TW202128208A

TW202128208A - 育毛劑

Info

Publication number: TW202128208A
Application number: TW109133131A
Authority: TW
Inventors: 中村荘太; 高橋秀樹; 中池佑紀美; 永谷貴弘; 金澤由紀; 辻孝; 小川美帆
Original assignee: 日商日本安佳榜化妝股份有限公司; 國立研究開發法人理化學研究所
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2020-09-24
Publication date: 2021-08-01
Also published as: JP6956368B2; CN114828872A; KR20220087486A; CN114828872B; US20220387283A1; CN117695372A; JP6956368B6; CN117679486A; WO2021075219A1; JP7186407B2; JP2021193133A; JPWO2021075219A1; JP2021193134A

Abstract

本發明提供一種育毛劑，其為外用劑，係促進頭髮、眉毛及/或睫毛中的毛幹成長，使有助於毛乳頭細胞中的育毛之基因表現亢進而生毛，並發揮提高毛幹伸長速度、提高毛幹最大長度、及增大毛幹直徑之效果。為此，本發明之屬於外用劑之育毛劑中，含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸作為有效成分。

Description

育毛劑

本發明係關於育毛劑。更詳細而言係關於含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之為外用劑之育毛劑。

以人類為首的哺乳動物的改善育毛效果及毛種、毛質之育毛劑等外用劑的需求正在增加。為了改善育毛效果及毛種、毛質，係提出有有助於調節屬於毛生命週期之毛囊週期之有效成分，並作為育毛劑上市。

例如已提出利用米諾地爾(minoxidil)作為育毛劑之有效成分(參照專利文獻1~3等)，經過人類臨床試驗，已有以米諾地爾為有效成分之育毛劑上市。但是，其醫藥用途對於日本國而言僅限於男性中年性脫毛症等，無法滿足眾多要求育毛效果及毛種、毛質之改善效果的消費者需求。

又，已提出利用chiro-肌醇作為育毛劑之有效成分(參照專利文獻4)。但是，專利文獻4所記載之含有chiro-肌醇之外用劑之育毛劑僅對無胰島素抗性之對象有育毛效果，投藥對象者受限。因此，無法滿足眾多要求育毛效果及毛種、毛質之改善效果的消費者需求。

棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸已知可作為化粧品原材料(參照專利文獻5)。但未有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之育毛效果的報告。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

專利文獻1：美國專利第4139619號說明書。

專利文獻2：日本特開昭63-150211號公報。

專利文獻3：日本特開昭63-145217號公報。

專利文獻4：國際公開第2017/188393號。

專利文獻5：日本專利第5028474號公報。

本發明之目的為提供具有優異育毛作用之育毛劑。

本發明人等為了解決上述課題而不斷努力研究，結果發現以棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸為有效成分，藉此可發揮優異育毛活性，從而完成本發明。

為了解決上述課題之本發明之第1手段為一種育毛劑，係含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之外用劑。

為了解決上述課題之本發明之第2手段為如本發明之第1手段所述之育毛劑，其中棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之含量相對於整體為0.001~20重量%。

為了解決上述課題之本發明之第3手段為如本發明之第1或2手段所述之育毛劑，其中棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之含量相對於整體為0.005~10重量%。

為了解決上述課題之本發明之第4手段為如本發明之第1~3手段中任一手段所述之育毛劑，其係含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸而成者，其質量比(棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸/棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸)為99/1~1/99。

為了解決上述課題之本發明之第5手段為如本發明之第1~4手段中任一手段所述之育毛劑，其係用於促進毛幹成長或生毛。

為了解決上述課題之本發明之第6手段為如本發明之第1~手段中任一手段所述之育毛劑，其係用於提升毛幹伸長速度。

為了解決上述課題之本發明之第7手段為如本發明之第1~5手段中任一手段所述之育毛劑，其係用於提升毛幹最大長度。

為了解決上述課題之本發明之第8手段為如本發明之第1~5手段中任一手段所述之育毛劑，其係用於增大毛幹直徑。

為了解決上述課題之本發明之第9手段為如本發明之第1~5手段中任一手段所述之育毛劑，其係用於增加毛數。

為了解決上述課題之本發明之第10手段為如本發明之第1~9手段中任一手段所述之育毛劑，其係溶液。

為了解決上述課題之本發明之第11手段為如本發明之第1~10手段中任一手段所述之育毛劑，其係頭髮、眉毛及/或睫毛用。

為了解決上述課題之本發明之第12手段為一種育毛方法，係對於對象投藥本發明之第1~11手段中任一手段所述之育毛劑。

為了解決上述課題之本發明之其他手段為一種頭皮保養劑，係含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之外用劑。

為了解決上述課題之本發明之其他手段為一種頭皮症狀改善方法，係對於對象投藥含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之為外用劑之頭皮保養劑。

根據本發明之手段，將棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸作為外用劑之育毛劑之有效成分，藉此可提供優異育毛劑及頭皮保養劑，該等可發揮促進頭髮、眉毛及/或睫毛中的毛幹成長、提升毛幹伸長速度、提升毛幹最大長度、增大毛幹直徑之效果以及頭皮保養效果。

圖1係表示小鼠塗布60%乙醇水溶液後之藥劑塗布部位中的毛幹長的變化圖。縱軸表示毛幹長(mm)，橫軸表示天數。又，第一毛囊週期表示塗布不含有藥劑之60%乙醇水溶液之標準資料。

圖2係表示小鼠塗布含有米諾地爾(5%)之60%乙醇水溶液後之藥劑塗布部位中的毛幹長的變化圖。縱軸表示毛幹長(mm)，橫軸表示天數。又，第一毛囊週期表示塗布不含有藥劑之60%乙醇水溶液之標準資料。

圖3係表示小鼠塗布含有米諾地爾(3%)之60%乙醇水溶液後之藥劑塗布部位中的毛幹長的變化圖。縱軸表示毛幹長(mm)，橫軸表示天數。又，第一毛囊週期表示塗布不含有藥劑之60%乙醇水溶液之標準資料。

圖4係表示小鼠塗布含有米諾地爾(1%)之60%乙醇水溶液後之藥劑塗布部位中的毛幹長的變化圖。縱軸表示毛幹長(mm)，橫軸表示天數。又，第一毛囊週期表示塗布不含有藥劑之60%乙醇水溶液之標準資料。

圖5係表示小鼠塗布含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸(3%)之60%乙醇水溶液後之藥劑塗布部位中的毛幹長的變化圖。縱軸表示毛幹長(mm)，橫軸表示天數。又，第一毛囊週期表示塗布不含有藥劑之60%乙醇水溶液之標準資料。

圖6係表示小鼠塗布含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸(1%)之60%乙醇水溶液後之藥劑塗布部位中的毛幹長的變化圖。縱軸表示毛幹長(mm)，橫軸表示天數。又，第一毛囊週期表示塗布不含有藥劑之60%乙醇水溶液之標準資料。

圖7係表示棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物所進行細胞分裂活性評價。以朝上箭頭表示可確認BrdU攝入之細胞。

圖8係表示棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物所進行細胞分裂活性評價。

圖9係表示藥劑塗布後之毛幹直徑之測定結果。

圖10係表示人類毛乳頭細胞受棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物刺激24小時所致基因表現量之變化圖。圖10(a)表示FGF-7基因表現量之變化，圖10(b)表示VEGF基因表現量之變化。

圖11係表示人類毛乳頭細胞受棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物刺激72小時所致基因表現量之變化圖。圖11(a)表示FGF-7基因表現量之變化，圖11(b)表示VEGF基因表現量之變化。

以下說明本發明之實施型態。又，本發明並不限定於該等例示，可在不超出本發明主旨範圍內實施各種變更。

本發明之為外用劑之育毛劑及頭皮保養劑之有效成分，包括棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸(Palmitoyl Dipeptide-5 Diaminobutyloyl Hydroxythreonine(Palm-Lys-Val-Dab-Thr-OH))及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸(Palmitoyl Dipeptide-5 Diaminohydroxybutyrate(Palm-Lys-Val-Dab-OH))。

本發明之育毛劑及頭皮保養劑中的有效成分之棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物之濃度，相對於育毛劑及頭皮保養劑整體為0.001~20重量%。更具體而言為0.005~10重量%。

本發明之含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸所成之育毛劑之質量比(棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸/棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸)為99/1~1/99。

本發明之育毛劑及頭皮保養劑作為醫藥品、準醫藥品、包括頭髮、眉毛及/或睫毛用化粧品及頭皮用化粧品之化粧品等，可使用軟膏、泥敷劑、擦劑、洗劑、外用液劑、散布劑、乳劑、凝膠、乳液、生髮液、髮噴霧劑等各種態樣之製劑，但並不限定於該等。

又，進一步地，可在不妨礙本發明之育毛效果及頭皮保養效果程度，摻配醫藥品、準醫藥品、包括頭髮、眉毛及/或睫毛用化粧品及頭皮用化粧品之化粧品等中通常可含有之添加物等成分。該添加物等成分可舉例如賦形劑、穩定劑、矯臭劑、基劑、分散劑、稀釋劑、陰離子性界面活性劑、兩性界面活性劑、非離子性界面活性劑、陽離子性界面活性劑、陰離子性聚合物、非離子性聚合物、環氧乙烷/環氧丙烷嵌段共聚物、醇類、乳化劑、經皮吸收促進劑、pH調整劑、保存劑、著色劑、油脂、礦物油等油分、保濕劑、增黏劑、聚合物、皮膜形成劑、紫外線吸收劑、細胞活化劑、保濕劑、無機鹽、功能性珠、膠囊類、聚矽氧類、金屬螫合劑、抗氧化劑、防腐劑、清涼劑、消臭劑、顏料、染料、香料、糖類、胺基酸類、維生素類、有機酸、有機胺、植物萃取物、黏土礦物、或各種聚合物等黏度調整劑等，但並不限定於該等。

本發明之育毛劑及頭皮保養劑亦可為含有具生毛、育毛、養毛等效果之公知成分。

本發明之手段中的育毛劑及頭皮保養劑之每一次投藥之有效成分投藥量，可依使本發明之育毛劑及頭皮保養劑之效果可發揮之方式調節。又，其投藥量例如可為0.005~200mg，具體而言可為0.05~100mg，更具體而言可為0.5~10mg。

本發明之育毛劑及頭皮保養劑之投藥次數，可依使本發明之育毛劑及頭皮保養劑之效果可發揮之方式，可為1次或複數次。又，本發明之育毛劑及頭皮保養劑之投藥次數，例如可為每天1~6次。又，具體而言可為每天1~3次，更具體而言可為每天1~2次。

本發明之育毛劑及頭皮保養劑係關於毛幹成長促進、生毛及脫毛防止者，較佳為關於毛幹成長促進及生毛者。

本說明書中，「毛幹成長促進」的用語是指提升毛幹伸長速度、提升毛幹最大長度、及/或增大毛幹直徑。

本說明書中，「生毛」的用語意指於不長毛(毛幹無法從表皮突出)或毛數少的部位，從停止生毛的毛穴、或生毛能力降低的毛穴促進生出新毛並增加毛數，詳細而言是指縮短毛囊週期中的休止期、及/或再次開始已停止的毛囊週期。

本說明書中，「具有毛幹成長促進效果」意指有利於毛幹成長促進的作用，表示毛幹成長促進效果之特質稱為「毛幹成長促進活性」。又，「具有生毛效果」意指有利於生毛的作用，表示生毛效果之特質稱為「生毛促進活性」。

本說明書中，「脫毛」的用語是指毛幹從毛穴脫落之現象，詳細而言是指阻礙細胞增殖之抑制性細胞激素等的增加及該等的細胞凋亡。表示脫毛防止效果之特質稱為「脫毛防止活性」。又，「具有脫毛防止效果」是指透過抑制細胞激素之阻礙或減少、及抑制細胞凋亡，而減少從毛穴脫落的毛幹數，與表示毛幹成長促進、生毛效果之特質為相異的生理現象。

本說明書中，「頭皮症狀」意指頭皮屑、頭皮粗糙、頭皮乾澀、紅斑、搔癢、膿包等症狀。又，本說明書中「頭皮症狀改善」是指頭皮屑、頭皮之肌膚粗糙、頭皮之乾澀、紅斑、搔癢、膿包等的抑制或改善。

本發明之育毛劑係用於提升毛幹伸長速度或毛幹最大長度。又，有關於毛幹伸長速度，相較於毛囊週期之標準資料中的毛幹伸長速度，例如最大可提升110%左右，具體而言可提升25~110%左右，更具體而言可提升33~110%左右。又，有關於毛幹最大長度，相較於毛囊週期之標準資料中的毛幹最大長度，例如可提升最大49%左右，具體而言可提升1~49%左右，更具體而言可提升2~49%左右。

本發明之育毛劑可用於增大毛幹直徑。

本發明之育毛劑可使用於不長毛(毛幹無法從表皮突出)或毛數少部位，從停止生毛的毛穴、或生毛能力降低的毛穴促進生出新毛並增加毛數，詳細而言係可使用於縮短毛囊週期中的休止期、及/或再次開始已停止之毛囊週期。

本發明之育毛劑及頭皮保養劑除了人類以外亦可用於家畜或寵物等動物。本發明之一方面提供一種育毛方法及頭皮症狀改善方法，係對於包括人類及家畜或寵物等動物的對象投藥含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之外用劑。

(實施例)

<試驗例1：棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物所進行育毛活性評價>

1.材料及方法

(1)實驗動物

由日本SLC股份有限公司(日本)購入C57BL/6N小鼠(公)及Balb/cnu/nu小鼠(母)，飼育後用於以下實驗。又，動物之飼育及試驗係遵守相關法規、法令、及指針並獲得理化學研究所實驗倫理審查會承認而實施。

(2)試藥

分別準備以下試藥。

比較例1：60%乙醇水溶液。

比較例2：米諾地爾5%溶液。

比較例3：米諾地爾3%溶液。

比較例4：米諾地爾1%溶液。

實施例1：棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物3%溶液。

實施例2：棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物1%溶液。

(3)源自於小鼠背部體毛皮膚之皮膚試驗片之製作

為了採取拔毛後第12~14天之成長期VI皮膚作為背部體毛皮膚，係對7~8週齡之C57BL/6N小鼠背部體毛皮膚採取預定部位進行拔毛，並養育12~14天。其後將拔毛之C57BL/6N小鼠以頸椎脫臼安樂死後，由背部體毛皮膚採取預定部位適量採取背部體毛皮膚。

將採取之皮膚浸於含有10mM HEPES、10%胎牛血清、及1%青黴素/鏈黴素溶液之DMEM培養基(以下稱為「DMEM10」)。以前端彎曲鑷子夾取採取之背部體毛皮膚，浸漬於滅菌用溶液10秒並進行處理。以聚乙烯吡咯烷酮碘7%溶液處理2次、PBS(-)處理3次、DMEM10處理2次的順序分別使用新鮮溶液進行滅菌處理。滅菌處理後，浸漬於乾淨的DMEM10中。

將滅菌處理後之背部體毛皮膚切取並塊狀化。使用彎曲剪刀沿著附著於皮膚之皮肌層的透明結合組織切除，將毛群沿毛流切為長方形籤狀。此時，以毛囊成為短軸5列之方式調整，並以長軸毛囊成為6列之方式切取並塊狀化。

(4)皮膚試驗片對於Balb/cnu/nu小鼠之移植

將上述所製作源自於背部體毛皮膚之皮膚試驗片移植至4~6週齡之Balb/cnu/nu小鼠。根據規定方法對於小鼠以異氟醚氣體麻醉。又，以聚乙烯吡咯烷酮碘7%溶液消毒小鼠背部後，使其成為自然橫躺位。之後，使用MANI眼科手術刀(MANI股份有限公司，日本)穿刺小鼠背部，形成從皮膚表皮層到真皮層下層部之移植創。

將源自於背部體毛皮膚之皮膚試驗片以毛群朝向移植創的體表側之方式插入於所形成移植創。皮膚試驗片之移植深度以成為毛群上端部露出於移植創上端部之狀態之方式調節。其次，使用Nurseband(註冊商標)(Sunplanet股份有限公司，日本)及手術膠帶(3M JAPAN股份有限公司，日本)作為保護帶而被覆移植有源自於背部體毛皮膚之皮膚試驗片之移植創，並保護移植創。

移植後5~7天後去除保護帶，以目視或數位顯微鏡(keyence股份有限公司，日本)判定所移植之源自於背部體毛皮膚之皮膚試驗片的取用後，進行歷程觀察。

(5)對於移植皮膚試驗片之藥劑塗布

毛囊週期之第1週期係以60%乙醇水溶液作為安慰劑塗布。於已移植上述皮膚試驗片之Balb/cnu/nu小鼠使用微移液管將25μL之60%乙醇分別塗布於已取用皮膚試驗片之左右背部。其後使用乾燥器吹以冷風快速乾燥乙醇。在小鼠左右背部分別重複4次該作業。

毛囊週期之第2週期以後係根據上述方法，取代60%乙醇水溶液而於毛群移植之Balb/cnu/nu小鼠塗布各種濃度之棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合溶液。

(6)生毛歷程觀察及組織學的分析

從Balb/cnu/nu小鼠之皮膚試驗片移植部位分別選擇3領域，由該等領域分別選擇5根毛，確認生毛狀態並記錄。觀察及記錄係藉由目視及數位顯微鏡(keyence股份有限公司，日本)進行。

2.結果

對於每個藥劑隔1~3天測量毛幹長度，將經時變化之各時間點的毛幹長度平均值作為1個點而繪點於圖，同樣的繪點重複3批。結果示於表1~6及圖1~6。

[表1]

[表2]

上述表2中，＊表示p<0.05之顯著性差異。

[表3]

上述表3中，＊表示p<0.05之顯著性差異，＊＊表示p<0.01之顯著性差異。

[表4]

上述表4中，＊＊表示p<0.01之顯著性差異。

[表5]

上述表5中，*表示p<0.05之顯著性差異，**表示p<0.01之顯著性差異。

[表6]

上述表6中，＊表示p<0.05之顯著性差異。

於小鼠之皮膚試驗片移植部位塗布60%乙醇水溶液時，相較於不進行溶液塗布之標準數據，毛幹成長速度及毛幹最大長度皆未有顯著差異，無法確認到育毛活性(參照表1及圖1)。

於小鼠之皮膚試驗片移植部位塗布含有米諾地爾5%、3%、或1%之溶液時，相較於標準數據，毛幹成長速度及毛幹最大長度皆顯著提升，確認有育毛活性(參照表2~4及圖2~4)。

另一方面，於小鼠之皮膚試驗片移植部位塗布含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物3%之溶液時，相較於標準數據，毛幹成長速度顯著提升。又，毛幹最大長度雖未有顯著差異但亦提升(參考表5及圖5)。由該等結果來看，含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物3%之溶液具有育毛活性。

另一方面，於小鼠之皮膚試驗片移植部位塗布含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物1%之溶液時，相較於標準數據，毛幹成長速度在第二毛囊週期未有顯著差異，毛幹最大長度在第三毛囊週期雖未有顯著差異但亦提升(參照表6及圖6)。由該等結果來看，含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物1%之溶液之育毛活性有具顯著差異的傾向。

因此，棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之育毛活性之有效下限濃度以棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物之含量而言建議在1%至3%之間。

<試驗例2：棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物所進行細胞分裂活性評價>

1.材料及方法

(1)實驗動物

由6~8週齡之C57BL/6N小鼠(日本SLC股份有限公司，日本)採取背部體毛皮膚。動物之飼育及實驗係遵守相關法規、法令、及指針並獲得理化學研究所實驗倫理審查會而實施。

(2)藥劑

分別準備以下藥劑。

比較例1：60%乙醇水溶液。

比較例5：RiUPX5PLUS(大正製藥，日本)。

(3)藥劑塗布

將C57BL/6N小鼠之背部體毛進行拔毛。使用微移液管於C57BL/6N小鼠之左右背部塗布25μL藥劑。其後使用乾燥器於塗布部位吹以冷風使藥劑快速乾燥。在左右背部分別重複4次該作業。在拔毛隔天起進行7天該藥劑塗布作業。

(4)BrdU投藥

從塗布7天藥劑之C57BL/6N小鼠採取背部體毛皮膚，於其24小時及48小時前使用注射器(Terumo股份有限公司，日本)於各小鼠之後腳部分腹部投藥10mg/mL之BrdU/生理食鹽水0.5mL。

(5)小鼠皮膚組織採取及固定

在第8天於與投藥時間相同時間使C57BL/6N小鼠藉由頸椎脫臼而安樂死後，以不傷害毛球部之方式採取皮膚組織。將採取之皮膚組織於SuperFix(東洋紡股份有限公司，日本)浸於固定液16~24小時後，以1×PBS洗滌4次，放入新的1×PBS並保管。切除其皮膚組織之必要部分，以石蠟液交換機(Leica Microsystems GmbH，德國)製作石蠟塊。

(6)切片製作

將石蠟化皮膚組織塊以薄片切片機(Leica Microsystems GmbH，德國)切片化，將切片貼合於鍍鉑載玻片(PLATINUM PRO(松浪硝子工業股份有限公司，日本))，以40℃溫蒸氣放置8~10小時乾燥。

(7)BrdU免疫染色

為了實施脫石蠟處理而將載有樣品之載玻片依序浸於二甲苯、二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇各3分鐘。將經脫石蠟處理之載玻片於室溫浸於2M HCl30分鐘。將載玻片設置於Ventana Discovery ULTRA(自動染色裝置)並啟動程式。將1次抗體Anti-BrdU antibody-Proliferation Marker(abcam，英國)以稀釋溶液(1%BSA，0.1%TX100/PBS)稀釋160倍，在加入1次抗體之時機添加100μL/樣品數。將2次抗體Donkey Anti-Sheep IgG H&L(Alexa Flour 594)(Thermo Fisher Scientific，美國)及Hoechst(Hoechst33342)以稀釋溶液(1%BSA，0.1%TX100/PBS)稀釋500倍，添加100μL/樣品數。程式結束後，流通0.1%TX100/PBS並洗淨，浸於1×PBS。將水溶性封入劑(0.5%沒食子酸，90%甘油/PBS)以80μL/樣品數滴入後，載於蓋玻片，以黃片擠出空氣，以抽濾管移動蓋玻片位置並去除多餘封入劑，使用頂封劑(美甲用)封住蓋玻片四邊。確認頂封劑乾燥後，以Axio Scan掃描影像並解析。

(8)BrdU之測量方法

劃上5000μm之線，並測量位於該範圍之表皮層、真皮層、位於毛囊之BrdU數。

2.結果

本試驗例中使用已拔毛之C57BL/6N小鼠，將溶解於60%乙醇之濃度1%及3%之棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸作為試驗用藥劑液連日塗布。並塗布作為陰性對照組之60%乙醇、及作為陽性對象之RiUP(5%製劑)。該等塗布係以1次/天之總塗布量為100μl之方式進行7天。又，在6、7天之相同時間從腹部投藥BrdU，其隔天採取皮膚組織。將採取之皮膚組織石蠟化並製作切片，並進行BrdU之免疫染色，藉由測量BrdU數而觀察細胞活性。結果示於圖7及圖8。

由圖7及圖8明顯可知，相較於陰性對照組及陽性對象，藉由塗布本發明之手段之有效成分之棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸，而有細胞分裂活性增大的傾向，可知棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸3%至少可提升毛囊中的細胞分裂活性，本發明之手段之有效成分具有育毛活性。又，藉由塗布本發明之手段之有效成分之棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸，而確認到表皮基底層中的細胞分裂活性的亢進，本發明之手段之有效成分具有頭皮保養效果。本發明之手段之有效成分之棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸係發揮優異育毛活性，且可同時發揮塗布部分中的頭皮保養效果，係可發揮優異效果。

<試驗例3：棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物所進行粗毛化活性評價>

1.材料及方法

(1)實驗動物

以與上述試驗例1相同之順序由7~8週齡之C57BL/6N小鼠(SLC)採取背部體毛皮膚，將所製作源自於背部體毛皮膚之毛群移植至4~6週齡之Balb/cnu/nu小鼠(SLC)後，塗布藥劑。動物之飼育及實驗動物之飼育及實驗係遵守相關法規、法令、及指針並獲得理化學研究所實驗倫理審查會而實施。

(2)藥劑

試驗使用以下藥劑。

比較例1：60%乙醇水溶液。

比較例5：RiUPX5PLUS(註冊商標)(大正製藥，日本)。

(3)粗毛化之測量方法

使用試驗例1中第3週期結束之成長的毛幹進行粗毛化測量。所採取毛幹中係使用Zigzag毛2根。以邊長100μm正方形選擇3處其中心部分變粗範圍。測量所選擇範圍5處。

2.結果

使用藥劑塗布後之毛測量毛幹直徑之結果示於圖9。又，評價相對於對照之塗布60%乙醇水溶液之比較例1中的毛幹直徑的增加率，結果示於表7。

[表7]

相較於對照之塗布60%乙醇水溶液之比較例1，塗布本發明之手段之有效成分之棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸係可確認到產生明確粗毛化。該粗毛化程度為與比較例5同等，確認到與上市育毛劑之RiUPX5PLUS同等之活性。

<試驗例4：人類毛乳頭細胞中的FGF-7基因及VEGF基因表現之評價>

1.材料及方法

(1)有關人類毛乳頭細胞及培養基

購入人類毛乳頭細胞(目錄編號：CA60205a，白色人種，源自於29歲男性，東洋紡股份有限公司(日本))，以準則所記載方式維持、培養細胞，並進行試驗評價。

(2)藥劑

試驗用藥劑係調製以下各濃度(終濃度)之藥劑溶液並使用。

實施例3：棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物0.1%溶液。

實施例4：棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物0.025%溶液。

米諾地爾30μM。

腺苷100μM。

(3)試驗方法

將人類毛乳頭細胞以5×10⁴個/孔之方式播種於96孔盤。在CO₂培養器(5%CO₂、37℃)內培養1天後，取代為含有各試驗用藥劑之培養基。其後將細胞板放回CO₂培養器，進一步培養24小時或72小時。培養後，從各孔抽取全RNA並回收，其反轉錄為cDNA。使用所調製cDA以實時PCR法測定FGF-7基因的表現。內標準使用GAPDH基因，計算與陰性對照群的相對值作為FGF-7基因的表現量。

由細胞之全RNA回收使用FastGene RNA BasicKit(目錄編號：FG-80250，NIPPON Genetics股份有限公司(日本))。

於每孔添加100μL之溶解緩衝液RL，以移液器溶解細胞。於細胞溶解液添加70%乙醇100μL，以移液器混合。將樣品溶液添加於FastGene RNA binding column，以10000g、1分鐘在室溫離心分離。將通過管柱之濾液從接收管廢棄，使FastGene RNA binding column放回原來的接收管後，將600μL之洗淨緩衝液RW1加入於FastGene RNA binding column，以10000g、1分鐘在室溫離心分離。將FastGene RNA binding column移至新的接收管並裝設，將700μL之洗淨緩衝液RW2加入於FastGene RNA binding column，以10000g、1分鐘在室溫離心分離。FastGene RNA binding column移至新的接收管並裝設，以15000rpm、1分鐘在室溫離心分離。FastGene RNA binding column移至新的接收管並裝設，將50μL之溶出緩衝液RE添加於FastGene RNA binding column之薄膜中央，以10000g、1分鐘在室溫離心分離，回收精製之RNA。以NanoDrop Lite(目錄編號：ND-LITE，Thermo Fisher Scientific股份有限公司)測定回收之RNA濃度，在-80℃保存至接下來的cDNA化作業。

cDNA之合成使用FastGene scriptaseII cDN Asynthesis 5×Ready Mix(目錄編號：NE-LS64，NIPPON Genetics股份有限公司(日本))。以於新的管生成之全RNA濃度成為20ng/mL之方式，以RNase Free Water稀釋，於該樣品溶液16μL添加FastGene scriptaseII cDNA synthesis 5×Ready Mix4μL，以漩渦攪拌。使用Mini Amp溫度循環器(Thermo Fisher Scientific股份有限公司)，以25℃、10分鐘；42℃、60分鐘；85℃、5分鐘培養並合成cDNA。

將以上述方法合成之cDNA用於實時PCR。於96孔盤之規定孔各別添加cDNA template稀釋液，添加THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(目錄編號：QPS-201，東洋紡股份有限公司(日本))及引子並混合，以QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System(目錄編號：4485693，Thermo Fisher Scientific股份有限公司)解析基因表現。PCR反應為95℃、5秒；60℃、30秒；及72℃、30秒進行40循環。

試驗所使用VEGF基因特異之引子、FGF-7基因特異之引子、及內標準之GAPDH基因特異之引子如以下所示。

FGF-7基因表現檢測用引子

順向：tctgtcgaacacagtggtacctgag(序列編號1)。

逆向：gccactgtcctgatttccatga(序列編號2)。

VEGF基因表現檢測用引子

順向：atcttcaagccatcctgtgtgc(序列編號3)。

逆向：caaggcccacagggattttc(序列編號4)。

GAPDH基因表現檢測用引子

順向：catccctgcctctactggcgctgcc(序列編號5)。

逆向：ccaggatgcccttgagggggccctc(序列編號6)。

用以下方式計算各基因之相對表現量。

以各基因之增幅曲線與閾值線的交點計算Ct值(PCR循環數)。由目的基因之Ct值除以內標準GAPDH基因之Ct值，以此值作為相對表現量。

2.結果

於人類毛乳頭細胞使棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物作用24小時及72小時後，測定FGF-7基因以及VEGF基因之表現量變化，其結果分別示於圖10(24小時)及圖11(72小時)。

如圖10所示，相對於人類毛乳頭細胞使棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物以最終濃度3%之方式作用24小時之群，與無添加對照群相比，可確認到FGF-7基因表現量及VEGF基因表現量顯著上升。

接著，該等FGF-7基因表現量及VEGF基因表現量皆大於米諾地爾或腺苷作用的情形。

又，相對於人類毛乳頭細胞使棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物以最終濃度0.1%之方式作用24小時之群，與無添加對照群相比，亦可確認到FGF-7基因表現量及VEGF基因表現量顯著上升。

又進一步地，如圖11所示，相對於人類毛乳頭細胞使棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物以最終濃度3%之方式作用72小時之群，與無添加對照群相比，亦可確認FGF-7基因表現量及VEGF基因表現量顯著上升。又，可確認該等基因表現量之上升程度與24小時作用的情形相比係變大。

接著，該等FGF-7基因表現量及VEGF基因表現量為皆大於米諾地爾或腺苷作用的情形。

又，相對於人類毛乳頭細胞使棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之混合物以最終濃度0.1%作用72小時之群，與無添加對照群相比，亦可確認到FGF-7基因表現量及VEGF基因表現量顯著上升。

已知人類毛乳頭細胞中的FGF-7基因之表現亢進、及VEGF基因之表現亢進皆有助於人類的育毛活性之亢進。由以上所示試驗結果來看，棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸皆可使人類毛乳頭細胞中的FGF-7基因及VEGF基因之表現量亢進，且藉由長時間作用而可更提高該等基因表現量。如上述，棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸係可做為用以使人類育毛活性之有效成分亢進。

[產業上可利用性]

藉由本發明之手段，使用棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸作為外用劑之育毛劑之有效成分，藉此可提供一種新的育毛劑及頭皮保養劑，可發揮頭髮、眉毛及/或睫毛等毛中的毛幹之成長促進效果、毛幹伸長速度的提升效果、毛幹最大長度的提升效果及毛幹直徑增大之效果、以及頭皮保養效果。

Claims

一種育毛劑，係含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之外用劑。
如請求項1所述之育毛劑，其中棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之含量相對於整體為0.001~20重量%。
如請求項1或2所述之育毛劑，其中棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸之含量相對於整體為0.005~10重量%。
如請求項1至3中任一項所述之育毛劑，其係含有棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸及棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸而成者，其質量比(棕櫚醯基二肽-5二胺基丁醯基羥基蘇胺酸/棕櫚醯基二肽-5二胺基羥基丁酸)為99/1~1/99。
如請求項1至4中任一項所述之育毛劑，其係用於毛幹成長促進或生毛。
如請求項1至5中任一項所述之育毛劑，其係用於提升毛幹伸長速度。
如請求項1至5中任一項所述之育毛劑，其係用於提升毛幹最大長度。
如請求項1至5中任一項所述之育毛劑，其係用於增大毛幹直徑。
如請求項1至5中任一項所述之育毛劑，其係用於增加毛數。
如請求項1至9中任一項所述之育毛劑，其為溶液。
如請求項1至10中任一項所述之育毛劑，其為頭髮、眉毛及/或睫毛用。
一種育毛方法，係對於對象投藥如請求項1至11中任一項所述之育毛劑。