KR20010108982A - 효소를 이용한 Ｒ-폼 또는 Ｓ-폼의 α-치환헤테로싸이클릭 카르복실산 유도체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 효소를 이용하여 R-폼(form) 또는 S-폼의 α-HCCA(α-substituted heterocyclic carboxyl acid) 유도체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 라세믹 α-HCCA를 알코올과 반응시켜 α-HCCA 에스테르를 제조하고, 상기 α-HCCA 에스테르를 pH와 온도가 일정하게 유지되는 수용액 상에서 입체특이성을 갖는 효소를 이용하여 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA와 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 에스테르로 광학분할(optical resolution)하여 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 에스테르를 얻는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제조된 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA는 광학순도가 높고 수율이 높을 뿐 아니라 제조 공정에 드는 단가가 낮아 경제적이다.

Description

효소를 이용한 Ｒ-폼 또는 Ｓ-폼의 α-치환 헤테로싸이클릭 카르복실산 유도체의 제조방법 {Method for preparing Ｒ- or Ｓ-form α－substituted heterocyclic carboxyl acid derivative using enzyme}
본 발명은 효소를 이용하여 R-폼(form) 또는 S-폼의 α-HCCA(α-substituted heterocyclic carboxyl acid) 유도체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 라세믹 α-HCCA를 알코올과 반응시켜 α-HCCA 에스테르를 제조하고, 상기 α-HCCA 에스테르를 pH와 온도가 일정하게 유지되는 수용액 상에서 입체특이성을 갖는 효소를 이용하여 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA와 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 에스테르로 광학분할(optical resolution)하여 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 에스테르를 얻는 방법에 관한 것이다.
α-HCCA의 일종인 테트라하이드로-2-퓨로익산(Tetrahydro-2-furoic acid, 이하 'THFA'라 약칭함)은 여러가지 용도로 사용되는 중요한 키랄 빌딩브록(chiral building block)이다. THFA에는 광학 이성질체의 관계인 R-폼과 S-폼이 존재하는데 이중 R-(+)-THFA는 페넴(penem)계 항생제의 곁가지 중간체(side chain intermediate)로 사용되며, S-(-)-THFA는 유기합성의 키랄 중간체로서 유용하게 사용되는 화합물이다. 이처럼 THAF의 R-폼과 S-폼은 각각 사용되는 용도가 다른데 화학 공정상 합성되는 THAF에는 상기 두 폼이 혼합되어 있으므로 분리를 위한 부가적인 공정이 요구된다.
라세믹(Racemic) THFA로 부터 R- 또는 S-폼의 THFA를 얻기 위해서는 혼합 라세미체(racemate)를 광학적으로 분할하는 광학분할법(optical resolution)이 주로 사용되어 왔다. 1983년 벨란거(Belanger)는 용해제(resolving agent)로 브루신(brucine)과 에페드린(ephedrine)을 사용하여 분할하는 법을 처음 실시하였으나(Can. J. Chem. 61. 1383(1983)) 상기 용해제는 가격이 높아 경제성으로 효율이 떨어질 뿐 아니라 광학순도(enantiomeric excess value) 또한 낮은 문제가 있었다.
일본 공개 특허 제89-216983호 에서는 브루신과 에페드린 대신 키랄 아민{1-(4-할로게노페닐)에틸아민} (chiral amine{1-(4-halogenophenyl)ethylamine})을 용해제로 사용하여 R,S-THFA로 디아스테레오머염(diastereomer salt)을 제조한 후 분할하는 방법이 사용되었으나 키랄 아민 역시 가격이 높아 경제성이 떨어지며, 초기 반응액에 넣어주는 R,S-THFA양이 4 mmol 정도의 매우 낮은 농도로 한정되어 있어 수율이 낮을 뿐 아니라 제조되는 키랄 THFA의 광학순도 역시 높지 않았다.
일본 공개 특허 제97-71576호 에서는 분할법이 아닌 R- 또는 S-THFA 염에 할로겐화 수소를 처리해 R- 또는 S-THFA를 제조하는 방법에 관한 것이다.
이전에도 라세믹 화합물을 광학분할 하기위해 에스테라아제(esterase), 리파아제(lipase), 프로테아제(protease) 등의 효소를 이용하여 선택적으로 거울상 이성질체를 가수분해시키는 방법들이 다수 알려져 왔다. 미국특허 제5,928,933에서는 프로테아제, 리파아제 및 에스테라아제 중에서 선택된 44가지 효소에 대해 반응특이성을 실험하였고 그 중 한 종류 만이 95%의 광학 순도를 나타냄을 확인하였다. 따라서 거울상 이성질체 혼합물의 분할에 매우 효과적일 수 있으나, 사용하는 효소의 종류 및 기질의 화학적 구조 등에 의해 거울상 이성질체(enantiomer)의 선택도 및 반응 산물의 광학 순도가 달라지므로 지속적인 연구를 통해 기질에 적합한 조합을 찾아내는 것이 요구되고 있고, α-HCCA의 광학분할에 효소를 이용한 예는 없는 실정이다.
이에 본 발명자들이 광범위한 연구를 수행한 결과 α-HCCA의 광학분할에 효소를 이용함으로써 높은 광학순도를 갖는 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA를 고수율로 얻을 수 있음을 발견하였으며, 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 높은 광학 순도를 갖는 α-HCCA를 고수율로 제조할 수 있고 경제적으로 제조할 수 있는, 효소를 이용한 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA 에스테르 유도체의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA 유도체의 제조방법은 1) 라세믹 α-HCCA(α-substituted heterocyclic carboxyl acid)를 알코올과 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 라세믹 α-HCCA 에스테르를 제조하는 단계; 및 2) 상기 α-HCCA 에스테르를 pH와 온도가 일정하게 유지되는 수용액 상에서 입체특이성을 갖는 효소 분말 또는 수용액을 이용하여 광학분할하여 R-폼 또는S-폼의 α-HCCA, 및 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 에스테르를 동시에 생성한 후 유기용매를 사용하여 상기 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 에스테르를 추출하는 단계를 포함한다.
상기 R1은 치환되거나 또는 치환되지 않은 탄소수 1 내지 6의 알킬기 또는 알케닐기, 벤질기, 탄소수 3 내지 6의 싸이클로알킬기, 치환되거나 치환되지 않은 아릴 알킬기 및 치환되거나 치환되지 않은 헤테로아릴알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되며, X는 O, S 또는 N이고, n은 1 내지 3의 정수이다.
이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따르면, 먼저 α-HCCA를 알코올과 당량비로 반응시켜 에스테르 형태로 제조한 후 pH와 온도가 일정하게 유지된 수용액 내에서 입체 특이성을 갖는 효소와 반응시켜 한가지 폼의 에스테르 만을 특이적으로 가수분해시킴으로써 라세믹 α-HCCA를 광학분할하여 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA, 및 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 에스테르를 제조한다. 반응 종료후 유기용매를 첨가하면 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA는 수용액에 남아있고 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 에스테르는 모두 유기용매층에 포함된다. 상기 유기용매 층에서 유기용매를 제거하면 광학적으로 순수한 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 에스테르를 얻는 것이 가능하다. 상기 과정에서 남아있는 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA는 다소 광학순도가 떨어지므로 컬럼 등을 이용한 정제 과정을 통하여 순도를 높여 원하는 용도에 따라 사용할 수 있으며, 본 발명의 제조 공정에 출발물질로 재사용할 수 있다.
본 발명에 의해 얻어진 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 에스테르는 입체 특이성이 없는 효소, 팔라디움 촉매 등을 이용하여 광학순도가 매우 높은(>99%) S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA를 제조할 수 있다. 또한, S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 에스테르를 키랄 알코올로 환원시켜 여러 의약품의 중간체로 유용하게 사용할 수 있다.
예로서 상기 입체 특이성이 없고 α-HCCA 유도체를 비특이적으로 가수분해시키는 효소의 사용시에는 pH와 온도가 일정하게 유지된 수용액상에서 상기 α-HCCA 유도체를 효소와 반응시킨다. 반응이 종료된 후 수용액층 만을 취해 염산을 첨가하여 pH를 2 ∼ 3으로 조절하고 유기용매로 수회 추출한 다음 유기용매룰 제거하면 광학순도가 매우 높은(>99%) S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA를 얻을 수 있다. 또한, 상기 팔라디움 촉매 사용시에는 먼저 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 유도체를 유기용매에 녹이고 일정한 수소기체 압력과 온도가 유지되는 조건 하에서 팔라디움 촉매(Pd/C)를 이용한 수소화 환원반응을 실시하면 역시 광학순도가 매우 높은(>99%) S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA를 쉽게 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, α-HCCA의 일종인 THFA를 알코올과 당량비로 반응시켜 THFA 에스테르 유도체를 제조한 다음 입체특이성을 갖는 효소를 이용하여 광학분할하여 R-폼 또는 S-폼의 THFA, 및 S-폼 또는 R-폼의 THFA 에스테르를 동시에 생성한 후 유기용매를 사용하여 상기 S-폼 또는 R-폼의 THFA 에스테르를 추출하였고, 그 후에는 입체특이성이 없는 효소 또는 팔라디움 촉매를 이용하여 광학순도가 매우 높은(>99%) S-폼 또는 R-폼의 THFA를 얻었다. THFA 외에도 α-HCCA의 범주에 속하는 모든 물질, 예를 들어 프롤린(Proline), 테트라 하이드로치오펜-2-카르복실산(Tetrahydrothiopen-2-carboxylic acid) 등은 본 발명에 의해 광학분할이 가능하다.
본 발명에 사용된 알코올은 탄소수 1 내지 6의 선형 또는 브랜치된 알코올, 방향족 알코올, 탄소수 3 내지 6의 싸이클로알킬알코올, 치환되거나 치환되지 않은 아릴 알킬알코올, 및 치환되거나 치환되지 않은 헤테로아릴알킬알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 반응 시간이 짧고, 광학 순도를 보다 높일 수 있는 측면에서 탄소수 4이상의 선형 알코올 또는 방향족 알코올이다.
본 발명에서 효소는 미생물 또는 동물 유래의 리파아제(lipase), 프로테아제(protease) 또는 에스테라아제 (esterase) 중에 선택된 것이 바람직한데 사용한 효소의 종류에 따라 R-폼 또는 S-폼이 선택되며 사용 형태는 분말 또는 수용액일 수 있다. 상기 효소 분말 또는 수용액의 사용량은 α-HCCA 에스테르 100 중량부에 대하여 0.1 ∼ 100 중량부인 것이 바람직하다. 효소 분말 또는 수용액의 사용량이 α-HCCA 유도체에 대하여 0.1 중량부 미만일 경우 반응 시간이 너무 길어지는 문제점이 있으며, 100 중량부를 초과할 경우는 다량의 효소 사용으로 인한 비용의 문제가 발생하게 된다.
효소 반응시 수용액의 온도는 0 ∼ 60℃, pH는 4 ∼ 12으로 일정하게 유지되는 것이 최적의 효과를 위해 바람직하다.
상기 유기용매는 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소 또는 톨루엔으로 부터 선택된 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하다.
상기 팔라디움 촉매는 0.1 ∼ 30 중량%로 사용하는 것이 바람직한데 30 중량%를 초과하였을 경우에는 재료가격이 비싸지는 문제점이 있고, 0.1 중량% 미만일 경우에는 수소화 환원 반응이 잘 일어나지 않게 되며, 보다 바람직하게는 0.5∼10중량%를 사용한다.
상기 수소화 환원반응에서 사용되는 수소기체의 압력은 1 ∼ 10 바(bar)인 것이 바람직한데, 10 바를 초과하면 부산물이 증가하고, 1 바 미만일 경우에는 반응효율이 현저히 떨어진다. 보다 바람직하게는 1 ∼ 5 바를 사용한다. 상기 수소화 환원반응의 반응시간 및 온도는 충분한 반응을 위해서 1 ∼ 20 시간 및 0 ∼ 70℃ 인 것이 바람직하며, 1 ∼ 8시간 및 20 ∼ 40℃인 것이 보다 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
- THFA 에틸 에스테르(ethyl ester)에 대해 특이성을 갖는 효소의 선별(screening)
0.1 몰의 THFA와 0.3 몰의 에틸 알코올을 0.15 몰의 염화티오닐(thionyl chloride)과 잘 혼합한 후 70℃에서 1시간동안 반응시켜 THFA 에틸 에스테르를 제조하였다.
50 mM 인산용액(pH 7.0) 500 ㎕에 1%의 THFA 에틸 에스테르 및 0.1%의 효소들을 각각 첨가하여 반응 용액을 만든 후 30℃에서 30시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 반응액 50 ㎕를 취해 50 ㎕ 1 N HCl과 잘 혼합한 뒤에 200 ㎕의 에틸아세테이트를 첨가한 후 잘 혼합하여 기질을 추출하였고 그 결과를 GC 및 키랄 GC로 분석하였다. GC의 경우 컬럼은 HP-5를 사용하였으며 초기온도는 80℃, 최종 온도는 200℃ 이었고, 키랄 GC의 경우 컬럼은 β-덱스트린(dextrin) GC 컬럼을 사용하여 초기 온도 110℃, 촤종온도 200℃에서 측정하였다.
결과는 하기 표 1에 나타내었으며, 효소 종류에 따라서 R-폼 또는 S-폼이 잔존됨을 확인하였으며, 따라서 효소의 종류에 따라 다른 폼의 THFA 에틸 에스테르를 제조할 수 있음을 확인하였다.
효소 광학순도(ee%) 키랄폼(THFA 에틸 에스테르) 비고
종류 유래원 THFA-C2 THFA
프로테아제 Papain 미반응
Bacillus subtilis 27.7% 51.2% S
Aspergillus oryzae 30.1% 22.3% S
아스파질러스 사이토이 Aspergillus saitoi 미반응
Rhizopus.sp 미반응
Bacillus licheniformis 26% 13.2% S
Bacillus amyloliquefaciens 0% 미반응
리파아제 Candida cylindracea 88% 12.3%
Aspergillus oryzae 15.4% 5.6% R
Fongipase 12.2% 9.3% R
Pseudomonas sp.(고정화) 35.3% 5.7% S
Pseudomonas sp. 3.1% 0.2% R
Candida sp. 21.5% 2.5% R
Porcine pancreatic 93.1% 19.8% S
Candida antarctica, fraction B
Novo IM lipase 6.2% 2.5% R
Candida rugosa 0%
Rhizomucor miehei 13.5% 1.1% R
K80 lipase 7.6% 8.2% S
L1 lipase 미반응
L62 lipase 16.9% 10.5% S
에스테라아제 Porcineliver 0%
실시예 2
- THFA 부틸 에스테르(butyl ester)에 대해 특이성을 갖는 효소의 선별(screening)
0.1 몰의 THFA와 0.1 몰의 부틸 알코올을 1×10-4몰의 p-톨루엔술폰산(p-toluenesulfonic acid) 촉매와 0.15 몰의 톨루엔 하에서 120℃로 4시간 반응시켜 THFA 부틸 에스테르를 제조하였다.
50 mM 인산용액(pH 7.0) 500 ㎕에 1%의 THFA 부틸 에스테르 및 0.1%의 효소들을 각각 첨가하여 반응 용액을 만든 후 30℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응종료 후 실시예 1과 동일한 방법으로 기질을 추출하고 분석하였다.
결과는 하기 표 2에 나타내었으며, 효소 종류에 따라서 R-폼 또는 S-폼이 잔존됨을 확인하였으며, 따라서 효소의 종류에 따라 다른 폼의 THFA 부틸 에스테르를 제조할 수 있음을 확인하였다.
효소 광학순도( ee%) 키랄폼(THFA 부틸에스테르) 비고
종류 유래원 THFA-C4 THFA
프로테아제 Papain 미반응
Bacillus subtilis 16.8% 37.8% S
Aspergillus oryzae 100% 24.6% S
Aspergillus saitoi 5.6% 27.8% R 반응미약
Rhizopus.sp 미반응
Bacillus licheniformis 100% 29.8% S
Bacillus amyloliquefaciens 미반응
리파아제 Candida cylindracea 88% 12.3% R
Aspergillus oryzae 79.3% 0.6% R
Fongipase 76.15% 2.7% R
Pseudomonas sp.(고정화) 35.3% 5.7% S
Pseudomonas sp. 19.1% 3.7% S
Candida sp. 65.8% 14.1% R
Porcine pancreatic 35.7% 20.3% S
Candida antarctica, fraction B 16.1% 11.3% R
Novo IM lipase 100% 2.96% R
Candida rugosa 81% 6% R
Rhizomucor miehei 미반응
K80 lipase 51.4% 11% S
L1 lipase 47.1% 16.3% R
L62 lipase 81.5% 8.4% S
에스테라아제 Porcineliver 42.2% 25.3% R
실시예 3
- THFA 벤질 에스테르(benzylester)에 대해 특이성을 갖는 효소의 선별(screening)
벤질 알코올을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 THFA 벤질 에스테르를 제조하였다.
50 mM 인산용액(pH 7.0) 500 ㎕에 1%의 THFA 벤질 에스테르 및 0.1%의 효소들을 각각 첨가하여 반응 용액을 만든 후 30℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응종료 후 실시예 1과 동일한 방법으로 기질을 추출하고 분석하였다.
결과는 하기 표 3에 나타내었으며, 효소 종류에 따라서 R-폼 또는 S-폼이 잔존됨을 확인하였으며, 따라서 효소의 종류에 따라 다른 폼의 THFA 벤질 에스테르를 제조할 수 있음을 확인하였다.
효소 광학순도(ee%) 키랄폼(THFA-벤질에스테르) 비고
종류 유래원 THFA-Bz THFA
프로테아제 Papain 미반응
Bacillus subtilis 94.7% 31.8% S
Aspergillus oryzae 98.3% 26.5% S
Aspergillus saitoi 22.2% 19.9% S
Rhizopus.sp 38.4% 44.1% S
Bacillus licheniformis 91.5% 29.1% S
Bacillus amyloliquefaciens 83.6% 36% S
리파아제 Candida cylindracea 0.7% 5.8% -
Aspergillus oryzae 18.1% 22% R
Fongipase 0%
Pseudomonas sp.(고정화) 13.1% 21.9% S
Pseudomonas sp. 1.8% 9.5% S
Candida sp. 0%
Porcine pancreatic 0%
Candida antarctica, fraction B 35% 10.7% S
Novo IM lipase 78.3% 3.9% R
Candida rugosa 0%
Rhizomucor miehei 0%
K80 lipase 92.1% 20.4% S
L1 lipase 40% 6% R
L62 lipase 0%
에스테라아제 Porcineliver 0%
실시예 4
- 유기용매를 이용한 THFA 에스테르(ester)와 THFA의 분리
라세믹 THFA 에스테르를 효소 반응시킨 후 반응액에 유기용매를 첨가하여 R-폼 또는 S-폼 THFA 에스테르와 S-폼 또는 R-폼 THFA로 분리하는 과정은 하기와 같이 수행하였다.
50 mM 인산용액(pH 7.0) 1 ℓ에 2% R,S-THFA 부틸 에스테르, 1% 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 프로테아제를 넣고 pH를 7.0으로 유지시키면서 30℃에서 4시간 동안 반응시켰다.
반응 종료 후 실시예 1과 동일한 방법으로 기질을 추출하고 분석하였다.
나머지 반응액에 500 ㎖의 에틸아세테이트를 넣고 잘 섞어준 후 층분리하여 에틸아세테이트층을 회수하였다(1차 추출액). 수용액층을 500 ㎖ 에틸아세테이트로 1회 더 추출하여 1차 추출액과 합친 후 황산나트륨 분말 5 g을 넣어 물을 제거하였다. 다음으로 상기 액에 존재하는 에틸아세테이트를 감압 증류로 제거하여 9.6 g의 S-THFA 부틸 에스테르를 회수하였으며 광학순도는 99.4 ee%임을 확인하였다. 한편 수용액 상에 남아있는 R-THFA의 광학순도는 70 ee%이었다.
실시예 5∼13
- 효소:기질 비율, 반응 온도 및 반응 pH의 변화에 따른 광학순도의 변화.
R,S-THFA 부틸 에스테르의 농도를 8 중량%로 고정시킨 상태에서 효소:기질 중량비, 반응온도 및 pH를 변경한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하였으며 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
실시예 효소:기질 반응시간(hr) 반응온도(℃) 광학순도(ee%) pH
5 1:2 5 50 100 일정하지 않음
6 1:2 2 50 98.6 7
7 1:4 3.5 50 98.4 7
8 1:8 7.5 50 98.9 7
9 1:4 4 50 98.6 9
10 1:8 4 50 98.5 9
11 1:8 4 30 98.7 9
12 1:12 8.5 30 98.8 9
13 1:16 11 30 97.4 9
실시예 14
- 바실러스 리케니포르미스 프로테아제를 이용한 부틸 에스테르의 광학 분할
50 mM 인산용액(pH 9.0) 400 ㎖에 12 중량% R,S-THFA 부틸 에스테르, 1 중량% 바실러스 리케니포르미스 프로테아제를 넣고 pH를 9.0으로 유지시키면서 30℃에서 10.5시간 반응시켰다. 반응 종료 후 실시예 1과 동일한 방법으로 기질을 추출하고 분석하였다.
200 ㎖의 에틸아세테이트를 넣어준 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 21 g의 S-THFA 부틸 에스테르를 얻었으며 광학순도는 99.3 ee%임을 확인하였다. 한편 수용액 상에 남아있는 R-THFA의 광학순도는 60 ee%임을 확인하였다.
실시예 15
- 바실러스 리케니포르미스 프로테아제를 이용한 부틸 에스테르의 광학분할
50 mM 인산용액(pH 9.0) 200 ㎖를 사용하여 20℃에서 반응시킨 것과 기질 추출시 100 ㎖의 에틸아세테이트를 넣어준 것을 제외하고는 실시예 14와 동일한 방법으로 12 g의 S-THFA 부틸 에스테르를 얻었으며 광학순도는 99.3 ee%임을 확인하였다.
실시예 16
- 바실러스 리케니포르미스 프로테아제를 이용한 부틸 에스테르의 광학 분할
10℃에서 19시간 동안 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 14와 동일한 방법으로 21 g의 S-THFA 부틸 에스테르를 얻었으며 광학순도는 99.1 ee%임을 확인하였다.
실시예 17
- 바실러스 리케니포르미스 프로테아제를 이용한 부틸 에스테르의 광학 분할
50 mM 인산용액(pH 9.0) 200 ㎖와 15 중량% R,S-THFA 부틸 에스테르를 사용하여 20℃에서 26시간동안 반응시킨 것과 기질 추출시 100 ㎖의 에틸아세테이트를 넣어준 것을 제외하고는 실시예 14와 동일한 방법으로 25.7 g의 S-THFA 부틸 에스테르를 얻었으며 광학순도는 99.8 ee%임을 확인하였다.
실시예 18∼22
- 바실러스 리케니포르미스 프로테아제를 이용한 부틸 에스테르의 광학 분할
실시예 17과 동일한 반응 조건하에서 R,S-THFA 부틸 에스테르의 농도 및 효소:기질의 비율을 변경하면서 실험하였고, 그 결과는 하기 표 5와 같다.
실시예 기질농도 효소:기질 반응시간(hr) 수율(%) ee%
18 15% 1:12 21 25.5 100
19 30% 1:12 24 30 99
20 30% 1:15 26 33.7 99.2
21 40% 1:15 28 46.4 99.1
22 50% 1:12 30 50 98.9
실시예 23
- S-THFA 부틸 에스테르에서 S-THFA 제조
실시예 2에서 R,S-THFA 부틸 에스테르를 비특이적으로 가수분해시켜 R,S-THFA를 생성했던 효소인 칸디다 실린드라세아 리파아제(Candida cylindracea lipase)를 선택하여 강산이나 강염기 사용하지 않고, 이성체를 만들지 않으면서 S-THFA 부틸 에스테르를 가수분해시켜 S-THFA를 제조하는 방법이다.
50 mM 인산용액(pH7.0) 300 ㎖에 1% S-THFA 부틸 에스테르, 0.1% 칸디다 실린드라세아 리파아제를 넣고 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 실시예 1과 동일한 방법으로 결과를 분석하였다.
GC 분석결과 S-THFA 부틸 에스테르가 모두 THFA로 가수분해 되었으며, 키랄 GC 분석결과 99.8 ee% 의 S-THFA임을 확인했다.
실시예 24∼32
- S-THFA 부틸 에스테르에서 S-THFA 제조 2
효소의 종류만을 달리하여 실시예 23과 동일한 방법으로 실험하였으며 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
실시예 효소 반응시간(hr) ee%(S-THFA)
24 Aspergillus oryzaelipase 16 100
25 Fongipase 16 100
26 Pseudomonas sp.Lipase (고정화) 16 100
27 Pseudomonas sp.Lipase 16 100
28 Candida sp.Lipase 1.5 100
29 Candida antarctica,fraction B Lipase 1 100
30 Novo IM Lipase 5 100
31 L62 lipase 2.5 100
32 Porcineliver Esterase 0.15 100
실시예 33
- THFA의 광학분할
50 mM 인산용액(pH 9.0) 200 ㎖에 12% R,S-THFA 부틸 에스테르, 1% 바실러스 리케니포르미스 프로테아제를 넣고 pH를 9.0으로 유지시키면서 20℃에서 10.5시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 실시예 1과 동일한 방법으로 결과를 분석하였다. 남은 반응액에 100 ㎖의 에틸아세테이트를 넣고 잘 섞어준 후 실시예 14와 동일한 방법으로 12g의 S-THFA 부틸 에스테르를 얻었으며, 광학순도는 99.3 ee%였다.
제조한 12g S-THFA 부틸 에스테르를 50 mM 인산용액(pH 7.0) 100 ㎖에 넣고 칸디다 안타륵티카 절편 B 리파아제 (Candida antarctica, fraction B lipase) 1g 을 넣은 후 pH를 7.0으로 유지시키면서 30℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 후 실시예 1과 동일한 방법으로 결과를 분석하였다. 나머지 반응액에 HCl 용액을 넣어 pH를 2.0으로 조절하고, 총 용액 부피의 3배가 되는 에틸아세테이트로 3회 추출하였다. 에틸아세테이트 추출액을 모아 실시예 14와 동일한 방법으로 6g의 S-THFA를 회수했다. 키랄 GC 분석결과 99.3 ee%의 광학순도를 나타냄을 확인하였다.
실시예 34
- 대량 THFA의 광학분할
50 mM 인산용액(pH 9.0) 2 ℓ에 40% R,S-THFA 부틸 에스테르와 3%의 바실러스 리케니포르미스 프로테아제를 넣고 pH를 9.0으로 유지시키면서 20℃에서 23시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 후 실시예 1과 동일한 방법으로 결과를 분석하였다. 나머지 반응액에 1 ℓ의 에틸아세테이트를 넣고 실시예 14와 동일한 방법으로 400g의 S-THFA 부틸 에스테르를 회수하였으며 광학순도는 99.3 ee%였다.
얻어진 S-THFA 부틸 에스테르 중 160g을 취해 50 mM 인산용액(pH7.0) 400 ㎖에 넣고 칸디다 안타륵티카 절편 B 리파아제 8g을 넣은 후 pH를 7.0으로 유지시키면서 30℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응 종결 후 실시예 1과 동일한 방법으로 결과를 분석하였다. 나머지 반응액에 HCl액을 넣어 pH를 2.0으로 조절하고 총 용액 부피의 3배가 되는 에틸아세테이트로 3회 추출하였다. 에틸아세테이트 추출액을 모아 실시예 14와 동일한 방법으로 80g의 S-THFA를 회수하였다. 키랄 GC 분석결과 99.3 ee%의 광학순도를 나타냄을 확인하였다.
실시예 35
- THFA의 광학분할
실시예 3과 동일한 방법으로 벤질 에스테르를 제조한 후 50 mM 인산용액(pH 9.0) 200 ㎖에 12% R,S-THFA 벤질 에스테르, 1% 바실러스 리케니포르미스 프로테아제를 넣고 pH를 9.0으로 유지시키면서 20℃에서 4.5시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 실시예 1과 동일한 방법으로 결과를 분석하였다. 남은 반응액에 100 ㎖의 에틸아세테이트를 넣고 잘 섞어준 후 실시예 14와 동일한 방법으로 16g의 S-THFA 벤질 에스테르를 얻었으며, 광학순도는 99.1 ee%였다.
제조한 S-THFA 벤질 에스테르 중 5.5 g을 에틸아세테이트 20 ㎖에 녹이고 10%의 팔라듐 촉매(Pd/C) 55mg(1 중량%)을 첨가하여 상온에서 10분간 교반하였다. 수소기체를 조금씩 넣어주면서 1.5 바에서 10시간 동안 다시 교반한 후 팔라듐 촉매를 여과를 통해 제거하고 에틸아세테이트 및 생성된 톨루엔을 감압증류하여 제거한 결과 2.5 g의 S-THFA를 얻었다. 키랄 GC 분석결과 99.1 ee%의 광학순도를 그대로 유지함을 확인하였다.
상기 실시예를 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의해 제조된 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA는 광학순도가 높고 수율이 높을 뿐 아니라 제조 공정에 드는 단가가 낮아 경제적이다.

Claims (6)

1) 라세믹 α-HCCA(α-substituted heterocyclic carboxyl acid)를 알코올과 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 라세믹 α-HCCA 에스테르를 제조하는 단계; 및
2) 상기 α-HCCA 에스테르를 pH와 온도가 일정하게 유지되는 수용액 상에서 입체특이성을 갖는 효소 분말 또는 수용액을 이용하여 광학분할하여 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA, 및 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 에스테르를 동시에 생성한 후 유기용매를 사용하여 상기 S-폼 또는 R-폼의 α-HCCA 에스테르를 추출하는 단계를 포함하는 효소를 이용한 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA 유도체의 제조방법:
화학식 1
상기 R1은 치환되거나 또는 치환되지 않은 탄소수 1 내지 6의 알킬기 또는 알케닐기, 벤질기, 탄소수 3 내지 6의 싸이클로알킬기, 치환되거나 치환되지 않은 아릴 알킬기, 및 치환되거나 치환되지 않은 헤테로아릴알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되며, X는 O, S 또는 N이고, n은 1 내지 3의 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 알코올은 탄소수 1 내지 6인 선형 또는 브랜치된 알코올, 방향족 알코올, 탄소수 3 내지 6의 싸이클로알킬알코올, 치환되거나 치환되지 않은 아릴 알킬알코올, 및 치환되거나 치환되지 않은 헤테로아릴알킬알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA 유도체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 효소는 미생물 또는 동물 유래의 리파아제(lipase), 프로테아제(protease) 또는 에스테라아제(esterase)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA 유도체의 제조방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 효소 분말 또는 수용액의 사용량은 α-HCCA 에스테르 100 중량부에 대하여 0.1 ∼ 100 중량부인 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA 유도체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 수용액의 온도는 0 ∼ 90℃이고, pH는 4 ∼ 12인 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA 유도체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 유기용매는 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소 또는 톨루엔으로 부터 선택된 하나 또는 그 이상 임을 특징으로 하는 효소를 이용한 R-폼 또는 S-폼의 α-HCCA 유도체의 제조방법.
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