TW202237080A

TW202237080A - 育毛劑

Info

Publication number: TW202237080A
Application number: TW110143483A
Authority: TW
Inventors: 中村荘太; 高橋秀樹; 中池佑紀美; 辻孝
Original assignee: 日商安佳榜控股股份公司; 國立研究開發法人理化學研究所
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2022-10-01
Also published as: JPWO2022107866A1; WO2022107866A1; US20240099951A1

Abstract

為了提供一種具促進頭髮、鬚毛、眉毛、及/或睫毛中之毛幹成長，增強有助於真皮乳頭細胞中之育毛的基因表現，達成毛髮生長、毛幹伸長速度之提升、毛幹最大長度之提升之效果及毛幹徑之增大之效果以及頭皮護理效果之屬於外用劑之育毛劑及頭皮護理劑，而含有植物神經鞘胺醇者作為此等劑之有效成分。

Description

育毛劑

本發明係關於育毛劑。更詳細而言，係關於屬於包含植物神經鞘胺醇之外用劑的育毛劑。

在包括人類在內的哺乳動物中，對改善育毛效果及毛種與毛質的育毛劑等之外用劑的需要逐漸增加。為了改善育毛效果及毛種與毛質，提案了有助於調整屬於毛髮的生命週期之毛髮週期的有效成分，並作為育毛劑而在市場上銷售。

例如，提案了利用米諾地爾作為育毛劑的有效成分(參照專利文獻1至3等)，並經過人體臨床試驗，以米諾地爾作為有效成分的育毛劑而在市場上銷售。然而，其醫藥用途在日本僅限於男性中年脫髮症等，無法充分地滿足廣大消費者對育毛效果及毛種與毛質改善效果的需求。

此外，提案了利用手性肌醇作為育毛劑的有效成分(參照專利文獻4)。然而，專利文獻4所述之屬於包含手性肌醇之外用劑的育毛劑僅在不具有胰島素抵抗性的對象中得到育毛效果的支持，以致投予對象者受限。因此，無法充分地滿足廣大消費者對育毛效果及毛種與毛質改善效果的需求。

已知植物神經鞘胺醇係作為化妝品原材料(參照專利文獻5)。然而，並未有關於植物神經鞘胺醇之育毛效果的報導。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

[專利文獻1]美國專利第4139619號說明書

[專利文獻2]日本特開昭63-150211號公報

[專利文獻3]日本特開昭63-145217號公報

[專利文獻4]國際公開第2017/188393號

[專利文獻5]日本特許第3220434號公報

本發明之目的係提供一種具有優異育毛作用的育毛劑。

本發明者等為了解決上述課題進行重複研究之結果發現，藉由將植物神經鞘胺醇作為有效成分，則可使育毛活性發揮，從而完成本發明。

用於解決上述課題之本發明之第1之手段係一種育毛劑，其為包含植物神經鞘胺醇的外用劑。

用於解決上述課題之本發明之第2之手段係，如本發明之第1之手段所述之育毛劑，其中，相對於整體，植物神經鞘胺醇之含量係0.001至20重量%。

用於解決上述課題之本發明之第3之手段係，如本發明之第1之手段或第2之手段所述之育毛劑，其中，相對於整體，植物神經鞘胺醇之含量係0.005至10重量%。

用於解決上述課題之本發明之第4之手段係，如本發明之第1至第3之手段中任一項之手段所述之育毛劑，其係用於促進毛幹生長或毛髮生長。

用於解決上述課題之本發明之第5之手段係，如本發明之第1至第4之手段中任一項之手段所述之育毛劑，其係使用於使毛幹伸長速度提升。

用於解決上述課題之本發明之第6之手段係，如本發明之第1至第4之手段中任一項之手段所述之育毛劑，其係使用於使毛幹最大長度提升。

用於解決上述課題之本發明之第7之手段係，如本發明之第1至第4之手段中任一項之手段所述之育毛劑，其係使用於使毛幹徑增大。

用於解決上述課題之本發明之第8之手段係，如本發明之第1至第4之手段中任一項之手段所述之育毛劑，其係使用於使毛髮數量增加。

用於解決上述課題之本發明之第9之手段係，如本發明之第1至第8之手段中任一項之手段所述之育毛劑，其為溶液。

用於解決上述課題之本發明之第10之手段係，如本發明之第1至第9之手段中任一項之手段所述之育毛劑，其係用於頭髮、鬚毛、眉毛及/或睫毛。

用於解決上述課題之本發明之第11之手段係，一種育毛方法，係包含將如本發明之第1至第10之手段中任一項之手段所述之育毛劑投予至對象。

用於解決上述課題之本發明之其他之手段係，一種頭皮護理劑，其係包含植物神經鞘胺醇的外用劑。

用於解決上述課題之本發明之其他之手段係，一種頭皮症狀改善方法，其係包含將屬於包含植物神經鞘胺醇之外用劑的頭皮護理劑投予至對象。

依據本發明之手段，可提供一種育毛劑及頭皮護理劑，此等係藉由將植物神經鞘胺醇作為屬於外用劑之育毛劑的有效成分，而在頭髮、鬚毛、眉毛及/或睫毛中，促進毛幹生長、毛幹伸長速度的提升、毛幹最大長度的提升之效果及毛幹徑的增大之效果，以及頭皮護理效果優異。

圖1係顯示在60%乙醇水溶液之塗佈後，小鼠之藥劑塗佈部位之毛幹長度之變化的圖。縱軸表示毛幹長(mm)、橫軸表示天數。又，第一毛週期顯示不含藥劑且塗佈有60%乙醇水溶液的標準數據。

圖2係顯示在包含米諾地爾(5%)之60%乙醇水溶液之塗佈後，小鼠之藥劑塗佈部位之毛幹長度之變化的圖。縱軸表示毛幹長(mm)、橫軸表示天數。又，第一毛週期顯示塗佈不含藥劑之60%乙醇水溶液的標準數據。

圖3係顯示在包含米諾地爾(3%)之60%乙醇水溶液之塗佈後，小鼠之藥劑塗佈部位之毛幹長度之變化的圖。縱軸表示毛幹長(mm)、橫軸表示天數。又，第一毛週期表示塗佈不含藥劑之60%乙醇水溶液的標準數據。

圖4係顯示在包含米諾地爾(1%)之60%乙醇水溶液之塗佈後，小鼠之藥劑塗佈部位之毛幹長度之變化的圖。縱軸表示毛幹長(mm)、橫軸表示天數。又，第一毛週期顯示塗佈不含藥劑之60%乙醇水溶液的標準數據。

圖5係顯示在包含植物神經鞘胺醇(3%)之60%乙醇水溶液之塗佈後，小鼠之藥劑塗佈部位之毛幹長度之變化的圖。縱軸表示毛幹長(mm)、橫軸表示天數。又，第一毛週期顯示塗佈不含藥劑之60%乙醇水溶液的標準數據。

圖6係顯示在包含植物神經鞘胺醇(1%)之60%乙醇水溶液之塗佈後，小鼠之藥劑塗佈部位之毛幹長度之變化的圖。縱軸表示毛幹長(mm)、橫軸表示天數。又，第一毛週期顯示塗佈不含藥劑之60%乙醇水溶液的標準數據。

圖7係表示在人真皮乳頭細胞中之因植物神經鞘胺醇72小時刺激引起的VEGF基因表現量之變化的圖表。

圖8係顯示因植物神經鞘胺醇刺激引起的細胞分裂活性評估。將可確認BrdU吸收的細胞以提高的三角形(△或▲)顯示。

圖9係顯示因植物神經鞘胺醇刺激引起的細胞分裂活性評估。

以下說明用於實施本發明之型態。又，本發明並非限定於此等例示，當然，在不脫離本發明之主旨的範圍內可進行各種變更。

本發明之屬於外用劑的育毛劑及頭皮護理劑之有效成分係由植物神經鞘胺醇所構成。

本發明之育毛劑及頭皮護理劑中之屬於有效成分的植物神經鞘胺醇的濃度，相對於育毛劑及頭皮護理劑之整體，係0.001至20重量%。更具體而言，係0.005至10重量%。

本發明之育毛劑及頭皮護理劑可使用作為包含醫藥品、準藥品、頭髮、鬚毛、眉毛及/或睫毛用化妝品及頭皮用化妝品的化妝品等，並且可使用作為軟膏、糊劑、搽劑、洗劑、外用液劑、散布劑、霜劑、凝膠劑、乳液、生髮劑、髮噴霧劑、微針等各種態樣的製劑，惟並非限定於此等者。

此外，在不妨礙本發明之育毛效果及頭皮護理效果之程度中，亦可進一步調配通常含有在包含醫藥品、準藥品、頭髮、鬚毛、眉毛及/或睫毛用化妝品及頭皮用化妝品之化妝品等中允許的添加物等成分者。作為該添加物等成分，係列舉例如：賦形劑、穩定劑、矯味劑、基劑、分散劑、稀釋劑、陰離子性界面活性劑、兩性界面活性劑、非離子性界面活性劑、陽離子性界面活性劑、陰離子性聚合物、非離子性聚合物、環氧乙烷/環氧丙烷嵌段共聚物、醇類、乳化劑、經皮吸收促進劑、pH調整劑、保存劑、著色劑、油脂、礦物油等油分、保濕劑、增黏劑、聚合物、皮膜形成劑、紫外線吸收劑、細胞賦活劑、保濕劑、無機鹽、機能性珠粒與膠囊類、聚矽氧類、金屬螯合物劑、抗氧化劑、防腐劑、清涼劑、除臭劑、顏料、染料、香料、糖類、胺基酸類、維他命類、有機酸、有機胺、植物萃取物、黏土礦物及各種聚合物等黏度調整劑等，惟並非限定於此等者。

本發明之育毛劑及頭皮護理劑可為含有具毛髮生長、育毛、養毛等效果的習知成分者。

可調整本發明之手段中每次投予育毛劑及頭皮護理劑的有效成分之投予量，從而表現出本發明之育毛劑及頭皮護理劑的效果。然後，其投予量，例如可為0.005至200mg，具體而言，可為0.05至100mg，更具體而言，可為0.5至10mg。

本發明之育毛劑及頭皮護理劑的投予次數可為1次或複數次，以表現出本發明之育毛劑及頭皮護理劑的效果。然後，本發明之育毛劑及頭皮護理劑的投予次數，例如可為每天1至6次。然後，具體而言，可為每天1至3次，更具體而言，可為每天1至2次。

本發明之育毛劑及頭皮護理劑係關於促進毛幹生長、毛髮生長及防脫毛者，較佳係關於促進毛幹生長及毛髮生長者。

本說明書中，「促進毛幹生長」之用語，係意指使毛幹伸長速度提升、使毛幹最大長度提升、及/或使毛幹徑增大。

本說明書中，「毛髮生長」之用語，係意指促進從毛髮不生長(毛幹不從表皮長出)或毛髮數量少之部位之毛髮生長已停止、或毛髮生長能力降低的毛孔長出新的毛髮，並使毛髮數量增加，詳細而言，縮短毛週期之休止期、及/或恢復已停止的毛週期。

本說明書中，「具有促進毛幹生長效果」係意指，有利於促進毛幹生長之作用，將顯示促進毛幹生長效果之特質稱為「促進毛幹生長活性」。此外，「具有毛髮生長效果」係意指，有利於毛髮生長之作用，將顯示毛髮生長效果之特質稱為「毛髮生長促進活性」。

本說明書中，「脫毛」之用語，係意指毛幹從毛孔脫落的現象，詳細而言，係意指阻害細胞增殖之抑制性細胞介素等之增加及、此等之細胞死亡。將顯示防脫毛效果之特質稱為「防脫毛活性」。此外，「具有防脫毛效果」係意指，經由抑制細胞介素之阻害或者減少、及細胞死亡之抑制，減少毛幹從毛孔的脫落數，並與顯示促進毛幹生長、毛髮生長效果之特質相異的生理現象。

本說明書中，「頭皮症狀」係意指，頭皮屑、頭皮粗糙、頭皮乾燥、紅斑、搔癢、丘疹等症狀。然後，本說明書中，「頭皮症狀改善」係意指，頭皮屑、頭皮粗糙、頭皮乾燥、紅斑、搔癢、丘疹等之抑制或改善。

本發明之育毛劑可使用於使毛幹伸長速度或毛幹最大長度提升。然後，針對毛幹伸長速度，與毛週期之標準數據之毛幹伸長速度比較，例如可提升最大110%左右，具體而言，可提升25至110%左右，更具體而言，可提升33至110%左右。此外，針對毛幹最大長度，與毛週期之標準數據之毛幹最大長度比較，例如可提升最大49%左右，具體而言，可提升1至49%左右，更具體而言，可提升2至49%左右。

本發明之育毛劑，可使用於使毛幹徑增大。

本發明之育毛劑可使用於促進從毛髮不生長(毛幹不從表皮長出)或毛髮數量少之部位之毛髮生長已停止、或毛髮生長能力降低的毛孔長出新的毛髮，並使毛髮數量增加，詳細而言，可使用於縮短毛週期之休止期、及/或恢復已停止的毛週期。

本發明之育毛劑及頭皮護理劑，人類以外，亦可使用於家畜及寵物等動物用。在本發明之一個方面中，提供一種育毛方法及頭皮症狀改善方法，係包括提供將包含植物神經鞘胺醇之外用劑投予至包含人類及家畜與寵物等動物之對象。

[實施例]

<試驗例1：因植物神經鞘胺醇引起的育毛活性評估>

1.材料與方法

(1)實驗動物

從日本SLC股份有限公司(日本)購入C57BL/6N小鼠(雄)及Balb/c nu/nu小鼠(雌)，飼養後提供於以下實驗。又，動物之飼養及試驗係遵守相關法規、部級法令、及指南，並經理化學研究所實驗倫理審查會之認可而實施者。

(2)試劑

各別準備以下試劑。

比較例1：60%乙醇水溶液

比較例2：米諾地爾5%溶液

比較例3：米諾地爾3%溶液

比較例4：米諾地爾1%溶液

實施例1：植物神經鞘胺醇3%溶液

實施例2：植物神經鞘胺醇1%溶液

(3)源自小鼠背部體毛皮膚之皮膚試驗片的製作

為了採集拔毛後第12至14天之成長期VI皮膚作為背部體毛皮膚，將7至8週齡之C57BL/6N小鼠的背部體毛皮膚採集擬定部位拔毛，飼養12至14天。其後，在藉由頸椎脫臼使已拔毛的C57BL/6N小鼠安樂死後，從背部體毛皮膚採集擬定部位適量採集背部體毛皮膚。

將採集的皮膚浸入包含10mM HEPES、10%胎牛血清、及1%青黴素/鏈黴素溶液之DMEM培養基(以下，稱為「DMEM10」)。將採集的背部體毛皮膚以彎鑷夾住，在滅菌用溶液中浸泡10秒進行處理。以優碘7%溶液處理2 次、PBS(-)處理3次、DMEM10處理2次之順序，各別使用新鮮的溶液進行滅菌處理。滅菌處理後，浸漬在乾淨的DMEM10中。

將滅菌處理後之背部體毛皮膚裁切並塊段化。使用弧形剪刀切除附著在皮膚之皮筋層的透明結合組織，沿著毛流將毛群裁切成長方形條狀。此時，毛囊係以成為短軸5排的方式而調整，長軸之毛囊係以成為6排之方式而裁切並塊段化。

(4)皮膚試驗片移植至Balb/c nu/nu小鼠

將上述所製作的源自背部體毛皮膚之皮膚試驗片移植至4至6週齡的Balb/c nu/nu小鼠。

具體而言，依據常規方法藉由異氟醚對小鼠進行氣體麻醉。其次，使用優碘7%溶液將小鼠背部消毒後，使其置於自然橫臥位。然後，使用MANI Ophthalmic Knife(MANI股份有限公司，日本)刺穿小鼠背部，形成從皮膚表皮層延伸至真皮層下層部的移植傷口。

將源自背部體毛皮膚之皮膚試驗片以使毛群朝向移植傷口的體表側的方式插入到形成的移植傷口。皮膚試驗片之移植深度係以毛群之上端部露出在移植傷口上端部之狀態的方式而調整。其次，將移植有源自背部體毛皮膚之皮膚試驗片的移植傷口使用Nurseban(註冊商標)(股份有限公司Sun Planet，日本)及手術膠帶(3M Japan股份有限公司，日本)作為保護帶覆蓋，以保護移植傷口。

移植後5至7天去除保護帶，將經移植源自背部體毛皮膚之皮膚試驗片的情況以目視或數位顯微鏡(股份有限公司Keyence，日本)判斷後，進行後續追蹤。

(5)對移植皮膚試驗片之藥劑塗佈

在毛週期之第1週，塗佈作為安慰劑的60%乙醇水溶液。對移植了上述皮膚試驗片的Balb/c nu/nu小鼠，使用微量吸移管將25μL之60%乙醇分別塗佈在移植的皮膚試驗片的左右背部。其後，使用烘乾機吹冷風使乙醇快速乾燥。此作業在小鼠左右背部各重複4次。

從毛週期之第2週期以後，依據上述方法，在經毛群移植的Balb/c nu/nu小鼠，使用植物神經鞘胺醇之溶液取代60%乙醇水溶液而塗佈。

(6)毛髮生長後續追蹤及組織學的分析

從Balb/c nu/nu小鼠之皮膚試驗片的移植部位各別選擇3個區域，從此等區域各別選擇5根毛髮，確認並記錄毛髮生長之狀態。藉由目視及數位顯微鏡(股份有限公司Keyence，日本)進行觀察與記錄。

2.結果

對於每種藥劑，每1至3天測量一次毛幹長度，將隨時間變化之各時間點的毛幹長度的平均值繪製為1個點繪製在圖上，並對5隻重複相同的繪製。將結果表示於表1及圖1。

表1

表2

上述表2中，*表示以p<0.05係顯著者。

表3

上述表3中，*表示以p<0.05、**表示以p<0.01係顯著者。

表4

上述表4中，**表示以p<0.01係顯著者。

表5

上述表5中，**表示以p<0.01係顯著者。

表6

上述表6中，*表示以p<0.05、**表示以p<0.01係顯著者。

在小鼠之皮膚試驗片的移植部位，塗佈有60%乙醇水溶液之情況下，與不進行溶液塗佈的標準數據比較，毛幹成長速度及毛幹最大長度無顯著差異，未確認出育毛活性(參照表1及圖1)。

在小鼠之皮膚試驗片的移植部位，塗佈有含有米諾地爾5%、3%、或1%的溶液之情況下，與標準數據比較，毛幹成長速度及毛幹最大長度有顯著提高，並確認出育毛活性(參照表2至4及圖2至4)。

另一方面，在小鼠之皮膚試驗片的移植部位，塗佈有含有植物神經鞘胺醇3%的溶液之情況下，與標準數據比較，毛幹成長速度無顯著差異，惟毛幹最大長度有顯著提高(參照表5及圖5)。從此等之結果而言，在含有植物神經鞘胺醇3%的溶液中，確認出育毛活性。

另一方面，在小鼠之皮膚試驗片的移植部位，塗佈有含有植物神經鞘胺醇1%的溶液之情況下，與標準數據比較，毛幹成長速度有顯著提高，毛幹最大長度儘管在第三毛週期無顯著差異惟仍有提高(參照表6及圖6)。從此等之結果而言，在含有植物神經鞘胺醇1%的溶液中，確認出育毛活性。

<試驗例2：因植物神經鞘胺醇引起的增粗化活性評估>

1.材料與方法

(1)實驗動物

以與上述試驗例1相同的程序，從7至8週齡之C57BL/6N小鼠(SLC)採取背部體毛皮膚，將所製作的源自背部體毛皮膚之毛群移植至4至6週齡之Balb/c nu/nu小鼠(SLC)後，塗佈藥劑。動物之飼養及試驗係遵守相關法規、部級法令、及指南，並經理化學研究所實驗倫理審查會之認可而實施者。

(2)藥劑

在試驗中使用以下3種溶液。

60%乙醇水溶液

米諾地爾5%溶液

植物神經鞘胺醇1%溶液

(3)增粗化之測量方法

使用上述試驗例1中第3週期結束後的毛幹進行增粗化的測量。在採集的毛幹中，使用2根Zigzag毛。將其中心部分增粗之範圍以1邊100μm之正方形選擇3處。對所選擇的範圍5處進行測量。

2.結果

使用藥劑塗佈後之毛進行毛幹徑測量。

成為對照之塗佈有60%乙醇水溶液之情況的毛幹徑係15.89μm。另一方面，塗佈有米諾地爾5%溶液之情況的毛幹徑係18.28μm。塗佈有米諾地爾之情況之從成為對照的毛幹徑之增加率係115%。相對於此，在塗佈植物神經鞘胺醇1%溶液之情況下，毛幹徑係20.15μm。塗佈有植物神經鞘胺醇之情況之從成為對照的毛幹徑之增加率係127%。

藉由上述試驗，塗佈米諾地爾，則與成為對照之塗佈有60%乙醇水溶液之情況相比，確認出增粗化產生，更且，塗佈屬於本發明之手段之有效成分的植物神經鞘胺醇，則確認出更產生增粗化。

<試驗例3：因人真皮乳頭細胞引起的VEGF基因表現之評估>

1.材料與方法

(1)針對人真皮乳頭細胞及培養基

購入人真皮乳頭細胞(目錄編號：CA602t05a、白人種、源自29歲男性、東洋紡股份有限公司(日本))，依據規程所記載的方式維持與培養細胞並進行試驗評估。

(2)藥劑

調製以下各濃度(最終濃度)之藥劑溶液並使用作為試驗用藥劑。

比較例5：米諾地爾30μM

比較例6：腺苷100μM

實施例3：植物神經鞘胺醇0.3125μM

實施例4：植物神經鞘胺醇1.25μM

(3)試驗方法

將人真皮乳頭細胞以成為6×10³個/孔的方式播種於24孔盤。在CO₂培養器(5%CO₂、37℃)內培養1天後，取代為包含各試驗用藥劑的培養基。其後，將細胞盤放回CO₂培養器，進一步培養24小時。培養後，從各孔萃取並回收總RNA，將此反向轉錄為cDNA。使用所調製的cDNA，以即時PCR法測定VEGF基因的表現。使用GAPDH基因作為內部標準，算出VEGF基因表現量作為與陰性對照群之相對值。

從細胞之總RNA的回收中使用FastGene RNA Basic Kit(目錄編號：FG-80250，日本Genetics股份有限公司(日本))。

每孔添加300μL之溶解緩衝劑RL，以移液溶解細胞。在細胞溶解液添加300μL 70%乙醇，以移液混合。將試樣溶液添加於FastGene RNA binding column，在室溫以10000g離心1分鐘。通過管柱的濾液從收集試管廢棄，將FastGene RNA binding column放回原收集試管後，將600μL之洗滌緩衝劑RW1加入FastGene RNA binding column，在室溫以10000g離心1分鐘。將FastGene RNA binding column轉移到新的收集試管並設置，將700μL之洗滌緩衝劑RW2加入FastGene RNA binding column，在室溫以10000g離心1分鐘。將FastGene RNA binding column轉移到新的收集試管並設置，在室溫以15000rpm離心1分鐘。將FastGene RNA binding column轉移到新的收集試管並設置，將50μL之溶出緩衝劑RE添加於FastGene RNA binding column之膜中央，在室溫以10000g 離心1分鐘，並回收純化的RNA。以NanoDrop Lite(目錄編號：ND-LITE，賽默飛世爾科技股份有限公司)測定回收的RNA之濃度，保存在-80℃直至其次的cDNA化作業為止。

cDNA之合成中使用FastGene scriptaseII cDNAsynthesis 5×Ready Mix(目錄編號：NE-LS64，日本Genetics股份有限公司(日本))。將新試管所產生的總RNA之濃度成為20ng/mL的方式，以RNase Free Water稀釋，在該試樣溶液16μL中添加FastGene scriptaseII cDNAsynthesis 5×Ready Mix 4μL，以渦漩攪拌。使用MiniAmp熱循環儀(賽默飛世爾科技股份有限公司)，在25℃培養10分鐘、在42℃培養60分鐘、在85℃培養5分鐘，並合成cDNA。

將以上述方法所合成的cDNA使用於即時PCR。在96孔盤之指定孔中，添加各cDNA template稀釋液，添加THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(目錄編號：QPS-201，東洋紡股份有限公司(日本))與引子並混合，以QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System(目錄編號：4485693，賽默飛世爾科技股份有限公司)分析基因表現。作為PCR反應，進行95℃ 5秒鐘、60℃ 30秒鐘的40個循環。

試驗中所使用的VEGF基因特異性引子及作為內部標準的GAPDH基因特異性引子係如下所示。

VEGF基因表現檢測用引子

順方向：aggccagcacataggagaga(序列編號1)

逆方向：acgcgagtctgtgtttttgc(序列編號2)

GAPDH基因表現檢測用引子

順方向：catccctgcctctactggcgctgcc(序列編號3)

逆方向：ccaggatgcccttgagggggccctc(序列編號4)

如下所示般算出各基因之相對表現量。

從各基因之擴增曲線與閾值線之交點算出Ct值(PCR循環次數)。相對表現量係從目的基因之Ct值除以內部標準GAPDH基因之Ct值而得的值。

2.結果

在人真皮乳頭細胞使植物神經鞘胺醇作用72小時後，測定VEGF基因表現量的變化，並將其結果顯示於圖7。

如圖7所示，相對於人真皮乳頭細胞，使植物神經鞘胺醇(實施例3、實施例4)作用72小時，則與無添加對照群相比，確認出VEGF基因表現量上升。然後，增加植物神經鞘胺醇之添加量，則確認出VEGF基因表現量較大於使米諾地爾(比較例5)或腺苷(比較例6)作用之情況。

<試驗例4：因植物神經鞘胺醇引起的細胞分裂活性評估>

1.材料與方法

(1)實驗動物

從7至8週齡之BALB/c-nu/nu小鼠(日本SLC股份有限公司，日本)採取背部體毛皮膚。動物之飼養及試驗係遵守相關法規、部級法令、及指南，並經理化學研究所實驗倫理審查會之認可而實施者。

(2)藥劑

分別準備以下之藥劑。

實施例：植物神經鞘胺醇3%溶液

比較例：60%乙醇水溶液

(3)藥劑塗佈

在BALB/c-nu/nu小鼠之左右背部，使用微量移液管塗佈25μL之藥劑。其後，在塗佈部位使用乾燥機以冷風使藥劑快速乾燥。該作業在左右背部各重複各4次。從拔毛的第二天起，進行7天的該藥劑塗佈作業。

(4)BrdU投予

從塗佈有7天藥劑的BALB/c-nu/nu小鼠採取背部體毛皮膚之24小時及48小時前，在各小鼠之後足部分的腹部，使用注射器(Terumo股份有限公司，日本)投予10mg/mL之BrdU/生理食鹽水0.5mL。

(5)小鼠皮膚組織採取及固定

在與第8天給藥的時間相同的時間，藉由頸椎脫臼使BALB/c-nu/nu小鼠安樂死後，以不損傷毛團部分的方式採取皮膚組織。將所採取的皮膚組織在SuperFix(東洋紡股份有限公司，日本)中浸泡於固定液16至24小時後，以1×PBS洗滌4次，並保管於新的1×PBS。將其皮膚組織必要的部分切出，並以石蠟液交換機(Leica Microsystems GmbH，德國)製作石蠟塊。

(6)切片作製

使用切片機(Leica Microsystems GmbH，德國)將石蠟化的皮膚組織塊切片化，將切片貼在鍍鉑的載玻片(Platinum Pro(松浪硝子工業股份有限公司，日本))，在40℃之熱蒸氣中放置8至10小時並使其乾燥。

(7)BrdU免疫染色

為了實施脫蠟處理，將放置有試樣的載玻片以二甲苯、二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇之順序各浸入3分鐘。將經實施脫蠟處理的載玻片在室溫浸入2M HCl 30分鐘。將載玻片置於Venta Discovery ULTRA(自動染色裝置)中並啟動程序。將1次抗體Anti-BrdU antibody-Proliferation Maker(abcam，英國)使用稀釋溶液(1%BSA、0.1%TX100/PBS)稀釋160倍，在加入1次抗體的時機添加100μL/試樣數。將2次抗體Donkey Anti-Sheep IgG H&L(Alexa Flour 594)(Thermo Fisher Scientific，美國)及Hoechst(Hoechst33342)使用稀釋溶液(1%BSA、0.1%TX100/PBS)稀釋500倍，並添加100μL/試樣數。程序結束後，使用0.1%TX100/PBS沖洗洗滌並浸入1×PBS。滴入80μL/試樣數的水溶性封裝劑(0.5%沒食子酸、90%甘油/PBS)後，蓋上蓋玻片，以黃色尖端押出空氣，以抽氣器校正蓋玻片之位置的同時去除多餘的封裝劑，並使用上塗層(修指甲用)密封蓋玻片之4邊。在確認上塗層乾燥後，使用AxioScan掃描並解析圖像。

(8)BrdU之測量方法

BrdU數係將表皮層、真皮層之100μm²分成3處，並測量3個與毛囊同等程度大小者。

2.結果

本試驗例中，使用BALB/c-nu/nu小鼠，將溶解於60%乙醇且濃度3%之植物神經鞘胺醇作為試驗用的藥劑液，並連日實施塗佈。將實施60%塗佈作為陰性對照。此等之塗佈，係以1次/天且總塗佈量成為100μL之方式持續進行7天。此外，在第6、7天之相同時間，從腹部投予BrdU，於次一日採取皮膚組織。將所採取的皮膚組織石蠟化並製作切片，進行BrdU之免疫染色，並藉由BrdU數之測量觀察細胞活性。將結果顯示於圖8及圖9。

從圖8及圖9明顯可知，與陰性對照及陽性對照比較，藉由塗佈屬於本發明之手段之有效成分的植物神經鞘胺醇，獲得細胞分裂活性增大傾向，植物神經鞘胺醇3%中，至少提高毛囊中的細胞分裂活性，從而獲得本發明之手段的有效成分中所教示之具育毛活性的結果。此外，藉由塗佈屬於本發明之手段之有效成分的植物神經鞘胺醇，亦確認出表皮基底層中之細胞分裂活性的亢進，且確認出藉由本發明之手段的有效成分而獲得頭皮護理效果。明顯可知屬於本發明之手段之有效成分的植物神經鞘胺醇，具優異育毛活性的同時，亦具能夠發揮塗佈部分中之頭皮護理效果之優異的效果。

[產業利用性]

依據本發明之手段，能夠提供一種新穎的育毛劑及頭皮護理劑，其係藉由使用植物神經鞘胺醇作為屬於外用劑之育毛劑的有效成分，而具有頭髮、鬚毛、眉毛及/或睫毛等毛中之毛幹之成長促進效果、毛幹伸長速度之提升效果、毛幹最大長度之提升效果及毛幹徑增大之效果，以及頭皮護理效果。

Claims

一種育毛劑，其為包含植物神經鞘胺醇的外用劑。
如請求項1所述之育毛劑，其中，相對於整體，植物神經鞘胺醇之含量係0.001至20重量%。
如請求項1或2所述之育毛劑，其中，相對於整體，植物神經鞘胺醇之含量係0.005至10重量%。
如請求項1至3中任一項所述之育毛劑，其係用於促進毛幹生長或毛髮生長。
如請求項1至4中任一項所述之育毛劑，其係使用於使毛幹伸長速度提升。
如請求項1至4中任一項所述之育毛劑，其係使用於使毛幹最大長度提升。
如請求項1至4中任一項所述之育毛劑，其係使用於使毛幹徑增大。
如請求項1至4中任一項所述之育毛劑，其係使用於使毛髮數量增加。
如請求項1至8中任一項所述之育毛劑，其為溶液。
如請求項1至9中任一項所述之育毛劑，其係用於頭髮、鬚毛、眉毛及/或睫毛。
一種育毛方法，係包含將如請求項1至10中任一項所述之育毛劑投予至對象。