TWI665217B

TWI665217B - 膠原蛋白衍生胜肽及其用於製備促進生髮組成物之用途

Info

Publication number: TWI665217B
Application number: TW107107723A
Authority: TW
Inventors: 曹知行; 黃嘉嫻; 蕭述文; 黃敏銓; 廖瑩妤
Original assignee: 臺鹽實業股份有限公司
Priority date: 2018-03-07
Filing date: 2018-03-07
Publication date: 2019-07-11
Also published as: TW201938577A

Abstract

本發明係關於一種膠原蛋白衍生胜肽及其用於製備促進生髮組成物之用途，其中膠原蛋白衍生胜肽之序列為SEQ ID NO：1，能抑制氧化壓力誘發之毛囊細胞死亡，促進毛囊真皮乳突細胞生長，以及促進髮幹生長。

Description

膠原蛋白衍生胜肽及其用於製備促進生髮組成物之用途

本發明係關於一種膠原蛋白衍生胜肽及其用於製備促進生髮組成物之用途。

毛髮為生長於表皮的附屬器官，位於皮膚表面的部分稱為髮幹(hair shaft)，而位於皮膚內部的稱為髮根(root)，髮根位於皮膚的真皮層及皮下脂肪層，並且包含毛囊(hair follicle)，毛囊為影響毛髮生長的重要部分。毛囊基部具有一洋蔥造型的構造，稱為毛球(bulb)，毛球含有結締組織的毛乳頭(papilla)以及基質(matrix)，基質內的細胞為毛髮的發生層，為長出新毛髮的細胞。毛髮生長具有週期性，分別為生長期、退化期與靜止期，生長期為健康毛髮生長的時期，退化期時毛囊的細胞分裂速度減緩，而進入靜止期時，毛囊會萎縮，最後導致毛髮掉落。造成毛髮不正常脫落的原因很多，包含營養失調、內分泌變化、疾病、壓力等等皆為可能的成因，由於毛髮不正常脫落會造成外觀上的不美觀，且目前並未有有效的處置方法，故促進毛髮生長或是避免不正常脫髮之組成物或是處置方法仍具有相當大的市場潛力。

中華民國專利第TW I 565467(B)號發明專利為一種刺激毛髮生長之組合物及方法，係包含一種滲透促進劑、百瑪前列腺素(bimatoprost)，其中滲透促進劑可為乙醇、丙二醇、二乙二醇單乙醚、甘油單油酸酯、油酸或芐醇。但是百瑪前列腺素原本為治療青光眼之用藥，其可能具有使皮膚產生色素沉積等副作用，於使用上必須十分謹慎小心。又，目前美國核准使用的生髮藥物米諾地爾(Minoxidil)或非那斯特萊(Finasteride)，雖然可減輕落髮症狀，然而此些藥物會影響使用者之生殖系統，且因對於胎兒有危害，亦不適合孕婦或是準備生育之女性使用。

今，發明人即是鑑於現有促進生髮之物質仍有不足，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，據此研創出本發明。

本發明係關於一種膠原蛋白衍生胜肽及其用於製備促進生髮組成物之用途，係以一胺基酸序列為SEQ ID NO：1之胜肽，用於製備促進生髮組成物。本發明亦關於一種包含胺基酸序列為SEQ ID NO：1之膠原蛋白衍生胜肽的生髮組成物。

於本發明之一實施例中，膠原蛋白衍生胜肽係促進毛囊真皮乳突細胞生長。

於本發明之一實施例中，膠原蛋白衍生胜肽係抑制過氧化壓力誘導之毛囊細胞死亡。

於本發明之一實施例中，膠原蛋白衍生胜肽係促進毛囊髮幹生長。

於本發明之一實施例中，膠原蛋白衍生胜肽係促進Wnt7a(Wnt family member 7a)、Wnt10a(Wnt family member 10a)與Lef1(Lymphoid enhancer-binding factor 1)基因表現。

於本發明之一實施例中，生髮組成物係為液劑、粉劑或氣霧劑其中至少之一者。

第一圖：膠原蛋白衍生胜肽細胞毒性分析圖。

第二圖：膠原蛋白衍生胜肽保護細胞免於氧化壓力分析圖。

第三圖：膠原蛋白衍生胜肽促進髮幹生長分析圖。

第四圖：膠原蛋白衍生胜肽促進髮幹生長顯微鏡照片。

第五圖：膠原蛋白衍生胜肽調控生髮相關基因表現分析圖(一)。

第六圖：膠原蛋白衍生胜肽調控生髮相關基因表現分析圖(二)。

第七圖：膠原蛋白衍生胜肽於過氧化壓力下調控生髮相關基因表現分析圖(一)。

第八圖：膠原蛋白衍生胜肽於過氧化壓力下調控生髮相關基因表現分析圖(二)。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明一種膠原蛋白衍生胜肽及其於製備生髮組成物之用途，係以一胺基酸序列為SEQ ID NO：1之膠原蛋白衍生胜肽，製備一生髮組成物；其中該膠原蛋白衍生胜肽係促進毛囊真皮乳突細胞生長、抑制過氧化壓力誘導之毛囊真皮乳突細胞死亡與促進毛囊髮幹生長，且該膠原蛋白衍生胜肽係進一步促進Wnt7a(Wnt family member 7a)，Wnt10a(Wnt family member 10a)與LEF-1(Lymphoid enhancer binding factor 1)基因其中至少之一的表現。

一、膠原蛋白衍生胜肽

本實驗係以人類第16型膠原蛋白(Collagen type XVI alpha-1 chain，簡稱COL16A1)做為模板，設計出20條膠原蛋白衍生胜肽，該些膠原蛋白衍生多肽係以化學合成方法製得，並進行測試以下測試。進行實驗時，係將膠原蛋白衍生胜肽配置於無菌之二次水中。

二、大鼠毛囊真皮乳突細胞(dermal papilla cells)之分離與培養

使用六週大的Sprague Dawley(SD)大鼠，以二氧化碳犧牲，取大鼠觸鬚外圍皮膚後將鬍鬚一顆顆拔出，並以1 X PBS緩衝液浸泡；挑選數顆鬍鬚，並將鬍鬚底部蓬大處之白色顆粒切下，放置於裝盛有10%胎牛血清(FBS)之DMEM培養液的培養盤，並以器械鈍端壓破白色顆粒；將上述培養盤移至37℃培養箱，於5%二氧化碳的環境下培養；每日觀察細胞生長情形，當細胞生長至八分滿後，便可繼代且進行實驗。

細胞繼代的方法簡述如下：移除培養液，以1 X PBS緩衝液清洗2~3次，加入Trypsin-EDTA溶液；令Trypsin-EDTA溶液均勻覆蓋於細胞，並於37℃培養箱作用3~5分鐘，使細胞自培養盤中脫落；加入含有胎牛血清之培養液以獲得一含有細胞之混合液，並將含有細胞之混合液移入離心管中，以700~800rpm 轉速離心2~3分鐘；移除培養液，再加入新鮮的含10%胎牛血清培養液，將細胞混合均勻後，移至新的培養盤，並於37℃、5%二氧化碳之培養箱進行繼代培養。

三、細胞存活率分析

將上述培養之毛囊真皮乳突細胞，以每孔2000顆細胞之數量培養於96孔培養盤，並加入含有50μg/mL之膠原蛋白衍生胜肽之溶液，於37℃、5%二氧化碳之環境培養3天；第四天加入MTT試劑，繼續培養3小時；加入10% SDS以溶解紫色結晶；將培養盤繼續放回培養箱作用隔夜，並於次日測量對於波長550nm之吸光值(簡稱OD 550)，並計算細胞存活度；將無處理對照組的存活率定義為1，並計算其他組別之細胞相對存活率，計算公式如下：細胞相對存活率=(實驗組OD550-對照組OD550)/對照組OD550)

請參見表一與第一圖，處理胜肽No.18之組別，其細胞存活度與對照組相比有微微上升之趨勢，但是處理胜肽No.7與胜肽No.8者的細胞存活度皆有下降之情形，尤其是胜肽No.8之組別，其細胞相對存活率下降至約0.7。本說明書敘述之膠原胜肽No.18之序列為SEQ ID NO：1，膠原胜肽No.7之序列為SEQ ID NO：2，以及膠原胜肽No.8之序列為SEQ ID NO：3。

四、氧化壓力誘發之細胞死亡

頭皮在日常生活中會因紫外線的照射、以及體內自由基的生成，產生氧化壓力並使毛囊老化而造成落髮；本試驗係以過氧化氫(H₂O₂)處理毛囊真皮乳突細胞以模擬氧化壓力，並測試膠原蛋白衍生胜肽對於細胞相對存活率的影響。請參見第二圖，將對照組之相對存活率定義為1，則以150μM過氧化氫處理細胞後，細胞的相對存活度會下降至0.57，但是同時給予胜肽No.18與過氧化氫之組別，其細胞相對存活率可提升至0.75，表示胜肽No.18可保護毛囊真皮乳突細胞免於氧化壓力誘發之細胞死亡。

五、膠原蛋白衍生胜肽No.18促進毛囊髮幹生長

使用六週大的Sprague Dawley(SD)大鼠，以二氧化碳犧牲，採取大鼠觸鬚外圍皮膚後將鬍鬚一顆顆拔出，並以1 X PBS緩衝液浸泡；挑選數顆完整之鬍鬚，並將鬍鬚剪掉，並留下底部蓬大處之白色顆粒；將白色顆粒放置於24孔培養盤中培養，並給予10μg/mL之胜肽No.18，分別於處理後第0天、第2天、第3天以及第8天使用顯微鏡拍照並測量髮幹(hair shaft)的長度，係將顯微鏡照片以軟體ImageJ量測髮幹長度並記錄，實驗結束後，再將該毛囊處理後第0天量測之結果視為「1」以進行標準化，所得到之結果請參見表二與第三圖；其中，胜肽No.18組的樣本4與樣本5，因為於第8天觀察時毛囊組織已死亡，故無法進行觀察。根據表二與第三圖，給予胜肽No.18之組別，其髮幹生長之情形確實優於對照組，表示胜肽No.18確實具有促進髮幹生長之功效。

再請參見第四圖，為培養後2、4、6天之顯微鏡照片，其中給予胜肽No.18之組別，其髮幹生長之情形明顯優於對照組，表示胜肽No.18確實具有促進髮幹生長之功效。

六、膠原蛋白衍生胜肽No.18對毛髮生長相關基因之影響

將毛囊真皮乳突細胞培養於6孔培養盤，當細胞長至七分滿時，加入胜肽No.18，或是已知的生髮藥物米諾地爾((Minoxidil，簡稱Mx)，並於培養箱中培養，其中胜肽No.18之使用濃度為10μg/mL，Mx之使用濃度為1μM；處理後72小時，收取細胞的RNA，並以反轉錄即時定量聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction)分析生髮相關基因的表現。請參見第五圖，胜肽No.18會促進Wnt7a(Wnt family member 7a)、Wnt10a(Wnt family member 10a)與Lef1(Lymphoid enhancer-binding factor 1)的表現，但是Mx並不會促進此三種基因表現；又，Mx會促進Wnt3a(Wnt family member 3a)、Wnt4(Wnt family member 4)與Wnt10b(Wnt family member 10b)的表現，但是胜肽No.18卻不會提高這三種基因表現，故推測胜肽No.18對細胞的影響與Mx並不相同。再請參見第六圖，胜肽NO.18與Mx皆不會促進Wnt5a(Wnt family member 10a)、Fzd7(Frizzled class receptor 7)、Gsk3b(Glycogen synthase kinase 3 beta)、Dvl2(Dishevelled segment polarity protein 2)與Ctnnb1(Catenin beta 1)的表現，甚至具有抑制該些基因表現的趨勢。

七、膠原蛋白衍生胜肽No.18於過氧化壓力下對基因表現之影響

將毛囊真皮乳突細胞培養於6孔培養盤，當細胞長至七分滿時，加入胜肽No.18，或是已知的生髮藥物米諾地爾(Minoxidil，簡稱Mx)，並於培養箱中培養，其中胜肽No.18之使用濃度為10μg/mL，Mx之使用濃度為1μM；處理後72小時，再加入150μM之過氧化氫，繼續處理24小時；收取細胞的RNA，並以反轉錄即時定量聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction)分析基因的表現。

請參見第七圖，於此環境下，Mx會促進Wnt7a之表現，但是胜肽No.18不會明顯促進Wnt7a表現；又，胜肽No.18會顯著增加Wnt10b之表現，而Mx卻不會顯著影響Wnt10b之表現。此外，胜肽No.18與Mx於氧化壓力下皆不會提高Wnt10a、Lef1、Wnt3a、Wnt4之表現，甚至胜肽No.18會明顯抑制上述四種基因的表現。再請參閱第八圖，於氧化壓力下，Mx對於Wnt5a、Fzd7、Gsk3b、Dvl2 與Ctnnb1的表現量影響不大，但是胜肽No.18會降低Fdz7的表現，以及增加Ctnnb1的表現。

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

1.本發明之胜肽No.18具有促進毛囊細胞生長，並且減緩氧化壓力下毛囊細胞之死亡情形，除了不具細胞毒性外，亦可保護處於壓力狀況下的毛囊細胞。

2.本發明之胜肽No.18確實具有促進髮幹生長之功效，於髮幹生長的實驗當中，給予胜肽No.18之組別與對照相比，髮幹生長情形確實較為明顯。

3.本發明之胜肽No.18，對於生髮相關基因的影響與米諾地爾(簡稱Mx)並不相同，表示本案胜肽No.18與Mx可能係透過不同的機制調控毛髮生長的情形。

綜上所述，本發明膠原蛋白衍生胜肽及其於製備促進生髮組成物之用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便

惟，上述所揭之說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；其；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇

<110> 台鹽實業股份有限公司

<120> 膠原蛋白衍生胜肽及其用於製備促進生髮組成物之用途

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Claims

一種膠原蛋白衍生胜肽，其胺基酸序列係為如SEQ ID NO：1所示之序列，係具有促進生髮之功效。
一種生髮組成物，係包含一膠原蛋白衍生胜肽，其中該膠原蛋白衍生胜肽之胺基酸序列係為如SEQ ID NO：1所示之序列。
如申請專利範圍第2項之生髮組成物，係為液劑、粉劑或氣霧劑其中至少之一者。
一種膠原蛋白衍生胜肽用於製備促進生髮組成物之用途，係以一有效劑量之膠原蛋白衍生胜肽施予一所需個體，以促進毛髮生長，其中該膠原蛋白衍生胜肽之胺基酸序列係為如SEQ ID NO：1所示之序列。
如申請專利範圍第4項之用途，其中該膠原蛋白衍生胜肽係促進毛囊真皮乳突細胞生長。
如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該膠原蛋白衍生胜肽係抑制過氧化壓力誘導之毛囊細胞死亡。
如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該膠原蛋白衍生胜肽係促進毛囊髮幹生長。
如申請專利範圍第4項之用途，其中該膠原蛋白衍生胜肽係促進Wnt7a(Wnt family member 7a)、Wnt10a(Wnt family member 10a)、LEF1(Lymphoid enhancer-binding factor 1)基因表現。