CN117679486A

CN117679486A - 毛乳头细胞的fgf-7促生成剂及vegf促生成剂

Info

Publication number: CN117679486A
Application number: CN202310835502.5A
Authority: CN
Inventors: 中村荘太; 高桥秀树; 中池佑纪美; 永谷贵弘; 金泽由纪; 辻孝; 小川美帆
Original assignee: Anjiabang Holding Co ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Anjiabang Holding Co ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2020-09-23
Publication date: 2024-03-12
Also published as: US20220387283A1; JPWO2021075219A1; KR20220087486A; CN114828872B; JP2021193134A; JP2021193133A; JP6956368B6; WO2021075219A1; CN114828872A; JP6956368B2; JP7186407B2; TW202128208A; CN117695372A

Abstract

本发明涉及一种毛乳头细胞的FGF‑7促生成剂及VEGF促生成剂。本发明提供一种育毛剂，其为外用剂，其促进头发、眉毛和/或睫毛中的毛干成长，使有助于毛乳头细胞中的育毛的基因表现亢进而生毛，并发挥提高毛干伸长速度、提高毛干最大长度、及增大毛干直径的效果。因此，本发明的属于外用剂的育毛剂中，含有棕榈酰基二肽‑5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽‑5二氨基羟基丁酸作为有效成分。

Description

毛乳头细胞的FGF-7促生成剂及VEGF促生成剂

本发明是中国专利申请号为202080088508.5，发明名称为“育毛剂”，国际申请日为2020年9月23日的进入中国的PCT专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及育毛剂。更详细而言涉及含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的属于外用剂的育毛剂。

背景技术

以人类为首的哺乳动物的改善育毛效果及毛种、毛质的育毛剂等外用剂的需求正在增加。为了改善育毛效果及毛种、毛质，提出有有助于调节属于毛生命周期的毛囊周期的有效成分，并作为育毛剂上市。

例如已提出利用米诺地尔(minoxidil)作为育毛剂的有效成分(参照专利文献1至3等)，经过人类临床试验，已有以米诺地尔为有效成分的育毛剂上市。但是，其医药用途对于日本国而言仅限于男性中年性脱毛症等，无法满足众多要求育毛效果及毛种、毛质的改善效果的消费者需求。

另外，已提出利用chiro-肌醇作为育毛剂的有效成分(参照专利文献4)。但是，专利文献4所记载的含有chiro-肌醇的外用剂的育毛剂仅对无胰岛素抗性的对象有育毛效果，投药对象受限。因此，无法满足众多要求育毛效果及毛种、毛质的改善效果的消费者需求。

棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸已知可作为化妆品原材料(参照专利文献5)。但未有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的育毛效果的报告。

[现有技术文献]

[专利文献]

专利文献1：美国专利第4139619号说明书

专利文献2：日本特开昭63-150211号公报

专利文献3：日本特开昭63-145217号公报

专利文献4：国际公开第2017/188393号

专利文献5：日本专利第5028474号公报。

发明内容

[发明所要解决的技术问题]

本发明的目的为提供具有优异育毛作用的育毛剂。

[用以解决课题的手段]

本发明人等为了解决上述课题而不断努力研究，结果发现以棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸为有效成分，据此可发挥优异育毛活性，从而完成本发明。

用以解决上述课题的本发明的第1手段为一种育毛剂，为含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的外用剂。

用以解决上述课题的本发明的第2手段为如本发明的第1手段所述的育毛剂，其中棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的含量相对于整体为0.001至20重量％。

用以解决上述课题的本发明的第3手段为如本发明的第1或2手段所述的育毛剂，其中棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的含量相对于整体为0.005至10重量％。

用以解决上述课题的本发明的第4手段为如本发明的第1至3手段中任一手段所述的育毛剂，含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸而成，其质量比(棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸/棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸)为99/1至1/99。

用以解决上述课题的本发明的第5手段为如本发明的第1至4手段中任一手段所述的育毛剂，其用于促进毛干成长或生毛。

用以解决上述课题的本发明的第6手段为如本发明的第1至手段中任一手段所述的育毛剂，其用于提升毛干伸长速度。

用以解决上述课题的本发明的第7手段为如本发明的第1至5手段中任一手段所述的育毛剂，其用于提升毛干最大长度。

用以解决上述课题的本发明的第8手段为如本发明的第1至5手段中任一手段所述的育毛剂，其用于增大毛干直径。

用以解决上述课题的本发明的第9手段为如本发明的第1至5手段中任一手段所述的育毛剂，其用于增加毛数。

用以解决上述课题的本发明的第10手段为如本发明的第1至9手段中任一手段所述的育毛剂，为溶液。

用以解决上述课题的本发明的第11手段为如本发明的第1至10手段中任一手段所述的育毛剂，为头发、眉毛和/或睫毛用途。

用以解决上述课题的本发明的第12手段为一种育毛方法，包含对于对象投药本发明的第1至11手段中任一手段所述的育毛剂。

用以解决上述课题的本发明的其它手段为一种头皮保养剂，为含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的外用剂。

用以解决上述课题的本发明的其它手段为一种头皮症状改善方法，包含对于对象投药含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的属于外用剂的头皮保养剂。

[发明的功效]

根据本发明的手段，将棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸作为外用剂的育毛剂的有效成分，据此可提供优异育毛剂及头皮保养剂，这些可发挥促进头发、眉毛和/或睫毛中的毛干成长、提升毛干伸长速度、提升毛干最大长度、增大毛干直径的效果以及头皮保养效果。

附图说明

图1表示小鼠涂布60％乙醇水溶液后的药剂涂布部位中的毛干长的变化图。纵轴表示毛干长(mm)，横轴表示天数。另外，第一毛囊周期表示涂布不含有药剂的60％乙醇水溶液的标准数据。

图2表示小鼠涂布含有米诺地尔(5％)的60％乙醇水溶液后的药剂涂布部位中的毛干长的变化图。纵轴表示毛干长(mm)，横轴表示天数。另外，第一毛囊周期表示涂布不含有药剂的60％乙醇水溶液的标准数据。

图3表示小鼠涂布含有米诺地尔(3％)的60％乙醇水溶液后的药剂涂布部位中的毛干长的变化图。纵轴表示毛干长(mm)，横轴表示天数。另外，第一毛囊周期表示涂布不含有药剂的60％乙醇水溶液的标准数据。

图4表示小鼠涂布含有米诺地尔(1％)的60％乙醇水溶液后的药剂涂布部位中的毛干长的变化图。纵轴表示毛干长(mm)，横轴表示天数。另外，第一毛囊周期表示涂布不含有药剂的60％乙醇水溶液的标准数据。

图5表示小鼠涂布含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸(3％)的60％乙醇水溶液后的药剂涂布部位中的毛干长的变化图。纵轴表示毛干长(mm)，横轴表示天数。另外，第一毛囊周期表示涂布不含有药剂的60％乙醇水溶液的标准数据。

图6表示小鼠涂布含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸(1％)的60％乙醇水溶液后的药剂涂布部位中的毛干长的变化图。纵轴表示毛干长(mm)，横轴表示天数。另外，第一毛囊周期表示涂布不含有药剂的60％乙醇水溶液的标准数据。

图7表示棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物所进行细胞分裂活性评价。以朝上箭头表示可确认BrdU摄入的细胞。

图8表示棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物所进行细胞分裂活性评价。

图9表示药剂涂布后的毛干直径的测定结果。

图10表示人类毛乳头细胞受棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物刺激24小时所致基因表现量的变化图。图10(a)表示FGF-7基因表现量的变化，图10(b)表示VEGF基因表现量的变化。

图11表示人类毛乳头细胞受棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物刺激72小时所致基因表现量的变化图。图11(a)表示FGF-7基因表现量的变化，图11(b)表示VEGF基因表现量的变化。

具体实施方式

以下说明本发明的实施方式。另外，本发明并不限定于这些例示，可在不超出本发明主旨范围内实施各种变更。

本发明的为外用剂的育毛剂及头皮保养剂的有效成分，包括棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸(Palmitoyl Dipeptide-5Diaminobutyloyl Hydroxythreonine(Palm-Lys-Val-Dab-Thr-OH))及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸(Palmitoyl Dipeptide-5Diaminohydroxybutyrate(Palm-Lys-Val-Dab-OH))。

本发明的育毛剂及头皮保养剂中的有效成分的棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物的浓度，相对于育毛剂及头皮保养剂整体为0.001至20重量％。更具体而言为0.005至10重量％。

本发明的含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸所成的育毛剂的质量比(棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸/棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸)为99/1至1/99。

本发明的育毛剂及头皮保养剂作为医药品、准医药品、包括头发、眉毛和/或睫毛用化妆品及头皮用化妆品的化妆品等，可使用软膏、泥敷剂、擦剂、洗剂、外用液剂、散布剂、乳剂、凝胶、乳液、生发液、发喷雾剂等各种态样的制剂，但并不限定于这些。

另外，进一步地，可在不妨碍本发明的育毛效果及头皮保养效果程度，掺配医药品、准医药品、包括头发、眉毛和/或睫毛用化妆品及头皮用化妆品的化妆品等中通常可含有的添加物等成分。该添加物等成分可举例如赋形剂、稳定剂、矫臭剂、基剂、分散剂、稀释剂、阴离子性界面活性剂、两性界面活性剂、非离子性界面活性剂、阳离子性界面活性剂、阴离子性聚合物、非离子性聚合物、环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物、醇类、乳化剂、经皮吸收促进剂、pH调整剂、保存剂、着色剂、油脂、矿物油等油分、保湿剂、增黏剂、聚合物、皮膜形成剂、紫外线吸收剂、细胞活化剂、保湿剂、无机盐、功能性珠、胶囊类、聚硅氧类、金属螫合剂、抗氧化剂、防腐剂、清凉剂、消臭剂、颜料、染料、香料、糖类、氨基酸类、维生素类、有机酸、有机氨、植物萃取物、黏土矿物、或各种聚合物等黏度调整剂等，但并不限定于这些。

本发明的育毛剂及头皮保养剂也可为含有具生毛、育毛、养毛等效果的公开已知成分。

本发明的手段中的育毛剂及头皮保养剂的每一次投药的有效成分投药量，可依使本发明的育毛剂及头皮保养剂的效果可发挥的方式调节。另外，其投药量例如可为0.005至200mg，具体而言可为0.05至100mg，更具体而言可为0.5至10mg。

本发明的育毛剂及头皮保养剂的投药次数，可依使本发明的育毛剂及头皮保养剂的效果可发挥的方式，可为1次或多次。另外，本发明的育毛剂及头皮保养剂的投药次数，例如可为每天1至6次。另外，具体而言可为每天1至3次，更具体而言可为每天1至2次。

本发明的育毛剂及头皮保养剂涉及毛干成长促进、生毛及脱毛防止，较优选为关于毛干成长促进及生毛。

本说明书中，“毛干成长促进”的用语是指提升毛干伸长速度、提升毛干最大长度、和/或增大毛干直径。

本说明书中，“生毛”的用语意指于不长毛(毛干无法从表皮突出)或毛数少的部位，从停止生毛的毛穴、或生毛能力降低的毛穴促进生出新毛并增加毛数，详细而言是指缩短毛囊周期中的休止期、和/或再次开始已停止的毛囊周期。

本说明书中，“具有毛干成长促进效果”意指有利于毛干成长促进的作用，表示毛干成长促进效果的特质称为“毛干成长促进活性”。另外，“具有生毛效果”意指有利于生毛的作用，表示生毛效果的特质称为“生毛促进活性”。

本说明书中，“脱毛”的用语是指毛干从毛穴脱落的现象，详细而言是指阻碍细胞增殖的抑制性细胞激素等的增加及这些的细胞凋亡。表示脱毛防止效果的特质称为“脱毛防止活性”。另外，“具有脱毛防止效果”是指通过抑制细胞激素的阻碍或减少、及抑制细胞凋亡，而减少从毛穴脱落的毛干数，与表示毛干成长促进、生毛效果的特质为相异的生理现象。

本说明书中，“头皮症状”意指头皮屑、头皮粗糙、头皮干涩、红斑、搔痒、脓包等症状。另外，本说明书中“头皮症状改善”是指头皮屑、头皮的肌肤粗糙、头皮的干涩、红斑、搔痒、脓包等的抑制或改善。

本发明的育毛剂用于提升毛干伸长速度或毛干最大长度。另外，有关于毛干伸长速度，相比于毛囊周期的标准数据中的毛干伸长速度，例如最大可提升110％左右，具体而言可提升25至110％左右，更具体而言可提升33至110％左右。另外，有关于毛干最大长度，相比于毛囊周期的标准数据中的毛干最大长度，例如可提升最大49％左右，具体而言可提升1至49％左右，更具体而言可提升2至49％左右。

本发明的育毛剂可用于增大毛干直径。

本发明的育毛剂可使用于不长毛(毛干无法从表皮突出)或毛数少部位，从停止生毛的毛穴、或生毛能力降低的毛穴促进生出新毛并增加毛数，详细而言可使用于缩短毛囊周期中的休止期、和/或再次开始已停止的毛囊周期。

本发明的育毛剂及头皮保养剂除了人类以外也可用于家畜或宠物等动物。本发明的一方面提供一种育毛方法及头皮症状改善方法，包含对于包括人类及家畜或宠物等动物的对象投药含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的外用剂。

(实施例)

<试验例1：棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物所进行育毛活性评价>

1.材料及方法

(1)实验动物

由日本SLC股份有限公司(日本)购入C57BL/6N小鼠(公)及Balb/cnu/nu小鼠(母)，饲育后用于以下实验。另外，动物的饲育及试验遵守相关法规、法令、及指针并获得理化学研究所实验伦理审查会承认而实施。

(2)试药

分别准备以下试药。

比较例1：60％乙醇水溶液。

比较例2：米诺地尔5％溶液。

比较例3：米诺地尔3％溶液。

比较例4：米诺地尔1％溶液。

实施例1：棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物3％溶液。

实施例2：棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物1％溶液。

(3)源自于小鼠背部体毛皮肤的皮肤试验片的制作

为了采取拔毛后第12至14天的成长期VI皮肤作为背部体毛皮肤，对7至8周龄的C57BL/6N小鼠背部体毛皮肤采取既定部位进行拔毛，并养育12至14天。其后将拔毛的C57BL/6N小鼠以颈椎脱臼安乐死后，由背部体毛皮肤采取既定部位适量采取背部体毛皮肤。

将采取的皮肤浸于含有10mM HEPES、10％胎牛血清、及1％青霉素/链霉素溶液的DMEM培养基(以下称为“DMEM10”)。以前端弯曲镊子夹取采取的背部体毛皮肤，浸渍于灭菌用溶液10秒并进行处理。以聚乙烯吡咯烷酮碘7％溶液处理2次、PBS(-)处理3次、DMEM10处理2次的顺序分别使用新鲜溶液进行灭菌处理。灭菌处理后，浸渍于干净的DMEM10中。

将灭菌处理后的背部体毛皮肤切取并块状化。使用弯曲剪刀沿着附着于皮肤的皮肌层的透明结合组织切除，将毛群沿毛流切为长方形签状。此时，以毛囊成为短轴5列的方式调整，并以长轴毛囊成为6列的方式切取并块状化。

(4)皮肤试验片对于Balb/cnu/nu小鼠的移植

将上述所制作源自于背部体毛皮肤的皮肤试验片移植至4至6周龄的Balb/cnu/nu小鼠。根据规定方法对于小鼠以异氟醚气体麻醉。另外，以聚乙烯吡咯烷酮碘7％溶液消毒小鼠背部后，使其成为自然横躺位。然后，使用MANI眼科手术刀(MANI股份有限公司，日本)穿刺小鼠背部，形成从皮肤表皮层到真皮层下层部的移植创。

将源自于背部体毛皮肤的皮肤试验片以毛群朝向移植创的体表侧的方式插入于所形成移植创。皮肤试验片的移植深度以成为毛群上端部露出于移植创上端部的状态的方式调节。其次，使用Nurseband(注册商标)(Sunplanet股份有限公司，日本)及手术胶带(3MJAPAN股份有限公司，日本)作为保护带而包覆移植有源自于背部体毛皮肤的皮肤试验片的移植创，并保护移植创。

移植后5至7天后去除保护带，以目视或数字显微镜(keyence股份有限公司，日本)判定所移植的源自于背部体毛皮肤的皮肤试验片的取用后，进行历程观察。

(5)对于移植皮肤试验片的药剂涂布

毛囊周期的第1周期是以60％乙醇水溶液作为安慰剂涂布。于已移植上述皮肤试验片的Balb/cnu/nu小鼠使用微移液管将25μL的60％乙醇分别涂布于已取用皮肤试验片的左右背部。其后使用干燥器吹以冷风快速干燥乙醇。在小鼠左右背部分别重复4次该作业。

毛囊周期的第2周期以后根据上述方法，取代60％乙醇水溶液而于毛群移植的Balb/cnu/nu小鼠涂布各种浓度的棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合溶液。

(6)生毛历程观察及组织学的分析

从Balb/cnu/nu小鼠的皮肤试验片移植部位分别选择3领域，由这些领域分别选择5根毛，确认生毛状态并记录。通过目视及数字显微镜(keyence股份有限公司，日本)进行观察及记录。

2.结果

对于每个药剂隔1至3天测量毛干长度，将经时变化的各时间点的毛干长度平均值作为1个点而绘点于图，同样的绘点重复3批。结果示于表1至6及图1至6。

[表1]

[表2]

上述表2中，＊表示p<0.05的显著性差异。

[表3]

上述表3中，＊表示p<0.05的显著性差异，＊＊表示p<0.01的显著性差异。

[表4]

上述表4中，＊＊表示p<0.01的显著性差异。

[表5]

上述表5中，*表示p<0.05的显著性差异，**表示p<0.01的显著性差异。

[表6]

上述表6中，＊表示p<0.05的显著性差异。

于小鼠的皮肤试验片移植部位涂布60％乙醇水溶液时，相比于不进行溶液涂布的标准数据，毛干成长速度及毛干最大长度皆未有显著差异，无法确认到育毛活性(参照表1及图1)。

于小鼠的皮肤试验片移植部位涂布含有米诺地尔5％、3％、或1％的溶液时，相比于标准数据，毛干成长速度及毛干最大长度皆显著提升，确认有育毛活性(参照表2至4及图2至4)。

另一方面，于小鼠的皮肤试验片移植部位涂布含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物3％的溶液时，相比于标准数据，毛干成长速度显著提升。另外，毛干最大长度虽未有显著差异但也提升(参考表5及图5)。由这些结果来看，含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物3％的溶液具有育毛活性。

另一方面，于小鼠的皮肤试验片移植部位涂布含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物1％的溶液时，相比于标准数据，毛干成长速度在第二毛囊周期未有显著差异，毛干最大长度在第三毛囊周期虽未有显著差异但也提升(参照表6及图6)。由这些结果来看，含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物1％的溶液的育毛活性有具显著差异的倾向。

因此，棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的育毛活性的有效下限浓度以棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物的含量而言建议在1％至3％之间。

<试验例2：棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物所进行细胞分裂活性评价>

1.材料及方法

(1)实验动物

由6至8周龄的C57BL/6N小鼠(日本SLC股份有限公司，日本)采取背部体毛皮肤。动物的饲育及实验遵守相关法规、法令、及指针并获得理化学研究所实验伦理审查会而实施。

(2)药剂

分别准备以下药剂。

比较例1：60％乙醇水溶液。

比较例5：RiUPX5PLUS(大正制药，日本)。

(3)药剂涂布

将C57BL/6N小鼠的背部体毛进行拔毛。使用微移液管于C57BL/6N小鼠的左右背部涂布25μL药剂。其后使用干燥器于涂布部位吹以冷风使药剂快速干燥。在左右背部分别重复4次该作业。在拔毛隔天起进行7天该药剂涂布作业。

(4)BrdU投药

从涂布7天药剂的C57BL/6N小鼠采取背部体毛皮肤，于其24小时及48小时前使用注射器(Terumo股份有限公司，日本)于各小鼠的后脚部分腹部投药10mg/mL的BrdU/生理食盐水0.5mL。

(5)小鼠皮肤组织采取及固定

在第8天于与投药时间相同时间使C57BL/6N小鼠通过颈椎脱臼而安乐死后，以不伤害毛球部的方式采取皮肤组织。将采取的皮肤组织于SuperFix(东洋纺股份有限公司，日本)浸于固定液16至24小时后，以1×PBS洗涤4次，放入新的1×PBS并保管。切除其皮肤组织的必要部分，以石蜡液交换机(Leica Microsystems GmbH，德国)制作石蜡块。

(6)切片制作

将石蜡化皮肤组织块以薄片切片机(Leica Microsystems GmbH，德国)切片化，将切片贴合于镀铂载玻片(PLATINUM PRO(松浪硝子工业股份有限公司，日本))，以40℃温蒸气放置8至10小时干燥。

(7)BrdU免疫染色

为了实施脱石蜡处理而将载有样品的载玻片依次浸于二甲苯、二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、70％乙醇各3分钟。将经脱石蜡处理的载玻片于室温浸于2M HCl30分钟。将载玻片设置于Ventana Discovery ULTRA(自动染色装置)并启动程序。将1次抗体Anti-BrdUantibody-Proliferation Marker(abcam，英国)以稀释溶液(1％BSA，0.1％TX100/PBS)稀释160倍，在加入1次抗体的时机添加100μL/样品数。将2次抗体Donkey Anti-Sheep IgG H&L(Alexa Flour 594)(Thermo Fisher Scientific，美国)及Hoechst(Hoechst33342)以稀释溶液(1％BSA，0.1％TX100/PBS)稀释500倍，添加100μL/样品数。程序结束后，流通0.1％TX100/PBS并洗涤，浸于1×PBS。将水溶性封入剂(0.5％没食子酸，90％甘油/PBS)以80μL/样品数滴入后，载于盖玻片，以黄片挤出空气，以抽滤管移动盖玻片位置并去除多余封入剂，使用顶封剂(美甲用)封住盖玻片四边。确认顶封剂干燥后，以Axio Scan扫描影像并解析。

(8)BrdU的测量方法

划上5000μm的线，并测量位于该范围的表皮层、真皮层、位于毛囊的BrdU数。

2.结果

本试验例中使用已拔毛的C57BL/6N小鼠，将溶解于60％乙醇的浓度1％及3％的棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸作为试验用药剂液连日涂布。并涂布作为阴性对照组的60％乙醇、及作为阳性对象的RiUP(5％制剂)。这些涂布是以1次/天的总涂布量为100μl的方式进行7天。另外，在6、7天的相同时间从腹部投药BrdU，其隔天采取皮肤组织。将采取的皮肤组织石蜡化并制作切片，并进行BrdU的免疫染色，通过测量BrdU数而观察细胞活性。结果示于图7及图8。

由图7及图8明显可知，相比于阴性对照组及阳性对象，通过涂布本发明的手段的有效成分的棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸，而有细胞分裂活性增大的倾向，可知棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸3％至少可提升毛囊中的细胞分裂活性，本发明的手段的有效成分具有育毛活性。另外，通过涂布本发明的手段的有效成分的棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸，而确认到表皮基底层中的细胞分裂活性的亢进，本发明的手段的有效成分具有头皮保养效果。本发明的手段的有效成分的棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸发挥优异育毛活性，且可同时发挥涂布部分中的头皮保养效果，可发挥优异效果。

<试验例3：棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物所进行粗毛化活性评价>

1.材料及方法

(1)实验动物

以与上述试验例1相同的顺序由7至8周龄的C57BL/6N小鼠(SLC)采取背部体毛皮肤，将所制作源自于背部体毛皮肤的毛群移植至4至6周龄的Balb/cnu/nu小鼠(SLC)后，涂布药剂。动物的饲育及实验动物的饲育及实验遵守相关法规、法令、及指针并获得理化学研究所实验伦理审查会而实施。

(2)药剂

试验使用以下药剂。

比较例1：60％乙醇水溶液。

比较例5：RiUPX5PLUS(注册商标)(大正制药，日本)。

(3)粗毛化的测量方法

使用试验例1中第3周期结束的成长的毛干进行粗毛化测量。所采取毛干中使用Zigzag毛2根。以边长100μm正方形选择3处其中心部分变粗范围。测量所选择范围5处。

2.结果

使用药剂涂布后的毛测量毛干直径的结果示于图9。另外，评价相对于对照的涂布60％乙醇水溶液的比较例1中的毛干直径的增加率，结果示于表7。

[表7]

相比于对照的涂布60％乙醇水溶液的比较例1，涂布本发明的手段的有效成分的棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸可确认到产生明确粗毛化。该粗毛化程度为与比较例5同等，确认到与上市育毛剂的RiUPX5PLUS同等的活性。

<试验例4：人类毛乳头细胞中的FGF-7基因及VEGF基因表现的评价>

1.材料及方法

(1)有关人类毛乳头细胞及培养基

购入人类毛乳头细胞(目录编号：CA60205a，白色人种，源自于29岁男性，东洋纺股份有限公司(日本))，以准则所记载方式维持、培养细胞，并进行试验评价。

(2)药剂

试验用药剂是调制以下各浓度(终浓度)的药剂溶液并使用。

实施例3：棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物0.1％溶液。

实施例4：棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物0.025％溶液。

米诺地尔30μM。

腺苷100μM。

(3)试验方法

将人类毛乳头细胞以5×10⁴个/孔的方式播种于96孔盘。在CO₂培养器(5％CO₂、37℃)内培养1天后，取代为含有各试验用药剂的培养基。其后将细胞板放回CO₂培养器，进一步培养24小时或72小时。培养后，从各孔抽取全RNA并回收，其反转录为cDNA。使用所调制cDA以实时PCR法测定FGF-7基因的表现。内标准使用GAPDH基因，计算与阴性对照群的相对值作为FGF-7基因的表现量。

由细胞的全RNA回收使用FastGene RNA BasicKit(目录编号：FG-80250，NIPPONGenetics股份有限公司(日本))。

于每孔添加100μL的溶解缓冲液RL，以移液器溶解细胞。于细胞溶解液添加70％乙醇100μL，以移液器混合。将样品溶液添加于FastGene RNA binding column，以10000g、1分钟在室温离心分离。将通过管柱的滤液从接收管废弃，使FastGene RNA binding column放回原来的接收管后，将600μL的洗涤缓冲液RW1加入于FastGene RNA binding column，以10000g、1分钟在室温离心分离。将FastGene RNA binding column移至新的接收管并装设，将700μL的洗涤缓冲液RW2加入于FastGene RNA binding column，以10000g、1分钟在室温离心分离。FastGene RNA binding column移至新的接收管并装设，以15000rpm、1分钟在室温离心分离。FastGene RNA binding column移至新的接收管并装设，将50μL的溶出缓冲液RE添加于FastGene RNA binding column的薄膜中央，以10000g、1分钟在室温离心分离，回收精制的RNA。以NanoDrop Lite(目录编号：ND-LITE，Thermo Fisher Scientific股份有限公司)测定回收的RNA浓度，在-80℃保存至接下来的cDNA化作业。

cDNA的合成使用FastGene scriptaseII cDN Asynthesis 5×Ready Mix(目录编号：NE-LS64，NIPPON Genetics股份有限公司(日本))。以于新的管生成的全RNA浓度成为20ng/mL的方式，以RNase Free Water稀释，于该样品溶液16μL添加FastGene scriptaseIIcDNA synthesis5×Ready Mix4μL，以漩涡搅拌。使用Mini Amp温度循环器(Thermo FisherScientific股份有限公司)，以25℃、10分钟；42℃、60分钟；85℃、5分钟培养并合成cDNA。

将以上述方法合成的cDNA用于实时PCR。于96孔盘的规定孔各别添加cDNAtemplate稀释液，添加THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(目录编号：QPS-201，东洋纺股份有限公司(日本))及引子并混合，以QuantStudio 7Flex Real-Time PCR System(目录编号：4485693，Thermo Fisher Scientific股份有限公司)解析基因表现。PCR反应为95℃、5秒；60℃、30秒；及72℃、30秒进行40循环。

试验所使用VEGF基因特异的引子、FGF-7基因特异的引子、及内标准的GAPDH基因特异的引子如以下所示。

FGF-7基因表现检测用引子

顺向：tctgtcgaacacagtggtacctgag(序列编号1)。

逆向：gccactgtcctgatttccatga(序列编号2)。

VEGF基因表现检测用引子

顺向：atcttcaagccatcctgtgtgc(序列编号3)。

逆向：caaggcccacagggattttc(序列编号4)。

GAPDH基因表现检测用引子

顺向：catccctgcctctactggcgctgcc(序列编号5)。

逆向：ccaggatgcccttgagggggccctc(序列编号6)。

用以下方式计算各基因的相对表现量。

以各基因的增幅曲线与阈值线的交点计算Ct值(PCR循环数)。由目的基因的Ct值除以内标准GAPDH基因的Ct值，以此值作为相对表现量。

2.结果

于人类毛乳头细胞使棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物作用24小时及72小时后，测定FGF-7基因以及VEGF基因的表现量变化，其结果分别示于图10(24小时)及图11(72小时)。

如图10所示，相对于人类毛乳头细胞使棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物以最终浓度3％的方式作用24小时的群，与无添加对照群相比，可确认到FGF-7基因表现量及VEGF基因表现量显著上升。

接着，这些FGF-7基因表现量及VEGF基因表现量皆大于米诺地尔或腺苷作用的情形。

另外，相对于人类毛乳头细胞使棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物以最终浓度0.1％的方式作用24小时的群，与无添加对照群相比，也可确认到FGF-7基因表现量及VEGF基因表现量显著上升。

又进一步地，如图11所示，相对于人类毛乳头细胞使棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物以最终浓度3％的方式作用72小时的群，与无添加对照群相比，也可确认FGF-7基因表现量及VEGF基因表现量显著上升。另外，可确认这些基因表现量的上升程度与24小时作用的情形相比为变大。

接着，这些FGF-7基因表现量及VEGF基因表现量为皆大于米诺地尔或腺苷作用的情形。

另外，相对于人类毛乳头细胞使棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸的混合物以最终浓度0.1％作用72小时的群，与无添加对照群相比，也可确认到FGF-7基因表现量及VEGF基因表现量显著上升。

已知人类毛乳头细胞中的FGF-7基因的表现亢进、及VEGF基因的表现亢进皆有助于人类的育毛活性的亢进。由以上所示试验结果来看，棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸皆可使人类毛乳头细胞中的FGF-7基因及VEGF基因的表现量亢进，且通过长时间作用而可更提高这些基因表现量。如上述，棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸可做为用以使人类育毛活性的有效成分亢进。

[产业利用性]

通过本发明的手段，使用棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸作为外用剂的育毛剂的有效成分，据此可提供一种新的育毛剂及头皮保养剂，可发挥头发、眉毛和/或睫毛等毛中的毛干的成长促进效果、毛干伸长速度的提升效果、毛干最大长度的提升效果及毛干直径增大的效果、以及头皮保养效果。

Claims

1.一种毛乳头细胞的FGF-7促生成剂，含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸。

2.一种毛乳头细胞的VEGF促生成剂，含有棕榈酰基二肽-5二氨基丁酰基羟基苏氨酸及棕榈酰基二肽-5二氨基羟基丁酸。