KR20220064674A - 넙치 유래 dna 단편혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부조직 재생용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 부작용을 유발하지 않고 혈관신생을 유도함에 따라 우수한 피부 재생 효과가 있는 넙치 유래 DNA 단편혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부조직 재생용 조성물을 제공한다.

Description

넙치 유래 DNA 단편혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부조직 재생용 조성물{Composition for skin tissue regeneration containing DNA fragments derived from Paralichthys olivaceus as an active ingredient}

본 발명은 피부조직 재생용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 넙치 유래 DNA 단편혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부조직 재생용 조성물에 관한 것이다.

인체에 있어서 피부는 외부환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 기능을 하는 기관으로서, 인체 내의 생체성분 즉, 물이나 전해질 등의 손실을 방지하는 동시에 외부로부터 유해물질이 인체 내로 침입하지 못하도록 하는 역할을 한다. 이러한 피부는 크게 표피층, 진피층 및 피하지방층으로 구분된다. 표피층은 각질세포와 멜라닌 세포로 구성되는데, 피부 최외곽의 각질세포층은 외부환경과 직접 접촉하기 때문에 물리적, 화학적 혹은 물질의 투과에 대한 강한 저항성이 요구되며, 인체로부터 외부로 수분이 손실되는 것을 막아줌과 동시에 자체로도 적당한 수분을 보유함으로써 유연성을 유지하여야 한다.

한편 혈관신생(angiogenesis)은 만성 및 허혈성 부상으로부터 회복하기 위한 상처 치유 과정에서 중요한 역할을 한다. 기존 혈관으로부터의 혈관성장은 임시 육아조직(granulation tissue) 형성에 참여하고 성장하는 조직에 영양과 산소를 제공하여 조직 복구하는 필수적인 과정이다. 혈관신생 과정 동안 세포 외 기질(ECM) 환경, 비만세포 트립신분해효소, VEGF, TGF-β, FGF, 안지오포이에틴(angiopoietin)과 같은 혈관신생 사이토카인 및 내피세포 간에 동적 상호작용이 발생하고(Tonnesen MG et al., Dermatol Symp Proc. Dec;5(1):40-6. 2000) 혈관신생 촉진인자와 항-혈관신생 인자의 균형은 항상성(homeostasis)을 유지한다. 관상동맥 및 말초동맥 질환과 같은 허혈성 질환에서는 불충분한 혈관신생이 유발되는데 새로 발견된 혈관신생 조절제가 임상 시험에 적용되었다(Squadrito F et al., Front Pharmacol. Apr 26;8:224. 2017).

그러나 넙치 정액 유래 DNA 단편혼합물의 피부조직 재생 등 다양한 치료활성에 관한 연구는 아직 미개척 분야이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 피부 부작용을 유발하지 않고 혈관신생을 유도함에 따라 우수한 피부 재생 효과가 있는 넙치 유래 DNA 단편혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부조직 재생용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 넙치(Paralichthys olivaceus)의 정액 유래 DNA 단편혼합물을 유효성분으로 함유하는, 피부조직 재생용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 넙치(Paralichthys olivaceus)의 정액 유래 DNA 단편혼합물을 유효성분으로 함유하는, 피부개선 기능성 화장료 조성물이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부조직 재생용 조성물은 우수한 혈관신생 활성으로 인해 피부 고유의 기능을 유지시키면서 빠르고 효과적으로 피부의 상처를 치유하고 재생을 촉진시킬 수 있으므로 산업적 활용도가 높은 피부 기능성 화장품 및 다양한 의약용 소재로 활용가능하다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1a는 넙치 정액으로부터 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물을 제조하는 과정을 나타내는 아가로스겔 사진이다. 넙치의 정자 게놈 DNA(100 ng/ul; 300 ng/sample)의 전단(Shearing)은 30초 ON/OFF 사이클로 다른 초음파 처리주기 설정에서 전단되었다.
도 1b는 넙치 정액으로부터 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물을 정제하는 과정을 나타내는 아가로스겔 사진이다. 초음파 처리 및 정제 후 넙치 DNA 단편혼합물. 1, 넙치의 정자 게놈 DNA; 2, 초음파 처리 후 9, 11, 13 및 15 사이클에서 함께 수득된 전단 DNA로부터 수집된 정자 게놈 DNA의 혼합물; 3, 추가 정제된 넙치 DNA 단편혼합물.
도 2a는 HUVEC에 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물을 처리하여 관 형성을 분석한 것으로 넙치 유래 DNA 단편혼합물 또는 VEGF, 양성 대조군에 의해 형성된 관형 구조의 반복적 이미지를 나타내는 현미경 사진이다. 세포를 파종할 때 넙치 유래 DNA 단편혼합물(100 μg/ml) 또는 VEGF(20 ng/ml)를 함께 처리했고 세포의 형태학적 변화를 현미경으로 촬영하였다(100X).
도 2b는 HUVEC에 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물을 처리하여 관 형성을 분석한 것으로 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물 또는 VEGF에 의해 6시간 동안 형성된 관 영역의 수를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2c는 HUVEC에 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물을 처리하여 관 형성을 분석한 것으로 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물 또는 VEGF에 의해 6시간 동안 형성된 관형 구조 영역의 분기점 수를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 생체 내 혈관신생에 대한 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물의 효과를 분석한 것으로 매트리겔 플러그의 대표적인 이미지다. 넙치 유래 DNA 단편혼합물(100 μg/ml) 또는 VEGF(20 ng/ml)와 혼합된 매트리겔 플러그를 마우스에 주입했다.
도 3b는 생체 내 혈관신생에 대한 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물의 효과를 분석한 것으로 헤모글로빈의 농도를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 헤모글로빈의 농도는 알려진 양의 헤모글로빈을 사용한 병렬 분석에서 계산되었다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "넙치(Paralichthys olivaceus)"는 가자미목 넙치과에 속하는 바닷물고기로 광어(廣魚)라고도 한다. 연안의 조수가 고여 있는 곳으로부터 수심 1,000 m의 심해에까지 서식한다. 몸길이는 5cm 정도인 소형종에서 80cm에 달하는 종류까지 있다. 몸은 납작하고 대개 원 모양에서 긴 타원형까지 있고 꼬리지느러미는 등지느러미와 뒷지느러미에서 명확하게 분리되어 있다. 몸 색깔은 눈 있는 쪽은 갈색 또는 어두운 색이고, 반대쪽은 흰색이다.

본 문서에서 사용되는 용어 "DNA 단편혼합물"은 넙치의 정액 유래 DNA 복합체 즉 데옥시리보뉴클레오타이드 중합체가 포함된 화합물로 넙치의 정액으로부터 게놈 DNA를 추출하고 초음파 처리한 다음 에탄올 침전으로 농축하여 제조된다. 상기 DNA 단편혼합물은 혈관신생 유도에 따른 피부조직 재생에 매우 효과적인 활성을 나타낸다.

본 문서에서 사용되는 용어 "재생"은 피부외과 및 내부 원인에 의해 발생된 피부 또는 세포의 손상에 대한 피부 조직의 회복과정을 의미한다. 상기 외부 원인에 의한 손상은 자외선, 외부 오염 물질, 창상, 외상 등을 들 수 있으며 상기 내부원인에 의한 손상은 스트레스 등을 들 수 있다.

발명의 상세한 설명:

본 발명의 일 관점에 따르면, 넙치(Paralichthys olivaceus)의 정액 유래 DNA 단편혼합물을 유효성분으로 함유하는, 피부조직 재생용 조성물이 제공된다.

상기 조성물에 있어서, 혈관신생 활성에 의해 피부조직 재생을 촉진할 수 있고 넙치의 정소로 부터 정액을 수득하는 단계; 넙치의 정액을 배양한 후 게놈 DNA를 추출하는 DNA 추출단계; 상기 게놈 DNA를 초음파 처리하는 초음파 처리단계; 및 초음파 처리된 DNA 용액을 에탄올 침전으로 농축하여 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 넙치(Paralichthys olivaceus)의 정액 유래 DNA 단편혼합물을 유효성분으로 함유하는, 피부개선 기능성 화장료 조성물이 제공된다.

상기 조성물에 있어서, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 피부 콜라겐 합성 촉진, 콜라게네이즈 활성 저해, 피부 주름 개선, 피부 재생 촉진, 피부 탄력 향상, 피부장벽 기능회복, 아토피 개선 효과, 항염증 효과 및 피부 보습 향상으로부터 선택되는 어느 하나의 피부 상태 개선 효과를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분 외에 필요에 따라 향료, 비타민, 안정제, 황산화제 등과 같은 인체에 유해하지 않은 통상적인 첨가제를 추가로 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총중량에 대해 0.001 내지 30중량%이다. 다만, 어떠한 경우라도 첨가제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있고 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용될 때에는 화장수, 에멀젼, 크림, 에센스, 젤, 팩 및 클렌징크림으로부터 선택되는 기초 화장료; 화운데이션 등의 메이크업 화장료로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

넙치(Paralichthys olivaceus)는 한국, 중국, 일본에서 가장 상업적으로 중요한 해양 양식 어종 중 하나이다(Kang JH et al., Int J Biol Sci. 4:143??149. 2008). 2019년에는 약 3억 2,600 만 달러에 해당하는 43,400톤 이상이 생산되었으며, 이는 한국 전체 어류 양식 가치의 52.7%에 해당한다(한국 통계 정보원, 2020). 이러한 넙치 종의 경제적 중요성으로 인해 넙치를 활용한 식,의약품 소재에 대한 연구가 많이 부족한 실정이다.

본 발명자들은 넙치의 정액 유래 생리활성 물질에 대한 연구에 주목하였다. 현재까지 넙치 정액 유래의 피부 조직 재생 물질에 대한 연구는 많이 수행되지 않았다. 따라서 본 발명자들은 넙치의 정액으로부터 DNA 단편혼합물을 제조하였고 넙치 유래 DNA 단편혼합물이 혈관 형성과 관련된 생물학적 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 넙치(Paralichthys olivaceus) 정액에서 유래된 피부 복원 물질인 DNA 단편혼합물을 처리함에 따라 시험관 내에서 VEGF와 유사한 관 형성 활성을 나타내었고 혈관신생의 척도인 매트리겔 플러그의 헤모글로빈 함량을 증가시킴을 확인하였다. 상기 결과는 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물은 피부 재생 조직 촉진을 위한 의학 소재 또는 화장료 조성물로 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

일반적 방법

DNA 단편혼합물의 제조

본 발명자들은 넙치(P. olivaceus)의 정액으로 부터 DNA 단편혼합물을 제조하였다. 구체적으로 국립수산과학원 생명공학과에서 사육 관리하고 있는 넙치의 정액은 용해 완충액(10 mM Tris-Hcl(pH 7.4), 10 mM EDTA, 125 mM NaCl, 2% SDS, 8M UREA) 및 proteinase K(60 mAnson U/ml)에서 37℃ 조건으로 밤새 배양하였다. 다음 날 phenol:chloroform:isoamylalcohol(=25:24:1)을 처리하여 단백질을 제거하고 3M 아세트산 나트륨(sodium acetate)을 이용한 에탄올 침전을 통해 게놈 DNA를 추출했다. 2 ml TE의 총 게놈 DNA(200 ng/μl)는 소니케이터(sonicator)를 사용하여 30'' ON /OFF 펄스로 초음파 처리하였다. 초음파 처리 중에 DNA 샘플은 저온에 보관하였고 9, 11, 13 및 15분 동안 초음파 처리된 샘플을 균일하게 혼합하여 2000 bp 이하의 DNA 단편혼합물을 생성했다. DNA 용액은 에탄올 침전을 2차례 실시하여 순도를 높이고 최종 농도 10 ug/ul로 농축되었다.

세포 배양

본 발명에서 사용한 인간제대정맥내피세포(HUVEC)는 Lonza(Basel, Switzerland)에서 구입하였다. 상기 HUVEC를 0.2% 젤라틴 코팅 플레이트에 플레이팅하고 내피 기저 배지(EBM-2), 20% 우태아혈청(FBS)(Gibco), 1% 페니실린-스트렙토 마이신(ps)(Gibco), 3 ng/ml bFGF(Millipore), 5 U/ml 헤파린(Sigma)을 포함하는 멸균내피 성장배지(EGM-2 BulletKit, Lonza)에서 배양하였다. 그 후 세포는 37 ℃, 5% CO₂/95% 습도 조건에서 배양하였고 70-80% 정도 증식했을 때 계대 배양하였으며 48시간 마다 배지를 교체했다.

내피세포의 관 형성

본 발명자들은 내피세포의 관 형성 분석을 위해 실험 전 날 2 계대에서 상기 HUVEC를 5% FBS를 함유하는 M199 배양 배지(Gibco BRL, NY, USA)로 교환하여 16시간 배양하였다. 3 계대에서 상기 HUVEC를 5% FBS를 함유하는 M199 배양 배지(Gibco BRL, NY, USA)에 현탁하고 500 μL 성장 인자-감소 매트리겔(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 코팅된 24 웰 플레이트에 플레이팅하였으며 37℃에서 30분 동안 중합하였다. 이 때 상기 세포에 VEGF 또는 넙치 유래 DNA 단편혼합물을 최종 농도 20 ng/ml 또는 100 μg/ml로 각각 6시간 동안 처리했다. 세포의 형태학적변화는 도립 현미경(100x)으로 촬영하였고 관 형성은 관 영역의 수와 분기점을 측정하여 분석했다.

매트리겔 플러그 분석

본 발명자들은 생체 내(In vivo) 매트리겔 플러그 분석을 수행하였다. 구체적으로 혈관신생은 매트리겔 플러그(matrigel plug) 분석에 의해 정량화되었다(Baek A et al., Cell Transplant. Oct 12:963689718804130. 2018). 정량화를 위해 4℃ 액체 상태의 마트리겔을 넙치 유래 DNA 단편혼합물(100 μg/ml)과 혼합하였고 생성된 혼합물을 7주령 수컷 C57BL/ 마우스의 복막 중간선을 따라(3 마리 마우스/그룹) 복부 피하 조직에 주입했다(0.5 ml). 7일 후 상기 마우스를 희생시켜 매트리겔 플러그를 제거하였고 사진을 촬영하였다. 또한, 헤모글로빈 측정을 위해 500 μl 증류수에서 플러그를 균질화하고 혈관 형성을 정량화하기 위해 Drabkin 시약 키트 525(Sigma)를 사용하여 헤모글로빈 농도를 측정했다.

실시예 1: 넙치 유래 DNA 단편혼합물의 제조

본 발명자들은 2,000 bp 길이 이하의 선형 DNA 뉴클레오티드 폴리머를 생성하기 위해 넙치의 정액 게놈 DNA를 추출하고 단편화했다.

그 결과, 정액에서 넙치의 정자 게놈 DNA는 다양한 초음파 처리 조건 세트와 함께 초음파기를 사용하여 전단되었다(도 1a). 한 세트의 초음파 처리 조건은 50-2000 bp의 광범위한 DNA를 커버하기에 충분하지 않았으며, 다른 초음파 처리 시간 과정(9, 11, 13 및 15주기)의 DNA 샘플을 초음파 처리 후 혼합했다(도 1b). 상기 전단된 DNA의 혼합물을 정제하고 단백질 및 펩티드 없이 순수한 넙치 유래 DNA 단편혼합물을 생성하기 위해 A260/280을 분석하였으며 최종적으로 DNA 단편혼합물의 특징을 가진 넙치 정액 유래 뉴클레오티드의 혼합물을 수득하였다.

실시예 2: 체외 혈관신생 분석

본 발명자들은 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물이 HUVEC에서 혈관신생에 미치는 영향을 조사하였다. 구체적으로 혈관신생에 대한 넙치 유래 DNA 단편혼합물의 역할을 입증하기 위해, HUVEC가 세포 외 기질(extracellular matrix) 지지체에 튜브형 네트워크를 형성하는 능력을 분석했다.

그 결과, 내피세포는 매트리겔에서 넙치 유래 DNA 단편혼합물 및 VEGF에 의해 6시간 만에 작은 가지(small branch)를 이동하고 형성했다(도 2a). 또한 상기 HUVEC에 의해 형성된 모세관과 같은 구조는 튜브 영역의 수와 분기점의 수를 측정하여 정량화한 결과 넙치 유래 DNA 단편혼합물은 VEGF와 비교하여 관 형성에 유사한 활성을 나타냈다(도 2b 및 2c).

실시예 3: 체내 혈관신생 분석

본 발명자들은 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물이 마우스의 혈관신생에 미치는 영향을 조사하였다. 혈관신생에 대한 넙치 유래 DNA 단편혼합물의 역할을 입증하기 위해, HUVEC가 세포 외 기질 지지체에 관형 네트워크를 형성하는 능력을 분석했다.

그 결과 생체 내 마우스 매트리겔 플러그 분석에 의해 본 발명의 넙치 유래 DNA 단편혼합물은 마우스에서 혈관신생의 척도인 매트리겔 플러그의 헤모글로빈 함량을 증가시킴을 확인하였다(도 3a 및 3b).

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (6)

1. 넙치(Paralichthys olivaceus)의 정액 유래 DNA 단편혼합물을 유효성분으로 함유하는, 피부조직 재생용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   혈관신생 활성에 의해 피부조직 재생을 촉진하는, 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   넙치의 정소로 부터 정액을 수득하는 단계;
   넙치의 정액을 배양한 후 게놈 DNA를 추출하는 DNA 추출단계;
   상기 게놈 DNA를 초음파 처리하는 초음파 처리단계; 및
   초음파 처리된 DNA 용액을 에탄올 침전으로 농축하여 제조되는, 조성물.
4. 넙치(Paralichthys olivaceus)의 정액 유래 DNA 단편혼합물을 유효성분으로 함유하는, 피부개선 기능성 화장료 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는, 조성물.
6. 제4항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 피부 콜라겐 합성 촉진, 콜라게네이즈 활성 저해, 피부 주름 개선, 피부 재생 촉진, 피부 탄력 향상 및 피부 보습 향상으로부터 선택되는 어느 하나의 피부 상태 개선 효과를 갖는, 조성물.

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