는 반응 물질이 결합된 Cys를 말한다.
본 발명은 또한 하기의 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 올리고펩타이드를 제공한다:
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln; 및,
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln.
본 발명은 또한 서열번호 3 에서 서열번호 124 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 올리고펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드를 제공한다: Tyr Asn Glu Gln Ser Cys Asp Arg Glu Glu; Thr Ser Asp Gln Cys Cys Asp Pro Asp Lys; Pro Ser Glu Gln Ser Cys Ala Glu Glu Glu; Ser Asn Glu Gln Ser Cys Ala Val Ala Glu; Thr Thr Glu Gln Ser Cys Ala Val Asp Glu; Ser Ile Glu Gln Ser Cys Gly Gln His Glu; Ser Ser Ala Gln Ser Cys Leu Gln Asp Thr; Tyr Ile Glu Gln Tyr Cys Asp Gln Asp Glu; 또는 Thr Ile Trp Gln Ser Cys Asp Gln Glu Glu.
본 발명의 올리고펩타이드는 천연(natural) 아미노산 잔기, 비-천연 아미노산 잔기, 또는 둘을 혼합해서 가지는 올리고펩타이드를 포함한다. 본 발명의 올리고펩타이드는 교차-연결제를 이용해서 변형시킨 올리고펩타이드를 포함한다. 본 발명은 또한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 동종다량체(homopolymer) 및 동종다량체인 올리고펩타이드 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys이 아닌 다량체이며, 교차-연결를 이용해서 만든 본 발명 올리고펩타이드를 적어도 두개를 포함하는 올리고펩타이드 다량체를 포함한다. 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 동종다량체(homopolymer) 및 동종다량체인 올리고펩타이드 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys가 아닌 다량체의 조건에서, 교차-연결에 의하여 수득된 올리고펩타이드 다량체를 적어도 두개 포함한다.
본 발명은 본 발명의 올리고펩타이드를 가지는 조성물을 포함한다. 어떤 실시예에서, 조성물은 추가로, 약학적 허용이 가능한 부형제(excipient)를 포함한다. 다른 실시예에서, 조성물은 경피(transdermal) 투과 또는 운반을 강화시키는 제제를 포함한다.
본 발명은 또한 전기 포유동물에서 모발성장을 촉진시키는 효과적인 양을 모발성장을 필요로 하는 포유동물에게 본 발명의 올리고펩타이드를 포함하는 조성물을 투여하는 방법과 포유동물에서 모발성장을 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상피세포의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체 또는 그의 단편을 제공한다. 어떤 실시예에서, 상피세포의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원은 성체(imago)의 성장기간 또는 태아의 발생기간 동안에 특이적으로 발현되는 항원이다. 다른 실시예에서, 본 발명은 산업소재 종합연구소내 특허 및 생물소재센터(Patent and Bio-Resource Center of National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)에 기탁번호 FERM P-18578로 기탁된 융합세포종(hybridoma)와 전기 융합세포종에 의해 만들어지는 단일클론 항체를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 산업소재 종합연구소내 특허 및 생물소재센터에 기탁번호 FERM P-18578로 기탁된 융합세포종에 의해 만들어진 단일클론 항체에 의해 인식되는 항원 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 성장기 포유동물의 피부에서 수집된 모발 및/또는 성장기 포유동물 수염의 소낭, 및 포유동물의 골수종(myeloma) 세포로부터 추출된 단백질을 포함하는 면역원(immunogen)으로 면역된 포유동물 면역세포(immunocytes)를 융합시키는 단계를 가지는 방법에 의하여 생산되는 융합세포종을 제공한다. 본 발명은 산업소재 종합연구소내 특허 및 생물소재센터에 기탁번호 FERM P-18578로 기탁된 융합세포종을 배양하는 단계 및 전기 융합세포종에 의하여 생산된 단일클론 항체를모으는 단계를 포함하며, 상피조직의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원에 특이적인 단일클론 항체의 생산 과정을 제공한다.
본 발명은 또한 하기의 각 단계를 포함하는 모발성장 촉진활성의 평가방법을 제공한다: (1) 포유동물로부터 유래된 피부조직을 적합한 조건 및 모발성장 촉진에 효과적인 시간 동안,분석할 물질을 넣어 배양는 단계; (2) 단계(1)로 부터 전기 피부 조직을 회수하는 단계; (3) 산업소재 종합연구소내 특허 및 생물소재센터에 기탁번호 FERM P-18578로 기탁된 융합세포종에 의해 만들어지는 단일클론 항체 또는 그의 단편과 전기 피부조직을 반응시키는 단계; 및; (4) 피부조직과 반응하는 단일클론 항체 또는 단편을 탐색하는 단계.
본 발명은 또한 산업소재 종합연구소내 특허 및 생물소재센터에 기탁번호 FERM P-18578로 기탁된 융합세포종에 의해 만들어지는 단일클론 항체를 포함하는 키드를 제공한다.
본 발명의 실행을 위한 바람직한 방법
본 발명은 비 정상적인 형태형성과 관계된 질병 또는 질환 증상의 치료 또는 경감을 위해 이용가능한 올리고펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 올리고펩타이드는 형태형성을 유도하고, 맥관재생을 유도하며, 재생효과를 유도하고, 심장혈관의 재생을 유도하며, 내피세포성장을 유도하는데 사용 가능하다. 본 발명의 올리고펩타이드는 예를 들어, 화상 또는 상처의 증상을 치료 및/또는 경감 또는 모발성장을 촉진 또는 모발손실을 예방하기 위해 이용 가능하다. 특히, 본 발명은 모발성장 촉진활성을 가지는 올리고펩타이드 및 모발성장을 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 올리고펩타이드의 검출, 정량, 분리 또는 정제를 위해 이용가능한 본발명의 올리고펩타이드와 특이적으로 결합하는 다클론항체(polyclonal antibodies), 단클론항체 및 그것의 단편을 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 외피세포의 신생 소낭의 220 kDa 항원과 특이적인 단클론항체 및 이러한 단클론항체를 이용해서 모발성장을 확인할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명은 산업기술 종합연구소내 생물소재센터에 기탁 번호 FERM P-18578(FERM BP-8121)로 기탁된 융합세포종(hydridoma)에 의해 생성된 내피세포의 신생 소낭의 220 kDa에 특이적인 단일클론 항체를 포함한다.
본 발명은, 일부분은, 단독(single) 올리고펩타이드인 단위체(monomers), 및 특히 이량체화 하기 위한 적합한 조건하에서 이량체화 할 수 있는 능력이 있는 단위체, 반응 물질 결합물을 가지는 단위체, 및 동종이량체, 이종이량체, 삼량체를 포함하는 이량체와 같은 폴리머로써 모발성장 촉진활성을 가지는 본 발명의 올리고펩타이드의 관찰을 근거로 한다. 모발성장 촉진활성은 예 7 에 기술된 분석방법 및 이 분야에서 알려진 방법에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 실험은 달리 언급하지 않으면, 이 분야의 기술범위 안에 포함되는, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 원래의 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술은 분자 클로닝: 실험서, 2판(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook 등,1998); 올리고펩타이드 합성(Oligopeptide Synthesis, M.J.Gait, ed., 1984); 동물 세포 배양(Animal Cell Culture, R.I. Freshney, ed., 1987); 면역학(Immunology, D,M. Wei 그리고 C.C. Blackwell, ed.); 포유동물 세포에서 유전자 전달 벡터(Gene Transfer Vecters for Mammalian Cells, J.M. Miller 그리고 M.P. Colos, ed.,1987); 분자 생물학 현재 실험서(Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel 등, ed., 1987 및 해마다 갱신); PCR: 폴리머레이즈 연쇄 반응(The polymerase Chain Reaction, Mullis 등, ed., 1994); 면역학 현재 실험서(Current Protocols in Immunology, J.E. Coligan 등, ed., 1991 및 해마다 갱신)와 같은 책에 모두 설명되어 있다.
에피몰핀 서열
인간 및 쥐 에피몰핀 아미노산 서열은 미국 특허 번호 5,726,298에 기술하고 있다. 미국 특허 번호 5,726,298에서 또한 인간 및 쥐 에피몰핀의 아이소폼(isoforms)을 보여준다. 인간 에피몰핀 pep7 아미노산 부분은 미국 특허 번호 5,726,298의 서열번호 3-5의 아미노산 위치 94번에서 시작하며 다음과 같은 염기 서열을 가지며:Ala-Ile-Glu-Gln-Ser-Phe-Asp(서열 번호:137) 이 문서에서는 도 14에서 보여주고 있다. 쥐의 에피몰핀 pep7 아미노산 부분은 미국 특허 번호 5,726,298의 서열번호:9-11의 아미노산 위치 95번에서 시작하고 여기선 도 15.에서 보여준다. 쥐의 pep7 부분에서, 인간 pep7의 첫번째 Ala은 Ser으로 대체하였으며인간 pep7의 여섯번째 Phe는 Cys로 대체 하였다.
인간 및 쥐 모두의 에피몰핀 단백질에서, pep7 부분은, 심지어 인간 에피몰핀 pep7 부분에서 Cys가 없다고 해도, 이량체를 형성하기 위해 다른 폴리펩타이드 체인과 접근하는 능력을 가지는 폴리펩타이드 체인이 각각의 에피몰핀의 감겨진 코일 도메인에 위치한다. 본 발명의 일부분은 어떤 아미노산 잔기가 Cys으로 대체되거나, 예 7에 기술된 쥐 모델에서 신생 모발 소낭의 형태형성을 유도하는 능력을 가지는 인간 에피몰핀 pep7 구역 Ala-Ile-Glu-Gln-Ser-Phe-Asp의 변이 관찰에 근거한다. 본 발명은 추가로 이량체화를 허용하는 조건하에서 Cys를 포함하는 다른 pep7 부위를 가지고 이량체화 할 수 있는 능력을 가지고, 쥐 모델에서 활성을 가지는 위치 6에 Cys를 포함하는 pep7 부위 돌연변이체와 반면에 여기의 예에 기술된 쥐 모델에서 활성을 가지고 있지 않은 Cys를 Phe로 대체하여 Cys를 가지고 있지 않은 pep7 부위 돌연변이체의 관찰에 근거한다.
인간 및 쥐 pep7 아미노산 부위가 잘 보존된다는 사실과 예 7에 기술된 쥐 모델에서 활성을 나타내는 Cys를 포함하는 인간 pep7 부위의 변이를 근거로 해서, 여기에 기술된 올리고펩타이드가 인간 모발성장 유도 및/또는 모발손상을 예방할수 있을 것임을 예상했다. 단량체 형태 그리고 반응 물질 결합물을 가지는 단량체로써의 올리고펩타이드는 모발성장 촉진활성을 나타낸다. 이량체 형태의 올리고펩타이드는 여기의 예 7에 기술된 분석에 의해 측정된 높은 활성을 나타낸다.
올리고펩타이드
본 발명에 포함되는 올리고 펩타이드는 EP 0698666A2(또한 여기의 도 14 및 15 참조) 및 미국 특허 번호(U.S. Pat. No.) 5,726,298에 기술된 인간 또는 쥐의 에피몰핀 pep7 아미노산 부위를 기본으로 포함한다. 인간 에피몰핀 및 그것의 아이소폼을 암호화 하는 유전자는 서열번호 6, 7 및 8 로 미국 특허 번호 5,726,298에 기술되어 있다. 쥐 에피몰핀 및 그것의 아이소폼을 암호화 하는 유전자는 서열번호 12, 13 및 14로 미국 특허 번호(U.S. Pat. No.) 5,726,298 에 기술하고 있다.
어떤 실시예에서, 올리고펩타이드는 인간 또는 쥐 에피몰핀안이나 그 주위에서 일어나는 변이 즉, pep7 부위의 7번째 아미노산 및 첨가적으로는 인간 또는 쥐 에피몰핀의 pep7 부위의 N-말단 방향 및/또는 C-말단 방향에서 1-4번째 아미노산 안에서 일어날 수 있는 변이를 포함한다. 여기서 사용한 "변이"는 아미노산 치환(들) 및/또는 결실(들) 및/또는 삽입(들) 및/또는 부가(들)로 제한된 것을 포함한다. 본 발명의 올리고펩타이드는 5 번째 내지 104 번째 아미노산 잔기 길이를 포함하고 어떤 예에서는 올리고펩타이드가 서열번호 1 또는 서열번호 2와 동일하지 않으며 올리고펩타이드 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys와 동일하지 않고 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 조건에서 서열번호 3-124에 기술된 아미노산 서열을 가진다. 어떤 실시예에서는, 그 올리고펩타이드가 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다면, 올리고펩타이드는 pep7 부위의 변이로 이루어진다. 다른 실시예에서는, 그 올리고펩타이드가 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다면, 특히, 이 문서중의 서열번호 3-124에 기술된 것과 같이, 올리고펩타이드는 pep7 부위의 변이를 포함한다. 본 발명은 이 문서에 기술된 특히, 이 문서중의 서열번호 3-124에 기술된 것과 같이 pep7 부위 변이를 가지는 올리고펩타이드를 포함하며 올리고펩타이드의 pep7 부위의 변이에서 N-말단 방향 및/또는 C-말단 방향의 아미노산 잔기는 인간 또는 쥐의 에피몰핀 pep7 부위에서의 N-말단 방향 및/또는 C-말단 방향에 원래 존재하는 아미노산 서열이며 어느 정도의 길이일지도 모르며 그리고 그 올리고펩타이드가 서열번호 1 또는 서열번호 2 그리고 올리고펩타이드 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys와 동일하지 않은 조건하에서, 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다면, 인간 또는 쥐의 에피몰핀의 어떤 아이소폼 또는 인간 그리고 쥐의 에피몰핀의 완전한 길이를 포함한다.
본 발명은 이 문서에 기술된 특히, 이 문서중의 서열번호 3-124에 기술된 것과 같이 pep7 부위 변이를 가지는 올리고펩타이드를 포함하며 올리고펩타이드의 pep7 부위의 변이에서 N-말단 방향 및/또는 C-말단 방향의 아미노산 잔기는 인간 또는 쥐의 에피몰핀 pep7 부위에서의 N-말단 방향 및/또는 C-말단 방향에 원래 존재하는 아미노산 서열에 치환(들), 특히, 보존성의 치환(들) 및/또는 결실(들) 및/또는 부가(들) 및/또는 삽입(들)을 포함하며 어느 정도의 길이일지도 모르며 그 올리고펩타이드가 서열번호 1 또는 서열번호 2 그리고 올리고펩타이드 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys와 동일하지 않은 조건하에서, 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다면, 인간 그리고 쥐의 에피몰핀의 완전한 길이를 포함한다. 다른 실시예에서, 올리고펩타이드의 pep7 부위의 변이에서 N-말단 방향 및/또는 C-말단 방향의 아미노산 잔기는 포유동물의 에피몰핀 pep7 부위에서의 N-말단 방향 및/또는 C-말단 방향에 원래 존재하는 아미노산 서열이며 또는 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다면, 포유동물의 에피몰핀 pep7 부위에서의 N-말단 방향 및/또는 C-말단 방향에 원래 존재하는 아미노산 서열에 치환들, 특히, 보존성의 치환(들) 및/또는 결실(들) 및/또는 부가(들) 및/또는 삽입(들)을 포함한다. 어떤 실시예에서, 올리고펩타이드는 식염수 또는 물과 같은 수용성 배지에 용해된다. 다른 실시예에서는, 그 올리고펩타이드는 적합한 조건하에서 이량체화하는 능력을 가진다.
본 발명은 하기의 아미노산 서열을 포함하며, 모발성장 촉진활성을 가지는,약 5개 내지 104개의 아미노산 잔기 길이의 분리된 올리고펩타이드를 포함한다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;
상기에서, X1은 Ser, Ara, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val, Gly, Leu,
Ile 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드
로부터 결실되고;
X2는 Ile, Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe, Leu, Ala, Pro,
Cys 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부
터 결실되며;
X3는 Glu, Lys, Gln, Arg, Ala, Val, Trp, Cys 또는 Asp 잔
기이고;
X4는 Gln, Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His, Cys 또는 Lys 잔
기이며;
X5는 Ser, Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro, Ala, Gly, Val,
Leu, Ile 또는 Met 잔기이고;
X6는 Cys 잔기; 반응성 물질이 결합된(reactive
substance-bound) Cys 또는 반응성 물질이 결합된 Lys이
며; 및,
X7은 Asp, Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr, Arg 또는
Leu 이거나, 또는 올리고펩타이드가 서열번호 1 또는 서
열번호 2와 동일하지 않고, Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp
또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드와 동일
하지 않는 조건에서 전기 올리고펩타이드로부터 결실된
다.
본 발명은 하기의 아미노산 서열을 포함하며, 모발성장 촉진활성을 가지는,약 5개 내지 104개의 아미노산 잔기 길이의 분리된 올리고펩타이드를 포함한다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;
상기에서, X1은 Ser, Tyr, Thr 또는 Pro 잔기이거나, 또는 전기
올리고펩타이드로부터 결실되고;
X2는 Ile, Asn, Thr 또는 Ser 잔기이거나, 또는 전기
올리고펩타이드로부터 결실되며;
X3는 Glu, Ala, Trp 또는 Asp 잔기이고;
X4는 Gln 잔기이며,
X5는 Ser, Cys 또는 Tyr 잔기이고,
X6는 Cys 잔기; 반응성 물질이 결합된 Cys 또는
반응성 물질이 결합된 Lys이며; 및,
X7은 Asp, Ala, Gly 또는 Leu 잔기이거나 또는 올리
고펩타이드가 서열번호 2와 동일하지 않고,
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는 Ser-
Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드와 동일하지않은 조건에서 전기 올리고펩타이드로부터 결실된
다.
본 발명은 하기의 아미노산 서열을 포함하며, 모발성장 촉진활성을 가지는,약 7개 내지 100개의 아미노산 잔기 길이의 분리된 올리고펩타이드를 포함한다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;
상기에서, X1은 Ser, Ala, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val, Gly, Leu,
Ile 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부
터 결실되고;
X2는 Ile, Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe, Leu, Ala, Pro,
Cys 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부
터 결실되며;
X3는 Glu, Lys, Gln, Arg, Ala, Val, Trp, Cys 또는 Asp 잔
기이고;
X4는 Gln, Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His, Cys 또는 Lys 잔
기이며;
X5는 Ser, Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro, Ala, Gly, Val,
Leu, Ile 또는 Met 잔기이고;
X6는 Cys 잔기; 및,
X7은 Asp, Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr, Arg 또는
Leu이거나, 또는 올리고펩타이드가 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-
Cys-Asp 또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드
와 동일하지 않은 조건에서 전기 올리고펩타이드로부터
결실된다.
본 발명은 하기의 아미노산 서열을 포함하며, 모발성장 촉진활성을 가지는,약 7개 내지 100개의 아미노산 잔기 길이의 분리된 올리고펩타이드를 포함한다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;
상기에서, X1은 Ser, Tyr, Thr 또는 Pro 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부터 결실되고;
X2는 Ile, Asn, Thr 또는 Ser 잔기이거나, 또는 전기
올리고펩타이드로부터 결실되며;
X3는 Glu, Ala, Trp 또는 Asp 잔기이고;
X4는 Gln 잔기이며;
X5는 Ser, Cys 또는 Tyr 잔기이고;
X6는 Cys 잔기이며;
X7은 Asp, Ala, Gly 또는 Leu 잔기이거나, 또는 올리
고펩타이드 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드와 동일
하지 않은 조건에서 전기 올리고펩타이드로 부터
결실된다.
본 발명은 또한 모발성장 촉진활성을 나타내며 하기의 아미노산 서열을 포함하는 결실된 올리고펩타이드를 포함한다.
T/Y-S/N-E-Q-S-C-A(서열번호 3).
이 문서에 기술된 서열번호 3-124중 어떤 하나에서 보여진 아미노산 서열을 포한하는 결실된 올리고펩타이드는 본 발명에 포함된다. 어떤 실시태양에서, 올리고펩타이드는 서열번호 3-124중 어느 하나에서 나타나는 아미노산 서열을 구성하고 그리고 다른 실시태양에서는, 올리고펩타이드는 서열번호 3-124중 어느 하나에서 보여지는 아미노산 서열을 포함할 것이다. 이 문서에서 사용하는 것 처럼, "결실된" 올리고펩타이드는 원래 관계되어 있는, 적어도 하나의 구성성분으로 부터 제거된 올리고펩타이드를 나타낸다.
본 발명은 추가로 모발성장 촉진활성을 나타내는 다음과 같은 올리고펩타이드를 포함한다:
1개 내지 3개의 아미노산 잔기가 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산서열에서 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Glu-Gln-Ser-Cys를 제외한 다른 장기인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열을 포함하며, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이을 가지는 올리고펩타이드;
0 내지 2개의 아미노산 잔기가 Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또한 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Glu-Gln-Ser-Cys를 제외한 다른 잔기인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열을 포함하며, 5 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이을 가지는 올리고펩타이드;
첫번째 Ser은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 소수성 아미노산 잔기 또는 중성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이을 포함하는 올리고펩타이드;
첫번째 Ser은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Ala, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val 또는 Gly로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
두번째 Ile는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
두번째 Ile은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
다섯번째 Ser은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
다섯번째 Ser은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro 또는 Ala로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
일곱번째 Asp은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 친수성 아미노산 잔기인 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
일곱번째 Asp이 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
세번째 Glu은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Lys, Gly, Gln, Arg, Ala, Val, Asp 또는 Trp로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
네번째 Gln은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His 또는 Lys로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Thr 또는 Tyr로 치횐되고, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되며, 세번째 Glu은 Ala,Asp 또는 Trp로 치환되고, 다섯번째 Ser은 Cys 또는 Tyr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 내지 여섯번째 잔기인 Glu-Gln-Ser-Cys를 제외한 1 내지 3개의 아미노산 잔기가 치환되고, 첫번째 Ser은 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile는 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp는 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 1 개 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 잔기인 Glu-Gln-Cys-Ser를 제외한 다른 잔기인 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 0 내지 2 개의 아미노산 잔기가 치환되고; 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째내지 여섯번째 잔기인 Glu-Gln-Cys-Ser를 제외한 다른 잔기인 것을 특징으로 하는, 5 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 소수성 아미노산 잔기 또는 중성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Ala, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val 또는 Gly로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile은 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile은 Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser은 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser은 Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro 또는 Ala로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp은 친수성 아미노산 잔기, Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp은 Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 Glu은 Lys, Gly, Gln, Arg, Ala, Val, Asp 또는 Trp로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 네번째 Gln은 Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His 또는 Lys로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고, 세번째 Glu은 Ala, Asp 또는 Trp로 치환되며, 여섯번째 Ser은 Cys 또는 Tyr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp가 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Glu-Gln-Cys-Ser을 제외한 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 첫번째 Ser은 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 잔기인 Glu-Cys-Gln-Ser를 제외한 다른 잔기인 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 0 내지 2 개의 아미노산 잔기가 치환되고; 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Glu-Cys-Gln-Ser를 제외한 다른 잔기인 것을 특징으로 하는, 5 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 소수성 아미노산 잔기 또는 중성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Ala, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val 또는 Gly로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile은 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile은 Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser은 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser은 Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro 또는 Ala로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp은 친수성 아미노산 잔기, Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp은 Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 Glu은 Lys, Gly, Gln, Arg, Ala, Val, Asp 또는 Trp로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 다섯번째 Gln은 Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His 또는 Lys로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고, 세번째 Glu은 Ala, Asp 또는 Trp로 치환되며, 여섯번째 Ser은 Cys 또는 Tyr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Glu-Cys-Gln-Ser을 제외한 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 첫번째 Ser은 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기가 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Cys-Glu-Gln-Ser를 제외한 다른 잔기인 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 0 내지 2 개의 아미노산 잔기가 치환되고; 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Cys-Glu-Gln-Ser를 제외한 다른 잔기인 것을 특징으로 하는, 5 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 소수성 아미노산 잔기 또는 중성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Ala, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val 또는 Gly로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile은 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile은 Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser은 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser은 Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro 또는 Ala로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp은 친수성 아미노산 잔기, Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp은 Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 네번째 Glu은 Lys, Gly, Gln, Arg, Ala, Val, Asp 또는 Trp로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 다섯번째 Gln은 Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His 또는 Lys로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고, 네번째 Glu은 Ala, Asp 또는 Trp로 치환되며, 여섯번째 Ser은 Cys 또는 Tyr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Cys-Glu-Gln-Ser를 제외한 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 첫번째 Ser은 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로 치환되는 것을 특징으로 하는, 7 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Glu-Gln-Ser-Cys-Asp로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되는 것을 특징으로 하는, 5 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Glu-Gln-Cys-Ser-Asp로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되는 것을 특징으로 하는, 5 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Glu-Cys-Gln-Ser-Asp로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되는 것을 특징으로 하는, 5 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드;
Cys-Glu-Gln-Ser-Asp로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 치환되는 것을 특징으로 하는, 5 내지 100 개의 아미노산 잔기 길이를 포함하는 올리고펩타이드가 이에 속한다.
꼭 이론화하려고 하지 않지만, 비치환된 올리고펩타이드와, 예를 들면 유사한 모발성장 촉진활성과 같은 동일한 형태형성 활성을 가지는 아미노산 치환을 포함하는 올리고펩타이드 수득을 이론화하고, 에피몰핀의 pep7 부위에 새롭게 부가된 아미노산 잔기는 결손된 아미노산 잔기와 유사한 특성을 가지는 것이 바람직하다. 특이적으로, Ser(2 위치에), Ile, Glu, Gln(2 위치에) 및 Asp의 아미노산 잔기의 5 형태(모두 7 위치, 즉S I E Q SCD QD E 에서 7개의 밑줄로 표시된 위치)는 쥐의 에피몰핀의 pep7 부위의 아미노산 서열에서 치환될 수 있다. 그것들 중, Ser(serine)은 하이드록시아미노산(hydroxyamino acids)을 포함하는 Thr(threonine)로 치환될 수 있다; Ile(isoleucine)은 지방성(aliphatic)의 아미노산인 Gly(glycine), Ala(alanine), Val(valine) 또는 Leu(leucine)로 치환될 수 있다; Glu(glutamic acid)는 산성(acidic) 아미노산인 Asp(aspartic acid)로 치환될 수 있다; Gln(glutamine)은 아미드(amide)인 Asn(asparagine)과 치환될 수 있다; Asp(aspartic acid)는 산성 아미노산인 Glu(glutamic acid)로 치환될 수 있다; 선호되는 치환의 예가 있으며, 그리고 아미노산은 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다면 어느 다른 아미노산과도 치환될 수 있다.
하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드는 이 문서에 기술된, 실험실내(in vitro)에서 피부의 mAb27 항원의 양을 측정하는 실시예에서 설명하고 있는 분석방법에 의해 알 수 있는 모발성장 촉진활성을 가진다.
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp (서열번호 4);
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp (서열번호 5);
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp (서열번호 6);
Tyr-Asn-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp (서열번호 7);
Thr-Ser-Asp-Gln-Cys-Cys-Asp (서열번호 8);
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Gly (서열번호 9);
Ser-Ser-Ala-Gln-Ser-Cys-Leu (서열번호 10);
Tyr-Ile-Glu-Gln-Tyr-Cys-Asp (서열번호 11);
Thr-Ile-Trp-Gln-Ser-Cys-Asp (서열번호 12);
Thr-Thr-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala (서열번호 13);
Pro-Ser-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala (서열번호 14); 및,
Ser-Asn-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala (서열번호 15).
첨가한 올리고펩타이드는 모발성장 촉진활성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 한 글자 아미노산 코드(one letter amino acid)로 하기의 표 Ⅰ에서 나타내었다(? 표시는 약화된 아미노산을 나타내고 그리고 * 는 정지코드를 나타낸다.)
표 I
YIKQSCEQDE (서열번호 16)
YNEQSCDREE (서열번호 17)
SVEQSCHRGE (서열번호 18)
SSEQTCDQHG (서열번호 19)
STGQSCDQPG (서열번호 20)
TTEQSCDQQE (서열번호 21)
SIRQFCDQDV (서열번호 22)
TTEQSCDQQE (서열번호 23)
SNEPCSDQGG (서열번호 24)
FIEQSCDQNE (서열번호 25)
S?E?SCDQDQ (서열번호 26)
TSQQSCDLDE (서열번호 27)
VNEQSCDQDE (서열번호 28)
SNEQSCAVAE (서열번호 29)
SIEQSCDQDW (서열번호 30)
SIEQSCDQDV (서열번호 31)
TIWQSCDQEE (서열번호 32)
SSAQSCL (서열번호 10)
PSEQSCA (서열번호 14)
TIEQSCDEVA (서열번호 33)
STEQSCHKVE (서열번호 34)
SSEQWCSQDQ (서열번호 35)
SFEQSCDQHE (서열번호 36)
SNEESCDLDE (서열번호 37)
SIKQSCDPHQ (서열번호 38)
GLEQSCDQDW (서열번호 39)
TGEQSCDQHE (서열번호 40)
SIEQSCAPAF (서열번호 41)
PIKTSCDQEE (서열번호 42)
SIERSCDQDE (서열번호 43)
SSERSCDPDE (서열번호 44)
VIEQACDQNE (서열번호 45)
AIEQSCDQVE (서열번호 46)
SIEQSCNQDE (서열번호 47)
SSAQSCLQDT (서열번호 48)
YNEQSCD (서열번호 7)
YIEOYCD (서열번호 11)
SNEQSCA (서열번호 15)
YGEQSCDQGQ (서열번호 49)
SVEQSCDPND (서열번호 50)
SIEQFCEQGW (서열번호 51)
SLEQSCDQDK (서열번호 52)
SIEQSCDAHQ (서열번호 53)
SIEQFCNPDE (서열번호 54)
PIGPSCDKPV (서열번호 55)
SIVQSCGEAE (서열번호 56)
TGEQSCDQHE (서열번호 57)
FIEQSCDQHV (서열번호 58)
PIEQSCYQHG (서열번호 59)
STEQPCDQGL (서열번호 60)
PSEQSCAEEE (서열번호 61)
SIEQPCHQRV (서열번호 62)
TTEQSCAVDE (서열번호 63)
YIEQYCDQDE (서열번호 64)
TSDQCCD (서열번호 65)
TIWQSCD (서열번호 66)
YGEQSCDQGQ (서열번호 67)
SIEQSCDLHE (서열번호 68)
SIEQSCSQ?? (서열번호 69)
SIEQSCDQDE (서열번호 70)
SNEPSC?EDG (서열번호 71)
SSEHSCDHDE (서열번호 72)
PIKTSCDQFE (서열번호 73)
YNEQSCDQDE (서열번호 74)
TSDQCCDPDK (서열번호 75)
SIESSCDTAE (서열번호 76)
SFQQSCEQNE (서열번호 77)
SSEQFCDQGK (서열번호 78)
SIEQACGQGE (서열번호 79)
SIEQSCGQHE (서열번호 80)
SVEKPCDLVV (서열번호 81)
SIEQSCG (서열번호 9)
TTEQSCA (서열번호 13)
모발성장 촉진활성을 가지며 하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드는 본 발명에 포함된다.
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln (서열번호 82);
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln (서열번호 83);
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln (서열번호 84);
Thr-Ser-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala (서열번호 85);
Thr-Asn-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala (서열번호 86);
Tyr-Ser-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala (서열번호 87);
Tyr-Asn-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala (서열번호 88);
Thr-Ser-Glu-Gln-Cys-Ser-Ala (서열번호 89);
Thr-Asn-Glu-Gln-Cys-Ser-Ala (서열번호 90);
Tyr-Ser-Glu-Gln-Cys-Ser-Ala (서열번호 91);
Tyr-Asn-Glu-Gln-Cys-Ser-Ala (서열번호 92);
Thr-Ser-Glu-Cys-Gln-Ser-Ala (서열번호 93);
Thr-Asn-Glu-Cys-Gln-Ser-Ala (서열번호 94);
Tyr-Ser-Glu-Cys-Gln-Ser-Ala (서열번호 95);
Tyr-Asn-Glu-Cys-Gln-Ser-Ala (서열번호 96);
Thr-Ser-Cys-Glu-Gln-Ser-Ala (서열번호 97);
Thr-Asn-Cys-Glu-Gln-Ser-Ala (서열번호 98);
Tyr-Ser-Cys-Glu-Gln-Ser-Ala (서열번호 99);
Tyr-Asn-Cys-Glu-Gln-Ser-Ala (서열번호 100);
Glu-Gln-Ser-Cys-Asp (서열번호 101);
Glu-Gln-Cys-Ser-Asp (서열번호 102);
Glu-Cys-Gln-Ser-Asp (서열번호 103); 및,
Cys-Glu-Gln-Ser-Asp (서열번호 104).
첨가된 올리고펩타이드는 모발성장 촉진활성을 나타내는 하기의 아미노산 서열을 가지며 본 발명에 포함된다.
Ser-Ile-Glu-Gln-Xaa-Ser-Asp-Gln (서열번호 105);
Ser-Ile-Glu-Xaa-Gln-Ser-Asp-Gln (서열번호 106); 및,
Ser-Ile-Xaa-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln (서열번호 107);
상기에서, Xaa는 반응 물질이 결합된 Cys 또는 반응 물질이 결합된 Lys를 나타낸다.
하기의 표 Ⅱ에서는 모발성장 촉진활성을 가지는 올리고펩타이드 구조 특성을 보여준다. 아미노산 SIEQSCD는 쥐 에피몰핀의 pep7 부위이다.
표 II
대장균(E. coli)에서 올리고펩타이드를 생산하기 위해서, 올리고펩타이드 라이브러리를 제조했다. 표 Ⅲ는 제조된 올리고펩타이드에 대한 정보를 제공한다. 표 Ⅲ에서, 이 라이브러리의 디자인된 등급은 낮은쪽의 "이론값"으로 나타내었다. 실제 제조된 올리고펩타이드는 위쪽의 "출현"으로 나타내었다.
표 III
어떤 실시예에서, 본 발명의 올리고펩타이드는 약 5 내지 약 104 개의 아미노산 잔기 길이를 가지며, 다른 실시예에서는, 약 5 내지 약 100 개의 잔기길이를 가지고 그리고 추가된 예에서는, 약 7 내지 약 100 개의 아미노산 잔기 길이를 가진다. 지금까지 추가된 실시예에서, 올리고펩타이드는 약 7 내지 약 104 개의 아미노산 잔기길이를 가진다. 첨가된 실시예에서, 올리고펩타이드는 약 5 내지 약 40 개의 아미노산 잔기 길이, 약 6 내지 약 30 개의 아미노산 잔기 길이, 약 7 내지 약 20 개의 아미노산 잔기 길이, 약 7 내지 약 15 개의 아미노산 잔기 길이, 약 7 내지 약 12 개의 아미노산 잔기 길이, 약 7 내지 약 10 개의 아미노산 잔기 길이,약 8 내지 약 20 개의 아미노산 잔기 길이, 약 8 내지 약 15 개의 아미노산 잔기 길이, 약 8 내지 약 12 개의 아미노산 잔기 길이, 약 8 내지 약 10 개의 아미노산 잔기 길이를 가진다.
어떤 실시태양에서, 본 발명의 올리고펩타이드는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개의 아미노산 잔기를 가진다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고펩타이드는 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 101, 102, 103, 104 개 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이것은 올리고펩타이드의 피부 흡수를 강화 또는 촉진시키는 제제를 포함하는 긴 올리고펩타이드를 이용할때 적합하다. 이러한 제제는, 예를 들면, 경피 투과 및/또는 운반을 강화시키는 제제를 포함한다. 이러한 제제는 이 분야에서 잘 알려져 있으며 이 문서에서도 설명하고 있다.
어떤 실시예에서, 발명의 올리고펩타이드 길이는 최소한 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 개의 아미노산 잔기 길이여야 하며, 최대한 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 개의 아미노산 잔기 길이여야 하며 최소길이와 최대길이는 독립적으로 선별했다.
본 발명의 올리고펩타이드 아미노산 잔기 형태는 특별한 제한이 없으며, 천연 형태의 아미노산 잔기, 비-천연 형태의 아미노산 잔기 또는 그것의 유도체 중 어느 하나일 것이다. 아미노산은 L-아미노산, D-아미노산 또는 그것이 혼합된 것이다. 그 아미노산의 형태는 α-아미노산, β-아미노산, γ-아미노산 또는 δ-아미노산중 어느 하나일 것이다. α-아미노산이 자연계상태에서 선호되는 존재 형태의 아미노산이다.
이 문서에서 인용된 비-천연 형태의 아미노산은 천연 단백질(Gly, L-Ala, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Ser, L-Thr, L-Asp, L-Glu, L-Asn, L-Gln, L-Lys, L-Arg, L-Cys, L-Met, L-Phe, L-Tyr, L-Trp, L-His, L-Pro)을 구성하는 20가지의 천연 형태 아미노산 이외의 모든 아미노산을 말한다. 특별한 실시예에서는 (1) 천연 형태 아미노산의 원자(atom)가 다른 물질로 치환된 비-천연 형태 아미노산, (2) 천연 형태 아미노산의 측쇄(side chain)에 관한 광학 이성질체(optical isomer), (3) 천연 형태 아미노산의 측쇄를 치환함으로써 얻어진 비-천연 형태 아미노산, 및 (4) 소수성 특성, 재활성, 전하, 분자 크기, 수소 결합 능력, 기타 등등을 바꾸기 위해 천연 형태 아미노산의 측쇄를 치환함으로써 얻어진 비-천연 형태의 아미노산을 포함한다.
올리고펩타이드는 자유 형태로 존재하거나 또는 산 첨가 염 또는 염기 첨가 염으로 제공될 것이다.
올리고펩타이드 아미노산 잔기는 자발적인 발생 아미노산, 비-자발적인 발생 아미노산 또는 자발적 발생 및 비-자발적 발생 아미노산의 혼합형태를 포함한다. 어떤 실시태양에서, 올리고펩타이드는 예를 들어, 교차-연결제와 같은 반응 물질을 첨가함으로써 올리고펩타이드와 이량체화 또는 다량체화하는 능력을 가지는 올리고펩타이드로 변형될 수 있다. 본 발명은 올리고펩타이드 단량체, 반응 물질이 결합된 올리고펩타이드 단량체 그리고 동종이량체(동일한 올리고펩타이드와 이량체화 할 수 있는 올리고펩타이드) 및 이종이량체(다른 올리고펩타이드와 이량체화 할 수 있는 올리고펩타이드)를 포함하는 이량체와 같은 올리고펩타이드 다량체를 포함한다. 어떤 실시태양에서, 반응 물질은 올리고펩타이드에 Cys 또는 Lys를 결합하고그리고 추가의 실시태양에서, 반응 물질은 올리고펩타이드의 pep7 부위에 Cys 또는 Lys를 결합한다.
올리고펩타이드의 생물학적 활성은 예를 들어, EP 1008602A1에서 설명하는 것과 같이 신장으로 부터 유래된 MDCKⅡ세포에 대항하는 표현형성-촉진활성을 분석함으로써 측정 할 수 있다. 간단히 설명하면, MDCKⅡ 세포를 시험 폴리펩타이드, 콜라겐 및 콜라겐 젤을 생산할 수 있는 적합한 조건에 첨가하고 세포를 적합한 조건하에서 배양한다. 양성 결과는 콜라겐 젤에 삼차원의 형태로 관(tubular)구조를 형성하는 것으로써 알 수 있다.
일본 출원 공개 HEI 6-25,295에서 또한 상피 조직의 형태형성 활성을 측정하기 위한 분석법을 설명하고 있다. 미국 특허 번호 5,726,298에서는 상피세포의 성장을 확인하는 분석법을 설명한다. 간단히 설명하면, 태아 쥐로 부터 유래된 폐(pulmonary) 상피조직을 뉴크레오포어(nucleopore) 막에서 3차원 배양을 하고 폐상피의 관형태의 계속적인 성장을 본 발명의 올리고펩타이드와 같이 시험할 분자를 첨가하여 측정하였다.
올리고펩타이드의 생물학적 활성은, 또한 예를 들어, 모발 세대의 자극, 다수의 모발 섬유 형성 유도 및/또는 모발 섬유의 지름의 증가 및/또는 모발 섬유의 길이의 연장 및/또는 모발 손실 과정의 예방, 늦춤 또는 정지와 같은 모발 성장을 촉진 또는 모발성장 촉진활성이 나타나도록 하는 올리고펩타이드의 능력을 측정하고/측정하거나 이 문서의 실시예 7 그리고 8에 기술된 분석법에 의해 신생 소낭의 수 또는 크기 또는 둘다를 유도하고/유도하거나 미국 특허 번호 5,616,471에 기술된 실험실 분석법에 의해 측정할 수 있는 모발 소낭 세포 증식을 유도함으로써 측정할 수 있다.
더 특이적으로는, 모발성장 촉진활성은, 본 발명의 올리고펩타이드를 투여하고 반응하는 상피세포 신생 소낭에 발현하는 220 kDa 항원의 양을 측정함으로써 피부조직과 반응하는 상피세포의 신생 소낭의 220 kDa 항원에 특이적인 단일클론 항체 또는 그것의 항체 단편을 검출 또는 측정함으로써 평가할 수 있다.
이 분야의 일반적인 기술중 하나를 가지고 예를 들어 전기 테스트 방법을 특수화 또느 수정 또는 변경한 실시예에서 자세하게 설명하고 있는 것과 같은 테스트 방법으로 본 발명의 올리고펩타이드가 모발성장 촉진활성을 가진다는 것을 쉽게 확인할 수 있다. 다른 테스트 방법은 미국 특허 번호 5,616,471에서 설명하고 있다.
이 문서에 기술된 이러한 테스트 방법의 실시예는 하기에서 모두 설명하고 있다.
(1) C3H 및 C57BL/6 쥐는 태어난 후 45일째부터 약 50일 동안, 즉 90일 정도까지 텔로젠(telogen)상태를 유지한다고 알려져 있다. 그것의 모발 싸이클은, 즉 텔로젠에서는 분홍에서 회색으로 또는 아나젠(anagen)은 검은색과 같은 피부색 변화를 가지고 쉽게 판단할 수 있다. "아나젠"은 모발 소낭의 활성 단계를 나타내고 그리고 "텔로젠"은 모발 소낭의 휴지기 단계를 나타낸다. 모발성장 촉진활성은 이러한 쥐를 이용해서 평가 할 수 있고 텔로젠으로부터 아나젠으로의 변화를 촉진하는 테스트용 물질의 투여유무를 평가할 수 있다.
(2) 모발성장 촉진활성은 상피세포의 신생 소낭(예를 들면, 약 220 kDa의 항원)에 존재하는 항원을 특이적으로 인식하는 단일클론항체 또는 그의 단편(예를 들면, 기탁번호 FERM P-18578를 가지는 융합세포종에 의해 생산되는 단일클론 항체)에 의해 평가할 수 있다. 특이적으로, 조직으로부터의 피부조직은 본 발명의 올리고펩타이드와 같은 테스트용의 물질을 넣어 배양하고 피부조직을 수집하며 그리고 기탁번호 FERM P-18578를 가지는 융합세포종에 의해 생산되는 단일클론 항체 또는 그의 단편과 반응시킨다. 모발성장 촉진인자는 상피세포의 신생 소낭에 발현하는 항원의 양을 측정함으로써 피부조직과 반응하는 단일클론 항체 또는 그의 단편을 검출 또는 측정함으로써 평가 할 수 있다. 상피세포의 신생 소낭 양의 증가는 인간의 모발성장 촉진활성과 관계가 있다.
이 문서에서 사용한 이량체화를 위한 적합한 조건은 본 발명의 올리고펩타이드가 다른 올리고펩타이드와 결합하는 조건을 말한다. 어떤 실시태양에서, 올리고펩타이드는 다른 올리고펩타이드와 공유결합으로 결합한다. 이량체화 조건은 이 분야에서 잘 알려져 있으며 올리고펩타이드의 시스테인 잔기의 황화(sulfhydryl, SH) 그룹이 올리고펩타이드의 시스테인 잔기의 황화그룹 또는 라이신(lysine) 잔기의 아미노 그룹과 공유결합을 형성하는 조건을 포함한다.
반응 물질이 결합된 Cys 또는 반응 물질이 결합된 Lys는 -SH 그룹 또는 -NH2 그룹과 같은 기능적인 그룹과 반응하며 결합 할 수 있는 능력을 가지는, 예를 들면 교차-연결제와 같은 물질과 결합되어 있는 Cys 또는 Lys 아미노산 잔기를 말한다. 어떤 실시태양에서, 반응물질은 교차-연결제이다. 다른 실시태양에서, 반응물질은 두가지 기능를 가지는 교차-연결제를 말한다. 본 발명의 어떤 실시태양에서는, 예를 들면 모발성장 촉진활성을 나타내는 것과 같은 형태형성 활성을 가지는 올리고펩타이드는, 특히 적합한 조건하에서 이량체화 능력을 가지는 단량체 형태이다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 올리고펩타이드는 적합한 조건에서 이량체화 능력을 가지는 반응물질이 결합된 단량체의 형태이다. 본 발명의 첨가된 실시태양에서, 동종이량체 또는 이종이량체 및 삼량체와 같은 이량체인 다량체의 형태이다.
따라서, 본 발명은 약 5개 내지 104개의 아미노산 잔기 길이 및 하기의 아미노사 서열을 포함하는 전기 올리고펩타이드 다량체의 적어도 하나의 올리고펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 교차-연결된 올리고펩타이드를 가지며 모발성장 촉진활성과 같은 형태형성 촉진활성을 가지는 올리고펩타이드 다량체를 제공한다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;
상기에서, X1은 Ser, Ara, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val, Gly, Leu,
Ile 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드
로부터 결실되고;
X2는 Ile, Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe, Leu, Ala, Pro,
Cys 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부
터 결실되며;
X3는 Glu, Lys, Gln, Arg, Ala, Val, Trp, Cys 또는 Asp 잔
기이고;
X4는 Gln, Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His, Cys 또는 Lys 잔
기이며;
X5는 Ser, Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro, Ala, Gly, Val,
Leu, Ile 또는 Met 잔기이고;
X6는 Cys 잔기; 반응성 물질이 결합된(reactive
substance-bound) Cys 또는 반응성 물질이 결합된 Lys이
며; 및,
X7은 Asp, Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr, Arg 또는
Leu 이거나, 또는 올리고펩타이드가 서열번호 1 또는 서
열번호 2와 동일하지 않고, Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp
또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드와 동일
하지 않는 조건에서 전기 올리고펩타이드로부터 결실된
다.
어떤 실시태양에서, 형태형성 활성을 가지는 올리고펩타이드는 하기의 아미노산 서열을 포함하면서 약 5개 내지 104개의 아미노산 잔기 길이를 가지는 적어도 하나의 올리고펩타이드를 포함한다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;
상기에서, X1은 Ser, Tyr, Thr 또는 Pro 잔기이거나, 또는 전기
올리고펩타이드로부터 결실되고;
X2는 Ile, Asn, Thr 또는 Ser 잔기이거나, 또는 전기
올리고펩타이드로부터 결실되며;
X3는 Glu, Ala, Trp 또는 Asp 잔기이고;
X4는 Gln 잔기이며,
X5는 Ser, Cys 또는 Tyr 잔기이고,
X6는 Cys 잔기; 반응성 물질이 결합된 Cys 또는
반응성 물질이 결합된 Lys이며; 및,
X7은 Asp, Ala, Gly 또는 Leu 잔기이거나 또는 올리
고펩타이드가 서열번호 2와 동일하지 않고,
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는 Ser-
Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드와 동일하지않은 조건에서 전기 올리고펩타이드로부터 결실된
다.
본 발명은 또한 약 7개 내지 100개의 아미노산 잔기 길이 및 하기의 아미노사 서열을 포함하는 전기 올리고펩타이드 다량체의 적어도 하나의 올리고펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 교차-연결된 올리고펩타이드를 가지며 모발성장 촉진활성과 같은 형태형성 촉진활성을 가지는 올리고펩타이드 다량체를 제공한다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;
상기에서, X1은 Ser, Ala, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val, Gly, Ala, Leu,
Ile 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부
터 결실되고;
X2는 Ile, Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe, Leu, Ala, Pro,
Cys 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부
터 결실되며;
X3는 Glu, Lys, Gln, Arg, Ala, Val, Trp, Cys 또는 Asp 잔
기이고;
X4는 Gln, Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His, Cys 또는 Lys 잔
기이며;
X5는 Ser, Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro, Ala, Gly, Val,
Leu, Ile 또는 Met 잔기이고;
X6는 Cys 잔기; 및,
X7은 Asp, Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr, Arg 또는
Leu이거나, 또는 올리고펩타이드가 서열번호 1과 서열번
호 2와 동일하지 않고, Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또
는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드와 동일하
지 않은 조건에서 전기 올리고펩타이드로부터 결실된다.
본 발명은 약 7개 내지 100개의 아미노산 잔기 길이 및 하기의 아미노사 서열을 포함하는 전기 올리고펩타이드 다량체의 적어도 하나의 올리고펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 교차-연결된 올리고펩타이드를 가지며 모발성장 촉진활성과 같은 형태형성 촉진활성을 가지는 올리고펩타이드 다량체를 제공한다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;
상기에서, X1은 Ser, Tyr, Thr 또는 Pro 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부터 결실되고;
X2는 Ile, Asn, Thr 또는 Ser 잔기이거나, 또는 전기
올리고펩타이드로부터 결실되며;
X3는 Glu, Ala, Trp 또는 Asp 잔기이고;
X4는 Gln 잔기이며;
X5는 Ser, Cys 또는 Tyr 잔기이고;
X6는 Cys 잔기이며;
X7은 Asp, Ala, Gly 또는 Leu 잔기이거나, 또는 올리
고펩타이드 다량체가 올리고펩타이드 Ser-Ile-Glu-
Gln-Ser-Cys-Asp 또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인
동종다량체와 동일하지 않은 조건에서 전기 올리고
펩타이드로 부터 결실된다.
첨가된 실시예에서, 올리고펩타이드 다량체는 단독 올리고펩타이드(동종이량체를 말함) 또는 본 발명 올리고펩타이드의 혼합 다량체(이종다량체)로써 서열번호 3 내지 서열번호 124의 올리고펩타이드중 어느 하나를 가지는 본 발명의 올리고펩타이드를 포함한다. 본 발명의 어떤 실시예에서, 올리고펩타이드 다량체는 동종이량체; 이종이량체; 동종삼량체; 또는 이종삼량체이다.
본 발명은 변형된 올리고펩타이드를 포함한다. 본 발명에서 "변형된"이라는 용어는 화학적 변형 및 생물학적인 변형을 포함한다. 변형의 실시예는 알킬화(alkylation), 에스테르화(esterification), 할로겐화(halogenation) 및 아민화(amination)와 같은 기능적 그룹의 삽입 또는 산화(oxidation), 환원(reduction), 부가(addition) 그리고 제거(elimination)와 같은 기능적 그룹의 전환 또는 당 화합물(단당류, 이당류, 올리고당류 또는 다당류) 또는 지질 화합물, 인산화(phosphorylation), 비오틴화(biotinylation)의 삽입을 포함한다. 그러나, 여기서는 이러한 변형을 제한하지 않았다. 따라서 본 발명은 변형된 올리고펩타이드 및 전기 포유동물의 모발성장을 촉진시키는 효과적인 양을 모발성장을 필요로 하는 대상 포유동물에게 변형된 올리고펩타이드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 모발성장을 촉진시키는 방법을 제공한다.
변형된 올리고펩타이드의 실시예는 비오틴화한 올리고펩타이드를 포함하며 그리고 더 선호되는 실시예는 사이의 간격이 있거나 또는 없이 N-말단과 비오틴이 결합한 올리고펩타이드를 포함한다. 상기의 변형된 올리고펩타이드는 바람직한 생리적 활성을 유지하는한 적합한 화학 변화에 비오틴이 첨가되는 것이다. 비오틴화한 올리고펩타이드의 생산 방법은 본 발명 명세서의 실시예에서 명확하게 보여준다. 적당한 길이의 스페이서를 가지도록 N-말단에 비오틴을 삽입하기 위해서는, 예를 들면 NHS-비오틴 또는 NHS-LC-비오틴(Pierce에서 구입 가능)를 사용할 수 있다.
다른 변형된 올리고펩타이드의 실시예는 그것의 시스테인 잔기의 셜포하이드릴 그룹에 의해 이량체화 된 올리고펩타이드가 포함된다. 이량체 반응은 이량체를 형성하도록 공기중에서 자발적으로 일어난다. 이량체화한 올리고펩타이드는 같은 올리고펩타이드와 교차-연결에 의해 수득된 동종이량체 올리고펩타이드가 되거나 또는 올리고펩타이드의 다른 두가지 형태의 교차-연결에 의해 수득된 이종이량체올리고펩타이드가 될 것이다. 올리고펩타이드를 포함하는 조성물 또는 모발성장과 같은 형태형성 활성을 촉진시키는데 이용할 수 있는 본 발명의 올리고펩타이드는 같은 또는 다른 단량체의 혼합 형태 및 특히 반응물질 결합물 그리고 이량체와 같은 다량체를 가지는 단량체이며 적합한 조건에서 이량체화 할 수 있는 능력을 가지는 단량체의 형태를 가진다.
동종이량체 또는 이종이량체와 같은 본 발명의 다량체는 교차-연결에 의해 변형된 올리고펩타이드를 포함하는 위에 언급한 본 발명의 어떤 올리고펩타이드와 교차-연결에 의해 수득될수 있다.
본 발명에서 이용한 교차-연결제는 되도록이면 올리고펩타이드 시스테인 잔기의 셜포하이드릴 그룹을 활성화시킬 수 있고 그리고 다른 올리고페타이드의 시스테인 잔기의 셜포하이드릴 그룹과 공유결합을 형성할 수 있는 두가지 기능을 가지는 교차-연결제를 사용한다.
본 발명에 사용가능한 두가지 기능을 가지는 교차-연결제의 실례는 말레이마이드(maleimide) 그룹이 선택적으로 하이드록시 그룹과 같은 치환기를 가지는 아래쪽의 알칼리 그룹(예를 들면, C1-C10, 바람직하게는 C1-C8 알칼리 그룹)의 양쪽 말단과 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물과 같은 비스말레이마이드(bismaleimide) 그룹을 포함한다. 비스말레이마이드 화합물의 실시예는 1,4-비스말레이마이딜-2,3-디하이드록시부탄(1,4-bismaleimidyl-2,3-dihydroxybutane), 1,6-비스말레이마이드헥산(1,6-bismaleimidehexane), 비스말레이마이드에탄(bismaleimidethane) 및 1,4-비스말레이마이드부탄(1,4-bismaleimidebutane)를 포함한다.
추가로, 교차-연결제는 앞쪽에서 언급한 어느 올리고펩타이드(변형된 올리고펩타이드 포함) 및 포유동물대상에서 모발성장을 촉진하는 이러한 단량체을 이용하는 방법에서 시스테인 잔기와 결합하는 것을 특징으로 하는 단량체 올리고펩타이드는 본 발명의 범주안에 포함된다.
게다가, 첨가적으로 이량체 올리고펩타이드, 삼량체 또는 그 이상과 같은 다량체 올리고펩타이드도 본 발명의 범주에 포함된다. 예를 들면, 본 발명은 3개 또는 그 이상의 펩타이드를 교차-연결할 수 있는 교차-연결제를 이용해 수득된 삼량체 또는 그이상과 같은 다량체 올리고펩타이드를 포함한다.
상기의 올리고펩타이드는(변형된 올리고펩타이드를 포함) 자유 형태로 존재하며 또는 산 첨가 염 또는 염기 첨가 염으로써 제공될 수 있을 것이다. 산 첨가 염의 실시예는 염산(hydrochloride), 황산염(sulfate), 질산염(nitrate) 및 인산염(phosphate)과 같은 광산염(mineral acid salts); 파라-톨루엔술폰산염(para-toluenesulfonate), 메탄술폰산염(methanesulfonate), 구연산염(citrate), 옥살산염(oxalate), 말레이산염(maleate) 및 타르타르산염(tartrate)과 같은 유기산염(organic acid salts)이 포함된다. 염기 첨가 염을 이용한 실시예는 나트륨염(sodium salts), 칼륨염(potassium salt), 칼슘염(calcium salts) 및 마그네슘염(magnesium salt)과 같은 금속염(metal salts); 암노늄염(ammonium salt); 메틸 암모늄염(methyl ammonium salt) 및 트리메틸 암모늄염(trimethyl ammonium salt)과 같은 유기암모늄염(organ ammonium salts)을 포함한다. 올리고펩타이드는 글라이신과 같은 아미노산을 가지는 염을 형성하거나 또는 분자안에 역이온(counter ion)을 형성할 것이다.
게다가, 이러한 올리고펩타이드 또는 그것의 염은 수화물(hydrate) 또는 용해물(solvate)형태로 존재할 것이다. 상기의 올리고펩타이드는 다수의 비대칭 탄소 원자를 가진다.
비록 이러한 각각의 비대칭 탄소 원자의 입체화학이 제한이 없기는 하지만, 아미노산 잔기가 L-아미노산인 것이 바람직하다. 비대칭 탄소 원자를 기본으로 하는 광 이성질체 또는 다이스테로머(diastereomers)와 같은 입체이성질체, 입체이성질체의 어느 혼합물 및 레이스메이트(racemates)는 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 올리고페타이드는 고체상 또는 액체상 방법과 같은 펩타이드 합성을 위한 종래의 화학 기술에 의해 합성될 수 있다. 아미노 그룹 등을 위한 방어 그룹 및 펩타이드 합성 분야에서 축합 반응을 위한 축합제제에 대한 다양한 종류의 참고문이 있기 때문에 이러한 참고문을 합성에 인용할 수 있다. 액체상 방법에서, 상업적으로 이용가능한 다양한 펩타이드 합성기(synthesizers)를 이용할 수 있다. 이러한 합성은 필요한 기능적 그룹의 보호(protection)및 역보호(deprotection)를 실행함으로써 효과적으로 실행될 수 있다. 예를 들면, 유기합성의 방어 그룹과 같은 방어 그룹의 삽입 및 제거를 위한 방법에 관해서는, T.W,Greene, John Wiley & Sons, Inc. 1981 등을 인용할 수 있다.
유전자 발현 방법과 같이 이 분야에서 잘 알려져 있는 생물학적 방법을 인용함으로써, 원하는 올리고펩타이드를 상기의 올리고펩타이드을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 제조합 벡터를 만들고, 벡터를 이용해 형질 전환된 미생물(형질전환체, transformant)을 제조하며 그리고 선택적으로 분리하고 형질전환체 배양에서 올리고 펩타이드를 분리함으로써 수득될 수 있다. 올리고펩타이드를 생산하는 방법은 화학 및 생물학적 방법에만 제한되어 있지 않다. 화학적 변형 및 생물학적 변형을 포함하는 변형된 올리고펩타이드를 만드는 방법은 이 분야에서 일반적인 기술의 하나로 잘 알려져 있으며 다른 방법도 이용가능하다.
본 발명은 또한 핵산을 포함(예, 형질전환된)하고 이 문서에서 설명한 올리고펩타이드를 암호화하는 숙주세포를 제공한다. 원핵 생물 및 진핵 생물 모두의 숙주 세포는 적합한 복제 출발점과 같은 그 숙주에서 유지를 해야하는 서열이 존재하는한 이용할 수 있다. 편리하게, 선택 표지인자 또한 제공한다. 숙주 시스템은 이 분야에선 잘 알려져 있다. 원핵 생물의 숙주 세포는, 예를 들면E.coil, B. subtilis, 및 mycobacteria와 같은 세균 세포를 포함한다. 원핵생물의 숙주 세포에는 효모(yeast), 곤충(insect), 조류(avian), 식물(plant),C.elegans(또는 선충) 및 포유동물 숙주이다. 곰팡이(효모를 포함하는)숙주 세포를 예로 들면S.cerevisiae, Kluyveromyces lactis(K.lactis),C.albicans및C.glabrate를 포함하는Candida종,Aspergillus nidulans, Schizosacchaomyces pombe(S.pombe),Pichia pastoris, 및 Yarrowia lipolytica이다. 포우세포를 예로 들면 배양된 중국 헴스터 난소(cultured Chinese hamster ovary, CHO)세포 및 아프리카 그린 원숭이(African green monkey) 세포이다.Xenopus laevis의 난모세포 및 양서류 원천의 다른 세포도 또한 이용가능할 것이다.
본 발명의 올리고펩타이드의 이용
본 발명의 올리고펩타이드는 비정상적인 형태형성 질환 또는 질병의 치료 및/또는 경감을 위해 이용할 수 있는 약제 또는 약물학적인 조성물의 유효성분으로서 이용할 수 있다. 본 발명의 올리고펩타이드는 형태형성, 맥관재생효과, 재생 효과, 심장혈관 재생 및 내피세포성장을 유도하는데 이용가능하다. 본 발명의 올리고펩타이드는 예를 들어 화상 또는 상처와 같은 증상의 치료 및/또는 경감 또는 모발성장을 촉진 또는 모발손실을 예방하는데 이용 할 수 있다. 어떤 실시예에서, 이러한 조성물은 모발성장촉진 또는 모발손실예방을 위해 유용하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 올리고펩타이드 및 약물학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 어떤 실시예에선 모발성장을 촉진하기 위해 사용하는 조성물은 추가로 경피 투과 강화제 및/또는 경피운반 제제와 같은 피부흡수를 강화시키는 제제를 포함한다. 이러한 제제는 이분야에서 잘 알려져 있으며 이 문서에서 설명하고 있다. "약물" 또는 "약물학적인 조성물"이라는 용어는 이 문서에서 교체가능하게 사용하고 있다. 이 문서에서 사용하는 "약물학적인 조성물"은 넓은 범위에서 사용하고 형태형성 제제를 포함하는 조성물을 포함하며 그리고 어떤 실시예에서는 모발성장촉진제제를 포함한다. 형태형성 제제는 인간을 포함하는 포유동물의 질병 또는 질환의 치료학적 처방뿐만 아니라 증상의 경감에도 이용한다. 모발성장 조성물은 가끔은 약물 또는 약물학적 조성물 뿐만아니라 준-약물 또는 화장품으로 분류되기도 한다. 투여물질 및 본 발명 약물의 약물학적인 효과 및 본 발명의 약물로 처방되는 질환 및/또는 질병은 하기에 상세하게 언급하고 있다. 이 문서에서 사용하는 "경감"은 상태의 예방, 감소 또는 완화를 의미한다. 본 발명의 올리고펩타이드 및 올리고펩타이드를 포함하는 조성물은 맥관재생효과, 재생촉진효과, 심장혈관 재생효과, 혈관내피세포에서의 유도효과 등을 제공할 수 있으며 만성 저해 동맥경화, 뷰르거 병(Buerger's), 심각한 협심증, 동맥경화 등의 증상 치료 및 경감에 이용가능하다(Exp. Cell. Res., 1996, Jan 10, 222(1):189-98). 본 발명의 올리고펩타이드는 췌장 내피의 형태형성과 관계가 있으며 올리고펩타이드를 포함하는 조성물은 당료 증상등의 치료 및 경감에 이용할 것이다(J. Cell. Biol., 2001, Mar 5;152(5):911-22). 본 발명의 올리고펩타이드는 간 형성(재생)과 관계가 있으며 올리고펩타이드를 포함하는 조성물은 간 대사 실패증상의 치료 및 경감에 이용할 수 있을 것이다(Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, Sep 18;250(2):486-90). 본 발명의 올리고펩타이드는 뼈와 이의 형성과도 관계가 있으며 따라서 올리고펩타이드를 포함하는 조성물은 치주질환, 골절, 골암, 골결함 및 골형성질환의 증상의 치료 및 경감에도 이용할 수 있을 것이다(Arch. Oral. Biol., 1995, Feb;40(2):161-4). 본 발명의 올리고펩타이드는 폐 분지 형태형성 및 폐 섬유증과 관계가 있으며 올리고펩타이드를 포함하는 조성물은 폐질환 증상의 치료 및 경감에도 이용할 수 있을 것이다(Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, May 19;234(2):522 및Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 2000, Aug;(2):168-74). 본 발명의 올리고펩타이드는 근육구조를 유지하는 것과 관계가 있으며 근위측증등과 같은 증상의 치료 및 경감에 이용할 수 있다(Histochem. J., 1998, Dec;30(12):903-8). 본 발명의 올리고펩타이드는 쓸개 상피의 형태형성과 관계가 있으며 올리고펩타이드를 포함하는 조성물은 쓸개질환 증상의 치료 및 경감에 이용 할 수 있다(Cell. Tissue. Res., 2000, May;300(2):331-44). 본 발명의 올리고펩타이드는 유선 내강 표현형성과 관계가 있으며 올리고펩타이드를 포함하는 조성물은 유선질환 증상의 치료 및 경감에 이용 할 수 있다(J. Cell. Biol.,2001, May 14;153(4):785-94). 이러한 것 중 가장 선호되는 것은, 본 발명의 올리고펩타이드가 모발성장 촉진제로써 이용할 수 있다는 것이다.
올리고펩타이드를 포함하는 본 발명의 조성물은 형태형성을 촉진할 수 있는 효과적인 양으로 대상물에 투여한다. 어떤 실시예에서, 올리고펩타이드를 포함하는 본 발명의 조성물은 모발성장을 촉진할 수 있는 효과적인 양으로 대상물에 투여한다. 이러한 대상은 모발손실 및/또는 모발손실의 위험을 경험한 대상이다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 올리고펩타이드를 포함하는 조성물을 전기 포유동물 대상에 모발성장을 촉진시키는 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함해서 모발손실의 경험이 있거나 또는 모발 손실의 위험이 있는 포유동물 대상에 모발성장을 촉진시키기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 약물 또는 약물학적인 조성물로서, 여기에 개시한 올리고펩타이드 중에서 선별된 하나 또는 그 이상의 올리고펩타이드 또는 생리적으로 허용가능한 염을 이용할 수 있다. 본 발명의 올리고펩타이드는 단량체, 특히 이량체화를 위한 적합한 조건에서 이량체화 할 수 있는 능력을 가지는 단량체, 반응물질이 결합된 단량체 및 동종이량체 및 이종이량체 또는 동종삼량체 및 이종삼량체를 가지는 삼량체와 같은 이량체인 다량체의 형태를 나타낸다. 그러나 일반적으로는 약물학적으로 허용가능한 하나 또는 그 이상의 약물 첨가물을 이용해서 유효성분으로써 하나 또는 그 이상의 상기 올리고펩타이드을 포함하는 약물 조성물을 제조 및 투여하는 것이 바람직하다. 유효성분으로 위에서 언급한 올리고펩타이드중 하나 또는 그 이상을 포함하는 모발성장 촉진제제는 크림, 스프레이, 코팅용액 및 패치와 같은 외부 조제품의 형태로 제공될 수 있다. 이러한 제제의 이용방법은 목표위치에 바로 이용할 수 있다. 모발성장 촉진제제로써의 이용 목적에 적합한 어떤 형태로든 만들 수 있다.
예를 들면, 유효성분으로서의 상기의 올리고펩타이드는 샴푸나 린스에 첨가가 가능하며 또는 상기의 올리고펩타이드는 조제품을 생산하기 위해 리포좀안에 넣어 단백질 막으로 쌓을 수도 있다. 상기에서 언급한 형태의 조성물은 또한 본 발명의 범주안에 들어간다. 피부의 케라틴층을 통해 본 발명의 올리고펩타이드의 효과적인 경피 흡수를 위해서는 크림에 적합한 세제, 지질-용해 물질을 첨가하는 것이 바람직하다.
경피 투과 및 경피 운반제제를 강화시키는 물질은, 예를 들어, 미국특허공개, 2002 0048558A1; 미국특허번호 6,376,557; 미국특허번호 6,333,057; 미국특허번호 6,358,541; 미국특허번호 6,299,900에 기술되어 있고, 예를 들어, 미국특허번호 5,169,410에서 명시한 라우로켑람(laurocapram) 및 1-알킬아작 시클로헵탄(alkylazacycloheptan)-2와 같은 라우로켑람 유도체 및 올레인산 및 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 비닐 및 글라이세릴모노올레이트와 같은 그것의 에스테르 유도체, 미국특허번호 5,082,866에 명시된 도데실(N,N-디메틸아미노) 아세테이트 및 도데실(N,N-디메틸아미노) 프로피오네이트 및 미국특허번호 4,861,764에 명시된 2-엔(n)-노닐(nonyl)-1-3-다이옥솔렌(dioxolane)을 포함한다. 다른 잘 알려진 피부 투과 강화제는 아다팔렌(adapalene), 트리티노인(tretinoin), 레틴알데하이드(retinalaldehyde), 타자로틴(tazarotene), 살리실산(saliccylic acid), 아질라익산(azelaic acid) 및 글라이콜산(glycolic acid)을 포함한다. 추가적인 피부 투과제는 에톡시다이글라이콜(ethoxydiglycol), 에탄올, 트윈.RTM.80 및 레시틴 올가노젤(lecithin organogel)을 포함한다.
포유동물, 바람직하게는 인간에 국소투여하기 위한, 대상 조성물은 이에 제한되는 것은 아니나, 로션, 크림, 젤, 스틱, 스프레이, 오인트먼트 및 연고를 포함하는 다양한 형태로 제공될 수 있을 것이다. 이러한 형태는 이에 제한되는 것은 아니나, 용액, 유탁액, 젤, 고체 및 리포좀과 같은 여러가지 형태를 포함한다.
용액상태로 제제화된 본 발명 조성물의 국소 투여로 이용가능한 조성물은 일반적으로 약물학적으로 허용가능한 수용성 또는 유기 용매을 포함한다. "약물학적으로 허용가능한 유기 용매"란 용어는 본 발명의 올리고펩타이드가 거기에 분산되거나 용해되고, 허용가능한 안정적 특성(예, 흥분(irritation) 및 감작(sensitization) 특성)을 가지는 용매를 의미한다. 적합한 유기 용매의 예는 다음을 포함한다: 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜(200-600), 폴리에틸렌 글라이콜(425-2025), 글라이세롤, 1,2,4-부탄트리올, 솔비톨 에스테르, 1,2,6-헥산트리올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄디올 및 그것의 혼합물.
본 발명의 올리고펩타이드는 대략 1 ㎎/㎖의 PBS에 녹일 수 있다. 교차-연결제를 이용해 이량체화한 올리고펩타이드는 대량 0.9 ㎎/㎖에 녹일 수 있다. 용해도는 펩타이드 용액의 흡광도를 측정함으로써 결정할 수 있다. 단량체인 경우, 용해도는 (A215-A225) × 144(㎍/㎖ )(Waddell, 1956)의 식에 의해 계산할 수 있다. 이량체인 경우, 상기 식에 의해 얻어진 값을 1.3으로 나누어 결정한다.
본 발명에 유용한 국소 조성물(topical composition)을 에어로졸 형태로 제제화하고 스프레이로 피부에 도포하는 경우, 추진제를 용액 조성물에 첨가하여 사용한다. 이때, 추진제의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 염소화, 플루오르화 또는 클로로-플루오르화 저분자량의 탄화수소를 포함한다.
본 발명의 유용한 국소 조성물은 완화제를 포함하는 조성물로 제제화될 수 있다. 이때, "완화제(emollient)"는 피부보호 뿐만 아니라 건조를 예방 또는 경감시키기 위해 이용되는 물질을 의미한다. 여러가지 적합한 완화제가 알려져 있고, 여기에 이용될 수 있다.
올리고펩타이드를 포함하는 조성물로부터 제제화된 생산물의 또 다른 형태는 크림 및 로션이다. 로션 및 크림은 용액으로서뿐만 아니라 유탁액으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 조성물로부터 제조할 수 있는 또 다른 형태의 생산물은 오인트먼트(ointment)이다. 오인트먼트는 동물성 또는 식물성 오일 또는 반-고체 탄화수소(oleaginous)의 간단한 성분을 포함할 것이다. 오인트먼트는 또한 유탁액을 형성하기 위해 물을 흡수하는 흡수 오인트먼트 성분을 포함할 것이다. 오인트먼트 담체 또한 물에 용해되어야 할 것이다.
또 다른 형태가 유탁액이다. 유화제(emulsifiers)는 비이온, 음이온 또는 양이온이며 유화제의 예는 예를 들어 미국특허번호 3,755,560 및 4,421,769에 기술되어 있다.
로션 및 크림과 같은 물안에 유지 형태(oil-in-water) 및 유지안에 물의 형태(water-in-oil)의 국소 조제물을 위한 단독 유탁액은 이 분야에서 잘 알려져 있다. 물안에 지질안의 물형태(water-in-oil-in-water)와 같은 다양한 형태의 유탁액 조성물 또한 잘 알려져 있으며 예를 들어 미국특허번호 4,254,105에 기술되어 있다. 트리플(triple) 유탁액은 또한 본 발명의 국소 투여에 이용가능하고 예를 들어 미국특허번호 4,960,764에 기술된 실리콘안에 물안에 지질(oil-in-water-in-silicone)의 유체 유탁액을 포함한다.
국소 조성물로 이용가능한 또 다른 유탁액은 미세-유탁액 시스템(micro-emulsion system)이다. 예를 들면, 이러한 시스템은 약 9% 내지 약 15%의 스쿠알렌, 약 25% 내지 약 40% 의 실리콘 오일; 약 8% 내지 약 20%의 지방알콜; 폴리옥시에틸렌 솔비탄 단일-지방산의 약 15% 내지 약 30% 또는 비이온; 및 약 7% 내지 약 20%의 물을 포함한다.
리포좀 조성물은 본 발명의 올리고펩타이드를 포함하는 조성물로 유용하다. 이러한 조성물은 잘 알려진 방법에 의해 본 발명의 올리고펩타이드를 포함하는 조성물과 다이팔미토일포스파티딜 콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine), 콜레스테롤 및 물과 같은 인지질을 혼합함으로써 얻어질 수 있다. 리포좀을 형성하기위해 적합한 조성물의 표피 지질은 인지질로 대체할 수 있을 것이다. 그 다음 리포좀 제조는 리포좀 조성물을 만들기 위해서 상기에서 언급한 국소 조성물(예를 들어, 젤 또는 물안의 지질 유탁액)중 하나와 결합시킨다. 국소적으로 적용되는 리포좀의 다른 조성물 및 약물학적 이용의 예는, Mezei(1985) Topics in Pharmaceutical Sciences, Breimer 등., eds., Elsevier Science, New York, N.Y., pp.345-358에서 설명하고 있다.
본 발명의 올리고펩타이드를 포함하는 조성물의 양은 적용 목적, 제제의 형태, 유효성분의 종류등에 따라 적합하게 선별할 수 있다. 예를 들면, 본 발명 명세서의 실시예에서 명확하게 보여주는 양을 인용해서 결정 할 수 있다. 예를 들면, 조성물의 유효성분, 즉, 본 발명의 올리고펩타이드의 양은 성인 한명당 하루에 일반적으로 약 1 ㎍/㎏/day 내지 약 10 ㎎/㎏/day 의 범위안에 들며, 어떤 실시예에서는, 약 10 ㎍/㎏/day 내지 약 1 ㎎/㎏/day, 다른 실시예에서는, 약 100 ㎍/㎏/day 내지 약 500 ㎍/㎏/day, 다른 실시예에서는, 약 200 ㎍/㎏/day 내지 약 400 ㎍/㎏/day의 범위안에 들어간다. 어떤 실시예에서는, 낮은 범위의 양은 적어도 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ㎍/㎏/day는 되어야 한다. 다른 실시예에서는, 낮은 범위 및 높은 범위는 독립적으로 선별해서, 높은 범위는 600, 700, 800, 900 ㎍/㎏/day, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ㎎/㎏/day 이상은 되어야 한다.
항체
본 발명은 전기 항체가 이 분야에서 잘 알려진 기술에 의해 올리고펩타이드의 검출, 정량 결정, 분리 또는 정제에 유용하며 본 발명의 올리고펩타이드와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 특이적으로 본 발명의 올리고펩타이드와 결합하는 다클론 항체 그리고 단클론 항체 및 그의 단편은 본 발명에 포함되며 통상의 방법에 의해 만들어 질 수 있다.
본 발명은 또한 성체 성장 기간 또는 태아 발생 기간동안 특이적으로 발현하는 상피의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체을 포함한다. 이러한 단클론 항체는 이 문서 실시예에서 설명하는 본 발명의 올리고펩타이드의 모발성장 촉진활성을 분석하기 위해 사용할 수 있다.
이러한 단클론 항체의 예는 이 문서의 실시예에 기술되어 있는 단클론항체 mAb27이다. 단클론 항체 mAb27을 생산하는 융합세포종은 산업기술 종합연구소내 특허 및 생물소재센터에 기탁번호 FERM P-18578로 2001년 11월 2일에 기탁되었다. 본 특허 명세서에서 사용한 용어 "항체"는 단클론 항체 뿐만 아니라 다클론 항체도 포함되며 또한 그 항체의 단편도 포함된다. 본 발명에 의하면, 상피의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원을 특이적으로 인식하는 단클론 항체의 단편이 포함된다. 항체의 단편은 기능적 단편이 선호되며 이것의 예는 F(ab')2및 Fab'이다.
F(ab')2및 Fab'는 펩신(pepsin) 또는 파파인(papain)과 같은 단백질분해효소(protease)를 가지고 면역글로블린(immunoglobulin)을 처리함으로써 얻을수 있으며 접번 지역(hinge region)의 H-사슬사이에 존재하는 이황화물(disulfide) 결합 전 및 후의 위치에 그것의 분해에 의해서 생산되는 항체 단편이다.
예를 들면, IgG1에 파파인을 처리했을때, 분열은 접번 지역의 두개의 H-사슬사이에 존재하는 이황화물 결합의 위쪽 부분에서 일어나며 C 말단 부위에 이황화물 결합에 의해 결합되어있는 VL(L 사슬 가변 부위) 및 CL(L 사슬 불가변 부위)을 포함하는 L 사슬과 VH(H 사슬 가변 부위) 및 CHγ1(H 사슬 불가변 부위의 γ1) 을 포함하는 H 사슬단편과 같은 동종의 항체 단편이 만들어 진다. 이러한 두개의 동종의 항체 단편을 Fab'라고 명명한다. 추가로, IgG에 펩신을 처리하면, 분열은 접변 지역의 두개의 H-사슬사이에 존재하는 이황화물 결합의 아래쪽 부분에서 일어나며 상기에서 언급한 두개의 Fab'가 접번 지역에서 연결되어있는 것보다 더 큰 항체 단편이 만들어 진다. 이러한 항체 단편을 F(ab')2라 명명한다.
본 발명의 항체는, 즉 고체 담체와 같은 불용성 담체에 고정된 고정화 항체 또는 표지화 물질로 표지화한 항체로써 이용할 수 있을 것이다. 이러한 모든 고정화된 항체 및 표지화한 항체는 본 발명의 범주안에 포함된다.
고정화한 항체는 물리적 흡착, 화학적 결합등에 의해 불용성 담체에 운반되는 상태의 항체이다. 이러한 고정화한 항체는 샘플(모발, 상피의 신생 소낭 또는 그것의 추출물과 같은 것)에 포함되는 항원(즉, 본 발명의 올리고펩타이드 또는 상피의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원) 또는 검출, 정량 결정, 분리 또는정제에 이용될 것이다. 항체의 고정을 위해 사용하는 불용성 담체의 예는 다음과 같은 것을 포함한다. (1) 플레이트(plate), 시험 튜브 또는 튜브, 또는 비드(beads), 볼(ball), 필터(filter), 막(membrane)등과 같은 내부용적을 가지는 컨데이너로 각각은 폴리스틸렌 수지(polystyrene resin), 폴리카보네이트 수지(polyacarbonate resin), 실리콘 수지(silicone resin) 또는 나일론 수지(Nylon resin)를 포함하는 플라스틱 또는 유리와 같은 물에 불용성 물질로 만들어진다. (2) 셀룰로오즈 기본 담체(cellulose based carrier), 아가로오즈 기본 담체(agarose based carrier), 폴리아크릴아마이드 기본 담체(polycarbonate based carrier), 덱스트란 기본 담체(dextran based carrier), 폴리스틸렌 기본 담체(polystyrene based carrier), 폴리비닐 알콜 담체(polyvinyl alcohol carrier), 폴리아미노산 담체(polyamino acid carrier) 또는 다공성의 실리카 담체(porous silica based carrier)와 같은 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)에 이용되는 불용성 담체가 포함된다.
표지화한 항체는 표지화 물질로 표지화한 항체를 말하며 이러한 표지화한 항체는 실시예(모발, 소낭 또는 그것의 추출물과 같은)에서 말하는 항원(즉, 상피의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원)의 검출 또는 정량 결정에 이용될 것이다. 그것의 존재가 물리적 결합, 화학적 결합등에 의해 항체와 결합함으로써 검출될 수 있으면 본 발명에 사용될 표지화하는 물질에는 특별한 제한이 없다. 표지화하는 물질의 예는 효소(enzyme), 형광(fluorescent) 물질, 화학 발광(chemiluminescent) 물질, 비오틴(biotin), 아비딘(avidin) 또는 방사선 동위원소(radioactive isotope)를 들 수 있다. 상세한 예는 효소에는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase) β-D-갈락토시데이즈(galactosidase), 글루코오즈 옥시데이즈(glucose oxidase), 글루코오즈-6-포스페이트 디하이드로겐에이즈(glucose-6-phosphatase dehydrogenase), 알코올 디하이드로겐에이즈(alcohol dehydrogenase), 말레익산 디하이도로겐에이즈(malic dehydrogenase), 페니실린에이즈(penicillinase), 카탈레이즈(catalase), 아포글루코오즈 옥시데이즈(apoglucose oxidase), 유레이즈(urease), 루시퍼레이즈(luciferase) 또는 아세틸알콜린 에스테레이즈(acetylcholine esterase); 형광 물질에는 형광 아이소티오시아네이트(isothiocyanate), 피코빌릭(phycobilic) 단백질, 지구상에 드문 금속 킬레이트(rare earth metal chelate), 덴실 클로라이드(dansyl chloride) 또는 테트라메틸 로담닌 아이소티오시아네이트(tetramethylol rhodamine isothiocyanate); 방사선 동위원소에는3H,14C,125I 또는131I; 비오틴; 아비딘; 및 화학냉광 물질과 같은 것을 포함한다. 항체에 표지화 물질을 결합하는 방법에 관해서는 글루타알데하이드(glutaraldehyde) 방법, 말레이마이드(maleimide) 방법, 피리딜 이화황물(pyridyl disulfide) 방법 및 페리오딕산(periodic acid) 방법과 같은 잘 알려진 방법을 시용할 것이다.
여기서, 각각의 방사선 동위원소 및 형광 물질은 스스로 검출가능한 신호를 발생시킬수 있지만 반면에 효소, 화학 냉광물질, 비오틴 및 아비딘은 스스로 검출신호를 만들수 없으므로 검출 가능한 신호를 하나 또는 그 이상의 다른 물질(들)과의 반응결과로써 발생시킨다. 예를 들면, 효소의 경우에는, 적어도 하나의 기질이 필요하며 효소활성을 측정하는 방법(비색계(colorimetric) 방법, 형광 방법, 생냉광(bioluminescent) 방법, 화학냉광 방법)에 따라서 다양한 기질을 사용한다. 비오틴의 경우에는, 적어도 아비딘 또는 효소-결합 아비딘을 함께 반응하는것이 일반적이다. 필요하다면, 상기에서 언급한 기질에 따라 다양한 색을 내는 물질을 사용 할 수 있다.
단클론 항체를 생산하는 융합세포종
본 발명은 또한 이 문서에 기술된 상피세포의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원을 특이적으로 인식하는 단클론 항체를 생산하는 융합세포종을 제공한다. 본 발명의 단클론 항체는 전기 융합세포종을 이용해서 생산할 수 있다.
상피세포의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원을 특이적으로 인식하는 본 발명의 단클론 항체을 생산하는 융합세포종의 제조 과정은 하기에서 설명하고 있다.
첫째로, 포유동물에서 성장기간의 피부 및/또는 성장기간의 수염의 소낭으로부터 수집된 모발로부터 추출된 단백질과 같은 면역원을 이용해서 면역성을 주면 그것에 의해서 동물체에 항체-생성 세포가 만들어진다. 비록 포유동물의 종류에는 특별한 제한이 없지만, 일반적으로는 생쥐(mouse), 쥐(rat), 소, 토끼, 염소 및 양을 포함하며, 바람직하게는 생쥐, 쥐 및 토끼와 같은 설치류이며, 더 바람직하게는 생쥐 또는 쥐를 선호한다. 생쥐를 예로 들면, A/J 주, BALB/C 주, DBA/2 주, C57BL/6 주, C3H/He 주, SJL 주, NZB 주 또는 CBA/JNCrj 주를 말한다. 세포주가 같은 주의 골수종으로부터 유도된 이래로 선호되는 BALB/C 생쥐를 융합세포종의 제조에 이용하기로 결정했다.
본 발명에서 성장기간의 피부 및/또는 성장기간의 수염의 소낭으로부터 수집된 모발로부터 추출된 단백질을 면역원으로 이용한다. 본 발명의 단일클론 항체에 의해 인식되는 상피세포의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원을 포함한다면 어떤 물질이든 면역원으로 이용할 수 있다.
면역화 하기 전에, 면역원은 면역반응을 강화시키기 위한 보조제(adjuvant)와 혼합시킬 것이다. 보조제의 예는 BCG,Propionibacterium acnes, 등의 세포체 및 세포벽 및 트리할로오즈 다이콜레이트(trihalose dicholate)와 같은 체서포구성성분(somatic component)의 내독소인 리포폴리싸카라이드(lipopolysaccharide) 및 지질 A 분획;β-글루칸(glucan);뮤라밀 다이펩타이드(muramyl dipeptide, MDP); 베스타틴(bestatin); 레바미졸(levamisole)과 같은 합성 구성성분(synthetic compound);타이머스(thymus) 호르몬, 타이머스 호르몬 및 타프트신(taftsin)의 지질 요소(lipid factor)와 같은 생구성성분(biocomponent)으로부터 유도된 단백질 또는 펩타이딕(peptidic) 물질; 및 그것의 혼합물(완전한 풀리운드(Freund) 보조제와 같은) 뿐만 아니라 오일안의 물형태 유탁액(불완전한 풀리운드 보조제와 같은), 물안의 오일안에 물 형태 유탁액, 물안의 오일형태의 유탁액, 리포좀, 알루미늄 하이드록사이드 젤(aluminum hydroxide gel), 실리카(silica) 보조제, 파우더형의 벤토나이트(powdery bentonite) 및 텝피오카(tapioca) 보조제가 포함된다. 이러한 보조제는 투여 경로, 양, 투여 기간등에 따라 면역반응의 증가 또는 억제에 효과적이다. 덧붙이면, 보조제의 종류에 따라, 혈액안의 항체 생성에 있어서 항원, 세포면역의 유도, 면역글로블린의 종류등과 같은 것의 차이점이 발견된다. 따라서, 면역반응의 목적에 따라 적합한 보조제를 선택해야 한다. 보조제의 처리 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있다.
포유동물의 면역화는 이 분야 기술로 잘 알려져 있는 방법에 따라 실행했다. 예를 들면, 항원은 포유동물의 피하, 피내, 정맥 또는 복강내에 주입한다. 면역반응이 면역화 하려는 동물의 종류 및 형태에 따라 다르기 때문에, 면역화 계획을, 사용하려는 동물에 따라 적합하게 디자인했다. 항원의 투여는 초기 면역화이후에 몇번 더 반복적으로 실행했다. 추가 면역은 예를 들면, 초기 면역화를 실행한 후 사주 후, 육 주후 및 반년후에 실행하였다.
면역화 이후에, 포유동물의 혈액을 수집하고 수집된 혈액은 포유동물체의 소낭에 대항하는 항체의 생산를 확인하기 위해 모발 소낭-결합 활성의 존재를 분석했다. 이러한 분석 방법은 효소결합항체법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA) 및 형광항체방법과 같은 잘 알려져 있는 방법을 포함한다.
소낭-결합 항체의 생산을 확인한 후, 특이적인 항체 생산의 능력을 가지는 면역세포가 세포융합에 적합한 상태에 만들어지도록 추가면역(추가로 면역원 주입)을 실행하는게 좋다. 비록 추가 면역에 투여되는 면역원의 양에는 특별히 제한을 두지 않지만, 초기 면역양의 약 4배 내지 5배가 좋다. 일반적으로, 추가면역은 면역원의 유탁액 및 불완전 풀리운드 보조제을 이용해서 실행된다. 투여경로는 피하, 피내, 정맥, 복강내 투여등중 적합한 방법을 선별한다.
최후의 면역후에는, 면역화한 포유동물로부터 비장세포을 절개해서 골수종으로부터 유도된 세포주와 함께 세포융합을 시켰다. 세포융합에는 높은 증식잠재력을 가지는 세포주를 이용하는것이 좋으며 골수종으로부터 유도된 세포주는 포유동물로 부터 유도된 융합될 비장세포와 화합성을 가지는 것을 이용하는것이 바람직하다. 생쥐의 골수종으로부터 유도된 세포주의 예는 P3U1, P3X63-Ag8.653, Sp2/O-Ag14, FO.1, S194/5, XX0BU.1, P3/NS1/1-Ag4-1등이 포함된다,
세포융합은 이 분야 기술로 잘 알려진 방법을 이용해 실행할 것이다. 세포융합방법의 예는 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol) 방법, 센다이(Sendai) 바이러스를 이용한 방법, 및 전기 흐름(electric current)을 이용한 방법이 포함된다. 일반적인 방법은 1988에 콜드 스프링 하보 실험실의 에드 하로우 데이비드 레인의 실험서의 항체부분(Antibodies, A Laboratory Manual by Ed Harlow David Lane, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory)을 참고한다.
이러한 결과에 의해 융합된 세포는 이 분야에서 잘 알려진 조건에 의해 증식시킬 수 있다. 적합한 융합세포는 생산된 항체와의 결합능력에 따라 선별한다.
융합된 세포로 부터의 항체의 적합한 항원과의 결합능력은 이 분야에서 잘 알려져 있는 방법에 따라 분석한다. 본 발명에서, 원하는 세포주는 융합된 세포와높은 결합능력을 가지며 그리고 상피세포 신생소낭의 항원과 특이적인 항체를 생산하는 능력을 선별함으로써 클로닝한다. 항체의 결합 능력은 항체 생산의 확인을 위해서 상기에서 언급한 동일한 방법인 효소결합항체법, 방사면역측정법 및 형광항체방법으로 분석할 수 있다. 효소결합항체법은 간단하고 높은 감수성을 가지기 때문에 선호되는 방법이다.
융합된 세포의 클로닝은 이 분야에서 알려진 방법으로 실행할 것이다. 클로닝 방법은 제한 희석 방법(limiting dilution), 반고형한천배양(soft agar) 방법등이 포함된다. 작동법이 쉽고 높은 재현성을 가지기 때문에 제한희석 방법을 선호한다. 세포융합으로 얻어진 많은 융합세포로부터 유용한 세포를 효과적으로 선별하기위해서는 세포의 선별이 클로닝 초기단계에 이루어져야 바람직하다. 이러한 방법으로 적합한 결합능력을 가지는 항체을 생산하는 융합세포주를 선별 할 수 있다.
상기에서 언급한 단일클론 항체를 생산하는 선별된 세포주를 큰 규모로 배양함으로써, 소낭에 특이적인 많은 양의 단일클론 항체를 생산할 수 있다. 단일클론항체-생산 세포주의 큰 규모의 배양 방법은 생체내(in vivo) 및 실험실내(in vitro) 배양방법이 포함된다. 큰 규모의 생체내 배양의 예는 융합된 세포를 증식시키기 위해 복강내로 주입하는 방법으로 항체가 복부(abdominal)의 수종(dropsy), 즉 복부의 복수(ascites)내에서 생산되도록 하는 방법이다. 실험실내의 배양법에는, 융합된 세포를 배지에서 배양하며, 항체를 배지에서 생산하는 방법이다.
본 발명의 단일클론 항체는 큰 규모의 배양 또는 이 분야에서 알려진 방법으로 배양배지의 상등액에서 얻어진 복부 수종에서 분리할 수 있다. 정제를 위해서는, DEAE 음이온-교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 분별증류법, PEG 분별증류법, 에탄올 분별증류법등의 방법를 적당하게 결합해서 이용할 수 있다. 본 발명의 항체는 약 90%의 순수도, 바람직하게는 약 95%의 순수도, 더 바람직하게는 98%의 순수도로 정제하는 것이 바람직하다.
모발성장 촉진활성의 평가 방법
추가로 본 발명은 상피세포의 신생소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원 또는 그 항체의 단편과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체을 이용해서 실행하는 면역분석(immunoassay)으로 특징을 나타내는 모발성장 촉진활성의 평가을 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 적어도 하기의 단계(a)-(c)를 포함하는 것이 바람직하다.
(a) 살아있는 조직으로부터 유리된 피부 조직을 본 발명의 올리고펩타이드와 같은 시험할 물질이 있는 조건에서 배양.
(b) 전기 피부조직의 회복 및 상피세포의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원 또는 그것의 항체 단편과 특이적으로 결합하는 단클론 항체와 배양; 및,
(c) 피부조직단편과 반응하는 전기 단클론항체 또는 그의 단편을 검출 또는 측정.
상피세포의 신생소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원과 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 통해 알수 있는 모발성장 촉진인자의 평가방법은 항체를 이용한 분석법 또는 다른 말로 하면, 면역분석법이라면 어느 방법이든지 가능할 것이다. 즉,본 발명은 상피세포의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원의 존재가 모발성장과 관계하고 있는 것을 특징으로 하며, 이 분야에서 잘 알려진 기술인 면역분석으로 측정하기 위해 상피세포의 신생소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원 또는 항체의 단편과 특이적으로 결합하는 단클론 항체의 이용이 포함된다. 이러한 면역분석법의 예는 웨스턴 블러팅, 효소결합항체법(ELISA), 형광면역분석법, 방사면역측정법(RIA), 발광면역분석법(luminoimmunoassay), 면역효소분석법, 면역형광분석법, 면역탁도측정법(immunoturbidimetry), 라텍스 응집 반응, 라텍스 탁도측정법, 적혈구 응집 반응 및 입자 응집 반응을 들 수 있다.
본 발명의 방법을 이용할 시험 물질의 형태에는 제한이 없으며 시험 물질은 본 발명의 올리고펩타이드와 같은 올리고펩타이드 또는 낮은 분자 유기 화합물도 가능하다. 예를 들면, 에피몰핀의 아미노산 서열의 부분을 가지는 올리고펩타이드를 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 모발성장 촉진활성의 평가방법은 효소결합항체법, 형광면역분석법, 방사면역측정법 또는 발광면역분석법과 같은 표지화한 항체을 이용한 면역분석법으로 측정했으며, 또한 이것은 샌드위치 방법(sandwich method) 또는 컴피티션 방법(competition method)으로 수행 할 수도 있다. 샌드위치 방법의 경우에는, 적어도 하나의 고체상 항체 및 표지화한 항체가 본 발명의 단클론 항체이어야 한다.
고체상 담체에 의하면, 고정된 항체과 관계있는 불용성 담체의 특이적인 예로써 본 발명명세서에서 설명하고 있는 담체를 사용할 것이다. 또한 표지화한 물질에는, 표지화할 항체와 관계가 있는 본 발명명세서에서 설명하고 있는 물질을 이용할 것이다.
측정방법은 알려진 방법으로 실행할 것이다(1998년에 린소 리오리 칸코카이(Rinsho Ryori Kankokai)에 의해 출판되고 일본사회의 임상병리학회에서 편집한 린소비오리(Rinsho Byori)의 특별부 53호인 "Immunoassay for Clinical Tests-Technique and Application"; 1987년에 아이카꾸 소인(Igaku Shoin)에 의해 출판된 3차부이며 이지 이시까와(Eiji Ishikawa)등에 의해 편집된"Enzyme-Linked Immunosorbent Assay"; 및 1987년에 고리추 셥판(Kyoritsu Shuppan)에 의해 출판되고 투니히로 키타가와(Tsunehiro Kitagawa)등에 의해 편집된 탬파쿠신츄(Tampakushitsu), 카쿠산(kakusan), 코소(Koso)의 부록본 제 31호인 "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay").
예를 들면, 고체상 항체는 샘플과 반응하고 동시에 항체를 표지화 하거나 또는 샘플과 반응하고, 세척한 후, 표지화한 항체와 반응함으로써 고체상 항체-항원-표지화한 항체 복합물을 형성한다. 다음에, 결합되지 않은 표지화한 항체는 세척에 의해 분리되며 샘플안의 항원의 양은 결합된 표지화한 항체의 양으로 측정할 수 있다. 특별히, 효소결합항체법(ELISA)의 경우에, 표지화한 효소는 적합한 조건하에 기질과 반응하고 반응생성물의 양을 광학 방법에 의해 측정한다. 형광면역분석법의 경우에는, 형광물질로 표지화 함으로써 형광의 강도를 측정하며, 방사면역측정법의 경우에는, 방사활성물질로 표지화함으로써 방사선양을 측정한다. 발광면역분석법의 경우에는, 발광반응계에서 냉광의 양을 측정한다.
본 발명에 의한 검출 및/또는 정량 결정을 위한 방법에서, 면역탁도, 라텍스 응집 반응, 라텍스 탁도, 적혈구 응집 반응, 입자 응집 반응등에 의해 면역 복합체생산물의 응집이 광학 방법에 의해 투과되는 빛 또는 산란되는 빛을 측적함으로써 확인하거나 또는 눈으로 측정할때, 용매로써 인산 완충액, 글라이신 완충액, 트리스 완충액, 좋은 완충액등을 사용할 수 있으며 폴리에틸렌 글라이콜 또는 비특이적 반응 억제제와 같은 반응 촉진제을 포함 할 수도 있다.
항체를 고체상 담체를 가지고 감광성을 주기위해 사용할 경우에는, 고체상 담체로써 폴리스틸렌(polystyrene), 스틸렌-부타디닌(styrene-butadiene), 코다량체, 메트 아크릴레이드(meth acrylate) 다량체, 라텍스, 젤라틴, 리포좀, 미세켑슐, 적혈구, 실리카, 알루미나(alumina), 카본 블렉(carbon black), 금속 화합물, 금속, 세라믹 또는 마그네틱 물질과 같은 물질로 만들어진 입자를 사용할 것이다.
감광화(sensitization) 방법은 생리적 흡착, 화학결합 또는 그것의 혼합과 같은 알려진 방법을 포함한다. 측정방법은 알려진 방법으로 실행될 것이다. 예를 들면, 광학 방법에 희한 측정의 경우에는, 샘플을 항체 또는 고체상 담체를 가지고 감광시킨 항체와 반응한다. 다음에는, 투과되는 빛 또는 산란되는 빛을 엔드-포인트(end-point) 방법 또는 레이트(rate) 방법으로 측정한다.
눈으로 측정을 할때는, 샘플을 플레이트(plate) 또는 마이트로타이터(microtiter) 플레이트와 같은 컨테이너에서 고체상 담체로 감광화한 항체와 반응시킨다음 응집상태를 눈으로 판단한다. 눈으로 측정하는것 대신에, 마이트로플레이트 판독기(microplate reader)와 같은 장비를 이용해 측정할 수 있다.
모발성장 촉진활성의 평가 키트
시험할 물질의 모발성장 촉진활성을 평가하는데 이용한 본 발명의 키트는 상피세포의 신생소낭 또는 그의 단편에 존재하는 약 220 kDa의 항원을 특이적으로 인식하는 단클론 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 상피세포의 신생소낭 또는 그의 단편에 존재하는 약 220 kDa의 항원을 특이적으로 인식하는 단클론 항체는 고정화 또는 표지화한 형태일 것이다.
예를 들어, 상피세포의 신생소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원을 특이적으로 인식하는 본 발명의 단클론 항체를 제일의 항체로 이용할때, 본 발명의 키트는 추가로 항원-항체 반응에 의해 형성된 복합물을 검출하기 위한 제이의 항체를 포함한다. 본 발명의 키트는 추가로 이러한 항체를 첨가하는것 뿐만아니라 다양한 보조제도 포함하고 있으므로 전기 키트는 효과적이며 쉽게 이용될 수 있다. 보제제를 예로 들면, 고체의 제이 항체를 녹이기 위한 용해제, 불용성 담체를 세척하기 위해 사용하는 세제, 항체를 표지화 하기 위해 효소를 사용할 경우 효소활성을 측정하기 위한 기질, 반응정지제등과 같은 면역학적 측정을 위한 시약이 포함된다. 본 발명의 키트는 또한 모발성장 촉진활성의 측정을 실행시키기 위한 지도방법을 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 라이브러리 벡터의 제조
융합된 세포로써 대장균의 표면에 약 10개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 표면단백질(invasin)(Nakajima등.,Gene, 260,121-131(2000))과 함께 표출시키기 위해 벡터를 사용하였다. 모든 BstX1 위치를 변이 키트(Takara)을 이용해서 제거하고, 프로모터 부위는 PL프로모터롤 대체하며 티오레독신(thioredoxin) cDNA의 아미노산 2-36개를 인바신(invasin) cDNA의 C-말단 위치에서 결합시켰다. 추가로, 결합된 부분의 티오레독신의 33번째 시스테인에서 36번째의 시스테인 부위를 벡터를 만들기 위해 TCCGGTCCGCCATCACGTTGGCTCGAGCCAGGATATTGGGGTCCGTGA(서열번호 125)로 대체하였다(pALinvThio4로 나타냄).
HA 에피톱을 암호화하는 두 가닥의 cDNA를 이 벡터의 BstX1 위치의 구조안으로 삽입하고 얻어진 벡터는 대장균 GI724에 삽입하였다. 얻어진 주는 하기의 실시예 3에 첫번째 와 두번째 스크리닝에서의 유사한 방법으로 실험하였다. 그 결과, 이러한 대장균주는 항-HA 항체와 결합하는것이 확인되었다. 모델로 삽입된 HA 에피톱 펩타이드는 세포표면에 표출된다는 것을 확인하였다.
실시예 2: 대장균 표면에 표출되는 라이브러리의 제조
하기와 같은 올리고펩타이드가 합성되었다:
1. 5' CTG CAG AAC CAT CAC GTT GGagTatTgaG caG agTtgTgaTcaG gaTgaGC CAG GAT ATT GGA TGC AT 3' (서열번호 126),
2. 5' CTG CAG AAC CAT CAC GTT GGagT atT gaGcaGagT tgT gaT caGgaT gaG C CAG GAT ATT GGA TGC AT 3' (서열번호 127),
T,G,a,t,g및c는 하기를 말한다.
T: T:G=17:3
G: T:G=3:17
a: A:T:G:C=7:1:1:1
t: A:T:G:C=1:7:1:1
g: A:T:G:C=1:1:7:1
c: A:T:G:C=1:1:1:7
상기의 올리고펩타이드 1 및 2를 동일한 양으로 혼합하고 프라이머(5' ATG CAT CCA ATA TCC TGG 3')(서열번호 128)와 결합시켰다. DNA를 클레노우 단편을 이용해서 연장시키고 제한효소인 BstX1을 가지고 절단하여 원하는 밴드를 폴리아크릴아마니드 젤에서 전기영동한 후 수집하였다. 수집된 DNAs를 SIEQSCDQDA(서열번호142)에서 부분적 아미노산 변이를 가지는 펩타이드 그룹을 암호화한다. 벡터 pALino4를 BstX로 잘라서 BAP(세균성 알칼라인 포스파테이즈)를 가지고 처리하며, 다음엔 상기에서 얻은 라이브러리 단편과 연결시켰다.
수득된 벡터는 펩타이드 라이브러리(3.8 × 106)와 같은 EPM pep7로 나타나는 형질전환체를 제조하기 위해 대장균 GI724의 전기 컴피턴트(electro competent) 세포안에 형질전환시켰다. 도 3은 라이브러리에 존재하는 이론값 백분율(%)을 보여준다.
펩타이드 라이브러리와 같은 EPM pep7를 나누어서 LB 한천 플레이트에 배양시키고 100 군락(colonies)을 무작위로 찍어서 이러한 플라즈미드를 나누어서 수집하고 분석하였다. 그 결과, 아미노산서열 SIEQSCDQDE 생쥐의 pep7 부위를 포함하는)에서 1 내지 3개의 아미노산이 치환된 펩타이드가 존재한 약 30 %의 군락이 발견되었다. 추가로, 상기에서 제조한 라이브러리의 조성의 분석결과로서, 치환된 아미노산의 위치 및 형태가 무작위로 발견되었다(도 2). 도 2는 100 클론의 분석결과를 보여준다.
실시예 3: 일차 및 이차 스크리닝
펩타이드 라이브러리(3.8 × 106의 라이브러리 수)와 같은 EPM pep7은 100 ㎍/㎖의 트립토판을 첨가해서 30 ℃에서 6시간동안 노출시켜 유도했고 10 ㎍의 토끼 항-에피몰핀 항체(에피몰핀 활성을 중화시키는 단클론 항체; 1998년에 히라이(Hirai)등의J.Cell.Biol., 140:159-169)로 미리 코팅된 35 ㎜ 접시(dish)에 첨가하며 블러킹 용액(1 % 탈지우유, 150 mM NaCl, 1 % α-메틸 만노사이드(α-methyl mannoside)를 가지는 IMC 배지)으로 저지시킨 후 1시간 동안 방치하였다. 세척액(1 % α-메틸 만노사이드(α-methyl mannoside)를 가지는 IMC 배지)을 첨가한 후 접시를 100 rpm에서 5 분간 세척하였다. 세척을 5 번 반복 실행하였다. 세척한 후, 결합된 클론을 수집하였다. 결합된 클론의 회복율을 측정하기 위해 플레이트에 넣고, IMC 배지(Invitrogen; 트립토판을 포함하지 않은 대장균 배양 배지), 30 ℃에서 12 시간 배양하였다.
밤새 배양한 후 일차 스크리닝한 클론은 상기에서와 같은 방법으로 트리토판을 첨가함으로써 발현을 유도하였다. 이차 스크리닝을 위한 접시는 EMP pep7과 친화력을 가지는 것만 정제한 10 ㎍의 쥐 H12 항체를 가지고 코팅을 했으며, 모발성장 촉진활성이 없는 각각의 제조합 H1-72, H1-73△, H1-78, H1-79를 25 ㎍(하기를 참조)(총 100 ㎍)을 포함하거나 또는 그것의 각각의 다양한 부위의 합성 펩타이드 4 ㎍(총 16 ㎍)을 포함하는 블러킹 용액을 가지고 저지하였다. 일차 스크리닝과 같은 방법으로, 발현이 유도된 클론을 접시에 첨가하고 세척하였다. 결합된 클론을 회복율을 측정하기 위해 나누어서 플레이트에 깔았으며 IMC 배지에서 30 ℃로 12시간 배양하였다.
일차 및 이차 스크리닝 모두다, 벡터 pALinvThio4(삽입된 것이 없는)가 삽입된 세포를 대조군으로 사용하였다. 상기의 조건에 의한 수집율(collection ratio)은 라이브러리을 이용한 경우와 비교해서 일차 스크리닝에서 1/100 보다 적으며 이차 스크리닝은 1/50 보다 적다. 이렇게 해서 얻어진 라이브러리의 수는 2.5 × 105이다.
실시예 4: 대규모제조를 위한 벡터로의 재조합
① 높은 활성 재조합 에피몰핀, SRαEPM(Hirai 등,(1994)Eur.J.Biochem., 225, 1133-1139)의 대구모제조를 위한 벡터를 HindⅢ로 절단하고, 말단을 T4 폴리머레이즈(polymerase)를 가지고 평활(blunt)말단으로 만들었다. 전기 벡터의 HindⅢ 효소 부위를 제거여 자가-연결(self-ligation)되도록 제조하였다.
② 변이 삽입 키트(TAKARA)를 상기의 ①번에서 얻은 벡터에 삽입된 에피몰핀 SIEQSCDQDE을 암호화하는 서열의 바로 위쪽에 위치하고 있는 AAGCTG를 AAGCTT(HindⅢ의 효소 부위)로 대체하는데 이용하였다.
③ 생쥐 에피몰핀의 SIEQSCDQDE의 바로 아래쪽의 "NGN to C-terminal of 12 fragment(Eur.J.Biochem., 225, 1133-1139)"을 암호화하는 cDNA를 HindⅢ 효소 부위를 가지는 형태로 PCR 방법으로 제조하고, 이러한 cDNA를 상기의 ②번에서 제조된 벡터의 HindⅢ 위치에 삽입하였다. 벡터안에 삽입된 에피몰핀은 12개 단편으로 구성되어있으며, 펩타이드 7이 결여되고, 거기에 HindⅢ 효소 부위가 부가되었다.
④ AgCTTCCATCACgTTggTCTAgACCAggATATTggA(서열번호 135) AggTAgTgCAACCAgATCTgg TCCTATAACCTTCgA(서열번호 136)을 화학적으로 합성해서 제조한 다음 70-50℃에서 그것을 결합시키고, 상기의 ③에서 제조된 벡터의 HindⅢ 위치에 HindⅢ 효소 부위를 HindⅢ-BstX1-Xbal-BstX1-HindⅢ로 바꾸기 위해 삽입하였다.
⑤ 일단의 플라즈미드는 이차 스크리닝에 의해 수득된 대장균 그룹(30℃에서 밤새배양함)에서 수집하며 BstX1위치를 잘라서 얻어진 pep7-유사 펩타이드 그룹을암호화하는 cDNA를 상기의 ④에서 제조된 벡터의 BstX1XbaIBstX위치에 삽입하였다.
⑥ 수득된 펩타이드 그룹을 대장균 HB101에 나누어서 클로닝하고 15개의 클론을 시험하였다. 그 결과, 모든 클론이 pep7 부위안의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 에피몰핀 12개의 단편을 암호화하는 서열을 가진다는 것이 밝혀졌다.
⑦ 상기 ⑤번에서 수득된 플라즈미드 그룹을 변이된 pep7을 포함하는 에피몰핀 단편 유전자 그룹을 얻기 위해 NspV/PvuⅡ를 처리하였다. 이러한 단편을 N-말단에 6개의 His를 가지는 에피몰핀 12 단편의 대규모제조를 위해서 벡터 pet12의 NspV-SmaⅠ위치(Hirai등.,J. Cell. Biol., 2001, 153, 785-794)에 삽입하였다(대규모 제조용 라이브러리라 함).
⑧ 이렇게 해서 얻어진 플라즈미드 그룹을 대장균 BL21에 나누어서 클로닝시키고 단백질 발현 및 각 클론의 내부서열을 시험하였다. 그 결과, 모든 클론이 IPTG에 의해 단백질 발현의 유도 및 pep7 부위가 다른 펩타이드로 치환된 에피몰핀 단편을 보여주고 H12의 C-말단 부터 PvuⅡ위치까지의 부위가 결여됨을 확인하였다. 대량규모 발현을 위한 2.5 ×105의 대규모 제조용 라이브러리를 제조하였다.
실시예 5: pep7-유사 펩타이드의 제조
① 대규모 제조를 위한 라이브러리를 대장균 BL-21에 삽입하고 LB-아가로오즈(agarose, Amp포함한) 플레이트에 도말하였다. 다음날, 라이브러리를 플레이트에서 LB가 들어가 있는 96-웰(well) 플레이트의 각 웰에 클론하고 동시에 마스터(master) 플레이트를 준비하였다. 플레이트를 32℃에서 12시간 배양한 후 2시간 동안 1 mM(최종 농도) IPTG를 처리하였다. 다음에는, 각 웰에 His-tag 단백질을 퀴아젠(Qiagen)의 방법에 따라 Ni-NTA(Qiagen)와 결합하는 형태로 수집하였다. 하기에서 상세하게 설명하기로 한다.
플레이트를 2000 rpm에서 15분간 원심분리를 하고 배양액을 제거하였다. 2 ㎎/㎖의 농도인 라이소자임(lysozyme)을 50 ㎕을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 1시간 동안 배양하였다. 액체질소에서 냉동건조하고 상온에서 녹이는 과정을 두번 반복하였다. 웰에 DNAse를 처리하고 모든 단백질을 8 M 유레아(urea)(pH 8.0) 150 ㎕에 녹였다. 8 M 유레아를 가지고 평형화한 Ni-NTA 젤(Qiagen)을 첨가한 후 30분간 배양하였다. 플레이트를 2000 rpm에서 1 분간 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 각 웰을 PBS로 두번 세척하고 한번은 물을 이용해 세척하였다.
② 트립신(염기서열 분석 등급; Promega)을 최종 농도가 1 ㎍/㎖로 각 웰에 처리하고 37 ℃에서 12 시간동안 배양하였다.
③ 플레이트를 95 ℃에서 5분간 처리한 후, 용액을 모으고, 동일한 양의 2 ×DH10(10 % FCS을 보충해서 DMEM 및 Ham 12(Gibco)을 혼합한 배양액)을 샘플로 제조하기 위해 용액에 첨가하였다. 액체 크로마토그래피를 이용해서 분석함으로써, 샘플사이의 차이가 pep7 부위의 변이라는 것을 확인하였다. 또한, 각 클론의 염기서열을 마스터 플레이트를 이용해서 분석하였다.
실시예 6: 신생 소낭에 특이적인 단클론 항체의 제조
성장단계의 생쥐인 B57BL로 부터 모발을 수거해서 8 M 유레아, 2 % SDS 및 100 mM DTT을 포함하는 PBS에 37 ℃로 12시간 배양하였다. 추가로, 생쥐의 B57BL의 수염 소낭을 입체현미경으로 모으고 PBS로 균질화시켰다. 상기의 2개의 샘플(단백질 무게 0.5㎎)을 혼합하고 마이셀(micelle)을 제조하기 위해 동일한 양의 완전한 보조제를 첨가하였다.
상기에서 얻은 마이셀(0.2㎎)을 면역화하기 위한 쥐(Wister)의 피하에 투여(3 위치)하였다. 일차 면역을 시킨후, 추가면역은 상기와 같은 방법으로 수행하고, 2 주 후에, 이차 추가면역을 상기와 같은 방법으로 수행하였다. 이차 추가 면역후 3일째 되는 날에, 면역화한 쥐로 부터 비장을 분리하고, 혈액세포를 메쉬(mesh)를 가지고 수집하였다. 항체를 생산하는 세포는 이러한 혈액세포를 포함한다. 상기에서 수집한 모든 혈액세포를 폴리에틸렌글라이콜 1500을 이용해서 쥐의 골수종 P3U1과 혼합하고 Dulbecco/Hum F12혼합 배지에 부유시켰다. 100 ㎕ 배지를 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 다음날, 같은 양(100 ㎕)의 HAT 배지(시그마)를 각 웰에 첨가하였다. 이틀이 경과한 후, 각 웰에서 배지 150 ㎕를 흡입(aspiration)을 이용하여 제거하고, 150 ㎕의 새 배지를 각 웰에 첨가하였다. 96-웰 플레이트는 37 ℃, CO2배양기에서 배양하였다. 쥐 B57BL의 자라는 수염의 소낭을 초음파처리을 이용해서 8M 유레아에 용해하였다. 나이트로셀루로오즈 막을 이 용액에 5분간 담근후 PBS로 각 웰을 세척하였다. 상기의 막을 가지는 바이오레드 닷 블러터(Biorad dot blooter)을 상기의 96-웰 플레이트의 각 웰에서 수거된 융합세포종 상등액의 일차 스크리닝을 실행하기 위해 사용하였다. 첫째로, 상기에서 제조된 나이트로셀루로오즈 막을 5% 탈지유를 포함하는 트리스 완충액을 가지고 블럭시킨 다음에 100 ㎕의 융합세포종 상등액을 나이트로셀루로오즈 막이 바닥에 있는 각 웰에 첨가하였다. 1 시간동안 배양한 후, 각 웰을 트리스 완충액으로 세척하고, 호스라디쉬 퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase)로 표지화된 항-쥐 IgG(1 ㎍/㎖ ) 이차 항체를 첨가하였다. 발색 물질인 ECL 제(아머샴파마시아)를 첨가하고, 수염소낭과 반응하는 총 50 개의 항체를 발색 검출에 의해 선별하였다(일차 스크리닝).
상기의 일차 스크리닝에서 선별한 50개의 항체중, 자라는 수염소낭의 동결부분(10 ㎛)과 특이적으로 반응하는 항체를 선별하였다(이차 스크리닝). 명확하게, 자라는 수염소낭의 동결부분을 슬라이드 글라스에 놓고, 일차 스크리닝에서 선별된 융합세포종 상등액을 그 위에 첨가하며, 이차 항체를 가지고 발색을 유도하였다. 더 명확하게 말하면, 크라이오스댓(Cryosdat, Bright)를 가지고 제조한 자라는 수염소낭의 동결부분을 -20 ℃에서 메탄올처리하고, 1시간동안 TBST를 가지고 블러킹을 시킨후 다음엔 1시간동안 융합세포종 상등액을 가지고 반응시켰다. 이 샘플을 트리스 완충액을 가지고 세척하고, FITC-표지화한 항-쥐 IgG(TBST에 100 ㎍/㎖)를 가지고 반응시켰다. 이 샘플을 트리스 완충액을 가지고 세척하고, 커버글라스를 이용해서 덮은 다음, 형광현미경으로 관찰하였다.
이차 스크리닝의 결과로, 8개의 항체를 선별하였다. 이러한 항체는 표피와 반응하지 않으며 특이적으로 소낭과 반응한다. 이러한 8개의 항체를 한정적으로 희석함으로써 클론화하였다. 이러한 8개 항체의 재활성은 샘플의 성장기 수염소낭(아나젠단계) 또는 휴지기 수염소낭(텔로젠) 및 태어난지 14일 경과한 태아 생쥐로 부터 분리된 소낭을 가지는 피부 슬라이드 샘플을 이용해서 웨스턴 블러팅(Western Blotting)을 이용해서 실험하였다. 실험 결과, 성장기 수염 소낭 및 플라스틱 소낭(신생 소낭)과 특이적으로 반응하며 휴지기 수염 소낭과는 반응하지 않는 단클론항체인 mAb27을 수득하였다. 단클론항체 mAb27을 생산하는 융합세포종을 산업기술종합연구소내 특허 및 생물소재센터(초우-6, 1-1, 히가시 1-초미, 추쿠바-시, 아이바라키-켄, 일본, Chou-6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan)에 기탁번호 FERM P-18578로 2001년 11월 2일에 기탁하였다.
도 12(A)는 웨스턴 블러팅으로 항원 mAb27의 검출결과를 보여준다. 왼쪽은 수염의 아나젠에서 텔로젠으로부터 추출한 각 단백질을 분석한 결과를 보여주며, 등쪽 피부의 아나젠 및 텔로젠을 전기영동 및 웨스턴 블러팅을 한 후 본 발명의 단일클론 항체 mAb27을 이용해서 항원을 검출하였다.
명확하게는, 8M 유레아에서 초음파를 이용해 수염소낭을 갈아서 얻은 용액을 희석하지 않고 항원으로 이용하였다. 전기영동은 SDS-PAGE(아크릴아마이드 4 내지 20%)를 30 mA로 일정하게 전기 흐름을 주는 조건하에서 실행하였다. 러닝(running) 완충액은 글라이신 14.4 g/L, 트리스 1 g/L 및 SDS 1 g/L를 가지고 제조하였다. 전기영동한 후, 샘플은 PVDF 막에 옮긴 후, 탈지유 5%를 포함하는 트리스완충액(TBST)에 1 시간동안 배양하였다. 그 다음에는, mAb27(융합세포종 상등액 100 ㎕)과 1시간동안 반응시키고, TBS로 잘 세척한 후 이차 항체인 펄옥시데이즈로 표지화한 항-쥐 IgG(아머샴)(1 mg/ml의 TBST에 녹임)를 가지고 반응시켰다. 세척한 후, mAb27과 반응하는 감도를 ECL 키트(아머샴)을 이용해서 측정하였다.
결과는, 본 발명의 단클론 항체 mAb27 아나젠 샘플에 특이적으로 존재하는 약 220 kDa을 검출하였다.
도 12(B)는 성체 모발의 조직학적 염색의 결과를 보여주고, 도 12(C)는 14일 된 생쥐 배아의 턱을 보여준다. 이 과정은 실시예 1에서 항체의 이차 스크리닝의 과정에서와 동일하다.
결과로는, 본 발명의 단클론항체 mAb27을 이용한 경우에, 성체의 모발에서 표피는 염색이 되지 않았으며 단지 모발의 모근이 염색되었고, 14일된 생쥐의 배아의 턱에서 표피는 염색되지 않았고 단지 모발 소낭만 염색되었다.
도 12(A)-(C)에서 보듯이, 본 발명의 단클론항체 mAb27은 신생소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원을 특이적으로 인식한다는 것을 알 수 있다.
실시예 7: 모발성장 촉진활성의 평가
ICR 마우스(임신 14일) 등쪽 피부를 핀셋으로 벗겨내고 HCMF에 수집하였다. 수집한 피부를 플레이트에 옮기고 고정해서 두개의 칼을 이용해서 조각으로 절단하였다. 절단된 피부를 15 ml 원심분리용 튜브에 옮기고, 1000 rpm에서 1초간 원심분리하였다. DNase 50 ㎕(2 mg/ml)를 침전물에 첨가하고 혼합물을 균질화시켰다. 10 ml의 DH10 배지를 침전물에 넣고 혼합물을 현탁하고, 온합물을 팁을 이용해서 균질화되도록 현탁한 후에 현탁액 100 ㎕를 각 96-웰 플레이트에 넣었다.
96 웰 플레이트의 현탁액안에 상기의 실시예 5에서 얻은 각 샘플 50 ㎕를 각각 첨가하고, 그 플레이트를 CO2배양기에 37 ℃에서 이틀동안 배양하였다. 배양하는 동안 건조되는 것을 막기위해, 각 웰 사이의 공간에 PBS를 채우고 플레이트를 쌓아 놓았다. 배양한 후, 8M 유레아 100 ㎕를 첨가하였다.
TBS로 적신 종이 및 나이트로셀루로오즈 막을 닷 블러터(96 웰, Biorad, USA)에 올려놓았다. 각 장비를 세개 셋트 준비하고, 모든 표피를 검출하기 위해, 단클론항체 mAb27 및 항-E-카드허린(cadherin,타카라)용으로, 두개의 막에 10 ㎕씩 넣었다. 흡입을 통해 막안에 용액을 블러팅시킨 후, 막을 제거하고 상온에서 10분간 건조시켰다. 막을 TBS로 한번 세척하고 상온에서 1시간동안 탈지유로 블러킹시켰다. 이후에는, 막을 일차 항체인 단클론 항체 mAb27(융합세포종 배양 상등액을 1/30으로 희석했다) 또는 항-E-카드허린(1/2000으로 희석, 타카라)을 가지고 상온에서 1시간동안 배양하고, 각 막을 10분간, 두번씩 TBS로 세척하였다. 그 이후에, 퍼옥시데이즈로 표지화된 항-쥐 IgG또는 퍼옥시데이즈로 표지화된 항-토끼 IgG(아머샴)(1/1000으로 희석)를 이차 항체로서 반응시키고, 막을 10분간, 두번씩 TBS로 세척하였다. 반응의 감도는 ECL 플러스를 이용해서 분석하였다.
실시예 8: 결과 분석
ECL에 의해 검출된 자동-필름을 퓨지 사진 필름 발광이미지 분석기(Fuji Photo Film Luminoimage analyzer, LAS-1000plus)을 이용해서 올렸다. 단클론항체 mAb27의 항원의 양을 신생 소낭유도의 인덱스로써 페널 A로 부터 측정했고 E-카드허린의 양은 표피세포의 총수를 인덱스로써 페널 B로부터 측정하였다.
페널 A 및 B로 부터 얻은 측정양의 비율을 컴퓨터를 통해 분석했고 표피세포당 모발성장유도정도를 분석하였다.
총 960개 샘플의 분석 결과에서, 샘플은 페널 A로 부터 측정된 양이 페널 B로 부터 측정된 양보다 더 높다는 결론을 얻을 수 있었다(예, 신생소낭을 유도하는 높은 능력을 가지는 샘플). 각 샘플중 65 개 샘플의 pep7-유사 서열을 표 Ⅰ에 나타내었다. 또한 이러한 65 클론의 아미노산 서열구조의 필요조건을 이 문서의 표 Ⅱ에서 나타내었다.
페널 B의 측정 양보다 높은 페털 A의 측정양을 표 Ⅲ에 나타내었다. 이러한 샘플의 아미노산 서열은 :
Tyr Asn Glu Gln Ser Cys Asp Arg Glu Glu (서열번호 17)
Thr Ser Asp Gln Cys Cys Asp Pro Asp Lys (서열번호 75)
Pro Ser Glu Gln Ser Cys Ala Glu Glu Glu (서열번호 61)
Ser Asn Glu Gln Ser Cys Ala Val Ala Glu (서열번호 29)
Thr Thr Glu Gln Ser Cys Ala Val Asp Glu (서열번호 63)
Ser Ile Glu Gln Ser Cys Gly Gln His Glu (서열번호 80)
Ser Ser Ala Gln Ser Cys Leu Gln Asp Thr (서열번호 48)
Tyr Ile Glu Gln Tyr Cys Asp Gln Asp Glu (서열번호 64)
Thr Ile Trp Gln Ser Cys Asp Gln Glu Glu (서열번호 32)
이러한 펩타이드의 활성은 쥐의 에피몰핀의 pep7 부위의 아미노산 서열 Ser Ile Glu Gln Ser Cys Asp인 펩타이드보다 약 3배 높다.
65개 클론중 아미노산 서열 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp을 가지는 7개의 아미노산 잔기의 펩타이드이다. 따라서, 이러한 7개의 아미노산은 모발성장 촉진활성에 필요한 부위임을 알 수 있다.
65개 클론중, Cys 잔기는 다른 아미노산과 치환하지 않고 따라서 Cys잔기는 본 발명의 올리고펩타이드에서 중요하다는 것을 알수 있다. Cys 잔기를 포함하는 단량체는 적합한 조건하에서 이량체화 할 수 있는 능력을 가질 것이다.
65개 클론중, 아미노산 서열 Glu-Gln-Ser-Cys-Asp (서열번호 108)는 비교적 높게 보존되고(예, 23개 클론이 보존) 아미노산 서열 Glu-Gln-Ser-Cys (서열번호 109)도 추가로 높게 보존된다(예, 30개 클론이 보존).
실시예에서, 신생소낭을 유도의 높은 능력을 가지는 65개 펩타이드 클론은 960 개 샘플에서 수득하였다. 2.5 ×105펩타이드 클론은 실시예 3에서 보여주는 이차 스크리닝에서 수득했고, 상기의 65 개 클론이외의 것중 같은 능력을 가지는 펩타이드도 그 안에 포함시킬 수 있다. 어떤 실시예에서, 7 개의 아미노산 잔기중 3개의 아미노산 잔기가 치환 될 것이다. 만약 각각의 아미노산의 후보 아미노산이 8 개의 형태로 구성된다면, 혼합 총 수는7C3×83=17920과 같이 계산한다. 라이브러리 2.5 ×105에서 17920 클론의 비율은 7.1 %이다. 다른 말로 하면, 960 샘플에서 65 개 클론의 비율은 6.8 %이다. 상기에서 언급된 가정은 여기서 사용한 응용의 실시예의 결과와 잘 일치한다(스크리닝에서 명확하게 나온 펩타이드의 비율).
표 Ⅱ에서 제공한 시열을 기초로, 하기의 올리고펩타이드가 모발성장 촉진활성을 나타낼것이라고 예상할 수 있다:
SIDQSCD (서열번호 110)
SIEESCD (서열번호 111)
SIEQACD (서열번호 112)
SIEQSCR (서열번호 113)
SIEQFCH (서열번호 114)
SFDQSCD (서열번호 115)
SFEESCD (서열번호 116)
SFEQACD (서열번호 117)
SFEQSCR (서열번호 118)
SFEQFCH (서열번호 119)
실시예 9: 변경된 올리고펩타이드
하기와 같은 아미노산 서열을 가지는 올리고펩타이드 (A), (B), (C) 및 (D)는 Fmoc을 이용해서 고체상 방법으로 합성하였다.
A. Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu (서열번호 120)
B. Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu (서열번호 121)
C. Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu (서열번호 122)
D. Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln (서열번호 83)
합성된 올리고펩타이드는 동종이량체를 만들기 위해 교차-연결제(피어스에서 생산한 비스말레이마이드 헥산(bismaleimide hexane), 상표 이름 BMH)를 이용해서 이량체화하였다. 명확하게, 이러한 합성은 이러한 교차-연결제에 포함된 방법에 따라 실행하였다.
수득된 반응 혼합물은 동종이량체 올리고펩타이드 뿐만 아니라 교차-연결제와 결합하기 위해 단량체 올리고펩타이드도 포함한다.
상기와 같은 방법으로, 올리고펩타이드 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 및 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp (서열번호 4)를 이종이량체 올리고펩타이드를 제조하기 위해 동일한 양을 이용하였다. 수득된 반응 혼합물은 이종이량체 올리고펩타이드 뿐만 아니라 교차-연결제와 결합하기 위해 단량체 올리고펩타이드도 포함한다.
합성된 올리고펩타이드 (A), (B) 및 (C) 각각은 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)로 정제했고 HPLC 및 매스(Mass)를 이용해 정제도가 90% 또는 그이상이 되도록 실험하였다.
HPLC의 조건은 다음과 같다:
컬럼: ODS-UG3(모노머릭 ODS, 노무라 카가구), 직경 1.0 mm, 길이 100 mm
측정: 상온(25℃)
확인: UV 214 nm, 280 nm
용출 용매: 용매 A 및 용매의 그레디언트(용매 A: 0.1% 트리플루오르아세틱 산; 용매 B: 90% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오르아세틱 산, 5 분 후에서 55 분까지 직선 농도 구배)
속도: 75 ml/ml
올리고펩타이드 보유 시간
21.52 분(이량체), 20.59 분(단량체)
실시예 10: 변형 올리고펩타이드의 모발성장 촉진활성 평가
ICR 마우스(임신 12일)의 턱의 피부조직을 입체현미경으로 모으고 다섯마리에서 왼쪽 및 오른쪽 위치에서 각각 수집하였다. 다섯마리의 왼쪽(대조군용) 및 오른쪽(올리고펩타이드 시험용) 피부에서 수집한 각 다섯 조각을 1개의 뉴클레오포어 막(구멍직경 8㎛; 직경 13 mm)에 각각 올려놓고, 입체 현미경을 가지고 샘플을 관찰해서 바깥쪽을 뒤집는 것과 같은 방법으로 고정하였다. 1% BSA를 포함하는 둘베코 MEM/Ham F12배지 500 ㎕을 24 웰 접시의 2개의 웰에 첨가하였다. 용매(PBS)안에있는 시험용 올리고펩타이드를 하나의 웰에 최종 농도 20 uM을 첨가하고, 용매(PBS)를 대조군으로 다른 웰에 동일한 양으로 첨가하였다. 실시예 9에서 합성된 올리고펩타이드를 시험용 올리고펩타이드로 이용하였다.
안에 피부조직을 가지고 있는 각 막을 상기의 웰의 용매위에 띄우고 37 ℃에서 6일간 배양하였다. 조직 다섯 조각을 100 ㎕ SDS 샘플 완충액(SDS 0.02 g/ml, 글라이세롤 0.2 g/ml, pH 6.8)안의 막에서 수거하고 초음파를 처리해서 녹였다. 대조막 또한 같은 방법으로 처리하였다. 이렇게 처리해서 얻은 용액을 SDS-PAGE(아크릴아마이드 4-20 %)로 전기영동(35 mA, 1.5 시간)하고 PVDF 막으로 옮긴후, 탈지유가 5 % 첨가된 트리스 완충액에서 1시간동안 방치시켰다. 이 막을 실시예 2에서 얻은 mAb27(TBST에 10 ㎍/ml)과 1시간 반응시키고 TBS로 잘 세척하였다. 다음엔, 이차 항체로 퍼옥시데이즈 표지된 항-쥐 IgG(아머샴)와 반응시키고, 이 막을 TBS로 잘 세척했다. mAb27 과 반응한 감도는 ECL키트(아머샴)을 이용해서 확인하였다.
이렇게 해서 얻어진 결과는 도 4 및 도 5에서 볼 수 있다.
도 4의 각 레인의 올리고펩타이드는 하기와 같다.
왼쪽에서 첫번째: Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu(A) (서열번호 120)
왼쪽에서 두번째: 대조군
왼쪽에서 세번째: Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu(A) (서열번호 121)
왼쪽에서 네번째: 대조군
왼쪽에서 다섯번째: Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu(A) (서열번호 122)
왼쪽에서 여섯번째: 대조군
도 4에서 보듯이, 왼쪽에서 첫번, 세번 및 다섯번째 레인의 밴드는 각각 왼쪽에서 두번, 네번 및 여섯번째 레인의 밴드보다 더 강하다. 이러한 결과는 시험용 올리고펩타이드 (A), (B) 및 (C)가 모발성장 촉진활성을 가진다는 것을 보여준다.
도 5 의 각 레인의 시험용 올리고펩타이드는 하기와 같다.
왼쪽에서 첫번째: 그것을 처리한 후 올리고펩타이드 (A) 및 올리고펩타이드 (B)를 혼합함으로써 수득된 혼합물.
왼쪽에서 두번째: 대조군
왼쪽에서 세번째: 그것을 혼합한 후 올리고펩타이드 (A) 및 올리고펩타이드 (B)를 처리함으로써 수득된 혼합물.
왼쪽에서 네번째: 대조군
왼쪽에서 다섯번째: Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln(D) (서열번호 83)((b)의 C-말단에 두개의 아미노산이 제거된).
왼쪽에서 여섯번째: 대조군
도 5에서 보듯이, 그것을 처리한 후 올리고펩타이드 (A) 및 올리고펩타이드 (B)를 혼합함으로써 수득된 혼합물과 그것을 혼합한 후 올리고펩타이드 (A) 및 올리고펩타이드 (B)를 처리해서 얻은 혼합물에서 유사한 활성이 관찰되었다. 따라서, 이종이량체 올리고페타이드도 또한 모발성장 촉진활성을 가짐을 알 수 있다. C-말단에 두개의 아미노산이 결실된 올리고펩타이드 (D) 또한 모발성장 촉진활성을 가진다는 것을 확인하였다.
실시예 11
올리고펩타이드의 시스테인잔기가:
Ser Ile Asp Gln Ser Cys Asp (서열번호 110)
Ser Ile Glu Gln Ser Cys Asp (서열번호 111)
Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp (서열번호 112)
Ser Ile Glu Gln Ser Cys Arg (서열번호 113)
Ser Ile Glu Gln Phe Cys His (서열번호 114)
Ser Phe Asp Gln Ser Cys Asp (서열번호 115)
Ser Phe Glu Gln Ser Cys Asp (서열번호 116)
Ser Phe Glu Gln Ala Cys Asp (서열번호 117)
Ser Phe Asp Gln Ser Cys Arg (서열번호 118)
Ser Phe Glu Gln Phe Cys His (서열번호 119)
1, 2 또는 3 아미노산에 의해 위쪽으로 이동한 다양한 올리고펩타이드는 실시예 9에 의해 합성되었고 상기에서와 같은 방법에 의해 모발성장 촉진활성에 관하여 평가하였다.
그 결과, 활성이 있음을 알 수 있었다. 즉, Cys의 위치가 변경되고 아미노산 서열 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp (서열번호 4), Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Cys-Ser-Asp (서열번호 5)가 모발성장 촉진활성을 가지고 있다는 것을 알 수 있다. 이러한 펩타이드의 각 아미노산은 또한 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp의 경우에서와 같이 치환될 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열 Ser Asn Glu Pro Cys Ser Asp Gln Gly Gly (서열번호 24)와 같은 펩타이드는 아미노산 서열 Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp (서열번호 4)의 펩타이드에의 Ile 및 Gln이 Asn 및 Pro로 각각 치환됨으로써 얻어지고 본 특허 명세서에서 보여주는 경우와 같이 이러한 치환을 가지는 펩타이드는 모발성장 촉진활성을 보여줄 것이다라는 것을 알수 있다.
실시예 12: 변형된 올리고펩타이드의 제조
하기와 같은 아미노산 서열을 가지는 올리고펩타이드는 Fmoc를 이용한 고체상 방법에 의해서 합성했다.
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu(pep7 부위를 포함하는). 다음에는 합성된 올리고펩타이드를 교차-연결제의 사용방법에 따라 교차-연결제(피어스에서 생산한 비스말레이마이드 헥산, 상표 명은 BMH)와 반응시켰다. 반응은 올리고펩타이드 및 교차-연결제의 다양한 비율로 실행했다. 도 10A-10C는 젤 투과 컬럼(Gel permeation colume, 아머샴 파마시아, 적정 용액(developing solution)으로 슈퍼덱스TM펩타이드 PC 3.2/30, 250 mM NaCL, 20 mM 나트륨-인산 완충액(pH 7.2)을 사용했다)을 사용해서 올리고펩타이드 및 교차-연결제의 반응생산물을 분석함으로써 얻어진 결과를 보여준다.
도 10의 위쪽 도표에서 액체 크로마토그래피(아머샴 파마시아, 스마트 시스템)를 사용해 분리한 결과와 7:3의 비율로 올리고펩타이드와 비스말레이마이드를 반응시켜 얻은 결과를 보여주고 있다. 피크 (a)는 펩타이드 이량체를 피크 (b)는 반응 말레이마이드를 가지는 펩타이드 이량체를 나타낸다. 피크 (a)는 1.2 ml를 용출시키는 시간과 일치하고 피크 (b)는 1.4 ml를 용출시킬때의 시간과 일치한다.
도 10의 중간에 있는 도표는 2:5의 비율로 올리고펩타이드와 비스말레이마이드를 반응시킬 때 얻어진 결과를 보여준다. 피크 (a)는 펩타이드 이량체를 그리고 피크 (b)는 반응 말레이마이드을 가지는 펩타이드 이량체를 나타낸다. 비스말레이마이드 헥산이 초과된 이후에, 반응 말레이마이드를 가지는 펩타이드 이량체 (b)가 펩타이드 이량체(a)보다 많은 양을 형성했다.
도 10의 아래쪽 도표는 상기의 (B)(즉, 2:5의 비율로 올리고펩타이드와 비스말레이마이드와 반응시켰을 때 얻어지는 샘플)의 샘플이 초과된 상태에서 비-변형된 올리고펩타이드 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu을 첨가하면 얻어지는 샘플의 결과를 보여준다. 피크 (b)는 감소하고 피크 (a)는 증가하는 결과에서, 첨가한 피크 (c)는 이량체(a)를 형성하기 위해 (b)와 반응하는 것을 알 수 있다.
실시예 13: 다양한 올리고펩타이드의 모발성장 촉진활성의 평가
(1) 다양한 올리고펩타이드의 제조
하기의 아미노산 서열을 가지는 올리고펩타이드 (A) 및 (B)는 Fmoc을 이용한 고체상 방법에 의해 합성되었다(이 이후부터, 비변형된 올리고펩타이드로 나타내었다).
(A) Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu (서열번호 142)
(B) Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Lys-Asp-Gln-Asp-Glu (서열번호 123)
합성된 올리고펩타이드 (A)는 교차-연결제의 포함된 실험방법에 따라 교차-연결제(비스말레이마이드 헥산, 상표 이름은 BMH, 피어스가 생산)와 반응시켰다. 또한, 합성된 올리고펩타이드 (B)는 교차-연결제 DSG(다이석시니마이딜 글루타레이트, disuccinimide glutarate)와 반응시켰다. 분획 수집기(fraction collector)를 이용해서, 교차-연결제와 결합된 단량체를 분획하고 수집했다.
(2) 모발성장 촉진활성의 평가
ICR 마우스(임신 12일경과)의 턱의 피부조직을 입체 현미경을 이용해서 모았고 다섯마리로부터 왼쪽 및 오른쪽 면을 각각 수거했다. 다섯마리의 왼쪽(대조군용) 및 오른쪽(올리고펩타이드 시험용) 피부에서 수집한 각 다섯 조각을 1개의 뉴클레오포어 막(구멍직경 8㎛; 직경 13 mm)에 각각 올려놓고 입체 현미경을 가지고 샘플을 관찰해서 바깥쪽을 뒤집는 것과 같은 방법으로 고정했다. 1% BSA를 포함하는 듀베코 MEM/Ham F12배지 500 ㎕을 24 웰 접시의 2개의 웰에 첨가했다. 용매(PBS)안에 있는 시험용 올리고펩타이드를 하나의 웰에 최종 농도 20 uM을 첨가하고 용매(PBS)를 대조군으로 다른 웰에 동일한 양 첨가했다. 상기의 (1)에서 합성한 변형 및 비변형 올리고펩타이드를 시험용 올리고펩타이드로 이용했다.
안에 피부조직을 가지고 있는 각 막을 상기의 웰의 용매위에 띄우고 37 ℃에서 6일간 배양했다. 조직 다섯 조각을 100 ㎕ SDS 샘플 완충액(SDS 0.02 g/ml, 글라이세롤 0.2 g/ml, pH 6.8)안의 막에서 수거하고 초음파를 처리해서 녹였다. 대조막 또한 같은 방법으로 처리했다. 이렇게 처리해서 얻은 용액을 SDS-PAGE(아크릴아마이드 4-20 %)로 전기영동(35 mA, 1.5 시간)하고 PVDF 막으로 옮긴후 탈지유가 5 % 첨가된 트리스 완충액에서 1시간동안 방치했다. 이 막을 실시예 2에서 얻은 mAb27(TBST에 10 ㎍/ml)과 1시간 반응시키고 TBS로 잘 세척했다. 다음엔, 이차 항체로 퍼옥시데이즈 표지된 항-쥐 IgG(아머샴)와 반응시키고 이 막을 TBS로 잘 세척했다. mAb27 과 반응한 감도는 ECL키트(아머샴)을 이용해서 확인했다.
이렇게 해서 얻어진 결과는 도 11 에서 볼 수 있다.
도 11의 각 레인의 시험용 올리고펩타이드는 하기와 같다.
왼쪽에서 첫번째: 비변형 올리고펩타이드(A)
왼쪽에서 두번째: BMH 변형 올리고펩타이드(B)
왼쪽에서 세번째: 비변형 올리고펩타이드(B)
왼쪽에서 네번째: DSG 변형 올리고펩타이드(B)
도 11의 결과로부터 알수 있듯이, 왼쪽에서 두번째 및 네번째 레인의 밴드(변형된 올리고펩타이드)는 각각 왼쪽에서 첫번째 및 세번째 레인의 밴드(비변형 올리고펩타이드)보다 강하다. 이러한 결과를 통해서 변형 올리고펩타이드가 모발성장촉진활성을 가지며 특히 비변형 올리고펩타이드와 대응하는 것보다 높은 모발성장 촉진활성을 가진다는 사실을 알수 있다.
게다가, 변경된 아미노산 서열 및 다양한 교차-연결제를 가지는 올리고펩타이드를 이용해서 모발성장 촉진활성을 상기와 같은 방법으로 평가했다.
결과를 보면, Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu; Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu (서열번호 122): 또는 비스말레이마이드 헥산(BMH), 1,4-비스말레이마이드 뷰탄(BMB) 또는 비스말레이마이드 에탄(BMOE)와 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu를 변형함으로써 수득된 변형된 모든 올리고펩타이드가 모발성장 촉진활성을 보여줌을 확인했다.
실시예 14: 올리고펩타이드 제조
하기의 아미노산 서열 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu(쥐의 pep7 부위를 포함하는)을 가지는 올리고펩타이드는 Fmoc를 이용해서 고체상 방법에 의해 합성했다. 또한, 상기 서열의 N-말단에 비오틴에 의한 변형을 가지는 변형 올리고펩타이드(이 문서에서는 b7으로 나타냄)를 제조하였다.
합성된 올리고펩타이드는 고성능액체크로마토그래피(HPLC)을 이용해 정제했고, HPLC 및 매스(Mass)를 이용해 정제도가 90% 또는 그이상이 되도록 실험했다.
HPLC의 조건은 하기에 언급했다.
컬럼: ODS-UG3(모노머릭 ODS, 노무라 카가구), 직경 1.0 mm, 길이 100 mm
측정: 상온(25℃)
확인: UV 214 nm, 280 nm
용출 용매: 용매 A 및 용매의 그레디언트(용매 A: 0.1% 트리플루오르아세틱 산; 용매 B: 90% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오르아세틱 산, 5 분 후에서 55 분까지 직선 농도 구배)
속도: 75 ml/ml
올리고펩타이드 보유 시간:
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu: 21.52 분(이량체), 20.59 분(단량체)
b7; 29.89 분(단량체), 32.85 분(이량체)
상기에서 제조한 올리고펩타이드를 0.3 mg/ml의 농도로 인산 완충 식염수(PBS)에 녹이고 50 % 에탄올/PBS 용액(0.15 mg/ml)을 만들기 위해 100 % 에탄올을 같은 양으로 이 용액에 첨가했다. 올리고펩타이드의 교차-연결은 하기와 같이 실행하였다. 다이메틸설폭포사이드(dimethysulfoxide, 65㎕)에 녹인 BMH를 1 mg/ml의 올리고펩타이드 용액(PBS)에 최종 농도가 33 ㎍/㎕가 되도록 저으면서 천천히 첨가했고 이 혼합물을 4 에서 12시간 동안 반응시켰다. 이 용액에, 최종 농도가 5 mg/ml이 되도록 5 ml의 PBS에 녹여있는 6.6 ml의 PBS 및 시스테인 하이드로크로라이드를 첨가했고 최종 농도가 0.3 mg/ml에서 S-S 결합 올리고펩타이드(ss7이라 나타냄) 용액(이량체뿐만 아니라 교차-연결제와 결합되어 있는 단량체도 포함됨)을 만들기 위해 혼합했다. 상기에 기술된 조건에서의 실행된 HPLC에 의하면 보유시간은 33.01 분이다. 대조군 용액은 올리고펩타이드 용액대신에 PBS를 이용하는것 이외의 시약을 첨가해서 같은 조건에서 반응시켜 얻었다. 교차-연결된 올리고펩타이드 용액은 또한 최종 농도가 1.5 mg/ml에서 50% 에탄올/PBS용액을 제조하기 위해 동량의 에탄올를 첨가했다. S-S연결 올리고펩타이드는 실시예 15 및 16에서 모발성장 촉진활성을 평가하기 위해 사용했다.
실시예 15: 생체내(in vivo) 방법으로 모발성장 촉진활성 평가
C3H 및 C57BL/6 마우스는 태어난 후 45일부터 50일까지 95일 동안 텔로젠을 보유한다고 알려져 있다. 그들의 모발 주기는 피부 색의 변화, 즉 텔로젠은 핑크에서 회색으로 또는 아나젠은 검은색과 같은 변화를 기초로 쉽게 알 수 있다. 본 발명의 올리고펩타이드의 투여가 텔로젠에서 아나젠으로 이동을 촉진시키는 지의 유무를 확인하기 우한 실험용으로 이 마우스를 사용했다. 7 주 지난(48-50일 지난 암컷) C57BL/6 마우스를 구입했고 등쪽의 모발(약 3 ×2.5 ㎠)을 조심스럽게 피부에 상처를 입히지 않도록 하면서 동물용 전기 면도기를 이용해 면도를 했으며 피부색으로 모발주기가 텔로젠상태인지를 확인했다. 상기와 같은 방법으로 제조된 올리고펩타이드 용액을 각 그룹에 5 마리씩 시험시작후 38일까지 0.2 ml의 양을 일주일에 5일씩 하루에 한번씩 주입했다. 주입은 주사바늘이 없는 주사기를 이용해 실행했다. N-말단이 비오팅화된 다이펩타이드(Ile-Lys) 및 트리펩타이드(Glu-Ile-Lys)를 혼합한 다음에 대조용액을 제조하기 위해 교챠-연결제를 첨가했다.
두 사람이상이(두 사람들) 마우스를 확인하기 위해 육안으로 관찰했으며 모발이 면도 된 부분을 기초로 모발 복원 부분의 비율에 따라 여섯 등급의 점수를 주었다. 같은 방법으로 사진을 찍었다. 모발성장 점수를 하기와 같이 계산했다. 처음에 모발 면도 영역에서 회색 또는 검은색으로의 피부색 변화영역의 비율에 따라 하기의 점수를 주었다; 0-20% :1, 20-40%:2, 40-60%:3, 60-80%:4, 80-100%:5. 각 그룹의 상기점수의 총합을 모발성장 점수로 결정했다. 판결을 위해 한 사람당 모발성장 점수의 최고점수를 50점으로 하였으며 판결이 두 사람에 의해 결정되므로 모발성장 점수의 최고 점수는 100이 된다. S-S 연결 올리고펩타이드(이량체 뿐만 아니라 교차-연결제와 결합한 단량체을 포함한) 및 비오틴화한 올리고펩타이드를 투여한 그룹에서 아나젠으로의 이동은 대조군보다 7일 또는 그이상 빨랐으며 모발 복원은 모발성장까지 어느 때건 촉진되었으며 거의 완벽하게 복원되었다. 비오틴화한 올리고펩타이드를 투여한 그룹은 이황화결합 그룹과 유사하게 대조군 그룹과 비교해서 시험시작으로부터 약 30 일까지 촉진되었다. 이 결과는 도 6 및 7에서 보여준다. 이러한 결과에서 알 수 있듯이, 아미노산 서열 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu를 가지는 올리고펩타이드는 모발성장 촉진활성을 가진다.
실시예 16: 본 발명의 단클론항체를 이용한 모발성장 촉진활성의 평가
본 발명의 항체
ICR 마우스(임신 12일)의 턱의 피부조직을 입체현미경으로 모으고 다섯마리에서 왼쪽 및 오른쪽 위치에서 각각 모았다. 다섯마리의 왼쪽(대조군용) 및오른쪽(올리고펩타이드 시험용) 피부에서 수집한 각 다섯 조각을 1개의 뉴클레오포어 막(구멍직경 8㎛; 직경 13 mm)에 각각 올려놓고 입체 현미경을 가지고 샘플을 관찰해서 바깥쪽을 뒤집는 것과 같은 방법으로 고정했다. 1% BSA를 포함하는 듀베코 MEM/Ham F12배지 500 ㎕을 24 웰 접시의 2개의 웰에 첨가했다. 용매(PBS)안에 있는 시험용 올리고펩타이드를 하나의 웰에 최종 농도 20 uM을 첨가하고 용매(PBS)를 대조군으로 다른 웰에 동일한 양을 첨가했다. 상기의 실시예에서 합성된 S-S연결 올리고펩타이드를 시험용 올리고펩타이드로 이용했다.
안에 피부조직을 가지고 있는 각 막을 상기의 웰의 용매위에 띄우고 37 ℃에서 6일간 배양했다. 조직 다섯 조각을 100 ㎕ SDS 샘플 완충액(SDS 0.02 g/ml, 글라이세롤 0.2 g/ml, pH 6.8)안의 막에서 수거하고 초음파를 처리해서 녹였다. 대조막 또한 같은 방법으로 처리했다. 이렇게 처리해서 얻은 용액을 SDS-PAGE(아크릴아마이드 4-20 %)로 전기영동(35 mA, 1.5 시간)하고 PVDF 막으로 옮긴후 탈지유가 5 % 첨가된 트리스 완충액에서 1시간동안 방치했다. 이 막을 실시예 2에서 얻은 mAb27(TBST에 10 ㎍/ml)과 1시간 반응시키고 TBS로 잘 세척했다. 다음엔, 이차 항체로 퍼옥시데이즈 표지된 항-쥐 IgG(아머샴)와 반응시키고 이 막을 TBS로 잘 세척했다. mAb27 과 반응한 감도는 ECL키트(아머샴)을 이용해서 확인했다.
이렇게 해서 얻어진 결과는 도 13에서 볼 수 있다.
도 13에서, 왼쪽 레인은 실시예 14에서 제조된 S-S 연결 올리고펩타이드(ss7)을 첨가한 샘플의 결과를 보여주고 왼쪽 레인(대조군)은 단지 용매를 첨가한 샘플을 나타낸다. 도 13의 결과로 알수 있듯이, 대조군보다 S-S 연결 올리고펩타이드(ss7)을 첨가한 샘플에서 더 강한 밴드가 검출되었다. mAb27에 의해 인식된 항원의 발현양이 증가했다는 것을 알 수 있다.
이러한 실시예는 ss7이 모발성장 촉진활성을 가진다는 것을 보여준다. 이러한 실시예로부터, ss7이 mAb27 항원의 발현양을 증가시킨다는 것을 알 수 있다. 실시예로부터, 항원 mAb27이 소낭의 항원에 특이적이라는 것을 알 수 있다. 따라서, 항원 mAb27의 증가는 모발성장 촉진활성을 나타내는 지침으로 생각할 수 있다. 즉. 모발성장 촉진활성은 mAb27을 이용해서 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원의 발현을 확인함으로써 평가 할 수 있다.
본 발명의 단클론 항체는 상피의 신생 소낭에 존재하는 항원을 특이적으로 인식할 수 있고, 모발성장 촉진활성을 평가하는데 이용 가능하다.
실시예 17
올리고펩타이드 b7△C1, b7△C2, b7△C3, b7△C4 및 b7△C5는 각각 b7의 C-말단으로부터 하나, 두개, 세개, 내개 또는 다섯개 아미노산이 결실시키면서 합성한 다음에 황화그룹으로 블러킹시켰다. 올리고펩타이드 b7△N1, b7△N2 및 b7△N3은 b7의 N-말단으로부터 한개, 두개 또는 세개의 아미노산을 결실시킴으로써 합성했다. b7△C1는 올리고펩타이드 서열(SIEQSCDQD)로 나타내며; b7△C2는 올리고펩타이드 서열(SIEQSCDQ)로 나타내고; b7△C3은 올리고펩타이드 서열(SIEQSCD)로 나타내며; b7△C4는 올리고펩타이드 서열(SIEQSC)로 나타내고; b7△C5는 올리고펩타이드 서열(SIEQS)로 나타내며; b7△N1은 올리고펩타이드 서열(IEQSCDQDE)로 나타내고; b7△N2는 올리고펩타이드 서열(SQSCDQDE)로 나타내며; b7△N3은 올리고펩타이드 서열(QSCDQDE)로 나타내었다.
아미노산 서열 Lys-Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu을 가지는 올리고펩타이드 bk7(황화 그룹으로 블러킹하지 않은)은 N-말단이 라이신과 결합하지 않도록 합성했다.
인간 케라틴세포(NHEK 세포, 크론티스, 산코 주야구, Ltd에서 구입가능)는 30㎍/㎖ BPE, 0.1ng/㎖ 인간의 EGF, 5㎍/㎖ 인슐린, 0.5㎍/㎖ 하이드로코티존(hydrocortisone), 50㎍/㎖ 젠타마이신(gentamycin) 및 50ng/㎖ 엠포테린(amphoterin)을 포함하는 증식용 배지(Clontics, 크론티스)에서 배양했다. 이러한 세포는 상기의 증식용 배지에서 EGF, 인슐린 및 하이트로코르티존을 제거한 배지에 ml당 1×10세포의 농도가 되도록 다시 현탁한 다음에 100㎕의 현탁액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣었다. 세포를 플레이트에 넣는 동시에, 1㎎/㎖의 올리고펩타이드 5㎕를 최종농도가 50㎍/㎖가 되도록 현탁액에 첨가했다. 16-20시간을 배양한 후, 배양 상등액에 존재하는 IL-8의 양을 엘리자 키트(엔도젠)을 이용해서 측정했다. 표 Ⅳ에서는 NHEK 세포에 의한 IL-8 분비 유도활성과 모발성장 촉진활성사이의 상호관계를 보여준다.
표 IV
올리고펩타이드 IL-8 유도활성

 모발성장활성
b7 ◎
교차-연결된 b7 ◎
 ◎
ss7 ◎
 ◎
대조군 ×
 ×
b7은 SIEQSCDQDE와 같다. ssb7은 교차-연결된 b7을 타나낸다. ss7은 S-S 연결된 및 비오틴화한 올리고펩타이드를 나타낸다.
올리고펩타이드 b7△C1, b7△C2, b7△C3, b7△C4, b7△C5, b7△N1, b7△N2 및 b7△N3의 IL-8유도활성의 평가 결과는 도 8에서 보여준다. N-말단으로부터 하나 또느 그 이상의 아미노산이 결실될때, IL-8의 분비양은 약하게 감소했고 C-말단에서부터 하나 또는 그이상의 아미노산이 결실될때는 IL-8의 분비양이 네개의 아미노산이 결실될때 까지 유지되었다. 이러한 결과에서, 올리고펩타이드 b7과 같이 거의 동일한 모발성장활성이 C-말단으로부터 네개이상의 아미노산이 결실되거나 또는 b7 부위의 N-말단으로부터 세개이상의 아미노산이 결실됨으로써 기대 될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 도 9에서 보여지는 것처럼, 11-량체 올리고펩타이드 bk7또한 올리고펩타이드 b7의 경우에서와 같은 거의 동일한 IL-8 유도활성을 가지고 있다.
실시예 18
쥐의 올리고펩타이드 pep7의 N-말단은 동봉된 실험방법의 지시에 따라 NHS-비오틴 또는 NHC-비오틴(피어스)을 이용해서 비오틴화하였다. NHS-비오틴을 이용할때, -O-CO-(CH2)4-(13.5)을 N-말단 과 비오틴사이의 공간에 삽입했으며, NHS-LC-비오틴을 이용할때는 -O-CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)4-(22.4)를 N-말단과 비오틴사이의 공간에 삽입하였다. IL-8의 분비양은 실시예 17에서와 같은 방법으로 이러한 비오틴화한 올리고펩타이드를 이용해서 결정하였다. 이러한 올리고펩타이드는 올리고펩타이드 b7의 것과 같이 거의 동일한 모발성장 촉진활성을 가진다. 이러한 결과는 N-말단에 직접적으로 비오틴화한 올리고펩타이드는 공간에 의하여 N-말단이 비오틴화한 올리고펩타이드의 것과 거의 동일한 모발성장 촉진활성을 가진다는 사실 및 그것들 모두가 N-말단에 비오틴이 없는 b7 부위와 비교해서 활성이 있다는 것을 보여준다.
본 발명은 형태형성 촉진활성 특히, 모발촉진활성을 가지는 올리고펩타이드를 제공한다. 전기 올리고펩타이드는 동종이량체; 이종이량체; 동종삼량체; 또는 이종삼량체와 같은 다량체이며, 반응물질을 결합한 단량체 형태이다. 본 발명은 또한 상피의 신생 모발 소낭의 220 kDa의 항원을 특이적으로 인식하는 단클론항체; 전기 항체를 생산하는 융합세포종; 및 포유동물 대상에서 모발성장을 분석하기 위한 방법 및 키트를 제공한다.
관련 출원의 상호-참고문헌(cross-reference)
본 출원은 2001년 11월 13일에 일본출원번호 2001-347340, 2001년 11월 13일에 일본출원번호 2001-347338, 2001년 12월 5일에 일본출원번호 2001-371175, 2001년 12월 5일에 일본출원번호 2001-371366으로 출원한 것을 이 문서에 참고문헌으로 포함하며, 우선권으로 주장한다.

Claims (116)

  1. 하기의 아미노산 서열을 포함하며, 모발성장 촉진활성을 가지는, 약 5개 내지 약 104개 사이의 아미노산 잔기 길이의 분리된 올리고펩타이드:

    X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
    X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
    X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
    X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;

    상기에서, X1은 Ser, Ara, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val, Gly, Leu,
    Ile 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드
    로부터 결실되고;
    X2는 Ile, Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe, Leu, Ala, Pro,
    Cys 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부
    터 결실되며;
    X3는 Glu, Lys, Gln, Arg, Ala, Val, Trp, Cys 또는 Asp 잔
    기이고;
    X4는 Gln, Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His, Cys 또는 Lys 잔
    기이며;
    X5는 Ser, Trp, Phe, Phr, Cys, Tyr, Pro, Ala, Gly, Val,
    Leu, Ile 또는 Met 잔기이고;
    X6는 Cys 잔기; 반응성 물질이 결합된(reactive
    substance-bound) Cys 또는 반응성 물질이 결합된 Lys이
    며; 및,
    X7은 Asp, Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr, Arg 또는
    Leu 이거나, 또는 올리고펩타이드가 서열번호 1 또는 서
    열번호 2와 동일하지 않고, Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp
    또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드와 동일
    하지 않는 조건에서 전기 올리고펩타이드로부터 결실된
    다.

  2. 제 1항에 있어서,
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드:

    X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
    X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
    X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
    X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;

    상기에서, X1은 Ser, Tyr, Thr 또는 Pro 잔기이거나, 또는 전기
    올리고펩타이드로부터 결실되고;
    X2는 Ile, Asn, Thr 또는 Ser 잔기이거나, 또는 전기
    올리고펩타이드로부터 결실되며;
    X3는 Glu, Ala, Trp 또는 Asp 잔기이고;
    X4는 Gln 잔기이며;
    X5는 Ser, Cys 또는 Tyr 잔기이고;
    X6는 Cys 잔기; 반응성 물질이 결합된 Cys 또는
    반응성 물질이 결합된 Lys이며; 및,
    X7은 Asp, Ala, Gly 또는 Leu 잔기이거나 또는 올리
    고펩타이드가 서열번호 2와 동일하지 않고,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는 Ser-
    Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드와 동일하지않은 조건에서 전기 올리고펩타이드로부터 결실된
    다.

  3. 하기의 아미노산 서열을 포함하며, 모발성장 촉진활성을 가지는, 약 7개 내지 약 100개 사이의 아미노산 잔기 길이의 분리된 올리고펩타이드:

    X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
    X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
    X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
    X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;

    상기에서, X1은 Ser, Ala, Tyr, Thr, Pro, Phe, Val, Gly, Leu,
    Ile 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부
    터 결실되고;
    X2는 Ile, Gly, Asn, Thr, Val, Ser, Phe, Leu, Ala, Pro,
    Cys 또는 Met 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부
    터 결실되며;
    X3는 Glu, Lys, Gln, Arg, Ala, Val, Trp, Cys 또는 Asp 잔
    기이고;
    X4는 Gln, Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His, Cys 또는 Lys 잔
    기이며;
    X5는 Ser, Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro, Ala, Gly, Val,
    Leu, Ile 또는 Met 잔기이고;
    X6는 Cys 잔기; 반응성 물질이 결합된 Cys 또는 반응성 물
    질이 결합된 Lys이며; 및,
    X7은 Asp, Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr, Arg 또는
    Leu이거나, 또는 올리고펩타이드가 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-
    Cys-Asp 또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드
    와 동일하지 않은 조건에서 전기 올리고펩타이드로부터
    결실된다.

  4. 제 1항에 있어서,
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드:

    X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7;
    X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7;
    X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7; 또는,
    X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7;

    상기에서, X1은 Ser, Tyr, Thr 또는 Pro 잔기이거나, 또는 전기 올리고펩타이드로부터 결실되고;
    X2는 Ile, Asn 또는 Ser 잔기이거나, 또는 전기 올리
    고펩타이드로부터 결실되며;
    X3는 Glu, Ala, Trp 또는 Asp 잔기이고;
    X4는 Gln 잔기이며;
    X5는 Ser, Cys 또는 Tyr 잔기이고;
    X6는 Cys 잔기이며;
    X7은 Asp, Ala, Gly 또는 Leu 잔기이거나, 또는 올리
    고펩타이드 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는
    Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys인 올리고펩타이드와 동일
    하지 않은 조건에서 전기 올리고펩타이드로 부터
    결실된다.

  5. 제 1항에 있어서,
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드:
    T/Y-S/N-E-Q-S-C-A(서열번호 3).

  6. 제 3항에 있어서,
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드:
    T/Y-S/N-E-Q-S-C-A(서열번호 3).

  7. 제 1항에 있어서,
    1개 내지 3개의 아미노산 잔기가 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아
    미노산 서열에서 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번
    째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Glu-Gln-Ser-Cys를 제외한 다른 잔
    기인 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  8. 제 1항에 있어서,
    0개 내지 2개의 아미노산 잔기가 Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서
    열에서 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여
    섯번째 아미노산 잔기인 Glu-Gln-Ser-Cys를 제외한 다른 잔기인 것을
    특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  9. 제 1항에 있어서,
    첫번째 Ser은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 소수
    성 아미노산 잔기 또는 중성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로
    하는
    올리고펩타이드.

  10. 제 1항에 있어서,
    첫번째 Ser은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Ala,
    Tyr, Thr, Pro, Phe, Val 또는 Gly로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  11. 제 1항에 있어서,
    두번째 Ile는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 중성
    아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로
    하는
    올리고펩타이드.

  12. 제 1항에 있어서,
    두번째 Ile은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Gly,
    Asn, Thr, Val, Ser, Phe 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  13. 제 1항에 있어서,
    다섯번째 Ser은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 중
    성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으
    로 하는
    올리고펩타이드.

  14. 제 1항에 있어서,
    다섯번째 Ser은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서
    Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro 또는 Ala로 치환된 것을 특징으로 하
    는
    올리고펩타이드.

  15. 제 1항에 있어서,
    일곱번째 Asp은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 친
    수성 아미노산 잔기인 Gly, Ala 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로
    하는
    올리고펩타이드.

  16. 제 1항에 있어서,
    일곱번째 Asp이 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서
    Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr 또는 Leu로 치환된 것을 특징으
    로 하는
    올리고펩타이드.

  17. 제 1항에 있어서,
    세번째 Glu은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Lys,
    Gly, Gln, Arg, Ala, Val, Asp 또는 Trp로 치환된 것을 특징으로 하
    는
    올리고펩타이드.

  18. 제 1항에 있어서,
    네번째 Gln은 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 Pro,
    Glu, Thr, Arg, Ser, His 또는 Lys로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  19. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Thr
    또는 Tyr로 치환되고, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되며,
    세번째 Glu은 Ala, Asp 또는 Trp로 치환되고, 다섯번째 Ser은 Cys 또
    는 Tyr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  20. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 내지 여섯
    번째 잔기인 Glu-Gln-Ser-Cys를 제외한 1 내지 3개의 아미노산 잔기가
    치환되고, 첫번째 Ser은 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile는 Ser,
    Asn 또는 Thr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp는 Gly, Ala 또는
    Leu로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  21. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 1 개 내지
    3 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또
    는 세번째 내지 여섯번째 잔기인 Glu-Gln-Cys-Ser를 제외한 다른 잔기
    인 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  22. 제 1항에 있어서,
    Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 0 내지 2 개의 아미노산 잔
    기가 치환되고; 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째 내지 여섯
    번째 잔기인 Glu-Gln-Cys-Ser를 제외한 다른 잔기인 것을 특징으로 하
    는
    올리고펩타이드.

  23. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 소수
    성 아미노산 잔기 또는 중성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로
    하는
    올리고펩타이드.

  24. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Ala,
    Tyr, Thr, Pro, Phe, Val 또는 Gly로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  25. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile은 중성
    아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로
    하는
    올리고 펩타이드.

  26. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile은 Gly,
    Asn, Thr, Val, Ser, Phe 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  27. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser은 중
    성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으
    로 하는
    올리고 펩타이드.

  28. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser은
    Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro 또는 Ala로 치환된 것을 특징으로 하
    는
    올리고 펩타이드.

  29. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp은 친
    수성 아미노산 잔기, Gly, Ala 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로 하
    는
    올리고 펩타이드.

  30. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp은
    Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr 또는 Leu로 치환된 것을 특징으
    로 하는
    올리고 펩타이드.

  31. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 Glu은 Lys,
    Gly, Gln, Arg, Ala, Val, Asp 또는 Trp로 치환된 것을 특징으로 하
    는
    올리고 펩타이드.

  32. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 네번째 Gln은 Pro,
    Glu, Thr, Arg, Ser, His 또는 Lys로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고 펩타이드.

  33. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Thr
    또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고,
    세번째 Glu은 Ala, Asp 또는 Trp로 치환되며, 여섯번째 Ser은 Cys 또
    는 Tyr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp가 Gly, Ala 또는 Leu로
    치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  34. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 내지 여섯
    번째 아미노산 잔기인 Glu-Gln-Cys-Ser을 제외한 1 내지 3 개의 아미
    노산 잔기가 치환되고, 첫번째 Ser은 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번
    째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은
    Gly, Ala 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  35. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의 아
    미노산 잔기가 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번째
    내지 여섯번째 잔기인 Glu-Cys-Gln-Ser를 제외한 다른 잔기인 적어도
    하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  36. 제 1항에 있어서,
    Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 0 내지 2 개의
    아미노산 잔기가 치환되고; 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번
    째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Glu-Cys-Gln-Ser를 제외한 다른 잔
    기인 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  37. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 소수
    성 아미노산 잔기 또는 중성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로
    하는
    올리고펩타이드.

  38. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Ala,
    Tyr, Thr, Pro, Phe, Val 또는 Gly로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  39. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile은 중성
    아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로
    하는
    올리고 펩타이드.

  40. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile은 Gly,
    Asn, Thr, Val, Ser, Phe 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  41. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser은 중
    성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으
    로 하는
    올리고 펩타이드.

  42. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser은
    Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro 또는 Ala로 치환된 것을 특징으로 하
    는
    올리고 펩타이드.

  43. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp은 친
    수성 아미노산 잔기, Gly, Ala 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로 하
    는
    올리고 펩타이드.

  44. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp은
    Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr 또는 Leu로 치환된 것을 특징으
    로 하는
    올리고 펩타이드.

  45. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 Glu은 Lys,
    Gly, Gln, Arg, Ala, Val, Asp 또는 Trp로 치환된 것을 특징으로 하
    는
    올리고 펩타이드.

  46. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 다섯번째 Gln은
    Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His 또는 Lys로 치환된 것을 특징으로 하
    는
    올리고 펩타이드.

  47. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Thr
    또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고,
    세번째 Glu은 Ala, Asp 또는 Trp로 치환되며, 여섯번째 Ser은 Cys 또
    는 Tyr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로
    치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  48. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 내지 여섯
    번째 아미노산 잔기인 Glu-Cys-Gln-Ser을 제외한 1 내지 3 개의 아미
    노산 잔기가 치환되고, 첫번째 Ser은 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번
    째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은
    Gly, Ala 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  49. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 1 내지 3 개의
    아미노산 잔기가 치환되고, 치환되는 아미노산 잔기가 Cys 또는 세번
    째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Cys-Glu-Gln-Ser를 제외한 다른 잔
    기인 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  50. 제 1항에 있어서,
    Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 0 내지 2 개의
    아미노산 잔기가 치환되고; 치환되는 아미노산 잔기는 Cys 또는 세번
    째 내지 여섯번째 아미노산 잔기인 Cys-Glu-Gln-Ser를 제외한 다른 잔
    기인 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  51. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 소수
    성 아미노산 잔기 또는 중성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로
    하는
    올리고펩타이드.

  52. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Ala,
    Tyr, Thr, Pro, Phe, Val 또는 Gly로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  53. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile은 중성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로
    하는
    올리고 펩타이드.

  54. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 두번째 Ile은 Gly,
    Asn, Thr, Val, Ser, Phe 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  55. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser은 중
    성 아미노산 잔기 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으
    로 하는
    올리고 펩타이드.

  56. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 여섯번째 Ser은
    Trp, Phe, Thr, Cys, Tyr, Pro 또는 Ala로 치환된 것을 특징으로 하
    는
    올리고 펩타이드.

  57. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp은 친
    수성 아미노산 잔기, Gly, Ala 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로 하
    는
    올리고 펩타이드.

  58. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 일곱번째 Asp은
    Glu, His, Ser, Ala, Gly, Asn, Tyr 또는 Leu로 치환된 것을 특징으
    로 하는
    올리고 펩타이드.

  59. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 네번째 Glu은 Lys, Gly, Gln, Arg, Ala, Val, Asp 또는 Trp로 치환된 것을 특징으로 하
    는
    올리고 펩타이드.

  60. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 다섯번째 Gln은
    Pro, Glu, Thr, Arg, Ser, His 또는 Lys로 치환된 것을 특징으로 하
    는
    올리고 펩타이드.

  61. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 첫번째 Ser은 Thr
    또는 Tyr로 치환되며, 두번째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고,
    네번째 Glu은 Ala, Asp 또는 Trp로 치환되며, 여섯번째 Ser은 Cys 또
    는 Tyr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은 Gly, Ala 또는 Leu로
    치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  62. 제 1항에 있어서,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp인 아미노산 서열에서 세번째 내지 여섯
    번째 아미노산 잔기인 Cys-Glu-Gln-Ser를 제외한 1 내지 3 개의 아미
    노산 잔기가 치환되고, 첫번째 Ser은 Thr 또는 Tyr로 치환되며, 두번
    째 Ile은 Ser, Asn 또는 Thr로 치환되고/치환되거나 일곱번째 Asp은
    Gly, Ala 또는 Leu로 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  63. 제 1항에 있어서,
    Glu-Gln-Ser-Cys-Asp로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1 내지 3 개
    의 아미노산 잔기가 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  64. 제 1항에 있어서,
    Glu-Gln-Cys-Ser-Asp로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1 내지 3 개
    의 아미노산 잔기가 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  65. 제 1항에 있어서,
    Glu-Cys-Gln-Ser-Asp로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1 내지 3 개
    의 아미노산 잔기가 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  66. 제 1항에 있어서,
    Cys-Glu-Gln-Ser-Asp로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1 내지 3 개
    의 아미노산 잔기가 치환된 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  67. 제 1항에 있어서,
    하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 약
    8 내지 약 20 개의 아미노산 잔기를 포함하는 올리고펩타이드:

    Ser-Ile-Glu-Gln-Xaa-Ser-Asp-Gln;
    Ser-Ile-Glu-Xaa-Gln-Ser-Asp-Gln; 및,
    Ser-Ile-Xaa-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln,

    상기에서, Xaa는 Cys 또는 반응성 물질이 결합된 Cys이다.

  68. 제 67항에 있어서,
    하기로 구성된 그룹으로 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩
    타이드:

    Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln;
    Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln; 및,
    Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln.

  69. 제 1항에 있어서,
    전기 올리고펩타이드는 서열번호 3 내지 서열번호 124 중 어떤 하나의
    아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  70. 제 1항에 있어서,
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드:
    Tyr Asn Glu Gln Ser Cys Asp Arg Glu Glu.

  71. 제 1항에 있어서,
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드:
    Thr Ser Asp Gln Cys Cys Asp Pro Asp Lys.

  72. 제 1항에 있어서,
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드:
    Pro Ser Glu Gln Ser Cys Ala Glu Glu Glu.

  73. 제 1항에 있어서,
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드:
    Ser Asn Glu Gln Ser Cys Ala Val Ala Glu.

  74. 제 1항에 있어서,
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드:
    Thr Thr Glu Gln Ser Cys Ala Val Asp Glu.

  75. 제 1항에 있어서,
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드:
    Ser Ile Glu Gln Ser Cys Gly Gln His Glu.

  76. 제 1항에 있어서,
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드:
    Ser Ser Ala Gln Ser Cys Leu Gln Asp Thr.

  77. 제 1항에 있어서,
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드:
    Tyr Ile Glu Gln Tyr Cys Asp Gln Asp Glu.

  78. 제 1항에 있어서,
    하기의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드:
    Thr Ile Trp Gln Ser Cys Asp Gln Glu Glu.

  79. 제 1항에 있어서.
    아미노산 서열은 천연(natural) 아미노산 잔기, 비-천연 아미노산 잔
    기, 또는 그들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  80. 제 3항에 있어서,
    아미노산 서열은 천연 아미노산 잔기, 비-천연 아미노산 잔기, 또는
    그들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  81. 제 1항에 있어서,
    교차-연결제(cross-linking agent)를 이용해서 변형되는 것을 특징으
    로 하는
    올리고펩타이드.

  82. 제 3항에 있어서,
    교차-연결제를 이용해서 변형되는 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  83. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 동종다량체(homopolymer) 및 올리고펩타이드 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys의 동종다량체가 아닌, 제 1항의 올리고펩타이드의 교차-연결에 의하여 수득된 올리고펩타이드 다량체.

  84. 올리고펩타이드 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp 또는 Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys 의 동종다량체가 아닌, 제 3항의 올리고펩타이드의 교차-연결에 의하여 수득된 올리고펩타이드 다량체.

  85. 제 83항에 있어서,
    이량체(dimer)인 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드 다량체.

  86. 제 84항에 있어서,
    이량체인 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드 다량체.

  87. 제 85항에 있어서,
    전기 이량체가 동종이량체인 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  88. 제 85항에 있어서,
    전기 이량체가 이종이량체인 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  89. 제 86항에 있어서,
    전기 이량체가 동종이량체인 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  90. 제 86항에 있어서,
    전기 이량체가 이종이량체인 것을 특징으로 하는
    올리고펩타이드.

  91. 제 1항의 올리고펩타이드를 포함하는 조성물.

  92. 제 3항의 올리고펩타이드를 포함하는 조성물.

  93. 제 67항의 올리고펩타이드를 포함하는 조성물.

  94. 제 68항의 올리고펩타이드를 포함하는 조성물.

  95. 제 83항의 올리고펩타이드 다량체를 포함하는 조성물.

  96. 제 84항의 올리고펩타이드 다량체를 포함하는 조성물.

  97. 제 91항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    조성물.

  98. 제 91항에 있어서,
    경피(transdermal) 투과 강화제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하
    는
    조성물.

  99. 모발성장 촉진에 효과적인 양의 제 91항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 모발성장을 촉진시키는 방법.

  100. 모발성장 촉진에 효과적인 양의 제 92항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 모발성장을 촉진시키는 방법.

  101. 모발성장 촉진에 효과적인 양의 제 93항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 모발성장을 촉진시키는 방법.

  102. 모발성장 촉진에 효과적인 양의 제 95항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 모발성장을 촉진시키는 방법.

  103. 모발성장 촉진에 효과적인 양의 제 96항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 모발성장을 촉진시키는 방법.

  104. 상피세포의 신생 소낭(follicles)에 존재하는 약 220 kDa의 항원을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체 또는 그의 단편.

  105. 제 104항에 있어서,
    상피세포의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원은 태아(fetus)의
    발생기간 또는 성체(imago)의 성장기간 동안에 특이적으로 발현되는
    항원인 것을 특징으로 하는
    단일클론항체.

  106. 산업기술종합연구소내 특허 및 생물소재센터(Patent and Bio-Resource Center of National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)에 기탁 번호 FERM P-18578(FERM BP-8121)로 기탁된 융합세포종(hydridoma)에 의하여 생산된 단일클론 항체 또는 그의 단편.

  107. 제 106항의 단일클론 항체에 의하여 인식되는 항원 또는 그의 단편.

  108. 제 104항의 단일클론 항체를 생산하는 융합세포종.

  109. 제 108항에 있어서,
    산업기술종합연구소내 특허 및 생물소재센터(Patent and Bio-Resource
    Center of National Institute of Advanced Industrial Science and
    Technology)에 기탁 번호 FERM P-18578(FERM BP-8121)로 기탁된 것을
    특징으로 하는
    융합세포종.

  110. 제 108항에 있어서,
    성장기에 포유동물의 피부에서 수집된 모발, 및/또는 성장기 포유동물
    수염의 소낭, 및 포유동물의 골수종(myeloma) 세포로부터 추출된 단백
    질을 포함하는 면역원(immunogen)으로 면역된 포유동물의
    면역세포(immunocytes)를 융합시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여
    생산되는 것을 특징으로 하는
    융합세포종.

  111. 제 108항의 융합세포종을 배양하는 단계 및 전기 융합세포종에 의하여 생산된 단일클론항체를 수집하는 단계를 포함하는, 상피조직의 신생 소낭에 존재하는 약 220 kDa의 항원에 특이적인 단일클론항체의 생산방법.

  112. 하기의 각 단계를 포함하는 모발성장 촉진활성의 평가방법:
    (1) 적합한 조건 및 모발성장 촉진에 효과적인 시간 동안 조사되는 물
    질의 존재하에서 포유동물로부터 유래된 피부조직을 배양하는 단계;
    (2) 단계(1)로 부터 전기 피부 조직을 회수하는 단계;
    (3) 제 106항의 단일클론 항체 또는 그의 단편과 전기 피부조직을 반
    응시키는 단계; 및,
    (4) 피부조직과 반응하는 단일클론 항체 또는 단편을 탐색하는 단계.

  113. 제 112항에 있어서,
    전기 단일클론 항체는 제 109항의 세포융합체에 의하여 생산되는 것을
    특징으로 하는
    방법.

  114. 제 104항의 단일클론 항체 또는 그의 단편을 포함하는 모발성장 촉진활성 평가 키트.

  115. 제 105항의 단일클론 항체 또는 그의 단편을 포함하는 제 114항의 키트.

  116. 제 106항의 단일클론 항체 또는 그의 단편을 포함하는 제 114항의 키트.
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