KR20020033020A - 3가철의 폴리히드록실화 착체(폴리알코올)를 가진 가용성알부민의 첨가생성물, 그 취득방법, 그 첨가생성물을포함한 의약조성물 및 식이요법 조성물 - Google Patents

3가철의 폴리히드록실화 착체(폴리알코올)를 가진 가용성알부민의 첨가생성물, 그 취득방법, 그 첨가생성물을포함한 의약조성물 및 식이요법 조성물 Download PDF

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테나 귤러모
테덱 메이지 파르마 에스.에이.
루비오 페데리코
신텍스 우루과이아 에스.에이.
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Abstract

수용성 첨가생성물은 가용성의 감도상실한 알부민을 가진 3가철의 폴리히드록실화 착체를 구성한다.
그 폴리히드로실화 화합물은 1개이상의 히드록시기를 포함하며 3가철과 착체를 형성할 수 있는 화합물이다.
그 알부민은 가열, 알칼리 및 산화제로 처리시켜 알부민의 분자량에 영향을 줌이 없이 가용화할 수 있다.
그 첨가생성물은 처리한 알부민용액과 3가철 착체용액을 혼합시켜 얻을 수 있다.
이들의 첨가생성물은 3가철착체의 경구투여에 적합하여, 철결핍증 처리 및/또는 그 철공급용으로 접합하다.

Description

3가철의 폴리히드록실화 착체(폴리알코올)를 가진 가용성 알부민의 첨가생성물, 그 취득방법, 그 첨가생성물을 포함한 의약조성물 및 식이요법 조성물{ADDUCTS OF SOLUBLE ALBUMIN WITH POLYHYDROXYLATED COMPLEXES(POLYALCOHOLS) OF TRIVALENT IRON, METHOD FOR OBTAINMENT AND PHARMACEUTICAL AND DIETETICAL PREPARATIONS CONTAINING THEM}
본 발명은 가용성 알부민을 가진 3가철의 폴리히드록실화 착체첨가생성물, 그 첨가생성물을 취득하는 방법, 그 첨가생성물을 함유한 의약조성물 및 식이요법 조성물에 관한 것으로, 산업상볼 때 의학적 조성물, 약학적 조성물 및 식이요법 조성물의 제조에 관한 것이다.
알부민은 생리적 캐리어(physiological carrier)(즉, 운반자)로서, 잘 알려진 바와 같이 불용성인 체내생성물(지방산, 스테로이드, 히드록실화 화합물)을 운반한다.
따라서, 알부민은 일반적으로 생활성(bioactive)이 적고, 물에 불용성인 분자를 저장, 교환 및 조정방출하는 기능적 작용을 행한다.
널리 공지되어 있는 바와 같이, 알부민은 3종의 다른 기원, 즉 혈청, 우유 및 난백에서 얻어진다.
혈청알부민(seroalbumin)은 종-특이성(species-specific)이 있어, 다른 단백질 및 바이러스입자(viral particles)와도 오염될 우려가 있으므로, 병원균의 종간 전파에 대한 문제가 발생하였다.
더욱이, 이 혈청알부민은 실제로 수중에서 불용성이며, 코스트가 고가이다.
우유에 존재하는 락토알부민(lactoalbumin)은 단하나의 기원, 즉 젖소우유에서 기술적으로 처리하여 얻을 수 있다.
이와 같은 단백질은 코스트가 고가이고 분리 및 정제가 어렵다. 오보알부민 (ovoalbumin)은 난백(egg white)에서 다량으로 존재하는 성분으로, 코스트가 염가이며, 시중에서 얻을 수 있다.
사실, 그 오보알부민은 난백의 75%를 구성하고 있어, 여기서는 극소량의 아비딘(avidin),리소좀(lysozome),콘알부민(conalbumin) 및 오보뮤코이드(ovomucoid)가 포함되어있다.
그러나, 의약적 캐리어로서 오보알부민의 사용은 여러가지의 요인에 의해 극히 한정되어있다.
특히, 그 오보알부민은 격렬한 교반에 의해 비교적 저온(56℃)에서 변성되며, 아비딘은 본래 갖고 있는 부수물로서 바오틴(biotin)을 실활(deactivates)하는 독성요소(독성 난백요소)이므로 결과적으로 정제하기가 대단히 어렵다.
의약용 캐리어로서 오보알부민의 사용에 있어 주요한 추가적인 어려움은 난백 투여를 불과 2, 3명에게 할 때 발생하는 알레르기와 면역독성에 대한 기술적인 문제에 있다.
따라서, 이와 같은 캐리어중에서 오보알부민을 사용할 수 있도록 하기 위하여 그 오보알부민의 본래 갖고 있는 독성과 불순물(기본적으로 아비딘)을 제거하기 위한 처리를 할 필요가 있다.
화학적으로 알부민을 개질시켜 캐리어로서 알부민의 능력을 손상시키지 않고 알부민의 용해도 결여문제를 해결할 필요가 있으며, 가열, 교환 및 전이금속의 작용(그 금속의 대부분은 철, 코발트 등과 같이 생물학적으로 활성임)에 의해 이와같은 알부민의 변성에 대한 결점을 제거할 필요가 있다.
현재 행해지고 있는 의약연구의 주요한 기술분야에서는 치료에 활성인 물질을 효과적으로 조절할 수 있게 전달하는데 노력하고 있다.
그 결과, 경구투여에 적합하고, 위염증의 위험을 최소화하며 치료효율을 최대로 하는 생성물을 취득하는 것이 특히 중요하다.
경구투여의약품을 전달함으로(vehiculising), 위 수용성(gastric acceptabil ity)속도가 더 높아지고, 그 활성분자가 위 또는 장내에서의 분해를 방지하며, 대부분의 경우 최초 효율을 향상시키고, 약물동태학(또는 약동학)적인 바람직한 변형에 의해 1일 사용량을 감소한다.
의약품 및 수의약품의 치료투여용으로 3가철을 제조하여 전달하려는 여러가지의 시도가 있었다.
그 예로서, 금속을 킬레이팅(chelating)하는 콘알부민의 특성에 대하여 다음의 참고문헌에 기재되어있다(J.Am.Chem.Soc.75,5094,1953).
소르비톨(Inorg.Chim.Acta.80,251-254,1983)을 포함하는 탄소수화물타입(Car bon hydrate-type) 코리간드(coligand)를 가진 3가철착체(Inorg.Chim.Acta.124,55-59)에서와 같이 적합하게 변형시켜 생리적인 pH에서 전이금속을 가용화하는 젖산유도체에 대하여 기재되어있다(Drug Res.34(Ⅱ)NO.9,1984).
더욱이, 아미노화 화합물로 안정화시켜 전달한 3가철 사카레이트(saccharate )와 프럭테이트(fructate)의 제조에 대해서는 특허문헌, EP O 223 153 (Mediolanum Farmaceut ici)에서 기재되어 있으며, 불안정한 3가철착체를 전달하여 치료용으로투여하는 최상의 형태에 관한 것이다.
그러나, 위에서 예시한 참고문헌에서는 알부민 등 천연단백질 캐리어를 적합하게 처리하여 바람직하지 않은 효과를 제거하고 바람직한 효과(의약품 등의 용해도, 위보호, 조정방출)와 약물동태학적으로 철방출을 좋게 함과 동시에 그 캐리어를 위내에서 그리고 면역독성면에서 무해하도록 하는 아직 보고된 바 없는 기재 (substrate)(3가철의 폴리히드록실화 착제)의 결합을 향상시켜 천연단백질 캐리어(알부민 등)의 생리적인 행동을 치료하는 기술조성에 대하여 기재되어있거나 암시한 바 있다.
본 발명은 3가철의 폴리히드록실화 착체(폴리알코올)를 가진 가용성 알부민의 첨가생성물, 이들의 첨가생성물을 포함한 의약조성물 및 식이요법 조성물과 그 첨가생성물의 취득방법을 제공하는데 있다.
또, 본 발명은 알부민의 분자량에 영향을 줌이 없이 가용화하도록 하며, 그 알부민과 관련되어있는 알레르기 및 면역독성현상을 제거하는 그 어떤 기원의 알부민을 처리하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 가용성 알부민을 가진 3가철의 폴리히드록실화 착체 첨가생성물과 그 첨가생성물을 취득하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 추가목적은 이와 같은 첨가생성물을 포함하는 의약조성물 및 식이요법 조성물의 제공에 있다.
최종적으로, 본 발명의 또 다른 목적은 철분결핍증의 처리 및/또는 철이 필요할 때 사람 또는 동물의 공급 및 보충용으로 이들의 첨가생성물의 사용방법을 제공하는데 있다.
도 1은 본 발명의 열, 알칼리 및 산화공정에 의해 처리한 오보알부민의13C-NMR 스펙트럼도이다.
도 2는 본 발명에서와 같이 처리한 오보알부민(ovoalbumin)을 가진 철(Ⅲ)-만니톨착체의 첨가생성물에 대한 특성을 나타낸13C-NMR 스펙트럼도이다.
1. 알부민의 처리
제 1 목적으로, 본 발명은 분자량에 영향을 주지 않고 가용화할 수 있는 어떤기원의 알부민을 처리하는 방법을 제공하여, 그 알부민과 관련되어있는 알레르기와 면역독성의 현상을 제거한다.
다수의 연구와 시험에 의해, 처리시간, 처리온도 및 산화제의 첨가를 조정한 방법을 사용하여 알칼리도를 조정한 상태에서 알부민을 처리할 때 가용화할 수 있고, 3가철의 폴리히드록실화 착체를 가진 첨가생성물의 제조에 유용한 1종의 알부민이 얻어짐을 기대이상으로 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 설명한 알부민의 처리방법, 즉 알부민의 열알칼리산화 처리방법은 아래의 공정으로 이루어진다;
a) 수중에서 현탁시킨 알부민현탁액에 진한염기용액, 바람직하게는 1M의 NaOH의 최종농도를 얻는데 필요한 양의 소듐히드록사이드(NaOH)를 격렬한 교반을 하면서 첨가한다.
동시에 온도 63℃ ~ 67℃에서 강열하게 가열하면서 15 ~ 60분간에 걸쳐 그가열과 교반을 유지한다.
b) 적합한 산, 예로서 HCl을 첨가시켜 위 a)공정의 용액을 중화시켜 pH 8.5 ~ 10.0로 조정한다.
c) 그 다음, 그 알부민에 대하여 H2O24% ~ 8%의 양을 첨가한다.
d) 그 용액용량을 농축시켜 염, 잔류과산화물 및 바이러스를 실활시키는 처리공정에서 발생한 다른 저분자량의 분순물, 알레르기 및 면역독성을 제거하기 위하여, 분급(cut-off)분자량 10,000 달톤(Dalton)(Da)을 가진 격막으로 장치한 한외여과(UF)장치를 사용하여 정화(clarification)및 한외여과(ultrafilter)시킬 목적으로 여과한다.
수중에서 현탁시킨 알부민 현탁액에는 알부민의 최종농도 3% ~ 7%(w/v)를 포함한다.
그 현탁액은 어느 기원(혈청, 우유, 계란)의 알부민, 바람직하게는 오보알부민을 사용하여 제조할 수 있으며, 그 현탁액은 통상 분말형태의 알부민을 적량의 물에 첨가시켜 형성되며 격렬한 교반에 의해 바람직하게는 온도 40℃이내의 온화한 가열로 위에서 설명한 최종농도를 얻는다.
이와 같이 하여 얻은 용액에는 분자첨가생성물(molecular adducts)의 생성에의한 3가철착체(3가철의 폴리히드록실화 착체)의 전달 또는 다음 처리공정에서의 동결건조 및 사용에 적합한 그 처리알부민(treated albumin)이 포함되어있다.
위에서 설명한 방법의 작용조건에 대하여 아래에서 설명한다.
- 알부민 3%(w/v)이하의 농도는 알칼리공격에 의해 그 알부민의 분자보존을 손상 받게되므로 바람직하지 않으며, 반면에 그 농도가 7%(w/v)이상일 때 단백질의 농도가 높아져 겔을 형성하는 경향을 가진 용액으로 되어 이와 같은 경향은 pH값이 더 낮아질 때와 NaOH를 중화할 때 증가하기 때문에 바람직하지 않다.
- 용액중에서 가장 적합한 NaOH의 농도는 1M이다.
그 이유는 바이러스 실활(viral deactivation)에 적합한 농도로 입증되었기 때문이다.
- 그 가열온도는 63℃ ~ 67℃의 범위로 하는 것이 필요하다.
그 이유는 그 범위온도보다 더 높은 온도에서는 그 NaOH의 농도에서 단백질구조의 알칼리가수분해를 발생하며, 반면에 온도가 63℃이하에서는 용해도가 불확실한 최종생성물의 제조와는 별도로 그 알칼리실활이 완료되지 않기 때문이다.
- 알칼리처리시간은 15 ~ 60분의 범위로 할 필요가 있다.
그 이유는 15분이하에서 얻은 생성물은 가용성이 불충분하게되고, 반면에 60분이상에서는 주로 그 단백질구조의 알칼리분해를 발생하여 그 본래의 단백질의 분자량을 보존할 수 없기 때문이다.
- 그 H202는 위에서 설명한 양으로 첨가할 필요가 있다(그 오보알부민에 대하여 4% ~ 8%).
그 이유는 이 양이 필요한 제한범위내 있도록 함으로써, pH 8.5 ~ 10.0의 수중에서 H2O2의 부분파괴로 인하여 순수의 방사선분해에 의해 얻어진 아비딘실활활성과 대비할 수 있는 활성레벨을 얻을 수 있기 때문이다.
H2O2의 농도가 더 낮을 때에는 실활이 필요하지 않으나, 그 농도가 더 높아질 때에는 오보알부민이 해중합되어 위에서 설명한 3가철착제의 캐리어로서의 그 상태를 극심하게 변질시킨다.
위에서 설명한 알부민의 처리방법이 그 단백질의 분자량에 영향을 주지 않아, 본래의 단백질이 용해하지 않은 열상태에서 작용할 수 있다는 것이 기술적으로 중요하다.
이와 같이 처리한 그 단백질은 Fe+3등 카티온(cations)의 응집(flocculatin g)에 의해 응고되지 않으며, 물에 불용성인 3가철 화합물을 용해에 의해 전달할 수 있다.
위에서 설명한 열, 알칼리 및 산화처리는 아비딘의 존재와 그 단백질 자신의알레르기특성을 기초로 하는 면역독성 및 알레르기를 제거한다.
알레르기 쇼크(allergic shock)에 대한 문제는 수용성 매질중에서 온도를 조정하여 실시한 알칼리성 소화에 의해 제거한다.
아비딘은 특히 수용액중에서 가열 및 조사(irradiation)에 의해 파괴시킨다. 그 물을 X선 또는 감마선 또는 고에너지 전자선으로 조사시켜 수개의 활성이 높은 래디컬(HO·,H·,HO2·)로 되어, 이들의 래디컬은 잘 알려진 바와 같이 단백질 및 핵산의 불안정한 분자를 변성시키고, 분리시킨다(Bindoli,A.;Cavalini,L."1. Radicali Liberi," Piccin Eds.,(1980),78-80).
특히, 생물학적 시스템에서 산소 또는 공기의 존재하에서 조사할 경우에 조사에 대단히 민감하다.
산업적인면에서 수용액의 조사는 기술적인 어려움이 현저하다.
동일한 유리래디컬(바람직하게는, 과산화수소)의 캐스케이드(cascade)를 구성시켜 열분해하는 산화제를 첨가시켜 대규모의 수용액조사에 대한 기술적인 불가능성을 해결하였으며, 그 과산화수소의 과산화분해에 의해 아비딘의 파괴를 조절하도록 하였다.
그 조절상태에서 래디컬에 의한 이 분해는 오보알부민에 영향을 주지 않으나 아비딘을 파괴한다.
공지된 하버-바이스반응(Haber-Weiss reaction)에 의한 H2O2의 순간적인 열분해로, 물의 방사선분해와 같이 동일한 래디컬종(radical species)으로 된다.
즉, O2+ H2O2----------> OH-+ OH·+ O2
[Bindoli,A.;Cavalini,L."1.Radicali Liberi,"(1980),Piccin Eds.,22-23;F. Haber,J.Weiss,Proc.Roy.Soc.London,147,332/51(1934)].
더욱이, 이와 같이 주의를 요하는 열, 알칼리 및 산화처리는 종래의 슬로우바이러스(slow viruses)를 제거하는 가장 효과적인 방법으로 확인되었다(RBM Protoco l Exp.210287).
본 발명에 의한 알부민 처리방법을 사용하여 이와 같이 처리한 알부민을 가진 3가 카티온, 특히 Fe3+의 폴리히드록실화 착체의 안정성있는 첨가생성물을 얻는다.
2. 가용성 알부민을 가진 3가철의 폴리히드록실화 착체의 첨가생성물
본 발명은 가용성 알부민을 가진 철(Ⅲ)의 폴리히드록실화 착체중 안정성있는 착체의 첨가생성물을 제공한다.
그 폴리히드록실화 화합물은 3가철을 가진 착체를 형성할 수 있는 1종이상의 히드록시기를 포함한 화합물로 할 수 있다.
본 발명의 첨가생성물의 소정의 예에서, 위에서 설명한 폴리히드록실화 화합물은 모노사카라이드에서 유도된 폴리알코올이다.
바람직한 소정의 예에서, 그 폴리알코올은 마니톨 또는 소르비톨로 이루어진 그룹에서 선택한다.
소정의 예에서, 본 발명의 첨가생성물은 다음 일반식(I) 또는 (Ⅱ)로 나타낸다.
[FeX(CXH2XOX)]n알부민 (I)
여기서, x는 5,6 또는 12의 정수이다.
[FeX(CXH2X+2OX)n]알부민 (Ⅱ)
위식에서, x는 위에서와 동일한 정의를 가진다. 즉, 5,6 또는 12의 정수이다.
본 발명의 바람직한 예에서, 그 첨가생성물은 다음의 분자식을 가진다.
110{[(FeO)6(C6H14O6)]6HO}3알부민
이들의 첨가생성물(adducts)을 얻기 위한 기술구성에는 알부민을 처리하는 제 1 공정(first stage), 3가철의 폴리히드록실화 착체를 형성하는 제 2 공정 (second stage) 및 그 처리한 알부민과 그 3가철의 폴리히드록실화 착체의 반응에 의한 첨가생성물을 형성하는 제 3 공정(third stage)을 포함한다.
그 알부민의 처리는 위에서 설명한 방법에 의해 실시한다.
3가철의 폴리히드록실화 착체를 형성하기 위하여 3가철 이온의 기원을 가진 화합물(즉, 염화철:ferric chloride)과 폴리히드록실화 화합물을 염기성 매질중에서 혼합시키고 수중에서 용해시켜 약 95℃로 가열시킨 용액을 얻어 그 착화처리공정을 완료한 다음에 냉각시킨다.
처리한 알부민을 가진 3가철의 폴리히드록실화 착체 첨가생성물을 형성하기위하여, 그 처리알부민용액을 교반하면서 그 3가철착체용액에 첨가한다.
그 다음으로, 그 처리결과 얻어진 생성물을 분리시켜 결렬한 교반을 하면서 pH4.0으로 일정하게 한 무기산, 바람직하게는 2M HCl의 첨가수용액에 의해 정제한다.
그 고상의 침전물을 원심분리시킨 다음, 맑은 상증액(단백질 잔유물과 착화되지 않은 철포함)을 폐기한다.
위에서 설명한 바와 같이 분리시킨 고형분을 증류수중에서 용해시켜 교반하면서 10M 소듐히드록사이드의 첨가를 조정하여 pH 8.0 ~ 8.5를 얻은 다음, 그 첨가생성물을 일단 용해시키면 2M HCl에 의해 pH4로 재조정시켜 산매질중에서 침전물의 조작을 반복한다.
결합하지 않은 철과, 회합하지 않은(unassociated) 단백질 및 염이 없는 철단백질의 첨가생성물을 다시 원심분리한다. 그리고 그 상증액을 폐기한다.
이와 같이 분리시켜 정제한 첨가생성물은 증류수중에서 재용해시켜 위에서 설명한 바와 같이 10M NaOH용액의 첨가에 의해 pH를 7.8 ~ 8.2로 조정한다.
이와 같이하여 얻어진 생성물은 그 자체 물에 불용성인 이 착체를 경구투여하도록 한 처리알부민을 가진 3가철의 폴리히드록실화 착체의 첨가생성물로서, 철을 필요로 하는 사람 또는 동물에게 3가철을 공급하는데 사용할 수 있다.
3. 가용성 알부민을 가진 3가철의 폴리히드록실화 착체의 첨가생성물을 포함한 의약조성물, 수의약조성물 및 식이요법 조성물
본 발명은 의약용 또는 수의약용으로 허용할 수 있는 부형제와 함께 위에서 설명한 최소한 1종의 첨가생성물로 이루어진 의약 또는 수의약조성물을 제공한다.
본 발명은 또 다른 첨가제 및/또는 식품을 선택적으로 조합한 위에서 설명한 바 있는 최소한 1종의 첨가생성물로 이루어진 식이요법 조성물을 제공한다.
4. 가용성 알부민을 가진 3가철의 폴리히드록실화 착체의 첨가생성물의 사용
본 발명에 의해 제공한 첨가생성물은 철결핍증, 예로서 페로페닉 빈혈증( ferropenic anaemia)의 처리 및 병리학적인 이유는 아니더라도 철을 필요로 하는 사람 또는 동물에 철을 공급 또는 보충하는데 적합하다.
실시예
다음 실시예는 본 발명을 설명한 것이나, 여기에 한정되어 있는 것은 아니다.
실시예 1
처리오보알부민과 철(Ⅲ)-만니톨 착체의 첨가생성물
1.1 철(Ⅲ)-만니톨 착체
물 3ℓ(167몰)중에 FeCl3.6H2O 1.18몰(320g)과 만니톨 0.44몰(80g)을 용해하였다.
그 다음, 격렬하게 교반하면서 10M NaOH용액 4.5몰을 첨가하였다. 약 3,700㎖의 용액의 최종용량은 pH12.8에서 얻었다. 이 용액을 95℃로 가열시킨 다음 주위온도로 냉각하였다.
1.2 처리한 오보알부민
격렬한 교반을 하면서 충분한 수중에서 분말형태의 시판용 오보알부민 50g 을 분산시켜 현탁액 900㎖를 얻었다.
이 현탁액의 생성을 신속하게 하기 위하여, 교반하면서 온도 40℃로 가온하고, 묽은 증기(thin stream)중에 10M NaOH 용액 100㎖를 첨가하면서 버너상에서 격렬하게 가열하였고, 온도 65℃ 로 될 때까지 교반하면서, 1시간 유지하였다.
그 다음, 6M HCl을 첨가시켜 pH10으로 조정하고 온도 65℃에서 30% H2O2용액 2㎖를 첨가하였다.
가스의 초기 방출후에 청정판(clarifying plate)상에서 여과하고 한외여과장치(UF)(분급분자량:10,000 Da)를 사용하여 그 투과에서 음성펩티드반응(뷰렛:Biure t)이 있을 때까지 증류수중에서 투석시켜 한외여과하였다.
1.3 처리알부민을 가진 철(Ⅲ)-만니톨 착체의 첨가생성물을 형성시켜 교반하면서, 그 처리한 오보알부민용액(실시예1.2)을 철(Ⅲ)-만니톨 착체용액(실시예1.1)에 첨가하였다.
그 결과 얻어진 용액을 격렬하게 교반하면서 pH4가 일정하게 얻어질 때까지 HCl 2M용액을 점적(dripping)하였다.
그 고형침전물을 원심분리하였다. 그 투명한 상증액을 폐기하였고(그 상증액에는 단백질 잔류물과 착화되지 않는 철 및 다량의 염화물이 포함되어있음), 그 분리 페이스트(isolated paste)를 증류수 1ℓ중에서 재현탁시키면서 교반하여, 분산시켜 세척하였다.
그 현탁시킨 고형분을 다시 원심분리시켜, 세척수를 폐기하고 그 페이스트를 증류수 2ℓ중에서 재용해시키고(격렬한 교반에 대해) 소듐히드록사이드 10M용액을 첨가시켜 pH8.5로 조정하였다.
이와 같이하여 얻어진 용액을 동결건조시켜 암적색분말형태의 목적물 착체 화합물의 동결건조물 420g을 얻었다.
그 분석특성은 다음과 같다.
건조시의 손실율2%
철총량15.3%
유기철15.2%
질소총량8.5%
암모니아성 질소800ppm
용해도 1%투명
1% 용액의 pH8.0
Pm(HPSEC)*200,000
ㆍ조작조건에 대해서는 다음 설명참조
1.4 얻어진 생성물의 화학적 및 스펙트로스코피특성
1.4.1 처리한 오보알부민
위에서 설명한 방법(실시예1.2)에 의해 얻어진 처리오보알부민은 다음의 분석특성치를 얻었다.
a) 원소조성
%C %H %N %O %Na
47.96 7.35 14.19 28.2 2.3
이 조성은 본래의 오보알부민의 공지된 데이타와 유사하다.
즉, C = 46.2%
H = 7.7%
N = 14.0%
b) 분자량
투과크로마토그라피(HPSEC)에 의해 얻어진 분자량은 43,000 Da 로서, 본래의단백질에 대하여 참고문헌에서 보고된 숫치와 거의 일치한다(43,000 ~ 45,000 Da).
HPSEC를 실시한 조작조건은 다음과 같다.
Bio-Sep Sec 4000 컬럼(300 ×7.5),
통제 NaCl 0.1M,
모노소듐포스페이트 0.5M, pH7.4,
검출 : 280nm;
공지의 분자량 조절 : 시토크롬(3,000 Da, 세로알부민 65,000 Da, 카타라아제 230,000 Da, 페리틴(ferritin) 440,000 Da
c)13C-NMR 스펙트로스코피
스펙트럼(도 1)은 고분자 단백질구조의 대표적인 복잡성을 나타낸다. 그 스펙트럼은 3개 영역으로 분리할 수 있다:
- 지방족 알코올 신호영역(10-80ppm);
- 방향족 알코올 신호영역(120-140ppm);
-카르복실 카르바미드 영역(150-190ppm).
70-110ppm 영역에서 볼 수 있는 카르보히드레이트구조를 확인하는 미소신호( minor signals)도 존재하였다.
1.4.2 철(Ⅲ)-만니톨 착체로 처리한 오보알부민의 첨가생성물
위에서 설명한 방법(실시예1.3)을 사용하여 얻어진 첨가생성물은 다음의 특성을 가진 분석치를 가졌다.
a) 원소조성
%C %H %N %Cl %Fe %Na %O
33.50 5.0 8.6 1.2 18.3 1.83 32.57
b) 분자량
위에서 설명한 HPSEC 방법에 의해 측정한 결과, 그 측정치는 210,000 Da 로 확인되었다.
c) 오보알부민과 철(Ⅲ)-만니톨 착체의 비
그 첨가생성물에서 구한 질소%(N%)(8.62%)와 처리알부민에서의 C/N비(3.42)를 기준으로 하여, 그 첨가생성물에서 단백질프랙션에 속하는 탄소%(%C)는 다음과 같다:
8.62 ×3.42 = 29.48 C% (그 단백질에 속하는 탄소%)
그 나머지 C% 는 만니톨의 C% 에 대응한다.
즉, 33.53 - 29.48 = 4.05 C%
더욱이, 그 처리알부민에서 C%가 47.9% 일 경우 전단백질함량은 다음과 같다:
만니톨에 있어서,
따라서, 그 첨가생성물에서는 처리한 오보알부민 61.5% 와 철(Ⅲ)-만니톨 착체 28.5% 를 포함한다.
d) 분자식
110{[(FeO)6(C6H14O6)]6HO}3단백질
일반적으로, 일반분자식(I)의 첨가생성물은 다음과 같다.
[FeX(CXH2XOX)]n알부민 (I)
또는 일반식(Ⅱ)에 있어서는 다음과 같다.
[FeX(CXH2X+2OX)n] 알부민 (Ⅱ)
위식에서, x는 5,6 또는 12이다.
e)13C-NMR
13C-NMR 스펙트로그램(도 2)에서는 단백질 스펙트럼의 프로파일에서 특이변형(peculiar modification)을 나타내며, 그 알부민과 그 철(Ⅲ)-만니톨 착체사이의 상호작용과 단백질단위에서의 구조적인 변형이 있다는 것을 확인하였다.
실시예 2
처리한 오보알부민과 철(Ⅲ)-소르비톨 착체의 첨가생성물
2.1 철(Ⅲ)-소르비톨 착체
증류수 1ℓ중에 FeCl3·6H2O 1.18몰(320g)과 소르비톨 0.44몰(80g)을 용해시켰다.
그 다음, 격렬한 교반을 하면서 물 600㎖에 NaOH 180g을 용해시켜 첨가하였다.pH13.2의 최종용액이 얻어졌으며, 이 용액을 95℃로 가열시킨다음 주위온도로 냉각시켜 여과하였다. 그 결과 얻어진 용액은 폐기하였다.
2.2 처리시킨 오보알부민
충분한 수중에서 격렬한 교반을 하면서 분말상의 시판용 오보알부민 50g을 분산시켜 현탁액 900㎖를 얻어, 교반하면서 40℃로 가열하였다. 그 다음, 묽은 수중기중에서 10M NaOH용액 100㎖를 첨가시키고 동시에 버너상에서 격렬하게 교반하면서 가열하여 온도 65℃에 이르게 하였다. 이 온도에서 1시간 유지시켰다.
그다음, 6M HCl을 첨가시켜 pH10으로 조정하고, 65℃에서 H2O230%용액 2㎖를첨가하였다. 가스방출이 정지된 다음, 세정판상에서 여과하고 UF장치(한외여과기) (분급분자량 : 10,000 Da)를 사용하여 물에 투석하여 저분자량의 폴리펩티드의 잔여물을 제거하였다. 그 용액을 한외여과로 분리시켜 폐기하였다.
2.3 처리오보알부민을 가진 철(Ⅲ)-소르비톨 착체의 첨가생성물의 형성
그 처리한 오보알부민 용액(실시예2.2)을 교반하면서 철(Ⅲ)-소르비톨 착체(실시예2.1)용액에 첨가하였다.
그 결과 얻어진 용액을 격렬하게 교반하면서, pH4를 일정하게 얻을때까지 HCl의 2M용액을 적가하였다. 그 고형상의 침전물을 원심분리하였다.
그 세척수를 제거시키고 그 고형분을 증류수 2ℓ중에서 용해시켜, 10M NaOH의 첨가를 조절하여 pH8.0 ~ 8.5로 조정하였다.
이와같이하여 얻어진 용액을 동결건조시켜, 암적색 분말형태를 가진 목적화합물의 동결건조물 400g을 얻었다.
그 화합물의 분석치는 다음과 같다.
건조손실 2%
총철(total iron) 15.6%
유기철 15.2%
총질소(total nitrogen) 8.6%
용해도 수중에서 용해함
1%용액의 pH 8.0
본 발명에 의해 얻어진 생성물은 그 자체 물에 불용성인 착체를 경구투여 하도록 한 처리 알부민을 가진 3가철의 폴리히드록실화 착체의 첨가생성물로서 철을 필요로 하는 사람 또는 동물에게 3가철을 공급 및 보충하는데 효과적으로 사용할 수 있다.

Claims (18)

  1. 가용성의 감도상실(desensitized)한 알부민을 가진 3가철의 폴리히드록실화 착체의 수용성 첨가생성물.
  2. 제 1항에 있어서, 폴리히드록실화 화합물은 1개이상의 히드록시기를 포함한 화합물로 이루어지며, 3가철을 가진 착체를 형성할 수 있음을 특징으로하는 첨가생성물.
  3. 제 2항에 있어서, 폴리히드록실화 화합물은 모노사카라이드 카르보히드레이트에서 유도된 폴리알코올임을 특징으로하는 첨가생성물.
  4. 제 2항에 있어서, 폴리히드록실화 화합물은 만니톨 또는 소르비톨임을 특징으로하는 첨가생성물.
  5. 제 1항에 있어서, 그 첨가생성물은 다음일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)를 가짐을 특징으로하는 첨가생성물.
    〔Fex(CxH2xOx)〕n알부민 (Ⅰ)
    〔Fex(CxH2x+2O)n〕 알부민 (Ⅱ)
    위 식에서,
    x는 5,6 또는 12에서 선택한 정수이다.
  6. 제 1항에 있어서, 그 첨가생성물은 다음분자식을 가짐을 특징으로하는 첨가생성물.
    110{[(FeO)6(C6H14O6)6HO}3알부민
  7. 제 1항에 있어서, 알부민은 혈청알부민, 락토알부민 및 오보알부민으로 이루어진 그룹에서 선택함을 특징으로하는 첨가생성물.
  8. 제 1항에 있어서, 그 첨가생성물은 오보알부민과 헐(Ⅲ)-만니톨 착체의 첨가생성물과 오보알부민과 철(Ⅲ)-소르비톨 착체의 첨가생성물에서 선택함을 특징으로하는 첨가생성물.
  9. 알부민의 처리방법에 있어서,
    a) 수중에서 현탁한 알부민 현탁액에 소듐히드록사이드(NaOH의 진한 용액을 격렬하게 교반하면서 1M NaOH의 최종농도를 얻는데 필요한 양으로 첨가시켜 온도 63℃ ~ 67℃로 강하게 가열시켜 그 가열과 교반을 15분~1시간 동안 유지시키는 공정과,
    b) 적합한 산을 첨가하여 (a)공정에서 얻은 용액을 중화시켜 pH8.5 ~ 10.0으로 조정하는 공정과,
    c)알부민에 대하여 H2O24% ~ 8%를 첨가하는 공정으로 이루어짐을 특징으로하는 알부민의 처리방법.
  10. 제 9항에 있어서, 공정 c)에서 얻어진 용액을 여과하는 추가공정을 구성시켜 그 용액을 농축시키고 정제시키기 위하여 분급 분자량 10,000 Da 의 격막을 가진 한외여과장치(UF)를 사용하여 세정 및 한외여과 시킴을 특징으로하는 알부민의 처리방법.
  11. 제 9항에 있어서, 그 알부민 현탁액에는 최종알부민농도 3% ~ 7%(W/V)을 포함함을 특징으로하는 알부민의 처리방법.
  12. 제 9항에 있어서, 그 알부민은 혈청알부민, 락토알부민 및 오보알부민으로 이루어진 그룹에서 선택함을 특징으로하는 알부민의 처리방법.
  13. 제 1항에 의한 가용성의 감도상실한 알부민을 가진 3가철의 폴리히드록실화 착체의 첨가생성물을 취득하는 방법에 있어서, 제 9항의 처리방법에 의해 처리한 알부민 용액을 3가철의 폴리히드록실화 착체용액에 혼합함을 특징으로하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 처리결과 얻어진 생성물을 pH4의 산성침전액에 의해 정제시켜 고상침전물을 증류수로 세척시킨 다음 pH8로 조정시켜 수중에서 그 정제시킨 첨가생성물을 재용해시키는 추가공정을 구성함을 특징으로하는 방법.
  15. 제 1항에 의한 첨가생성물 중 최소한 하나를 의약 또는 수의약용으로 허용할수 있는 부형제와 함께 이루어진 의약 또는 수의약 조성물.
  16. 제 1항에 의한 첨가생성물중 최소한 하나와 다른 첨가제 및/또는 영양제를 선택적으로 조합하여 이루어진 식이요법 조성물.
  17. 제 1항에 의한 가용성알부민을 가진 3가철의 폴리히드록실화착체의 첨가생성물을 사람 또는 동물의 철결핍증 처리용으로 사용하는 방법.
  18. 제 1항에 의한 가용성 알부민을 가진 3가철의 폴리히드록실화착체의 첨가생성물을 사람 또는 동물의 철공급 또는 철보충용으로 사용하는 방법.
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