ES2258391B1 - Aducto de ovoalbumina soluble con complejos polialcoholicos de hierro trivalente y metodo para su obtencion. - Google Patents
Aducto de ovoalbumina soluble con complejos polialcoholicos de hierro trivalente y metodo para su obtencion. Download PDFInfo
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Abstract
Aducto de ovoalbúmina soluble con complejos polialcohólicos de hierro trivalente y método para su obtención. Se trata de aductos solubles en agua con complejos de polialcoholes monosacáridos con hierro trivalente con ovoalbúmina soluble y desensibilizada, para la formación de composiciones farmacéuticas o veterinarias junto con excipientes aceptables, o composiciones dietéticas junto con otros aditivos opcionales, empleados para el tratamiento de estados carenciales de hierro en personas o animales; siendo el polialcohol un compuesto que contiene más de un grupo hidroxilo y que es capaz de formar complejos con hierro (III), la ovoalbúmina ha sido sometida a un proceso térmico, alcalino, enzimático y oxidante para su solubilización y purificación, sin afectar mayormente a su peso molecular, destruyendo a la vez impurezas indeseables y fenómenos de alergia e inmunotoxicidad, el aducto se obtiene mezclando la solución del complejo férrico con la solución de ovoalbúmina tratada.
Description
Aducto de ovoalbúmina soluble con complejos
polialcohólicos de hierro trivalente y método para su obtención.
La presente invención se refiere a un producto
formado a base de aductos de ovoalbúmina soluble con complejos
formados entre polialcoholes derivados de monosacáridos y el hierro
trivalente, para su posterior utilización en composiciones tanto
farmacéuticas como dietéticas, que van a ser empleadas en el
tratamiento terapéutico de estados carenciales de hierro en personas
o animales.
Otro objeto de esta invención lo constituye un
método para el tratamiento de ovoalbúmina que permite su
solubilización sin afectar mayormente a su peso molecular, así como
eliminar fenómenos de alergia e inmunotoxicidad asociados con dicha
ovoalbúmina, y eliminación, dentro del ámbito de preparación
industrial, de fenómenos de gelificación inutilizante del lote, y
de aparición azarosa, debido a la presencia incontrolable de
impurezas naturalmente presentes en la ovoalbúmina comercial.
La albúmina es un carrier, es decir un vehículo
o transportador fisiológico que, como es sobradamente conocido,
transporta en el medio interno productos de por sí insolubles como
pueden ser ácidos grasos, esteroides, compuestos hidroxilados, etc.
Así, las albúminas en general desarrollan funciones de depósito, de
intercambio y aún de cesión regulada de moléculas bioactivas
pequeñas, y generalmente insolubles en agua.
Como es conocido existen albúminas procedentes
de tres orígenes distintos, a saber, suero sanguíneo, leche o la
clara del huevo.
La seroalbúmina es específica de cada especie, y
lleva asociados riesgos de contaminación con otras proteínas, así
como con partículas virales, originando problemas de transmisión de
patologías entre especies. Además, es difícilmente soluble en agua
y tiene un precio elevado.
La lactoalbúmina, presente en la leche, sólo
dispone de una única fuente de obtención técnica, la leche bovina.
Hecho este que hace que esta proteína sea cara y difícil de aislar
y purificar.
La ovoalbúmina es mayoritaria en la clara de
huevo, es barata y comercialmente asequible. Constituye de hecho el
75% de la clara de huevo de gallina, en donde está acompañado de
cantidades minúsculas de avidina, lisozima, conalbúmina y
ovomucoide. Desafortunadamente, la utilización de ovoalbúmina como
vehículo farmacéutico, está severamente limitada por diversos
factores. En particular, es desnaturalizada por temperaturas no
demasiado altas, de aproximadamente 56ºC, por agitación enérgica, y
porque la avidina, su acompañante natural, es un factor tóxico que
inactiva la biotina, de aquí su nombre de factor nocivo de la clara
de huevo, producto del cual la purificación resulta muy
difícil.
A todo esto hay que añadir otra dificultad
adicional importante en la utilización de la ovoalbúmina como
vehículo farmacéutico, es la referida al problema de la alergia e
inmunotoxicidad que induce, en no pocas personas, la administración
de clara de huevo. Por tanto, para la utilización de la ovoalbúmina
en tales vehículos, es necesario efectuar tratamientos que eliminen
la toxicidad intrínseca, así como la asociada a impurezas,
fundamentalmente avidina.
La modificación química de las albúminas debe
también solucionar problemas de falta de solubilidad de las mismas,
sin afectar su capacidad de transportar, así como eliminar
inconvenientes por desnaturalización de tales albúminas por calor,
agitación o por la adición de metales de transición, muchos de
ellos, por cierto, biológicamente activos, como hierro, cobalto,
etc.
El problema de la falta de solubilidad de las
albúminas, en orden a constituir aductos estables, químicamente
definidos e industrialmente aptos de ser preparados, no es un
problema menor. En particular, la ovoalbúmina acarrea serios
problemas de insolubilidad y aún de gelación, es decir de formación
de geles, hidrocoloides de viscosidad elevada, que no fluyen y que
son responsables del fracaso en la obtención industrial de no pocos
lotes de producción. Como se ha establecido, la ovoalbúmina
comercial no contiene más que un 75% en peso de ovoalbúmina
propiamente dicha, y son las impurezas acompañantes las
responsables de los procesos de gelificación en solución acuosa. En
particular, la presencia de ovomucoide es la que ofrece mayores
inconvenientes al logro de un aducto de ovoalbúmina perfectamente
soluble en combinación con complejos
ferri-polialcohólicos.
En el ámbito de la investigación farmacéutica se
han efectuado esfuerzos muy importantes para vehiculizar
eficientemente sustancias terapéuticas activas, mejorando la tasa
de aceptabilidad gástrica, protegiendo a la molécula activa de la
degradación gástrica o intestinal, mejorando la eficacia
terapéutica, etc.
Existen numerosos y excelentes ejemplos sobre
cómo preparar y vehiculizar complejos férricos para la
administración terapéutica en medicina humana y veterinaria.
Así, por ejemplo, se han descrito las
propiedades quelantes de metales por parte de la conalbúmina (J.
Am. Chem. Soc. 75, 5094, 1953). También se han descrito unos
derivados lácteos adecuadamente modificados con objeto de
solubilizar metales de transición a pH fisiológico (Drug Res. 34
(II) Nº 9, 1984), así como también complejos de hierro trivalente
con coligandos de tipo hidratos de carbono (Inorg. Chim. Acta, 124,
55-59, 1986) entre los cuales se encuentra el
sorbitol (Inorg. Chim. Acta 80, 251-254, 1983).
Más aún, la preparación de sacarato y de
fructato férrico, estabilizados y vehiculizados con compuestos
aminados, ha sido descrita en la solicitud de patente europea EP
0223153 (Mediolanum Farmaceutici), que está relacionada con la
mejor forma de vehiculizar y administrar terapéuticamente complejos
férricos inestables.
La solicitud de patente española nº 9602180 (15
de octubre de 1996) describe métodos de tratamiento de la
ovoalbúmina con álcali (NaOH), calefacción y oxidación controlada
con peróxido de hidrógeno en solución, esto último con fines
inactivantes de riesgo biológico.
Si bien es cierto que el citado tratamiento
térmico, alcalino y oxidante hace posible la preparación de aductos
estables con complejos ferri-polialcohólicos, el
ejercicio de este método en la práctica técnica, demuestra que el
proceso de gelificación que aparece en no pocos lotes de producción
no ha sido solucionado en su totalidad, constituyendo así un
inconveniente mayor para la preparación a gran escala de estos
productos antianémicos. Es verdad que cuando la ovoalbúmina
comercial se somete a penosos procesos de purificación, tal como los
bien citados de fraccionamiento con sulfato de amonio (Sorensen
et al, Rev. Trav. Lab. Carisberg, 12, 12, (1917)) el
fenómeno se soluciona, pues el ovomucoide resulta así
eliminado.
Pero sucede que la purificación con sulfato de
amonio por el método Sorensen es aplicable a la clara de huevo tal
cual, y no a la albúmina comercial en forma sencilla, en parte
porque esta ovoalbúmina está desnaturalizada por el secado en
espray, y en parte porque las fuertes concentraciones de sulfato
amónico utilizadas hacen imperiosa una diálisis posterior, la cual
es dificultosa por tratarse de diálisis de hidrocoloides
nativos.
De manera que, en otras palabras, no es posible
económicamente trabajar con ovoalbúmina pura, siendo además
impracticable la purificación a gran escala por el método descrito
de la ovoalbúmina comercial, para privarla de ovomucoide. Por
tanto, se deberían realizar grandes esfuerzos para lograr un método
que, en asociación a los procesos térmicos, alcalinos y oxidantes,
eliminaran "in situ" la indeseable interferencia que
ocasiona la presencia de ovomucoide sin necesidad de penosas y aún
impracticables etapas de purificación de la ovoalbúmina inicial.
Ninguna de las artes previas citadas describen la idea de remediar
el comportamiento fisiológico de un transportador proteico natural,
a través de tratamientos químicos que aseguren la eliminación de
efectos indeseables, como alergias, inmunotoxicidad, presencia
viral, etc., la generación de métodos industriales de preparación
sin inconveniente de tales aductos, y la potenciación de efectos
deseables tal como la solubilidad, protección gástrica, cesión
regulada del hierro, etc.
El método para la obtención de aductos de
ovoalbúmina soluble con complejos de polialcoholes monosacáridos con
hierro trivalente, que la invención propone resuelve de forma
plenamente satisfactoria la problemática anteriormente expuesta, en
todos los aspectos comentados.
En un primer objeto de la invención, se
proporciona un método para el tratamiento de la ovoalbúmina, que
permite su solubilización sin afectar mayormente su peso molecular,
así como la eliminación de fenómenos de alergia e inmunotoxicidad
asociados, como anteriormente se ha comentado, con dicha
albúmina.
Son numerosos los estudios y ensayos que han
puesto de manifiesto que, cuando se trata la ovoalbúmina en
condiciones controladas de alcalinidad, a través de un método que
regula temperaturas, tiempos y adición de oxidantes, conduce a la
obtención de un tipo de ovoalbúmina soluble, útil para preparar
aductos con compuestos polialcohólicos de hierro trivalente.
Así, el método de tratamiento de la ovoalbúmina
que la invención propone, comprende una serie de etapas que se
describen a continuación.
En primer lugar se añade una solución de una
base concentrada, preferentemente hidróxido sódico (NaOH), a una
suspensión de albúmina en agua, en la cantidad que sea necesaria
para alcanzar una concentración final de NaOH de 1 M, agitando de
manera enérgica, llevándose a cabo a la vez un fuerte calentamiento
hasta alcanzar una temperatura comprendida entre 63ºC y 67ºC,
manteniendo dicho calentamiento y agitación durante un periodo de
tiempo comprendido entre 15 minutos y una hora.
El siguiente paso consiste en neutralizar la
solución anteriormente preparada por adición de un ácido adecuado,
por ejemplo HCl, hasta ajustar el pH a un valor comprendido entre
8.5 y 10.
Seguidamente se añade una proteasa alcalina, de
procedencia fúnguica o bacteriana, en proporción
1\textperthousand sobre el peso de ovoalbúmina inicial,
procediendo a una cuidadosa proteólesis controlada que actúa
fundamentalmente, dentro de los tiempos en que se practica,
hidrolizando el ovomucoide dejando a la ovoalbúmina prácticamente
inalterada.
Finalmente se añade H_{2}O_{2} en cantidad
comprendida entre el 4 y el 8% respecto de la ovoalbúmina. El
tratamiento proteolítico llevado a cabo en el paso anterior, hace
innecesaria todo proceso de purificación que se pudiese llevar a
cabo posteriormente, por ejemplo, por ultrafiltración que elimine
sales, peróxido y sustancias de bajo peso molecular producidas por
la calefacción alcalina, procediéndose directamente a la aducción
con complejos férricos, tal como se detallará más adelante.
La suspensión de ovoalbúmina en agua contendrá,
ventajosamente, una concentración foral de ovoalbúmina comprendida
entre el 3% y el 7% en relación peso/volumen. La suspensión se
realiza mediante la adición de la ovoalbúmina, normalmente en forma
de polvo, al agua en una cantidad adecuada para dar la
concentración final antes citada.
La solución así obtenida contiene la ovoalbúmina
tratada, apta para vehiculizar los complejos férricos antes
mencionados, para la formación de aductos moleculares.
En relación con las condiciones operativas del
método descrito previamente, se ha podido comprobar que:
- Una concentración de ovoalbúmina inferior al
3% (p/v) no es aconsejable pues resulta agredida en su integridad
molecular por el ataque alcalino, mientras que a concentraciones
superiores al 7%, la elevada concentración proteica conduce a
soluciones con tendencia a formar geles, tanto más cuanto más se
baje el pH, al neutralizar el NaOH.
- La concentración mas apropiada de NaOH en la
solución es de 1 M, ya que es la concentración adecuada y validada
para la inactivación viral.
- La temperatura de calentamiento debe estar
comprendida entre 63ºC y 67ºC ya que temperaturas mayores producen
una hidrólisis alcalina de la estructura proteica a dicha
concentración de NaOH, mientras que a temperaturas inferiores a los
63ºC, la inactivación alcalina puede no transcurrir totalmente,
además de rendir productos finales con una solubilidad
cuestionable.
- El tiempo de tratamiento alcalino debe estar
comprendido entre 15 y 60 minutos, ya que por debajo de 15 minutos,
los productos resultantes no son adecuadamente solubles, mientras
que por encima de 60 minutos, procede una importante degradación
alcalina de la estructura proteica, sin conservación del peso
molecular de la proteína nativa.
- La proteasa alcalina debe agregarse al pH
citado en la cantidad mencionada de 1% del peso de ovoalbúmina,
pues dicha cantidad asegura la destrucción de impurezas
gelificantes y una inalterabilidad de la ovoalbúmina en sí misma.
Así mismo, el plazo de dos horas de digestión resulta el adecuado,
con menos tiempo la inactivación de la capacidad de formar geles no
es segura; con mayor tiempo de tratamiento proteolítico comienza la
degradación de la ovoalbúmina medida por el enzima.
- El H_{2}O_{2} debe añadirse en la cantidad
mencionada entre el 4 y el 8% respecto a la ovoalbúmina, pues dicha
cantidad está dentro de los límites necesarios para que,
compensando la destrucción parcial del H_{2}O_{2}, en el medio
acuoso a pH 8,5 - 10 se equipare a la actividad inactivante de la
biotina por medio de la radiólisis del agua pura. Concentraciones
menores de H_{2}O_{2} no son necesariamente inactivantes,
mientras que concentraciones mayores originan depolimerización de
la ovoalbúmina, modificando fuertemente su condición de vehículo de
los citados complejos férricos. Es importante mencionar que el
método de tratamiento de la albúmina anteriormente descrito, no
afecta mayormente al peso molecular de la proteína, permitiendo
operar en condiciones térmicas en las que la proteína nativa no
sería soluble. Tratada de esta forma, la proteína no es coagulable
por la acción de cationes floculantes, tal como el Fe^{3+},
vehiculizando en solución complejos férricos que son insolubles en
agua a pH fisiológico. Por otra parte, el citado tratamiento
enzimático proteolítico asegura que la ovoalbúmina no formará
productos gelificados durante los procesos de preparación
industrial y durante su aducción con los citados complejos
férricos, lo que originaría cuantiosas pérdidas económicas por el
descarte obligado de lotes de producción. Dicho tratamiento permite
eliminar problemas de inmunotoxicidad y alergia que están basados en
la presencia de avidina y en las características alergénicas de la
proteína. El problema del choque alérgico se elimina a través de la
digestión alcalina efectuada a temperatura controlada en medio
acuoso. La avidina se destruye por calefacción y por irradiación,
sobre todo en solución acuosa. En efecto, irradiando el agua con
rayos X o \delta electrónicos de alta energía, se obtienen varias
especies radicalarias sumamente reactivas (HO., H., HO_{2}) que
como es conocido, desnaturalizan y fragmentan las lábiles moléculas
de proteínas y de ácidos nucleicos. En particular, los sistemas
biológicos se muestran muy sensibles a la radiación, más aún cuando
son irradiados en presencia de oxígeno o de aires. Existe una
marcada imposibilidad técnica en el criterio de irradiación de
soluciones acuosas a escala industrial. La adición de agentes
oxidantes que se descomponen termolíticamente generando una cascada
similar de radicales libres, ha resuelto esta imposibilidad técnica
de la irradiación de soluciones acuosas a gran escala, permitiendo
la destrucción controlada de la avidina por medio de la
peroxidólisis del agua oxigenada. En condiciones controladas, esta
descomposición radicalaria no afecta a la ovoalbúmina pero permite
destruir a la avidina. La descomposición espontánea termolítica del
H_{2}O_{2} por la reacción de Haber-Weiss
conduce a la obtención de las mismas especies radicalarias que la
radiólisis del
agua:
agua:
O_{2} +
H_{2}O_{2} \rightarrow OH^{-} + OH +
O_{2}
Asimismo, este cuidadoso tratamiento térmico,
alcalino y oxidante, ha resultado validado como el más eficiente
para la eliminación de virus convencionales y lentos. Con el método
de tratamiento de la ovoalbúmina proporcionado por esta invención,
se han obtenido aductos estables de complejos polialcohólicos de
cationes trivalentes, en particular de Fe^{3+}, con la
ovoalbúmina así tratada.
De este modo la invención proporciona unos
aductos estables de complejos polialcoholicos de hierro (III) con
ovoalbúmina soluble. En una realización particular de los aductos
de esta invención, dicho polialcohol es un polialcohol derivado de
un monosacárido. En una realización particular y preferida, dicho
polialcohol se selecciona del grupo formado por manitol y
sorbitol.
Según una realización particular, los aductos
formados según la invención responden a la siguiente fórmula
general:
(I)[Fe_{x}(C_{x}H_{2x}O_{x})]_{n}
\
Albúmina
donde x es un número entero
seleccionado entre 5, 6 ó 12; o bien de fórmula
general:
(II)[Fe_{x}(C_{x}H_{2x+2}O_{x})]_{n}
\
Albúmina
donde x tiene el significado
previamente indicado, es decir, x se selecciona entre 5, 6 ó
12.
En una realización particular y preferida de
esta invención, el aducto responde a la siguiente fórmula
molecular:
110
[[(FeO)_{6}(C_{6}H_{14}O_{6})]6 \ HO]3 \
Albúmina
La obtención de tales aductos comprende, por
tanto, una etapa de tratamiento de la ovoalbúmina, otra etapa de
formación del complejo poliólico de hierro trivalente y una tercera
etapa de formación del aducto por reacción de la ovoalbúmina
tratada con dicho complejo polialcohólico de hierro trivalente.
Para la formación de los complejos
polialcohólicos de hierro trivalente se mezclan y disuelven en agua
una fuente de iones férricos, por ejemplo cloruro férrico, y el
polialcohol en medio básico, obteniéndose una solución que se
calienta a una temperatura de 95ºC aproximadamente para completar
la complejación, posteriormente se enfría.
Para la formación de los aductos de ovoalbúmina
con complejos polialcohólicos de hierro (III) se añade la solución
de ovoalbúmina tratada sobre la solución acuosa del complejo
férrico bajo agitación.
El aducto resultante de alto peso molecular, se
purifica a través de una etapa de ultrafiltración que elimina
péptidos de bajo peso molecular,
complejos férricos de bajo peso molecular y
restos de polisacáridos provenientes de la estructura catenaria del
ovomucoide destruido "in situ" a través del tratamiento
porteolítico citado.
El aducto así purificado, sin necesidad de
etapas de aislamiento de los productos intermedios, se descarga del
ultrafiltro, se ajusta a pH 7,8 - 8,2 y se liofiliza.
El producto obtenido, aducto de albúmina con
complejos polialcohólicos de hierro trivalente, puede ser utilizado
para la administración oral con fines terapéuticos en la terapia de
reposición de hierro.
De este modo la invención proporciona una
composición farmacéutica o veterinaria que comprende al menos uno
de los aductos previamente descritos, junto con un excipiente
aceptable farmacéuticamente o en veterinaria. La invención también
proporciona una composición dietética que comprende al menos uno de
los aductos previamente descritos, junto con, opcionalmente, otros
aditivos y/o sustancias alimenticias.
Los aductos proporcionados por esta invención
son adecuados para el tratamiento de estados carenciales de hierro,
por ejemplo para el tratamiento de anemias ferropénicas, así como
para el aporte o suplemento de hierro, aunque no sea debido a una
patología, a una persona o animal en necesidad de ello.
Para complementar la descripción que se está
realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las
características del invento, de acuerdo con un ejemplo preferente
de realización práctica del mismo, se acompaña como parte
integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con
carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo
siguiente:
La figura 1.- Muestra una representación de un
espectro ^{13}C-RMN característico de una
ovoalbúmina tratada según el procedimiento descrito en la presente
invención.
\newpage
La figura 2.- Muestra un espectro
^{13}C-RMN característico de un aducto de un
complejo de hierro (III) - manitol, con ovoalbúmina tratada,
proporcionado por esta invención.
La figura 3.- Muestra un cromatograma de
permeación característico de ovoalbúmina tratada de acuerdo con el
método descrito en la presente invención.
Con los siguientes ejemplos se pretende ilustrar
realizaciones particulares del objeto de esta invención, y no deben
ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
a) Complejo hierro - manitol: 31,5 g de
FeCl_{3}\cdot6H_{2}O se disuelven junto con 7,9 g de manitol
en 400 ml de agua. Se agrega bajo fuerte agitación una solución de
18 g de NaOH en 48 ml de agua. Se calienta a 95ºC dejando enfriar
espontáneamente hasta lograr temperatura ambiente.
b) Ovoalbúmina tratada: 37,50 g de ovoalbúmina
comercial en polvo se dispersan bajo fuerte agitación en 180 ml de
agua. Se calienta a parte a 65ºC una solución de 30 g de NaOH en 550
ml de agua. Se agrega la dispersión proteica sobre la solución
alcalina y se procede a digerir a 65ºC durante 15 minutos,
ajustando entonces el pH al valor de 8,5 - 10 con el HCl 6 M.
Manteniendo la solución a 50ºC y pH 8,5 - 10 se agrega Esperase®
(NOVO-NORDISK) en cantidad de 1\textperthousand
sobre albúmina inicial (37,5 mg) digiriendo proteolíticamente bajo
suave agitación 2 horas a 50ºC sin efectuar corrección de pH.
Cumplido el plazo, el pH espontáneo es de 8,5. Se calienta la
solución a 80ºC para inactivar restos de actividad enzimática, se
ajusta pH a 10 con NaOH 10 M y cuando la temperatura desciende a
65ºC se agrega 2 ml/l de H_{2}O_{2} al 30% p/v. Se deja enfriar
a temperatura ambiente, con lo que precipita un flóculo blanco
fácilmente filtrable, dejando una solución limpia, de color
ambarino y sin olor.
c) Aducto ovoalbúmina - hierro - manitol: se
agrega la solución acuosa de hierro manitol sobre la solución
proteica obtenida en b), bajo suave agitación. Se ajusta a pH 10
con HCl 2 M y se filtra con Supercel como ayuda filtrante, con lo
cual se obtiene una solución limpia de color rojo oscuro. Se
concentra por ultrafiltración (Cut Off 10000 Da)) hasta un tercio
del volumen inicial y se diafiltra a volumen constante contra 10
volúmenes de agua destilada. Se descarga del equipo de
ultrafiltración, se ajusta a pH de 8,0 - 8,2 con HCl 2 M, se filtra
por placa de profundidad y se liofiliza. Se obtienen 20 g de un
polvo liofilizado, color rojo oscuro, que presenta el siguiente
análisis característico:
| Pérdida por secado: | 2% |
| Hierro total: | 15,3% |
| Hierro orgánico: | 15,2% |
| N total: | 8,5% |
| N amoniacal: | 800 ppm |
| Solubilidad 1%: | limpia |
| PH al 1%: | 8,0 |
| Peso molecular (HPSEC): | 200.000 Da* |
(*) Columna Bio Sep Sec 4000 (300 x 7,5);
solvente NaCl 0,1 M, PO_{4}H_{2}Na 0,5 M, pH 7,4; detección 280
nm. Calibración efectuada con patrones de peso molecular conocido:
Ciocromo 13000 Da, Seroalbúmina bovina 65000 Da, Catalasa 230000
Da, Ferritina Equina 440000 Da.
a) Complejo de hierro (III) - sorbitol: 31,50 g
de Fe Cl_{3}6H_{2}O se disuelven en 400 ml de agua destilada
junto con 7,90 g de sorbitol. Se agrega bajo fuerte agitación una
solución 10 M de NaOH (45 ml). Se calienta bajo agitación a 95ºC,
dejando luego enfriar espontáneamente hasta alcanzar temperatura
ambiente.
b) Ovoalbúmina tratada: 37,50 g e ovoalbúmina
comercial en polvo se tratan en idénticas condiciones en que se
procedió en el ejemplo 1.
c) Aducto ovoalbúminba tratada - hierro (III) -
sorbitol: se procede a homogeneizar bajo agitación la solución
obtenida en a) con la solución proteica de b), procediendo entonces
a purificar por ultrafiltración según el ejemplo 1. La solución
purificada así obtenida se liofiliza, obteniéndose 20,6 g de un
polvo suave, de color rojo oscuro, que presenta el siguiente
análisis característico:
\newpage
| Pérdida por secado: | 2% |
| Hierro total: | 15,6% |
| Hierro orgánico: | 15,2% |
| N total: | 8,6% |
| PH al 1%: | 8,0 |
Se procede ahora a la caracterización química y
espectroscópica de productos intermedios y finales obtenidos.
En cuanto a la ovoalbúmina tratada, el ejercicio
del método de producción, detallado en le ejemplo 1, hace que el
intermedio "ovoalbúmina tratada", no sea aislado ni tenga
necesidad de purificación alguna, antes de la aducción con la
solución del complejo férrico y esto es debido a las ventajas que
aporta al método la proteólisis enzimática controlada de la
ovoalbúmina.
Con objeto de obtener el producto intermedio en
cuestión, se parte de ovoalbúmina comercial, la cual se somete a
los tratamientos de digestión alcalina, proteolítica y oxidante,
procediendo luego a purificar el material así obtenido con objeto
de caracterización. Esta purificación, como puede verse en los
ejemplos 1 y 2, no es necesaria a los fines preparativos, de ahí la
simplicidad del método de producción descrito en la invención.
Para su aislamiento y caracterización analítica
se procede entonces de acuerdo con el siguiente protocolo: 37,50 g
de ovoalbúmina comercial en polvo se dispersan bajo fuerte
agitación en 180 ml de agua destilada y se vierten agitando
fuertemente sobre una solución constituida por 30 g de NaOH en 550
ml de agua a 65ºC. Se digiere con agitación a 65ºC durante 15
minutos, se ajusta el pH a 10 con HCl 6 M y se enfría a 48 - 52ºC.
Se agregan 37 mg de Eperase® digiriendo dos horas a esa
temperatura, sin corrección de pH, dejando que el mismo evolucione
libremente. Transcurridas 2 horas se calienta a 80ºC para inactivar
todo resto enzimático, se enfría a 65ºC y se agrega 2 ml/l de
H_{2}O_{2} al 30%. Se enfría a temperatura ambiente, se filtra
para obtener una solución limpia y brillante, lo que no se logra
sin la proteólisis enzimática, y se procede a diafiltrar en
ultrafiltro hasta reacción negativa de cloruros y frente al
reactivo de biuret en los permeatos, lo cual se logra con 15
volúmenes de agua destilada. Es preciso hacer notar que, en el
concurso de la hidrólisis enzimática se produce la destrucción
"in situ" del ovomucoide acompañante, responsable de
procesos indeseables de gelificación de lotes industriales durante
la preparación técnica de los aductos citados. Ello se comprueba
porque si en el proceso de ultrafiltración aquí citado se practica
una reacción de Molisch sobre gotas del permeato de 10000 Da, se
puede ver que se obtiene fuerte reacción positiva de carbohidratos,
probablemente productos de degradación proteolítica de la
glicoproteína ovomucoide, destruida por el ataque enzimático
controlado. Si no se practica el ataque enzimático los citados
permeatos dan una reacción de Molisch negativa. De la misma manera,
la reacción en los permeatos es negativa si el ataque enzimático
aquí detallado se practica sobre ovoalbúmina purificada por el
método de Sorensen con sulfato de amonio.
La presencia de oligosacáridos en los permeatos
de 10 kDa no provienen de la digestión enzimática de la
ovoalbúmina, ni por la digestión alcalina de la ovoalbúmina
comercial, sino debido a la degradación proteolítica de las
impurezas que, en la práctica técnica, son responsables de fenómenos
de gelificación, coagulación en la reacción con el hierro, etc.
El producto liofilizado así obtenido, sea el
intermedio ovoalbúmina tratada, presenta el siguiente análisis
característico:
| Ovoalbúmina tratada | Ovoalbúmina tratada sin proteasas | Ovoalbúmina datos de bibliografía | |
| N Total | 14,0% | 14,2% | 14,0% |
| Na Total | 1,9% | 2,3% | |
| C | 48,0% | 47,96% | 46,2% |
| H | 7,2% | 7,35% | 7,7% |
| O | 28,9% | 28,2% |
El peso molecular, obtenido por cromatografía de
permeación (HPSEC) es de 43000 Da en el caso de un producto tratado
sin proteasas, de 43000 Da en el caso de un producto con
tratamiento proteolítico tal como el caso de la presente invención,
y 45000 Da para ovoalbúmina nativa. Las condiciones operativas de
HPSEC son las citadas en el ejemplo 1. Los cromatografías de
permeación característicos aparecen representados en la figura
3.
El espectrograma ^{13}C-RNM
característico de este intermedio está representado en la figura 1,
y muestra la típica complejidad de las estructuras macro
moleculares proteicas. El espectro puede ser dividido en tres
regiones:
- señales alinfáticas (10 - 80 ppm)
- señales aromáticas (120 - 140 ppm)
- señales carboxílicas y amídicas (150 - 190
ppm)
señales menores que reconocen
estructuras remanentes de carbohidratos son visibles entre 70 - 110
ppm.
En cuanto al aducto de ovoalbúmina tratada con
complejo de hierro (III) - manitol, obtenido según el método
descrito en el ejemplo, presenta el siguiente análisis
característico:
a) sicoanálisis elemental: 33,50% de C, 5,0% de
H, 8,6% de N, 1,2% de Cl, 18,3% de Fe, 1,83% de Na y 32,57% de
O.
b) Peso moleculares: según el método HPSEC,
previamente descrito, el valor encontrado es de 210000 Da.
c) prelación ovoalbúmina/complejo de hierro
(III) - manitol: del porcentaje de N hallado en el aducto (8,62%),
y de la relación C/N en la ovoalbúmina tratada (3,42) se desprende
que el porcentaje en el aducto perteneciente a la fracción proteica
en el aducto es:
8,62 \ x \
3,42 = 29,48% C \ perteneciente \ a \ la \
prote\text{í}na.
El % C restante corresponde a la contribución
del manitol, esto es: 33,53 - 29,48 = 4,05% C. Además si 47,96% es
el % C en la albúmina tratada, el total de proteínas será:
\frac{29,48 \
x \ 100}{47,96} = 61,5% \ de \ ovoalbúmina \
tratada
y para el
manitol:
\frac{4,05 \
x \ 182}{6 x 12} = 10,2% \ de \
manitol
por tanto, el aducto contiene 61,5%
de ovoalbúmina tratada y 28,5% de complejo de hierro (III) -
manitol.
d) Fórmula molecular:
110\{[(FeO)_{6}(C_{6}H_{14}O_{6})]6HO\}3
\
prote\text{í}na
y en general, aductos de fórmula
genérica
(I):
(I)[Fe_{x}(C_{x}H_{2x}O_{x})]_{n}
\
Albúmina
o bien, de fórmula genérica
(II):
(II)[Fe_{x}(C_{x}H_{2x+2}O_{x})]_{n}
\
Albúmina
en donde x es 5, 6 ó
12.
e) ^{13}C-RNM: el espectograma
correspondiente, representado en la figura 2, muestra peculiares
modificaciones en el perfil del espectro de la proteína,
demostrando interacciones entre la ovoalbúmina y el complejo de
hierro (III) - manitol, así como modificaciones estructurales en la
unidad proteica.
Claims (11)
1. Aducto de ovoalbúmina soluble con complejos
polialcohólicos de hierro trivalente, para la formación de
composiciones farmacéuticas o veterinarias junto con excipientes
aceptables, o composiciones dietéticas junto con otros aditivos
opcionales, empleados para el tratamiento de estados carenciales de
hierro en personas o animales, caracterizado porque presenta
la siguiente fórmula general:
(I)[Fe_{x}(C_{x}H_{2x}O_{x})]_{n}
\
Albúmina
donde x es un número entero
seleccionado entre 5, 6 ó 12; o bien de fórmula
general:
(II)[Fe_{x}(C_{x}H_{2x+2}O_{x})]_{n}
\
Albúmina
donde x tiene el significado
previamente
indicado.
2. Aducto de ovoalbúmina soluble con complejos
polialcohólicos de hierro trivalente, según reivindicación 1ª,
caracterizado porque en una realización particular y
preferida presenta la siguiente fórmula molecular:
110[[(FeO)_{6}(C_{6}H_{14}O_{6})]6
\ HO]3 \
Albúmina
3. Aducto de ovoalbúmina soluble con complejos
polialcohólicos de hierro trivalente, según reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque el compuesto polialcohólico
es capaz de formar complejos con el hierro (III).
4. Aducto de ovoalbúmina soluble con complejos
polialcohólicos de hierro trivalente, según reivindicación 3ª,
caracterizado porque dicho compuesto polialcohólico es un
polialcohol derivado de hidratos de carbono monosacáridos.
5. Aducto de ovoalbúmina soluble con complejos
polialcohólicos de hierro trivalente, según reivindicación 4ª,
caracterizado porque dicho compuesto polialcohólico se
selecciona entre sorbitol o manitol.
6. Procedimiento para la obtención del aducto de
ovoalbúmina soluble con complejos polialcohólicos de hierro
trivalente de las reivindicaciones anteriores, caracterizado
porque comprende una etapa de tratamiento de la ovoalbúmina, otra
etapa de formación del complejo poliólico de hierro trivalente y
una tercera etapa de formación del aducto por reacción de la
ovoalbúmina tratada con dicho complejo polialcohólico de hierro
trivalente.
7. Procedimiento para la obtención del aducto de
ovoalbúmina soluble con complejos polialcohólicos de hierro
trivalente, caracterizado porque dicha fase de tratamiento
de la ovoalbúmina está formada por las siguientes
etapas:
etapas:
a) añadir una solución de una base concentrada,
preferentemente hidróxido sódico (NaOH), a una suspensión de
albúmina en agua, en la cantidad que sea necesaria para alcanzar
una concentración final de NaOH de 1 M, agitando de manera
enérgica, llevándose a cabo a la vez un fuerte calentamiento hasta
alcanzar una temperatura comprendida entre 63ºC y 67ºC, manteniendo
dicho calentamiento y agitación durante un periodo de tiempo
comprendido entre 15 minutos y una hora;
b) neutralizar la solución anteriormente
preparada por adición de un ácido adecuado, por ejemplo HCl, hasta
ajustar el pH a un valor comprendido entre 8.5 y 10;
c) agregar una proteasa alcalina, de procedencia
fúnguica o bacteriana, en proporción 1\textperthousand sobre el
peso de ovoalbúmina inicial, y digerir sin corrección de pH durante
2 horas a 48 - 52ºC, elevando luego la temperatura hasta alcanzar
80ºC, con lo cual se logra la destrucción de impurezas
gelificantes;
d) añadir seguidamente H_{2}O_{2} en
cantidad comprendida entre el 4 y el 8% respecto de la
ovoalbúmina.
8. Procedimiento para la obtención del aducto de
ovoalbúmina soluble con complejos polialcohólicos de hierro
trivalente, según reivindicación 7ª, caracterizado porque la
suspensión de ovoalbúmina en agua contiene una concentración final
de ovoalbúmina comprendida entre el 3% y el 7% p/v.
9. Procedimiento para la obtención del aducto de
ovoalbúmina soluble con complejos polialcohólicos de hierro
trivalente, según reivindicación 6ª, caracterizado porque
para la formación de los complejos polialcohólicos de hierro
trivalente se mezclan y disuelven en agua una fuente de iones
férricos y el polialcohol en medio básico, obteniendo una solución
que se calienta a una temperatura de 95ºC aproximadamente para
completar la complejación, dejándola posteriormente enfriar.
10. Procedimiento para la obtención del aducto
de ovoalbúmina soluble con complejos polialcohólicos de hierro
trivalente, según reivindicación 6ª, caracterizado porque
para la formación de los aductos de ovoalbúmina con complejos de
hierro (III) se añade la solución de ovoalbúmina tratada sobre la
solución acuosa del complejo férrico bajo agitación.
11. Procedimiento para la obtención del aducto
de ovoalbúmina soluble con complejos polialcohólicos de hierro
trivalente, según reivindicación 6ª, caracterizado porque
comprende una etapa adicional de purificar el aducto resultante
mediante una concentración por ultrafiltración seguida de
diafiltración con agua destilada, en ultrafiltro provisto de
membrana de ultrafiltración con un peso molecular de 10000 Da.
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