WO2022107866A1 - 育毛剤 - Google Patents
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Classifications
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth
Definitions
- the present invention relates to a hair restorer. More specifically, the present invention relates to a hair growth agent which is an external preparation containing phytosphingosine.
- the hair-growth agent which is an external preparation containing chiro-inositol described in Patent Document 4
- the hair-growth agent is only supported by the hair-growth effect in subjects who are not insulin resistant, and the number of administration subjects is limited. Therefore, it does not fully meet the demands of a wide range of consumers who desire a hair growth effect and a hair type / quality improvement effect.
- Phytosphingosine is known as a component of cosmetic raw materials (see Patent Document 5). However, there are no reports on the hair-growth effect of phytosphingosine.
- An object of the present invention is to provide a hair-growth agent having an excellent hair-growth effect.
- the first means of the present invention for solving the above-mentioned problems is a hair-growth agent which is an external preparation containing phytosphingosine.
- the second means of the present invention for solving the above-mentioned problems is the hair growth agent according to the first means of the present invention, wherein the content of phytosphingosine is 0.001 to 20% by weight based on the whole. be.
- the third means of the present invention for solving the above-mentioned problems is the first means or the second means of the present invention in which the content of phytosphingosine is 0.005 to 10% by weight based on the whole.
- the described hair restorer is the first means or the second means of the present invention in which the content of phytosphingosine is 0.005 to 10% by weight based on the whole.
- the fourth means of the present invention for solving the above-mentioned problems is the hair growth agent according to any one of the first to third means of the present invention, which is used for promoting hair stem growth or hair growth. Is.
- the fifth means of the present invention for solving the above-mentioned problems is the hair growth agent according to any one of the first to fourth means of the present invention, which is used for improving the hair stem elongation rate. Is.
- the sixth means of the present invention for solving the above-mentioned problems is the hair growth agent according to any one of the first to fourth means of the present invention, which is used to improve the maximum hair shaft length. Is.
- the seventh means of the present invention for solving the above-mentioned problems is the hair growth agent according to any one of the first to fourth means of the present invention, which is used for increasing the hair shaft diameter. be.
- the eighth means of the present invention for solving the above-mentioned problems is the hair growth agent according to any one of the first to fourth means of the present invention, which is used for increasing the number of hairs. ..
- the ninth means of the present invention for solving the above-mentioned problems is a hair-growth agent according to any one of the first to eighth means of the present invention, which is a solution.
- the tenth means of the present invention for solving the above-mentioned problems is the hair growth according to any one of the first to ninth means of the present invention for hair, hair, eyebrows and / or eyelashes. It is an agent.
- the eleventh means of the present invention for solving the above-mentioned problems is a hair-growth method including administration of the hair-growth agent according to any one of the first to tenth means of the present invention to a subject. ..
- Another means of the present invention for solving the above-mentioned problems is a scalp care agent which is an external preparation containing phytosphingosine.
- Another means of the present invention for solving the above-mentioned problems is a method for improving scalp symptoms, which comprises administering a scalp care agent, which is an external preparation containing phytosphingosine, to a subject.
- phytosphingocin as an active ingredient of a hair restorer which is an external preparation
- hair stem growth promotion hair shaft elongation rate improvement
- maximum hair shaft length in hair, hair, eyebrows and / or eyelashes are achieved.
- An excellent hair restorer and scalp care agent that have an effect of improving hair stalks, an effect of increasing the diameter of the hair shaft, and an scalp care effect will be provided.
- FIG. 1 is a plot showing changes in hair shaft length at a drug-applied site in mice after application of a 60% ethanol aqueous solution.
- the vertical axis represents the hair shaft length (mm), and the horizontal axis represents the number of days.
- the first hair cycle shows standard data applied with a 60% ethanol aqueous solution containing no drug.
- FIG. 2 is a plot showing changes in hair shaft length at the drug application site in mice after application of a 60% ethanol aqueous solution containing minoxidil (5%).
- the vertical axis represents the hair shaft length (mm), and the horizontal axis represents the number of days.
- the first hair cycle shows standard data applied with a 60% ethanol aqueous solution containing no drug.
- FIG. 1 is a plot showing changes in hair shaft length at a drug-applied site in mice after application of a 60% ethanol aqueous solution.
- the vertical axis represents the hair shaft length (mm), and the horizontal axis represents the number of days.
- FIG. 3 is a plot showing changes in hair shaft length at the drug application site in mice after application of a 60% ethanol aqueous solution containing minoxidil (3%).
- the vertical axis represents the hair shaft length (mm), and the horizontal axis represents the number of days.
- the first hair cycle shows standard data applied with a 60% ethanol aqueous solution containing no drug.
- FIG. 4 is a plot showing changes in hair shaft length at the drug application site in mice after application of a 60% ethanol aqueous solution containing minoxidil (1%).
- the vertical axis represents the hair shaft length (mm), and the horizontal axis represents the number of days.
- the first hair cycle shows standard data applied with a 60% ethanol aqueous solution containing no drug.
- FIG. 5 is a plot showing changes in hair shaft length at the drug application site in mice after application of a 60% ethanol aqueous solution containing phytosphingosine (3%).
- the vertical axis represents the hair shaft length (mm), and the horizontal axis represents the number of days.
- the first hair cycle shows standard data applied with a 60% ethanol aqueous solution containing no drug.
- FIG. 6 is a plot showing changes in hair shaft length at the drug application site in mice after application of a 60% ethanol aqueous solution containing phytosphingosine (1%).
- the vertical axis represents the hair shaft length (mm), and the horizontal axis represents the number of days.
- the first hair cycle shows standard data applied with a 60% ethanol aqueous solution containing no drug.
- FIG. 7 is a graph showing changes in VEGF gene expression level in human dermal papilla cells when stimulated with tosphingocin for 72 hours.
- FIG. 8 shows the evaluation of cell division activity by phytosphingosine stimulation. Cells in which BrdU uptake can be confirmed are indicated by upward triangles ( ⁇ or ⁇ ).
- FIG. 9 shows the evaluation of cell division activity by phytosphingosine stimulation.
- the active ingredient of the hair restorer and the scalp care agent which are external agents according to the present invention, consists of phytosphingosine.
- the concentration of phytosphingosine which is an active ingredient in the hair restorer and scalp care agent of the present invention, is 0.001 to 20% by weight based on the total amount of the hair restorer and scalp care agent. More specifically, it is 0.005 to 10% by weight.
- the hair restorer and scalp care agent of the present invention include pharmaceuticals, non-pharmaceutical products, hair, hair, eyebrows and / or cosmetics including eyelid cosmetics and scalp cosmetics, and ointments, paps, liniments, lotions, and external liquid preparations. , Creams, gels, emulsions, hair tonics, hair sprays, microneedles and the like, but are not limited to these.
- ingredients such as additives that are permissible may be blended.
- Ingredients such as this additive include, for example, excipients, stabilizers, odorants, bases, dispersants, diluents, anionic surfactants, amphoteric surfactants, nonionic surfactants, and cationic surfactants.
- Activators anionic polymers, nonionic polymers, ethylene oxide / propylene oxide block copolymers, alcohols, emulsifiers, transdermal absorption promoters, pH adjusters, preservatives, colorants, fats and oils, mineral oils, etc. Oils, moisturizers, thickeners, polymers, film-forming agents, UV absorbers, cell activators, moisturizers, inorganic salts, functional beads and capsules, silicones, metal chelating agents, antioxidants, preservatives, Cooling agents, deodorants, pigments, dyes, fragrances, sugars, amino acids, vitamins, organic acids, organic amines, plant extracts, viscosity modifiers such as clay minerals and various polymers, but are limited to these. It is not something that is done.
- the hair growth agent and scalp care agent of the present invention may contain known components having effects such as hair growth, hair growth, and hair growth.
- the dose of the active ingredient per administration of the hair restorer and the scalp care agent in the means of the present invention can be adjusted so that the effects of the hair restorer and the scalp care agent of the present invention are exhibited.
- the dose thereof can be, for example, 0.005 to 200 mg, specifically 0.05 to 100 mg, and more specifically 0.5 to 10 mg.
- the number of administrations of the hair restorer and scalp care agent of the present invention can be one or more so that the effects of the hair restorer and scalp care agent of the present invention can be exhibited.
- the number of administrations of the hair restorer and the scalp care agent of the present invention can be, for example, 1 to 6 times per day. Then, specifically, it can be 1 to 3 times a day, and more specifically, 1 to 2 times a day.
- the hair restorer and scalp care agent of the present invention are related to hair shaft growth promotion, hair growth and hair loss prevention, and are preferably related to hair shaft growth promotion and hair growth.
- promoting hair shaft growth means improving the hair shaft elongation rate, improving the maximum hair shaft length, and / or increasing the hair shaft diameter.
- hair growth means that hair growth has stopped or the ability to grow hair has decreased in areas where hair is not growing (hair shafts do not appear outside the epidermis) or where the number of hairs is small. It means promoting the growth of new hair from the opened pores and increasing the number of hairs, specifically, shortening the resting period in the hair cycle and / or resuming the stopped hair cycle. ..
- having a hair shaft growth promoting effect means having an advantageous action on hair stem growth promoting effect, and a characteristic showing a hair shaft growth promoting effect is referred to as "hair shaft growth promoting activity”. Further, “having a hair growth effect” means having an advantageous action on hair growth, and a characteristic showing a hair growth effect is referred to as "hair growth promoting activity”.
- hair loss means a phenomenon in which hair stems are shed from pores, and more specifically, it means an increase in inhibitory cytokines and the like that inhibit cell proliferation and cell death thereof.
- the characteristic showing the hair loss prevention effect is called “hair loss prevention activity”.
- “having a hair loss preventing effect” means that the number of hair follicles shed from the pores is reduced through inhibition or reduction of inhibitory cytokines and suppression of cell death, and promotes and develops hair follicles. It is a physiological phenomenon that is different from the characteristics that show the hair effect.
- the "scalp symptom” means a symptom such as dandruff, rough skin of the scalp, dryness of the scalp, erythema, itch, and pimples.
- "improvement of scalp symptom” means suppression or improvement of dandruff, rough skin of scalp, dryness of scalp, erythema, itch, pimple and the like.
- the hair restorer of the present invention can be used to improve the hair shaft elongation rate or the hair shaft maximum length.
- the hair shaft elongation rate can be improved by, for example, up to 110%, specifically by about 25 to 110%, as compared with the hair stem elongation rate in the standard data of the hair cycle. More specifically, it can be improved by about 33 to 110%.
- the maximum hair shaft length can be improved by, for example, up to 49%, specifically by about 1 to 49%, as compared with the maximum hair shaft length in the standard data of the hair cycle. More specifically, it can be improved by about 2 to 49%.
- the hair restorer of the present invention can be used to increase the diameter of the hair shaft.
- new hair grows from pores where hair growth is stopped or hair growth ability is reduced at a site where hair is not growing (hair shaft does not come out from the epidermis) or the number of hair is small. It can be used to promote this and increase the number of hairs, and more specifically to shorten the resting period in the hair cycle and / or to resume the stopped hair cycle.
- the hair restorer and scalp care agent of the present invention can be used not only for humans but also for animals such as livestock and pets.
- a method for hair growth and a method for improving scalp symptoms which comprises administering an external preparation containing phytosphingosine to a subject including humans and animals such as livestock and pets.
- the planned back body hair skin collection site of 7 to 8 week old C57BL / 6N mice was removed and bred for 12 to 14 days. Then, after euthanizing the hair-extracted C57BL / 6N mouse by cervical spine dislocation, an appropriate amount of back body hair skin was collected from the planned back body hair skin collection site.
- DMEM10 DMEM medium
- the collected skin was immersed in DMEM medium (hereinafter referred to as "DMEM10") containing 10 mM HEPES, 10% fetal bovine serum, and 1% penicillin / streptomycin solution.
- DMEM10 DMEM medium
- the collected back hair skin is pinched with bent tweezers and soaked in a sterilizing solution for 10 seconds for treatment. Sterilization was performed using a fresh solution in the order of povidone iodine 7% solution treatment twice, PBS ( ⁇ ) treatment three times, and DMEM10 treatment twice. After sterilization, it was immersed in clean DMEM10.
- the transparent connective tissue attached to the cutaneous muscle layer of the skin was excised using curved scissors, and the hair group was cut into rectangular strips along the hair flow. At that time, the hair follicles were adjusted to have 5 rows on the short axis, and the hair follicles on the long axis were cut into 6 rows and blocked.
- the skin test piece derived from the back body hair skin prepared above was transplanted into 4 to 6 week old Balb / c nu / nu mice.
- mice were anesthetized with isoflurane according to a conventional method. Then, the back of the mouse was disinfected with a povidone iodine 7% solution, and then the mouse was placed in a natural lying position. Then, the back of the mouse was punctured with a Manny Offsalmic Knife (Manny Co., Ltd., Japan) to form a transplant wound extending from the epidermal layer of the skin to the lower layer of the dermis layer.
- a Manny Offsalmic Knife Manny Co., Ltd., Japan
- a skin test piece derived from the back body hair skin was inserted into the formed transplant wound so that the hair group faces the body surface side of the transplant wound.
- the transplantation depth of the skin test piece was adjusted so that the upper end of the hair group was exposed at the upper end of the transplant wound.
- the transplanted wound into which the skin test piece derived from the back body hair skin was transplanted was covered with Nurse Van (registered trademark) (Sample Planet Co., Ltd., Japan) and surgical tape (3M Japan Ltd., Japan) as protective tapes. Protected the transplant wound.
- the hair shaft diameter was measured using the hair after application of the drug.
- the hair shaft diameter was 15.89 ⁇ m when a control 60% ethanol aqueous solution was applied.
- the hair shaft diameter when the minoxidil 5% solution was applied was 18.28 ⁇ m.
- the rate of increase from the control hair shaft diameter when minoxidil was applied was 115%.
- the hair shaft diameter was 20.15 ⁇ m.
- the rate of increase from the control hair shaft diameter when phytosphingosine was applied was 127%.
- Human dermal papilla cells and medium Purchase human dermal papilla cells (catalog number: CA602t05a, white race, derived from 29-year-old male, Toyo Spinning Co., Ltd. (Japan)) and make them listed in the protocol. The cells were maintained and cultured for test evaluation.
- Test method Human dermal papilla cells were seeded on a 24-well plate so as to have 6 ⁇ 10 3 cells / well. After culturing in a CO 2 incubator (5% CO 2 , 37 ° C.) for 1 day, the cells were replaced with a medium containing each test drug. The cell plates were then returned to the CO 2 incubator and cultured for an additional 72 hours. After culturing, total RNA was extracted from each well, recovered, and reverse transcribed into cDNA. The expression of the VEGF gene was measured by the real-time PCR method using the prepared cDNA. The GAPDH gene was used as an internal standard, and the expression level of the VEGF gene was calculated as a relative value to the negative control group.
- 300 ⁇ L of lysis buffer RL was added per well, and the cells were lysed by pipetting. 300 ⁇ L of 70% ethanol was added to the cytolysate and mixed by pipetting. The sample solution was added to FastGene RNA binding volume and centrifuged at 10,000 g for 1 minute at room temperature. The filtrate that passed through the column was discarded from the collection tube, the FastGene RNA binding volume was returned to the original collection tube, 600 ⁇ L of the washing buffer RW1 was added to the FastGene RNA binding volume, and the mixture was centrifuged at 10000 g for 1 minute at room temperature.
- the FastGene RNA binding collection was transferred to a new collection tube and set, 700 ⁇ L of the wash buffer RW2 was added to the FastGene RNA binding collection, and the mixture was centrifuged at 10000 g for 1 minute at room temperature.
- the FastGene RNA binding collection was transferred to a new collection tube, set, and centrifuged at 15000 rpm for 1 minute at room temperature.
- the FastGene RNA binding volume was transferred to a new collection tube and set, 50 ⁇ L of elution buffer RE was added to the center of the membrane of the FastGene RNA binding volume, and the mixture was centrifuged at 10000 g for 1 minute at room temperature to recover the purified RNA.
- the concentration of the recovered RNA was measured by NanoDrop Lite (catalog number: ND-LITE, Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) and stored at ⁇ 80 ° C. until the next cDNA conversion operation.
- FastGene scriptaseII cDNAsynthesis 5 x Ready Mix (catalog number: NE-LS64, Japan Genetics Co., Ltd. (Japan)) was used for the synthesis of cDNA.
- the total RNA produced in the new tube was diluted with RNase Free Water so that the concentration was 20 ng / mL, and 4 ⁇ L of FastGene scriptaseII cDNAsynthesis 5 ⁇ Ready Mix was added to 16 ⁇ L of this sample solution, and the mixture was stirred with vortex.
- a MiniAmp thermal cycler Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.
- the cDNA was synthesized by incubating at 25 ° C. for 10 minutes, 42 ° C. for 60 minutes, and 85 ° C. for 5 minutes.
- the cDNA synthesized by the above method was used for real-time PCR.
- Each cDNA gene diluent is added to a predetermined well of a 96-well plate, and a primer is added and mixed with THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (catalog number: QPS-201, Toyo Spinning Co., Ltd. (Japan)), and QuantStudio 7 Flex Real. -Gene expression was analyzed by Time PCR System (catalog number: 4485693, Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.).
- As a PCR reaction 40 cycles of 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 30 seconds were performed.
- Primer for detecting VEGF gene expression Forward: aggccagcacataggagaga (SEQ ID NO: 1) Reverse direction: acgcgagtctgtgttttgc (SEQ ID NO: 2)
- Primer for detecting GAPDH gene expression Forward: catccctgcctctactggcgctgcc (SEQ ID NO: 3)
- Reverse direction ccaggatgcccttgagggggccctc (SEQ ID NO: 4)
- the relative expression level of each gene was calculated as follows.
- the Ct value (number of PCR cycles) was calculated from the intersection of the amplification curve of each gene and the threshold line.
- the relative expression level is the value obtained by dividing the Ct value of the target gene by the Ct value of the internal standard GAPDH gene.
- Section preparation A block of paraffinized skin tissue is sectioned with a microtome (Leica Microsystems GmbH, Germany), and the section is attached to a platinum-coated slide glass (Platinum Pro (Matsunami Glass Industry Co., Ltd., Japan)). It was allowed to stand in warm steam at ° C for 8 to 10 hours to dry.
- a microtome Leica Microsystems GmbH, Germany
- Platinum-coated slide glass Platinum Pro (Matsunami Glass Industry Co., Ltd., Japan)
- phytosphingosine which is an active ingredient of the means of the present invention
- At 3% at least the cell division activity in hair follicles was improved, and the results suggesting that the active ingredient of the means of the present invention has hair growth activity.
- the application of phytosphingosine, which is the active ingredient of the means of the present invention enhances the cell division activity in the basal layer of the epidermis, and that the active ingredient of the means of the present invention provides a scalp care effect.
- phytosphingosine which is the active ingredient of the means of the present invention, exhibits excellent hair-growth activity and at the same time exhibits an excellent scalp care effect at the applied portion. It became.
- the hair stem growth promoting effect and hair shaft in hair such as hair, hair, eyebrows and / or eyelashes. It is possible to provide new hair growth agents and scalp care agents that have an effect of improving the elongation rate, an effect of improving the maximum length of the hair shaft, an effect of increasing the diameter of the hair shaft, and an effect of scalp care.
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Abstract
頭髪、須毛、眉毛および／または睫毛における毛幹成長を促進し、毛乳頭細胞における育毛に寄与する遺伝子発現を亢進し、発毛、毛幹伸長速度の向上、毛幹最大長の向上の効果及び毛幹径の増大の効果ならびにスカルプケア効果を奏する外用剤である育毛剤およびスカルプケア剤を提供するため、その有効成分として、フィトスフィンゴシンを含有するものとする。
Description
本発明は、育毛剤に関する。さらに詳しくは、フィトスフィンゴシンを含む外用剤である育毛剤に関する。
ヒトを始めとする哺乳動物において、育毛効果および毛種・毛質を改善する育毛剤などの外用剤の需要が伸びている。育毛効果および毛種・毛質を改善のため、毛のライフサイクルである毛周期を調節することに寄与する有効成分が提案され、育毛剤として上市されつつある。
たとえば、育毛剤の有効成分としてミノキシジルの利用が提案され（特許文献１～３などを参照。）、ヒト臨床試験を経て、ミノキシジルを有効成分とする育毛剤が上市されている。しかしながら、その医薬用途は本邦においては男性の壮年性脱毛症に限られるなど、育毛効果および毛種・毛質改善効果を所望する幅広い消費者の要望を十分に叶えるものとはなっていない。
また、育毛剤の有効成分としてchiro-イノシトールの利用が提案されている（特許文献４を参照。）。しかしながら、特許文献４に記載のchiro-イノシトールを含む外用剤である育毛剤は、インスリン抵抗性ではない対象においてのみ育毛効果が裏付けられるに留まり、投与対象者が限られている。そのため、育毛効果および毛種・毛質改善効果を所望する幅広い消費者の要望を十分に叶えるものとはなっていない。
フィトスフィンゴシンは、化粧品原材料の成分として知られている（特許文献５を参照。）。しかしながら、フィトスフィンゴシンの育毛効果に関する報告はない。
本発明の目的は、優れた育毛作用を有する育毛剤を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、フィトスフィンゴシンを有効成分とすることで、育毛活性を発揮させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
上記の課題を解決するための本発明の第１の手段は、フィトスフィンゴシンを含む外用剤である育毛剤である。
上記の課題を解決するための本発明の第２の手段は、フィトスフィンゴシンの含有量が全体に対して０．００１～２０重量％である、本発明の第１の手段に記載の育毛剤である。
上記の課題を解決するための本発明の第３の手段は、フィトスフィンゴシンの含有量が全体に対して０．００５～１０重量％である、本発明の第１の手段または第２の手段に記載の育毛剤である。
上記の課題を解決するための本発明の第４の手段は、毛幹成長促進または発毛に用いるための、本発明の第１～第３の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
上記の課題を解決するための本発明の第５の手段は、毛幹伸長速度を向上させるために使用する、本発明の第１～第４の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
上記の課題を解決するための本発明の第６の手段は、毛幹最大長を向上させるために使用する、本発明の第１～第４の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
上記の課題を解決するための本発明の第７の手段は、毛幹径を増大させるために使用する、本発明の第１～第４の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
上記の課題を解決するための本発明の第８の手段は、毛数を増加させるために使用する、本発明の第１～第４の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
上記の課題を解決するための本発明の第９の手段は、溶液である、本発明の第１～第８の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
上記の課題を解決するための本発明の第１０の手段は、頭髪、須毛、眉毛および／または睫毛用の、本発明の第１～第９の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
上記の課題を解決するための本発明の第１１の手段は、本発明の第１～第１０の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤を対象に投与することを含む育毛方法である。
上記の課題を解決するための本発明のその他の手段は、フィトスフィンゴシンを含む外用剤であるスカルプケア剤である。
上記の課題を解決するための本発明のその他の手段は、フィトスフィンゴシンを含む外用剤であるスカルプケア剤を対象に投与することを含む頭皮症状改善方法である。
本発明の手段により、フィトスフィンゴシンを外用剤である育毛剤の有効成分とすることで、頭髪、須毛、眉毛および／または睫毛における毛幹成長促進、毛幹伸長速度の向上、毛幹最大長の向上の効果及び毛幹径の増大の効果並びにスカルプケア効果が奏される優れた育毛剤およびスカルプケア剤が提供されることとなる。
本発明を実施するための形態について、以下に説明する。なお、本発明はこれらの例示にのみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々の変更を加え得ることは勿論である。
本発明に係る外用剤である育毛剤およびスカルプケア剤の有効成分は、フィトスフィンゴシンからなる。
本発明の育毛剤およびスカルプケア剤における有効成分であるフィトスフィンゴシンの濃度は、育毛剤およびスカルプケア剤の全体に対し、０．００１～２０重量％である。より具体的には、０．００５～１０重量％である。
本発明の育毛剤およびスカルプケア剤は、医薬品、医薬部外品、頭髪、須毛、眉毛および／または睫毛用化粧品および頭皮用化粧品を含む化粧品などとし、軟膏、パップ、リニメント、ローション、外用液剤、散布剤、クリーム、ジェル、乳液、ヘアトニック、ヘアスプレー、マイクロニードルなどといった様々な態様の製剤として使用することができるが、これらに限定されるものではない。
また、さらに、本発明の育毛効果およびスカルプケア効果を妨げない程度において、医薬品、医薬部外品、頭髪、須毛、眉毛および／または睫毛用化粧品および頭皮用化粧品を含む化粧品などにおいて通常含有することが許容される添加物等の成分を、配合したものとしてもよい。この添加物等の成分としては、例えば賦形剤、安定剤、矯臭剤、基剤、分散剤、希釈剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性重合体、非イオン性重合体、エチレンオキシド・プロピレンオキシドブロック共重合体、アルコール類、乳化剤、経皮吸収促進剤、ｐＨ調整剤、保存剤、着色剤、油脂、鉱物油などの油分、保湿剤、増粘剤、ポリマー、皮膜形成剤、紫外線吸収剤、細胞賦活剤、保湿剤、無機塩、機能性ビーズ・カプセル類、シリコーン類、金属キレート剤、酸化防止剤、防腐剤、清涼剤、消臭剤、顔料、染料、香料、糖類、アミノ酸類、ビタミン類、有機酸、有機アミン、植物抽出物、粘土鉱物や各種ポリマーなどの粘度調整剤などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の育毛剤およびスカルプケア剤は、発毛、育毛、養毛などの効果を有する公知の成分を含有するものとしてもよい。
本発明の手段における育毛剤およびスカルプケア剤の１投与あたりの有効成分の投与量は、本発明の育毛剤およびスカルプケア剤の効果が奏されるように調節することができる。そして、その投与量は、例えば０．００５～２００ｍｇ、具体的には０．０５～１００ｍｇ、より具体的には０．５～１０ｍｇとすることができる。
本発明の育毛剤およびスカルプケア剤の投与回数は、本発明の育毛剤およびスカルプケア剤の効果が奏されるよう、１回もしくは複数回とすることができる。そして、本発明の育毛剤およびスカルプケア剤の投与回数は、例えば１日あたり１～６回とすることができる。そして、具体的には１日あたり１～３回、より具体的には１日あたり１～２回とすることができる。
本発明の育毛剤およびスカルプケア剤は、毛幹成長促進、発毛および脱毛防止に関するものであり、好ましくは毛幹成長促進および発毛に関するものである。
本明細書において、「毛幹成長促進」との用語は、毛幹伸長速度を向上させること、毛幹最大長を向上させること、および／または毛幹径を増大させることを意味する。
本明細書において、「発毛」との用語は、毛が生えていない（表皮から外に毛幹が出ていない）または毛数の少ない部位において発毛が停止した、または発毛能力が低下した毛穴から新しい毛が生えることを促進して毛数を増加させることを意味し、詳細には、毛周期における休止期を短縮すること、および／または停止した毛周期を再開させることを意味する。
本明細書において、「毛幹成長促進効果を有する」とは毛幹成長促進に有利に作用することを意味し、毛幹成長促進効果を示す特質を「毛幹成長促進活性」と称する。また、「発毛効果を有する」とは発毛に有利に作用することを意味し、発毛効果を示す特質を「発毛促進活性」と称する。
本明細書において、「脱毛」との用語は毛穴から毛幹が脱落する現象を意味し、詳細には、細胞増殖を阻害する抑制性サイトカイン等の増加および、それらの細胞死を意味する。脱毛防止効果を示す特質を「脱毛防止活性」と称する。また、「脱毛防止効果を有する」とは、抑制サイトカインの阻害もしくは減少、および細胞死の抑制を介して、毛穴からの毛幹の脱落数が減少することを意味し、毛幹成長促進、発毛効果を示す特質とは異なる生理現象である。
本明細書において、「頭皮症状」とは、ふけ、頭皮の肌荒れ、頭皮のかさつき、紅斑、かゆみ、吹き出物などの症状を意味する。そして、本明細書において「頭皮症状改善」とは、ふけ、頭皮の肌荒れ、頭皮のかさつき、紅斑、かゆみ、吹き出物などの抑制又は改善を意味する。
本発明の育毛剤は、毛幹伸長速度または毛幹最大長を向上させるために使用することができる。そして、毛幹伸長速度については、毛周期の標準データにおける毛幹伸長速度と比較して、例えば最大１１０％程度向上させることができ、具体的には２５～１１０％程度向上させることができ、より具体的には３３～１１０％程度向上させることができる。また、毛幹最大長については、毛周期の標準データにおける毛幹最大長と比較して、例えば最大４９％程度向上させることができ、具体的には１～４９％程度向上させることができ、より具体的には２～４９％程度向上させることができる。
本発明の育毛剤は、毛幹径を増大させるために使用することができる。
本発明の育毛剤は、毛が生えていない（表皮から外に毛幹が出ていない）または毛数の少ない部位において発毛が停止した、または発毛能力が低下した毛穴から新しい毛が生えることを促進して毛数を増加させるために使用することができ、詳細には毛周期における休止期を短縮する、および／または停止した毛周期を再開させるために使用することができる。
本発明の育毛剤およびスカルプケア剤は、ヒトの他、家畜や愛玩動物などの動物用に使用することもできる。本発明の１つの側面において、フィトスフィンゴシンを含む外用剤をヒト及び家畜や愛玩動物などの動物を含む対象に投与することを含む、育毛方法および頭皮症状改善方法が提供される。
＜試験例１：フィトスフィンゴシンによる育毛活性評価＞
１． 材料と方法
（１）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（オス）およびＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（メス）を日本エスエルシー株式会社（日本）より購入し、飼育の後に以下の実験に供した。なお、動物の飼育および試験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
（１）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（オス）およびＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（メス）を日本エスエルシー株式会社（日本）より購入し、飼育の後に以下の実験に供した。なお、動物の飼育および試験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
（２）試薬
以下の試薬をそれぞれ用意した。
比較例１：６０％エタノール水溶液
比較例２：ミノキシジル ５％溶液
比較例３：ミノキシジル ３％溶液
比較例４：ミノキシジル １％溶液
実施例１：フィトスフィンゴシン ３％溶液
実施例２：フィトスフィンゴシン １％溶液
以下の試薬をそれぞれ用意した。
比較例１：６０％エタノール水溶液
比較例２：ミノキシジル ５％溶液
比較例３：ミノキシジル ３％溶液
比較例４：ミノキシジル １％溶液
実施例１：フィトスフィンゴシン ３％溶液
実施例２：フィトスフィンゴシン １％溶液
（３）マウス背部体毛皮膚由来の皮膚試験片の作製
抜毛後１２～１４日目の成長期ＶＩ皮膚を背部体毛皮膚として採取するため、７～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの背部体毛皮膚採取予定部位を抜毛し、１２～１４日飼育した。その後、抜毛したＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを頸椎脱臼により安楽死させた後に、背部体毛皮膚採取予定部位から背部体毛皮膚を適量採取した。
採取した皮膚は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％牛胎児血清、および１％ペニシリン・ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ培地（以下、「ＤＭＥＭ１０」という。）に浸した。採取した背部体毛皮膚を先曲がりピンセットでつまみ、滅菌用溶液に１０秒浸して処理する。ポビドンヨード７％溶液処理２回、ＰＢＳ（－）処理３回、ＤＭＥＭ１０処理２回の順で、それぞれ新鮮な溶液を用いて滅菌処理を行った。滅菌処理後、清浄なＤＭＥＭ１０中に浸漬した。
滅菌処理後の背部体毛皮膚を切り分け、ブロック化する。皮膚の皮筋層に付着している透明な結合組織を曲ハサミを用いて切除し、毛群を毛流に沿って長方形の短冊状に切り分けた。その際、毛包が短軸５列になるように調整し、長軸の毛包が６列になるようにして切り分け、ブロック化した。
（４）皮膚試験片のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスへの移植
上記で作製した背部体毛皮膚由来の皮膚試験片を、４～６週齢のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに移植した。
具体的には、定法に従い、マウスに対してイソフルランによるガス麻酔を行った。次いで、マウスの背部をポビドンヨード７％溶液にて消毒した後、自然横臥位をとらせた。そして、マニーオフサルミックナイフ（マニー株式会社、日本）を用いてマウスの背部を穿刺し、皮膚表皮層から真皮層下層部に至る移植創を形成した。
形成された移植創へ、背部体毛皮膚由来の皮膚試験片を、移植創の体表側に毛群が向くようにして挿入した。皮膚試験片の移植深度は、移植創上端部に毛群の上端部が露出した状態となるように調節した。次いで、背部体毛皮膚由来の皮膚試験片が移植された移植創を、ナースバン（登録商標）（株式会社サンプラネット、日本）およびサージカルテープ（スリーエム ジャパン株式会社、日本）を保護テープとして用いて被覆し、移植創を保護した。
移植後５－７日で保護テープを除去し、移植した背部体毛皮膚由来の皮膚試験片の生着を目視またはデジタルマイクロスコープ（株式会社キーエンス、日本）で判定した後に経過観察を行った。
（５）移植皮膚試験片への薬剤塗布
毛周期の１周期目は、６０％エタノール水溶液をプラセボとして塗布する。上記の皮膚試験片を移植したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに、マイクロピペットを用いて２５μＬの６０％エタノールを、皮膚試験片の生着させた左右の背部にそれぞれ塗布した。その後、ドライヤーを用いて冷風をあててエタノールを素早く乾燥させた。この作業を、マウス左右背部に各４回ずつ繰り返した。
毛周期の１周期目は、６０％エタノール水溶液をプラセボとして塗布する。上記の皮膚試験片を移植したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに、マイクロピペットを用いて２５μＬの６０％エタノールを、皮膚試験片の生着させた左右の背部にそれぞれ塗布した。その後、ドライヤーを用いて冷風をあててエタノールを素早く乾燥させた。この作業を、マウス左右背部に各４回ずつ繰り返した。
毛周期の２周期目以降は、上記の方法に従い、毛群移植したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに、６０％エタノール水溶液に換えて、フィトスフィンゴシンの溶液を塗布した。
（６）発毛経過観察および組織学的分析
Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの皮膚試験片の移植部位から３領域をそれぞれ選択し、それら領域からそれぞれ５本の毛を選択して、発毛の状態を確認し記録した。観察と記録は、目視およびデジタルマイクロスコープ（株式会社キーエンス、日本）により行った。
Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの皮膚試験片の移植部位から３領域をそれぞれ選択し、それら領域からそれぞれ５本の毛を選択して、発毛の状態を確認し記録した。観察と記録は、目視およびデジタルマイクロスコープ（株式会社キーエンス、日本）により行った。
２． 結果
薬剤ごとに、１～３日おきに毛幹の長さを計測し、経時的に変化する各時点での毛幹の長さの平均値を１つのドットとしてグラフにプロットし、同様のプロットを５匹分繰返した。結果を表１および図１に示す。
上記表２中、＊はｐ＜０．０５で有意であることを示す。
上記表３中、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１で有意であることを示す。
上記表４中、＊＊はｐ＜０．０１で有意であることを示す。
上記表５中、＊＊はｐ＜０．０１で有意であることを示す。
上記表６中、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１で有意であることを示す。
マウスの皮膚試験片の移植部位に、６０％エタノール水溶液を塗布した場合には、溶液塗布を行っていない標準データと比較して、毛幹成長速度および毛幹最大長はいずれも有意差は見られず、育毛活性は認められなかった(表１および図１を参照。)。
マウスの皮膚試験片の移植部位に、ミノキシジルを５％、３％、または１％含有する溶液を塗布した場合には、標準データと比較して毛幹成長速度および毛幹最大長がともに有意に向上しており、育毛活性が認められた（表２～４および図２～４を参照。）。
一方、マウスの皮膚試験片の移植部位に、フィトスフィンゴシンを３％で含有する溶液を塗布した場合には、標準データと比較して毛幹成長速度は有意差が見られなかったが、毛幹最大長は有意に向上していた（表５および図５を参照。）。これらの結果から、フィトスフィンゴシンを３％で含有する溶液には、育毛活性が認められた。
一方、マウスの皮膚試験片の移植部位に、フィトスフィンゴシンを１％で含有する溶液を塗布した場合には、標準データと比較して毛幹成長速度は有意に向上し、毛幹最大長は第三毛周期に有意差が見られないが向上していた（表６および図６を参照。）。これらの結果から、フィトスフィンゴシンを１％で含有する溶液の育毛活性が認められた。
＜試験例２：フィトスフィンゴシンによる太毛化活性評価＞
１． 材料と方法
（１）実験動物
上記試験例１と同様の手順にて、７～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（ＳＬＣ）より背部体毛皮膚を採取し、作製した背部体毛皮膚由来の毛群を４～６週齢のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（ＳＬＣ）に移植した後、薬剤を塗布した。動物の飼育および実験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
（１）実験動物
上記試験例１と同様の手順にて、７～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（ＳＬＣ）より背部体毛皮膚を採取し、作製した背部体毛皮膚由来の毛群を４～６週齢のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（ＳＬＣ）に移植した後、薬剤を塗布した。動物の飼育および実験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
（２）薬剤
以下の３つの溶液を試験に使用した。
６０％エタノール水溶液
ミノキシジル ５％溶液
フィトスフィンゴシン １％溶液
（３）太毛化の計測方法
試験例１において３周期目終了した成長した毛幹を用いて、太毛化の計測を行った。採取した毛幹のうち、Ｚｉｇｚａｇ毛の２本を用いた。その中心部分の太くなっている範囲を１辺 １００μmの正方形で３か所を選択した。選択した範囲の５か所を計測した。
以下の３つの溶液を試験に使用した。
６０％エタノール水溶液
ミノキシジル ５％溶液
フィトスフィンゴシン １％溶液
（３）太毛化の計測方法
試験例１において３周期目終了した成長した毛幹を用いて、太毛化の計測を行った。採取した毛幹のうち、Ｚｉｇｚａｇ毛の２本を用いた。その中心部分の太くなっている範囲を１辺 １００μmの正方形で３か所を選択した。選択した範囲の５か所を計測した。
２． 結果
薬剤塗布後の毛を用い、毛幹径を計測した。
対照となる６０％エタノール水溶液を塗布した場合の毛幹径は１５．８９μｍであった。一方、ミノキシジル ５％溶液を塗布した場合の毛幹径は１８．２８μｍであった。ミノキシジルを塗布した場合の対照となる毛幹径からの増加率は１１５％であった。これに対し、フィトスフィンゴシン １％溶液を塗布した場合には、毛幹径は２０．１５μｍであった。フィトスフィンゴシンを塗布した場合の対照となる毛幹径からの増加率は１２７％であった。
薬剤塗布後の毛を用い、毛幹径を計測した。
対照となる６０％エタノール水溶液を塗布した場合の毛幹径は１５．８９μｍであった。一方、ミノキシジル ５％溶液を塗布した場合の毛幹径は１８．２８μｍであった。ミノキシジルを塗布した場合の対照となる毛幹径からの増加率は１１５％であった。これに対し、フィトスフィンゴシン １％溶液を塗布した場合には、毛幹径は２０．１５μｍであった。フィトスフィンゴシンを塗布した場合の対照となる毛幹径からの増加率は１２７％であった。
上記試験により、ミノキシジルを塗布すると、対照となる６０％エタノール水溶液を塗布した場合に比べて太毛化が生じたことが確認され、さらに、本発明の手段の有効成分であるフィトスフィンゴシンを塗布すると、より太毛化が生じたことが確認された。
＜試験例３：ヒト毛乳頭細胞におけるＶＥＧＦ遺伝子発現の評価＞
１． 材料と方法
（１）ヒト毛乳頭細胞及び培地について
ヒト毛乳頭細胞（カタログ番号：ＣＡ６０２ｔ０５ａ、白色人種、２９歳男性由来、東洋紡株式会社（日本））を購入し、プロトコールに記載されるようにして細胞を維持・培養して試験評価を行った。
（１）ヒト毛乳頭細胞及び培地について
ヒト毛乳頭細胞（カタログ番号：ＣＡ６０２ｔ０５ａ、白色人種、２９歳男性由来、東洋紡株式会社（日本））を購入し、プロトコールに記載されるようにして細胞を維持・培養して試験評価を行った。
（２）薬剤
試験用薬剤として、以下の各濃度（終濃度）の薬剤溶液を調製し、使用した。
比較例５：ミノキシジル ３０μＭ
比較例６：アデノシン １００μＭ
実施例３：フィトスフィンゴシン ０．３１２５μＭ
実施例４：フィトスフィンゴシン １．２５μＭ
試験用薬剤として、以下の各濃度（終濃度）の薬剤溶液を調製し、使用した。
比較例５：ミノキシジル ３０μＭ
比較例６：アデノシン １００μＭ
実施例３：フィトスフィンゴシン ０．３１２５μＭ
実施例４：フィトスフィンゴシン １．２５μＭ
（３）試験方法
ヒト毛乳頭細胞を６×１０３個／ウェルとなるように、２４ウェルプレートに播種した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）内で、１日間培養後、各試験用薬剤を含む培地に置換した。その後、細胞プレートをＣＯ２インキュベーターに戻し、さらに７２時間培養した。培養後、各ウェルより全ＲＮＡを抽出、回収して、それをｃＤＮＡに逆転写した。調製したｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ法にてＶＥＧＦ遺伝子の発現を測定した。内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用い、陰性対照群との相対値としてＶＥＧＦ遺伝子の発現量を算出した。
ヒト毛乳頭細胞を６×１０３個／ウェルとなるように、２４ウェルプレートに播種した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）内で、１日間培養後、各試験用薬剤を含む培地に置換した。その後、細胞プレートをＣＯ２インキュベーターに戻し、さらに７２時間培養した。培養後、各ウェルより全ＲＮＡを抽出、回収して、それをｃＤＮＡに逆転写した。調製したｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ法にてＶＥＧＦ遺伝子の発現を測定した。内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用い、陰性対照群との相対値としてＶＥＧＦ遺伝子の発現量を算出した。
細胞からの全ＲＮＡの回収にはＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔ（カタログ番号：ＦＧ－８０２５０、日本ジェネティクス株式会社（日本））を使用した。
ウェルあたり３００μＬの溶解バッファーＲＬを添加し、ピペッティングにて細胞を溶解した。細胞溶解液に７０％エタノールを３００μＬ添加し、ピペッティングにて混合した。サンプル溶液をＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎに添加し、１００００ｇで１分間、室温で遠心した。カラムを通過したろ液をコレクションチューブから廃棄し、ＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎを元のコレクションチューブに戻した後、６００μＬの洗浄バッファーＲＷ１をＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎに加え、１００００ｇで１分間、 室温で遠心した。ＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎを新しいコレクションチューブに移してセットし、７００μＬの洗浄バッファーＲＷ２をＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎに加え、１００００ｇで１分間、 室温で遠心した。ＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎを新しいコレクションチューブに移してセットし、１５０００ｒｐｍで１分間、 室温で遠心した。ＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎを新しいコレクションチューブに移してセットし、５０μＬの溶出バッファー RE をＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎのメンブレンの中央に添加し、１００００ｇで１分間、室温で遠心し、精製したＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ（カタログ番号：ＮＤ－ＬＩＴＥ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）にて測定し、－８０℃にて次のｃＤＮＡ化作業まで保存した。
ｃＤＮＡの合成にはＦａｓｔＧｅｎｅ ｓｃｒｉｐｔａｓｅＩＩ ｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ５× Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（カタログ番号：ＮＥ－ＬＳ６４、日本ジェネティクス株式会社（日本））を使用した。新しい チューブに生成した全ＲＮＡ の濃度が２０ｎｇ／ｍＬ になるように、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで希釈し、このサンプル溶液１６μＬにＦａｓｔＧｅｎｅ ｓｃｒｉｐｔａｓｅＩＩ ｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ５× Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘを４μＬ添加し、ボルテックスにて攪拌した。 ＭｉｎｉＡｍｐサーマルサイクラー （サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用い、２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、８５℃で５分間インキュベートし、ｃＤＮＡを合成した。
上記の方法にて合成したｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲに用いた。９６ウェルプレートの所定のウェルに、各ｃＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ 希釈液を添加し、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（カタログ番号： ＱＰＳー２０１、東洋紡株式会社（日本））とプライマーを添加して混合し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号：４４８５６９３、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）にて遺伝子発現を解析した。ＰＣＲ反応として、９５℃５秒間、６０℃３０秒間を４０サイクル行った。
試験に使用したＶＥＧＦ遺伝子に特異的なプライマー及び内部標準としたＧＡＰＤＨ遺伝子に特異的なプライマーを以下に示す。
ＶＥＧＦ遺伝子発現検出用プライマー
順方向：aggccagcacataggagaga（配列番号１）
逆方向：acgcgagtctgtgtttttgc（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ遺伝子発現検出用プライマー
順方向：catccctgcctctactggcgctgcc（配列番号３）
逆方向：ccaggatgcccttgagggggccctc（配列番号４）
ＶＥＧＦ遺伝子発現検出用プライマー
順方向：aggccagcacataggagaga（配列番号１）
逆方向：acgcgagtctgtgtttttgc（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ遺伝子発現検出用プライマー
順方向：catccctgcctctactggcgctgcc（配列番号３）
逆方向：ccaggatgcccttgagggggccctc（配列番号４）
以下のようにして各遺伝子の相対発現量を算出した。
各遺伝子の増幅曲線と閾値線との交点より、Ｃｔ値（ＰＣＲサイクル数）を算出した。目的遺伝子のＣｔ値より内部標準ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｔ値で除した値が相対発現量となる。
各遺伝子の増幅曲線と閾値線との交点より、Ｃｔ値（ＰＣＲサイクル数）を算出した。目的遺伝子のＣｔ値より内部標準ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｔ値で除した値が相対発現量となる。
２． 結果
ヒト毛乳頭細胞にフィトスフィンゴシンを７２時間作用させた後のＶＥＧＦ遺伝子の発現量の変化を測定し、その結果を、図７に示した。
ヒト毛乳頭細胞にフィトスフィンゴシンを７２時間作用させた後のＶＥＧＦ遺伝子の発現量の変化を測定し、その結果を、図７に示した。
図７に示すように、ヒト毛乳頭細胞に対してフィトスフィンゴシン（実施例３、実施例４）を７２時間作用させると、無添加対照群に比してＶＥＧＦ遺伝子発現量が上昇することが確認された。そして、フィトスフィンゴシンの添加量が増えると、ＶＥＧＦ遺伝子発現量はミノキシジル（比較例５）やアデノシン（比較例６）を作用させた場合よりも大きくなることが確認された。
＜試験例４：フィトスフィンゴシンによる細胞分裂活性評価＞
１． 材料と方法
（１）実験動物
７～８週齢のＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウス（日本エスエルシー株式会社、日本）より背部体毛皮膚を採取した。動物の飼育および実験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
７～８週齢のＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウス（日本エスエルシー株式会社、日本）より背部体毛皮膚を採取した。動物の飼育および実験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
（２）薬剤
以下の薬剤をそれぞれ用意した。
実施例：フィトスフィンゴシン３％溶液
比較例：６０％エタノール水溶液
以下の薬剤をそれぞれ用意した。
実施例：フィトスフィンゴシン３％溶液
比較例：６０％エタノール水溶液
（３）薬剤塗布
ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスの左右背部に、マイクロピペットを用いて２５μＬの薬剤を塗布した。その後、塗布部位にドライヤーを用いて冷風をあてて薬剤を素早く乾燥させた。この作業を左右背部に各４回ずつ繰り返した。この薬剤塗布作業を抜毛した翌日から７日間行った。
ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスの左右背部に、マイクロピペットを用いて２５μＬの薬剤を塗布した。その後、塗布部位にドライヤーを用いて冷風をあてて薬剤を素早く乾燥させた。この作業を左右背部に各４回ずつ繰り返した。この薬剤塗布作業を抜毛した翌日から７日間行った。
（４）ＢｒｄＵ投与
７日間薬剤を塗布したＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスから背部体毛皮膚を採取する２４時間および４８時間前に、各マウスの後足部分の腹部に１０ｍｇ／ｍＬのＢｒｄＵ／生理食塩水０．５ｍＬ、注射器（テルモ株式会社、日本）を用いて投与した。
７日間薬剤を塗布したＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスから背部体毛皮膚を採取する２４時間および４８時間前に、各マウスの後足部分の腹部に１０ｍｇ／ｍＬのＢｒｄＵ／生理食塩水０．５ｍＬ、注射器（テルモ株式会社、日本）を用いて投与した。
（５）マウス皮膚組織採取及び固定
８日目に投与した時間と同じ時間にＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスを頸椎脱臼により安楽死させた後に、毛球部を傷つけないように皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織をＳｕｐｅｒＦｉｘ（東洋紡株式会社、日本）に１６～２４時間固定液に浸した後、１×ＰＢＳで４回洗い、新しい１×ＰＢＳに入れ保管した。その皮膚組織を必要な部分を切り出しし、パラフィン液交換機（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）にてパラフィンブロックを作製した。
８日目に投与した時間と同じ時間にＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスを頸椎脱臼により安楽死させた後に、毛球部を傷つけないように皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織をＳｕｐｅｒＦｉｘ（東洋紡株式会社、日本）に１６～２４時間固定液に浸した後、１×ＰＢＳで４回洗い、新しい１×ＰＢＳに入れ保管した。その皮膚組織を必要な部分を切り出しし、パラフィン液交換機（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）にてパラフィンブロックを作製した。
（６）切片作製
パラフィン化した皮膚組織のブロックをミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）で切片化し、プラチナコートしたスライドガラス（プラチナプロ（松浪硝子工業株式会社、日本））に切片を張り付けて、４０℃のウォームスチームで８～１０時間放置し、乾燥させた。
パラフィン化した皮膚組織のブロックをミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）で切片化し、プラチナコートしたスライドガラス（プラチナプロ（松浪硝子工業株式会社、日本））に切片を張り付けて、４０℃のウォームスチームで８～１０時間放置し、乾燥させた。
（７）ＢｒｄＵ免疫染色
脱パラフィン処理を施すため、サンプルの乗ったスライドガラスを、キシレン、キシレン、１００％エタノール、９５％エタノール、７０％エタノールに、順に３分間ずつ浸した。脱パラフィン処理を施したスライドガラスを、室温にて２Ｍ ＨＣｌに３０分間浸した。スライドガラスをベンタディスカバリーＵＬＴＲＡ（自動染色装置）にセットし、プログラムを起動した。１次抗体Ａｎｔｉ－ＢｒｄＵ ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｍａｋｅｒ（ａｂｃａｍ、英国）を希釈溶液（１％ＢＳＡ、０．１％ＴＸ１００／ＰＢＳ）にて１６０倍希釈し、１次抗体を加えるタイミングで１００μＬ／サンプル数添加した。２次抗体Ｄｏｎｋｅｙ Ａｎｔｉ－Ｓｈｅｅｐ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５９４）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）およびへキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を希釈溶液（１％ＢＳＡ、０．１％ＴＸ１００／ＰＢＳ）にて５００倍希釈し、１００μＬ／サンプル数添加した。プログラム終了後、０．１％ＴＸ１００／ＰＢＳにて流しながら洗浄し、１×ＰＢＳに浸した。水溶性封入剤（０．５％没食子酸、９０％グリセロール／ＰＢＳ）を８０μＬ／サンプル数滴下した後、カバーガラスを乗せ、黄色チップで空気を押し出し、アスピレーターでカバーガラスの位置を修正しながら余分な封入剤を除き、トップコート（マニュキュア用）を使ってカバーガラスの４辺に封をした。トップコートが乾いていることを確認し、ＡｘｉｏＳｃａｎで画像をスキャンし、解析した。
脱パラフィン処理を施すため、サンプルの乗ったスライドガラスを、キシレン、キシレン、１００％エタノール、９５％エタノール、７０％エタノールに、順に３分間ずつ浸した。脱パラフィン処理を施したスライドガラスを、室温にて２Ｍ ＨＣｌに３０分間浸した。スライドガラスをベンタディスカバリーＵＬＴＲＡ（自動染色装置）にセットし、プログラムを起動した。１次抗体Ａｎｔｉ－ＢｒｄＵ ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｍａｋｅｒ（ａｂｃａｍ、英国）を希釈溶液（１％ＢＳＡ、０．１％ＴＸ１００／ＰＢＳ）にて１６０倍希釈し、１次抗体を加えるタイミングで１００μＬ／サンプル数添加した。２次抗体Ｄｏｎｋｅｙ Ａｎｔｉ－Ｓｈｅｅｐ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５９４）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）およびへキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を希釈溶液（１％ＢＳＡ、０．１％ＴＸ１００／ＰＢＳ）にて５００倍希釈し、１００μＬ／サンプル数添加した。プログラム終了後、０．１％ＴＸ１００／ＰＢＳにて流しながら洗浄し、１×ＰＢＳに浸した。水溶性封入剤（０．５％没食子酸、９０％グリセロール／ＰＢＳ）を８０μＬ／サンプル数滴下した後、カバーガラスを乗せ、黄色チップで空気を押し出し、アスピレーターでカバーガラスの位置を修正しながら余分な封入剤を除き、トップコート（マニュキュア用）を使ってカバーガラスの４辺に封をした。トップコートが乾いていることを確認し、ＡｘｉｏＳｃａｎで画像をスキャンし、解析した。
（８）ＢｒｄＵの計測方法
ＢｒｄＵ数は表皮層、真皮層の１００μｍ２を３か所、毛包は同程度の大きさのものを３つ計測した。
ＢｒｄＵ数は表皮層、真皮層の１００μｍ２を３か所、毛包は同程度の大きさのものを３つ計測した。
２．結果
本試験例では、ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスを用いて、６０％エタノールへ溶解した濃度３％のフィトスフィンゴシンを試験用の薬剤液とし、連日塗布を施した。陰性対照として６０％を塗布し施した。これら塗布は、１回／日で総塗布量１００μＬとなるようにして７日間行った。また、６、７日目の同じ時間にＢｒｄＵを腹部から投与し、その翌日に皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織をパラフィン化し切片を作製し、ＢｒｄＵの免疫染色を行い、ＢｒｄＵ数の計測により細胞活性を観察した。結果を図８及び図９に示す。
本試験例では、ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスを用いて、６０％エタノールへ溶解した濃度３％のフィトスフィンゴシンを試験用の薬剤液とし、連日塗布を施した。陰性対照として６０％を塗布し施した。これら塗布は、１回／日で総塗布量１００μＬとなるようにして７日間行った。また、６、７日目の同じ時間にＢｒｄＵを腹部から投与し、その翌日に皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織をパラフィン化し切片を作製し、ＢｒｄＵの免疫染色を行い、ＢｒｄＵ数の計測により細胞活性を観察した。結果を図８及び図９に示す。
図８及び図９から明らかであるように、陰性対照および陽性対照と比較して、本発明の手段の有効成分であるフィトスフィンゴシンの塗布によって、細胞分裂活性増大傾向が得られており、フィトスフィンゴシン３％において少なくとも毛包における細胞分裂活性が向上しており、本発明の手段の有効成分に育毛活性があることが示唆される結果が得られた。また、本発明の手段の有効成分であるフィトスフィンゴシンの塗布によって、表皮基底層における細胞分裂活性の亢進も確認され、本発明の手段の有効成分によりスカルプケア効果が得られることが確認された。本発明の手段の有効成分であるフィトスフィンゴシンは、優れた育毛活性を奏するものであるとともに、塗布部分におけるスカルプケア効果をも同時に発揮することが可能な優れた効果を奏するものであることが明らかとなった。
本発明の手段により、外用剤である育毛剤の有効成分として、フィトスフィンゴシンを用いるものとすることで、頭髪、須毛、眉毛および／または睫毛などの毛における毛幹の成長促進効果、毛幹伸長速度の向上効果、毛幹最大長の向上効果および毛幹径の増大の効果並びにスカルプケア効果を奏する新たな育毛剤およびスカルプケア剤を提供することが可能となる。
Claims (11)
- フィトスフィンゴシンを含む外用剤である育毛剤。
- フィトスフィンゴシンの含有量が全体に対して０．００１～２０重量％である、請求項１に記載の育毛剤。
- フィトスフィンゴシンの含有量が全体に対して０．００５～１０重量％である、請求項１または請求項２に記載の育毛剤。
- 毛幹成長促進または発毛に用いるための、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の育毛剤。
- 毛幹伸長速度を向上させるために使用する、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の育毛剤。
- 毛幹最大長を向上させるために使用する、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の育毛剤。
- 毛幹径を増大させるために使用する、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の育毛剤。
- 毛数を増加させるために使用する、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の育毛剤。
- 溶液である、請求項１～請求項８のいずれか１項に記載の育毛剤。
- 頭髪、須毛、眉毛および／または睫毛用の、請求項１～請求項９のいずれか１項に記載の育毛剤。
- 請求項１～請求項１０のいずれか１項に記載の育毛剤を対象に投与することを含む育毛方法。
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| JPH09227343A (ja) * | 1996-02-15 | 1997-09-02 | L'oreal Sa | ２−アミノ−１，３−アルカンジオールを含有する、髪抜け遅延および／または髪成長誘発および刺激剤 |
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