KR20010086405A

KR20010086405A - 뿌리 잘라먹는 벌레 해충의 구제 방법

Info

Publication number: KR20010086405A
Application number: KR1020017004658A
Authority: KR
Inventors: 브라이언에이. 스톡호프; 크리스토퍼 콘랜
Original assignee: 칼튼 제이. 에이블; 마이코겐 코포레이션
Priority date: 1999-08-23
Filing date: 2000-08-23
Publication date: 2001-09-10
Also published as: CN102246823A; HU228475B1; EP1124426B1; HUP0105078A3; KR100740391B1; RO122431B1; GEP20043349B; AU6799800A; ES2190421T3; HUP0105078A2; JP2003507398A; IL142171A; BR0007035A; AU775683B2; AR025349A1; CN1321067A; RU2311767C2; BR0007035B1; WO2001013731A1; ATE231339T1

Abstract

본 발명은 뿌리 잘라먹는 벌레(cutworm)를 구제하는데 유용한 방법 및 물질에 관한 것이다. 바람직한 일실시양태에 있어서,Cry1Fa 단백질은 검은 뿌리 잘라먹는 벌레를 구제하는데 사용된다.

Description

뿌리 잘라먹는 벌레 해충의 구제 방법{Methods of controlling cutworm pests}

곤충 및 다른 해충들은 농작물 손실과 이러한 해충들을 구제하는 비용에 있어서 농부에게 해마다 수천만 달러의 비용을 부담시킨다. 농작물 생산 환경에서 충해(蟲害)에 의하여 야기되는 손실은 농작물 수율의 감소 및 농작물 질의 저하를 포함한다. 증가된 추수 비용 또한 곤충이 만연한 결과이다.

충해는 윤작과 같은 경작 방법, 및 식물에 의한 강력한 뿌리계의 성장을 촉진하기 위한 높은 수준의 인산 공급에 의해 부분적으로 해결되어 왔다. 그러나, 윤작은, 예를 들면, 노던 옥수수 뿌리벌레(northern corn rootworm)의 최근 생겨난2년 휴면(즉, 월동) 습성에 의해 파괴될 수 있다. 원하는 수준의 구제를 보장하기 위해서는 화학적인 살충제에 가장 많이 의존하게 된다.

화학적인 살충제는 효과적인 해충 구제 방법을 제공하여 왔다. 하지만, 대중은 음식물, 지하수, 및 환경 도처에서 발견될 수 있는 잔류 화학물질의 양에 관심을 가지게 되었다. 따라서, 합성 화학 살충제는 그들의 잠재적인 환경 유해 결과에 대하여 점차 자세히 조사되고 있다. 몇몇 합성 화학 살충제는 토양 및 지하에 있는 대수층(帶水層)에 해독을 끼치고, 빗물이 땅 위를 흐른 결과 지표수를 오염시키며, 타겟이 아닌 생명체를 파괴할 수 있다. 몇몇 합성 화학 살충제는 애완동물, 사육동물 또는 어린아이들이 그들과 접촉하게 될 수도 있는 지역에 적용될 때, 대중의 안전을 위협한다는 추가적인 단점을 가지고 있다. 그들은 또한 적절한 사용 기술을 따르지 않는 경우에 특히, 그것을 사용하는 사람의 건강을 해칠 수 있다. 전세계의 조절 기구들은 많은 합성 살충제, 특히 분해가 잘 안되어 환경에 계속 남아 먹이 사슬로 들어가게 되는 살충제들의 사용을 제한하고/하거나 금지하고 있다. 살충제의 사용에 대한 엄격한 새로운 규제 및 몇몇 효과적인 살충제의 절판은 희생이 큰 해충을 구제하기 위한 경제적이며 효과적인 선택권을 제한할 수 있다.

많은 합성 화학 살충제의 사용과 연관된 문제점들 때문에, 이러한 제제의 사용을 제한하고 대체 살충제를 동정해야 할 명확한 필요성이 존재한다. 합성 화학 살충제의 대체, 또는 이들 제제와 생물학적 살충제의 조합은 환경 내의 유독성 화학물질의 수준을 감소시킬 수 있을 것이다.

점차 더 많은 사람들에 의하여 사용되고 있는 생물학적 살충제는 토양 미생물바실러스 슈린지엔시스(Bacillus thuringiensis, "B.t.")이다. 토양 미생물인바실러스 슈린지엔시스는 그람-양성의 포자-형성 세균이다. 대부분의B.t.균주는 살충 활성을 나타내지 않는다. 몇몇B.t.균주는 살충성 부포자 단백질 봉입체(inclusioins)를 생산한다. 이러한 단백질 봉입체는 종종 뚜렷한 형태를 가진 결정으로서 현미경으로 관찰된다. 결정성 봉입체의 형태 및 종류는B.t.균주를 특징짓는데 사용될 수 있다. 결정성 봉입체 내에 존재하는 "δ-내독소(δ-endotoxin)"는 전형적으로 특이적인 살충 활성을 가지고 있으며, 그럼 점에서 비특이적인 숙주 범위를 가지고 있는 외독소(exotoxin)와 구별된다.

B.t. 살충제의 상업적 사용은 원래 협소한 범위의 인시류(lepidopteran, 모충(毛蟲, caterpillar)) 해충에 제한되어 있었다. 예를 들면,비.슈린지엔시스아종쿠르스타키(kurstaki)의 포자 및 결정체 제조물(preparations)은 상업적인 인시류 해충용 살충제로서 수년간 사용되어 왔다. 그러나, 보다 최근에 연구자들은 훨씬 더 넓은 범위의 해충에 대하여 특이성을 지닌B.t. 살충제를 발견하여 왔다. 예를 들면,B.t.이스라엘렌시스(israelenis) 및모리소니(morrisoni)는 각각 쌍시류(Diptera)와 초시류(Coleoptera) 목의 곤충을 구제하는데 상업적으로 사용되어 왔다(Gaertner, F.H. [1989] "Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-living Microorganisms," inControlled Delivery of Crop Protection Agents, R.M. Wilkins, ed., Taylor and Francis, New York and London, 1990, pp. 245-255).

새로운B.t.아종이 동정되어 왔으며, 활성 δ-내독소 단백질의 유전자가 분리되어 서열분석 되었다(Hofte, H., H.R. Whiteley [1989]Microbiological Reviews52(2):242-255). Hofte 및 Whiteley는B.t. 결정성 단백질 유전자를 네개의 주요 클래스로 분류하였다. 상기 클래스는cryI(인시류-특이적),cryII(인시류- 및 쌍시류-특이적),cryIII(초시류-특이적), 및cryIV(쌍시류-특이적)이다. 다른 해충들에 대하여 특이적으로 독성을 나타내는 균주의 발견이 보고되어 왔다(Feitelson, J.S., J. Payne, L. Kim [1992]Bio/Technology10:271-275). 예를 들면, CryV 및 CryVI라는 정의가 두 가지 새로운 그룹의 선충류-활성 독소 용으로 제안되어 왔다.

많은바실러스 슈린지엔시스δ-내독소 단백질들은 두 개의 기능성 분절(segment)로 구성되어 있다. 이러한 "전장(full-length)" 단백질은 그 단백질 분자의 약 처음 절반(N-말단 영역)에 해당하는 프로테아제-내성 핵심 독소(core toxin)로 구성되어 있다. CryIIIAB.t. δ-내독소의 핵심 분절의 3차원 구조는 공지되어 있으며, 모든 관련 독소들이 그와 동일한 전체적인 구조를 가지고 있는 것으로 제안된 바 있다(Li, J., J. Carroll, D.J. Ellar [1991]Nature353:815-821). 분자의 두번째 절반(C-말단 영역)은 종종 "전독소 분절(protoxin segment)"이라 불리운다. 전독소 분절은 독소 결정 형성에 참여하는 것으로 믿어진다(Arvidson, H., P.E. Dunn, S. Strand, A.I. Aronson [1989]Molecular Microbiology3:1533-1534; Choma, C.T., W.K. Surewicz, P.R. Carey, M. Pozsgay, T. Raynor, H. Kaplan [1990]Eur. J. Biochem. 189:523-527). 전형적으로, 전체130kDa 독소 분자는 곤충 위 내의 프로테아제에 의해 내성 핵심 분절로 프로세싱된다. 따라서, 상기 전독소 분절은 독소 분자의 프로테아제 프로세싱을 감소시키거나(Haider, M.Z., B.H. Knowles, D.J. Ellar [1986]Eur. J. Biochem. 156:531-540), 또는 독소의 용해성을 감소시켜(Aronson, A.I., E.S. Han, W. McGaughey, D. Johnson [1991]Appl. Environ. Microbiol.57:981-986) 곤충이 핵심에 접근할 가능성을 제한함으로써, 독소에 부분적인 곤충 특이성을 부여할 수도 있다.

Hofte 및 Whiteley가 1989년에 발표한 결정성 단백질의 명명법 및 분류법은 유추된(deduced) 아미노산 서열 및 그 독소의 숙주 범위에 근거한 것이다. 이러한 체계는 다섯개의 주요 클래스로 나뉘어지는 14가지 상이한 유형의 독소 유전자를 포괄하도록 되어 있다. 오로지 아미노산 상동성에만 근거를 둔 수정된 명명법이 제안되어 왔다(Crickmoreet al. [1996] Society for InvertebratePathology, 29th Annual Meeting, IIIrd International Colloquium onBacillus thuringiensis, University of Cordoba, Cordoba, Spain, September 1-6, abstract). 연상기호 "cry"는 별개의 클래스로 남아 있는 cytA 및 cytB를 제외한 모든 독소 유전자들에 적용된다. 1순위의 아라비아 숫자는 로마자로 바뀌었고, 4순위의 삽입구는 삭제되었다. 현재의 경계는 약 95%(4순위), 75%(2순위), 및 48%(1순위)의 서열 상동성을 나타낸다. 다수가 재분류되었을 지라도, 원래의 명칭 중 다수가 그대로 남아있다. 또한, N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean (1998), "Revisions of the Nomenclature for theBacillus thuringiensisPesticidalCrystal proteins,"Microbiology and Molecular Biology RiviewsVol. 62:807-813; 및 Crickmore, Zeigler, Feitelson, Schnepf, Van Rie, Lereclus, Baum, and Dean, "Bacillus thuringiensistoxin nomenclature" (1990) http://www.biols.susx.ac.UK/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html을 참조하라. 그러한 체계는 무료로 입수가능한 소프트웨어 응용프로그램 CLUSTAL W 및 PHYLIP를 를 사용한다. PHYLIP 패키지 내의 NEIGHBOR 응용프로그램은 산술 평균(UPGMA) 알고리즘을 사용한다.

신규B.t. 분리주 및 그들의 독소 유전자의 분리 뿐만 아니라 독소의 정확한 살충성 범위의 결정은 느린 경험적인 과정이었다. 활발한 연구 및 연구력 투자의 결과, 신규의B.t. 분리주, 독소 및 유전자에 대한 특허, 그리고 공지의B.t. 독소 및 분리주의 새로운 용도에 대한 특허가 등록되어 왔다. 리뷰를 위해서는, Feitelsonet al.,supra를 참조하라. 하지만, 새로운B.t. 분리주, 및 공지의B.t. 분리주 및 독소의 새로운 용도의 발견은 경험적이고, 예측불가한 영역으로 남아 있다.

Smulevitchet al. ([1991]FEBS Lett. 293:25-26), Gleaveet al.([1991]JGM138:55-62), 및 Shevelveet al. ([1993]FEBS Lett. 336: 79-82)는 인시류에 대하여 활성을 갖는Cry9 독소의 특성규명을 기술하고 있다. Lambertet al. (Lambert, B., L. Buysse, C. Decock, S. Jansens, C. Piens, B. Saey, J. Seurinck, K. van Audenhove, J. Van Rie, A. Van Vliet, M. Peferoen [1996]Appl.Environ.Microbiol. 62(1):80-86), 및 공개된 PCT 출원 WO 94/05771 및 WO94/24264 또한 인시류에 대하여 활성을 갖는B.t. 분리주 및Cry9 독소를 개시하고 있다.

미국특허 제 5,126,133호; 제 5,188,960호; 제 5,246,852호; 및 제 5,691,308호는B.t. 분리주 PS81I 유래의Cry1Fa 독소 및 유전자(81A)를 개시하고 있다. 미국특허 제 5,527,883호; 제 5,508,264호; 제 5,827,514호; 및 제 5,840,554호는CryIF 키메라 독소에 관한 것이다. 국제공개 제 99/24581호는 식물에 최적화된 다양한cry1F 유전자를 개시하고 있다. 미국특허 제 5,686,069호는B.t. 분리주 PS91C2 유래의Cry1Fb 독소 및 유전자를 개시하고 있다.

유전 공학 기술을 사용하여,B.t. 독소를 농경 환경에 전달하기 위한 다양한 접근방법이 개발 중에 있다.에세리히아 콜라이(Escherichia coli) 내에서의B.t. 결정성 단백질 유전자의 클로닝 및 발현은 15년 이상 전에 간행물에 기술된 바 있다(Schnepf, H.E., H.R. Whiteley [1981]Proc. Natl. Acad. Sci. USA78:2893-2897). 미국특허 제 4,448,885호 및 미국특허 제 4,467,036호는이.콜라이(E. coli) 내에서의B.t. 결정성 단백질의 발현을 개시하고 있다. 곤충에 대한 내성을 위하여B.t. 유전자를 사용하여 유전공학적으로 조작된 식물의 사용 및B.t. 단백질의 전달체로서 안정화된 미생물 세포의 사용을 포함하여, 재조합 DNA에 근거한B.t. 산물이 생산되어 사용을 승인받아 왔다.B.t. 독소 및/또는 그들의 유전자를 변형시킴으로써 다양한 향상이 달성되어 왔다. 예를 들면, 미국특허 제 5,380,831호 및 제 5,567,862호는 식물에서의 향상된 발현성을 보유한 합성된 살충성 결정성 단백질 유전자의 생산에 관한 것이다. 이와 같이, 분리된B.t. 내독소 유전자는상업적으로 가치있어 지고 있다.

B.t. 독소의 성공적인 농업에의 활용에 있어서 장애가 되는 문제에는 곤충에 의한B.t. 독소에 대한 내성의 발현이 포함된다. 또한, 어떤 곤충은B.t.의 효과에 반응하지 않는다. 후자의 경우에는 목화다래바구미(boll weevil)와 뿌리 잘라먹는 벌레(cutworm)와 같은 곤충이 포함되는데, 이들은 지금까지 대부분의B.t. δ-내독소에 대하여 뚜렷한 감수성을 전혀 갖지 않는 것으로 주장되어 왔다.

뿌리 잘라먹는 벌레는 유충으로서 몇 단계의 령(齡)을 거친다. 후기 령 유충에 의한 묘종 절단이 가장 뚜렷한 손상 및 경제적 손실을 낳을 지라도, 잎의 섭취 역시 통상 옥수수와 같은 곡물의 수확율 손실을 초래한다. 후기 령(예를 들면, 3번째 내지 4번째)에 도달하자 마자, 유충은 식물 및 식물의 일부, 특히 묘종을 잘라먹기 시작한다. 섭취 습성의 전이 때문에, 경제적으로 손실을 입히는 개체수는 사전 경고 징후 없이 예기치 않게 증가할 수 있다. 큰 뿌리 잘라먹는 벌레는 하루에 몇 그루의 묘종을 파괴할 수 있으며, 심각한 만연은 전체 곡물 밭을 없앨 수 있다. 뿌리 잘라먹는 벌레의 야간 습성 및 땅속에 굴을 파는 습성 또한 발견과 처치를 어렵게 만든다.

검은 뿌리 잘라먹는 벌레(Agrotis ipsilon(Hufnagel); 인시류목(Lepidoptera); 밤나방과(Noctuidae))는 옥수수, 목화, 평지속(屬) 작물(브라시카(Brassica), 브로콜리, 양배추, 중국 양배추), 및 잔디를 포함한 많은 작물들의 심각한 해충이다. 이차 숙주 식물에는 비트뿌리,캡시쿰(Capsicum(고추)), 병아리콩, 파바콩(faba beans), 상추, 자주개자리(lucerne), 양파, 감자, 무,평지(캐놀라), 벼, 콩, 딸기, 사탕무, 담배, 토마토, 및 삼림이 포함된다. 북미에서는,아그로티스(Agrotis) 속(屬)의 해충이 클로버, 옥수수, 담배, 삼, 양파, 딸기, 블랙베리, 라스베리, 자주개자리(alfalfa), 보리, 강낭콩, 양배추, 귀리, 완두콩, 감자, 딸기, 토마토, 정원용 화초, 잔디, 자주개자리(lucerne), 옥수수, 아스파라거스, 포도, 거의 모든 종류의 잎, 잡초, 및 다수의 다른 곡물 및 원예식물에 서식한다. 아그로티니(Agrotini) 족(族)의 다른 뿌리 잘라먹는 벌레는, 특히펠티아(Feltia) 속(屬)(예를 들면,에프.자큘리페라(F. jaculifera(Guenee));두센스 서브고티카(ducens subgothica)와 동등함) 및육소아(Euxoa) 속(屬)(예를 들면,이.메소리아(E. messoria(Harris)),이.스캔댄스(E. scandens(Riley)),이.옥실리아리스(E. auxiliaris(Smith)),이.데테르사(E. detersa(Walker)),이.테셀라타(E. tessellata(Harris)),이.오크로가스터(E. ochrogaster(Guenee)))의 해충이다.페리드로마 소시아(Peridroma saucia)와 같은 뿌리 잘라먹는 벌레 또한 중요한 해충일 수 있다. 예를 들면, 밀감속(屬) 식물 또한 뿌리 잘라먹는 벌레의 타겟이 될 수 있다("밀감 뿌리 잘라먹는 벌레(citrus cutworm)"자일로마이게스 큐리알리스(Xylomyges curialis)가 일례이다).

뿌리 잘라먹는 벌레는 북미 이외의 지역에서도 발생하는 해충이며, 보다 경제적으로 중요한 해충은 병아리콩, 밀, 야채, 사탕무, 자주개자리, 옥수수, 감자, 순무, 평지, 상추, 딸기, 로건베리, 아마, 목화, 콩, 담배, 비트뿌리, 중국 양배추, 토마토, 가지, 사탕수수, 목초지, 양배추, 땅콩,큐커비타(Cucurbita), 순무, 해바라기,브라시카(Brassica), 양파, 파, 셀러리, 참깨, 아스파라거스, 장군풀,치커리, 온실 작물, 및 시금치를 공격한다. 검은 뿌리 잘라먹는 벌레에이.입실론은 중미, 유럽, 아시아, 호주, 아프리카, 인도, 대만, 멕시코, 이집트, 및 뉴질랜드를 포함한 북미 이외의 지역에서 발생하는 해충이다.

아르헨티나에서 우세한 뿌리 잘라먹는 벌레종은아그로티스 말레피다(Agrotis malefida),포로사그로티스 자이파에티아나(Porosagrotis gypaetiana), 및아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon,ypsilon으로도 표기함)이다. 이들 뿌리 잘라먹는 벌레는, 예를 들면, 옥수수, 콩, 및 해바라기 품종을 공격한다. 이들 곤충은 묘종의 개체수를 심각하게 감소시키며, 극심한 공격의 경우에는 전체 소구획을 완전히 파괴할 수 있다.

주변의 잡초 구제와 같은에이.입실론에 대한 재배상의 구제(curtural control)는 심각한 만연을 방지하는데 도움이 될 수 있다; 그러나, 그러한 방법은 항상 실행가능하거나 효과적인 것은 아니다. 만연은 매우 산발적이며, 따라서 파종 이전 또는 파종시에 살충제를 적용하는 것은 과거에 효과적이지 않았다. 몇몇 미끼는 곡물의 뿌리 잘라먹는 벌레를 구제하는데 유용하다. 덩굴이 뻗어 나가는 볏과(科)의 잡초와 같은 잔디풀을 보호하기 위하여, 화학적인 살충제가 사용되어 왔다. 화학적 살충제의 사용은 잔디로 덮인 지역(예를 들면, 골프장, 운동장, 공원 및 기타 오락 장소, 전문적인 조경, 및 가정용 잔디밭)에서는 대중이 이들 지역과 밀접하게 접하게 때문에 특별한 관심사이다. 천연 산물(예를 들면, 선충류 및 아자디라크틴(azadirachtin))은 일반적으로 잘 작용하지 못한다.

지금까지, 검은 뿌리 잘라먹는 벌레를 구제하기 위한바실러스 슈린지엔시스산물은 충분한 효능의 결여 때문에 널리 사용되지 않았다. 뿌리 잘라먹는 벌레의 급속한 섭취 및 굴을 파는 습성 때문에, 이들을 통상적인 생물학에 기초한 해충 구제법으로 구제하는 것은 특히 어려웠다. 예를 들면,Cry1A(b) 독소는 뿌리 잘라먹는 벌레에 대하여 근본적으로 비효과적이다.

[발명의 간단한 요약]

본 발명은CryIF 단백질이 검은 뿌리 잘라먹는 벌레(Agrotis ipsilon,아그로티스 입실론)와 같은 뿌리 잘라먹는 벌레에 대하여 활성을 가지고 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 이들 해충을 구제하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 해충을 최소한CryIF 독소의 살충성 영역을 포함하는바실러스 슈린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 독소의 살충성 양과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 따라서, 전장의(full-length), 절두된(truncated), 및 키메라(chimeric)CryIF 단백질 및 유전자가 본 발명에 포함된다. 바람직한 실시양태에 있어서,CryIF 독소는CryIFa 독소이다. 야생형(wild-type) 및 합성CryIF 단백질이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 따라서, 공지의cryIF 유전자와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드(및/또는 그들의 상보체, 바람직하게는 그들의 전체 상보체), 바람직하게는 핵심-독소 코딩 영역은 본 발명에 포함된다. 식물에 최적화된 폴리뉴클레오티드는 바람직한 실시양태에서 사용된다.

본 발명은 옥수수, 목화 및 해바라기와 같은 식물 숙주를 포함하는형질전이(transgenic) 숙주의 사용을 포함한다. 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명은, 형질변환된 식물 세포가 타겟 해충에 의해 소비되는 조직에서 살충성 단백질을 발현하도록, 본 발명의 적어도 한 폴리뉴클레오티드로 형질변환된 식물 세포에 관계된다. 그러한 식물의 형질전환은 당업계의 숙련가에게 공지된 기술을 사용하여 달성될 수 있으며, 전형적으로 식물에서의 독소 발현을 최적화하기 위한 유전자의 변형을 포함한다.

본원은 1999년 8월 23일자로 출원된 미국 가특허출원 제 60/150,319호로부터의 우선권을 주장한다.

본 발명은 뿌리 잘라먹는 벌레를 구제하는데 유용한 방법 및 물질에 관한 것이다.

도 1은 4령의 검은 뿌리 잘라먹는 벌레 유충에 의한 감염 및 다양한 처리로부터 24시간 이후의 완전한 밀 묘종의 중량 및 상대적인 손상 등급을 도시한 것이다.

도 2는 3령의 검은 뿌리 잘라먹는 벌레 유충에 의한 감염 및 다양한 처리로부터 48시간 이후의 밀 묘종의 생중량을 도시한 것이다.

도 3 및 도 4는 실시예 4에서 논의된 결과를 도시한 것이다(도 3: 손상된 식물에 근거한 시험식물의 등급; 도 4: 입목 감소(식물 사멸)로부터의 보호에 근거한시험식물의 등급).

[서열의 간단한 설명]

서열 1은 '1F1AB-PO'라 명명된, 전장의 식물에 최적화된cryIF/cryIA(b) 하이브리드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열이다.

서열 2는 전장의 식물에 최적화된 CryIF/CryIA(b) 키메라 독소의 아미노산 서열이다. 상기 1F1AB-PO 유전자는 이 독소를 코딩한다.

서열 3은 '1F-T-PO'라 명명된, 절두된 식물에 최적화된cryIF 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열이다.

서열 4는 절두된 식물에 최적화된 CryIF 독소의 아미노산 서열이다. 1F-T-PO, 1F-7G-PO, 및 IF-7Z-PO라 명명된 유전자들은 이 독소를 코딩한다.

서열 5는 '81IA(cryIFa)'라 명명된, 야생형의 전장B.t. 독소 유전자의 천연 폴리뉴클레오티드 서열이다.

서열 6은 '81IA(CryIFa)'라 명명된, 야생형의 전장B.t. 독소의 아미노산 서열이다.

서열 7은 목화에서의 발현을 위하여 최적화된, '1F-7G-PO'라 명명된 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열이다.

서열 8은 옥수수에서의 발현을 위하여 최적화된, '1F-7Z-PO'라 명명된 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열이다.

하기는 본 발명을 수행하기 위한 과정을 설명하는 실시예이다. 이들 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 발명은CryIF 단백질이 검은 뿌리 잘라먹는 벌레(Agrotis ipsilon,아그로티스 입실론)와 같은 뿌리 잘라먹는 벌레에 대하여 활성을 가지고 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 특히 놀라운 것은 3령의 유충 및 그보다 더 큰 유충이 본 발명에 따른 독소 및 유전자에 의해 구제된다는 발견이다. 1령 및 2령의 뿌리 잘라먹는 벌레 유충의 구제는 후기 령의 구제에 비해 훨씬 덜 중요하다.CryI 독소는 일반적으로 인시류에 대하여 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있음에도 불구하고, 상기 배경기술 항목에서 보다 상세히 논의된 바와 같이, 뿌리 잘라먹는 벌레는 대체로B.t. 독소에 반응하지 않는 것으로 사료되었다.

본 발명은 재조합 숙주의 사용을 포함하며, 식물에 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 이들 폴리뉴클레오티드 서열에는 '1F1AB-PO', '1F-T-PO', '1F-7G-PO' 및 '1F-7Z-PO'라 명명된, 식물에 최적화된 유전자들이 포함된다. 이들 유전자는 국제공개 제 99/24581호에 개시되어 있다. 바람직한 식물 숙주에는 옥수수, 콩, 목화, 밀, 캐놀라 및 해바라기가 포함된다.

본 발명의 몇몇 실시양태에 있어서, 유전자들은 전장CryIF 독소에 비하여 절두된CryIF 독소를 코딩한다. 본 발명의 절두된 독소는 전형적으로 전독소 분절(protoxin segment)의 전체 또는 일부영역이 결여되어 있다. 또한, 본 발명의 절두된 유전자는 키메라 유전자 및 단백질의 생산에 사용될 수 있다. 일례는cryIF 영역 및cryIA(b) 영역을 포함하는 식물에 최적화된 유전자로, 상기 하이브리드 유전자는 키메라 독소를 코딩한다. 바람직한 키메라 유전자 및 독소는 미국특허 제 5,527,883호 및 제 5,840,554호에 개시되어 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 키메라 유전자 및 독소는 미국특허 제 5,508,264호 및 제 5,827,514호에 개시되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 키메라 독소의CryIF 영역은 그 자체가 살충성이다. 융합 독소 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명은, 형질변환된 식물 세포가 타겟 해충에 의해 소비되는 조직에서 살충성 단백질을 발현함으로써 타겟 해충이 살충성 단백질과 접촉하게 되도록, 본 발명의 적어도 한 폴리뉴클레오티드 서열로 형질변환된 식물 세포에 관계된다. 그러한 식물의 형질전환은 당업계의 숙련가에게 공지된 기술을 사용하여 달성될 수 있으며, 전형적으로 식물에서의 독소 발현을 최적화하기 위한 유전자의 변형을 포함할 것이다.

본원에 개시된 유전자의 서열이 주어지면, 본 발명의 유전자는 몇 가지 방법에 의해 수득될 수 있음이 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다. 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명의 유전자는 예를 들면 유전자 합성기를 사용하여 합성적으로 제조될 수 있다. 본원에 예시된 특정 유전자 또한 본 발명의 가르침에 따라 후술하는 배양균 기탁소에 기탁된 특정 분리주 유래의 특정 야생형 유전자를 변형함으로써(예를 들면, 점-돌연변이 기술에 의해) 수득될 수 있다. 예를 들면, 야생형cryIF 유전자는B.t. 분리주 PS81I로부터 수득될 수 있다. 이와 마찬가지로, 본 발명의 하이브리드 유전자의cryIA(b) 영역은 합성적으로 생산되거나, 또는 야생형 유전자를 변형함으로써 유도될 수 있다. CryIA(b) 독소 및 유전자는, 예를 들면, Hofteet al. (1986)Eur. J. Biochem.161:273; Geiseret al. (1986)Gene48:109; 및 Haideret al. (1988)Nucleic Acids Res. 16:10927에 기술되어 왔다. 클론 및 추가적인 야생형 분리주들은 상기 "배경기술" 항목 및 하기의 목록에 보다 상세히 기술되어 있다.

본원에 기술된 배양균들은 부다페스트 조약에 따라 농업 연구 배양균 기탁소(Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA)에 기탁되었다. 하기 목록의 기탁된 균주들은 상기 "배경기술" 항목에서 논의된 인용특허들에 개시되어 있다.

계대배양주	수탁번호	기탁일
B.t.PS81I	NRRL B-18484	1989. 4. 19
E. coli(NM522)(pMYC1603)(81IA)	NRRL B-18517	1989. 6. 30

기탁주의 이용가능성이 정부의 결정에 의하여 보장된 특허권을 침해하는 방식으로 본 발명을 시행하여도 좋다는 인허를 구성하지는 않음을 이해하여야 한다.

유전자 및 독소. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 원하는 숙주 세포 내에서단백질 또는 펩티드를 코딩하는 완전한 "유전자"를 형성하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 당업계의 숙련가라면 쉽게 알아차릴 수 있듯이, 첨부된 서열목록의 폴리뉴클레오티드 중 몇몇은 종지 코돈 없이 도시되어 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 당업계에 이미 공지된 바와 같이, 관심있는 숙주 내의 프로모터의 조절 하에 적절하게 놓일 수 있다.

당업계의 숙련가라면 쉽게 알수 있듯이, DNA는 전형적으로 이중가닥 형태로 존재한다. 이러한 배열에 있어서, 한 가닥은 다른 하나의 가닥에 대하여 상보적이고, 그 역관계도 성립한다. DNA가 (예를 들면) 식물 내에서 복제될 때, 추가의 상보적인 DNA 가닥이 생산된다. 따라서, 본 발명은 첨부된 서열목록에 도시된 예시된 폴리뉴클레오티드 및 그의 상보성 가닥의 사용을 포함한다. "코딩 가닥(coding strand)"이란 용어는 종종 당업계에서 안티-센스 가닥(anti-sense strand)과 결합하는 가닥을 언급하기 위해 사용된다. 생체내(in vivo)에서 단백질을 발현하기 위하여, 하나의 DNA 가닥은 전형적으로, 단백질 해독의 주형으로 사용될 수 있는 상보적인 mRNA 가닥으로 전사된다. mRNA는 실질적으로 DNA의 "안티-센스" 가닥으로부터 전사된다. "센스" 또는 "코딩" 가닥은, 전사해독프레임(open reading frame, "ORF")으로 읽혀 관심있는 단백질 또는 펩티드를 형성할 수 있는 일련의 코돈(코돈이란 한번에 세개가 읽혀 하나의 특정 아미노산을 낳을 수 있는 세 개의 뉴클레오티드임)을 가지고 있다. 예시된 DNA와 기능적으로 동등한 RNA 및 PNA(peptide nucleic acids)는 본 발명에 포함된다.

본 발명의 유전자 및 독소는, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 동정되고, 수득되고, 특성이 규명될 수 있다. 프로브는 검출가능한 뉴클레오티드 서열이다. 본 발명의 특별히 예시된 폴리뉴클레오티드들은, 활성 독소를 코딩하기에 충분한 그들의 일부영역을 포함하여, 그 자체가 프로브로 사용될 수 있다. 프로브는 DNA, RNA 또는 PNA일 수 있다. 이들 서열은 적절한 표지에 의해 검출될 수 있거나, 또는 예를 들면 국제공개 제 93/16094호에 기술된 바와 같이 내재적으로 형광을 내도록 만들어질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 만일 프로브 분자 및 핵산 시료가 두 분자 간의 강력한 결합에 의해 혼성화된다면, 상기 프로브와 시료는 실질적인 상동성(homology)을 가지고 있는 것으로 가정하는 것이 타당하다. 바람직하게는, 혼성화는, 예를 들면, Keller, G.H., M.M. Manak (1987)DNA Probes, Stockton Press, New York, NY., pp. 169-170에 기술되어 있는 바와 같이 당업계에 공지된 기술을 사용하여 가혹한 조건하에서 수행된다. 예를 들면, 거기에 기술된 바와 같이, 높은 가혹도(high stringency)의 혼성화 조건은 실온에서 15분 동안 2X SSC(Standard Saline Citrate)/0.1% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)로 일차 세척함으로써 달성될 수 있다. 전형적으로 두 차례의 세척이 수행된다. 보다 높은 가혹도는 염 농도를 낮추고/낮추거나 온도를 높임으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 상술한 혼성화 단계 이후에, 실온에서 15분 동안 0.1X SSC/0.1% SDS로 세척한 다음, 이어서 55℃에서 30분 동안 0.1X SSC/0.1% SDS로 세척할 수 있다. 이들 단계에 사용된 온도 조건은 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 본원에 기술된 다른 프로토콜에도 적용될 수 있다(거기에서는, 예를 들면, SSC 대신에 SSPE가 염으로 사용된다). 2X SSC/0.1% SDS는 50㎖의 2X SSC와 5㎖의 10% SDS를445㎖의 물에 첨가함으로써 제조될 수 있다. 20X SSC는 NaCl(175.3g/0.150M), 시트르산 나트륨(88.2g/0.015M) 및 물을 최종 부피가 1리터가 되도록 합하고, 10N NaOH로 pH를 7.0으로 맞춤으로써 제조될 수 있다. 10% SDS는 SDS 10g을 50㎖의 멸균수에 용해시키고, 100㎖로 희석한 후 분주함으로써 제조될 수 있다.

프로브의 검출은 혼성화가 일어났는지 여부를 공지된 방식으로 결정하기 위한 수단을 제공한다. 그러한 프로브 분석은 본 발명의 독소-코딩 유전자를 동정하기 위한 신속한 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 프로브로 사용되는 뉴클레오티드 분절(segment)은 DNA 합성기 및 표준 과정을 사용하여 합성될 수 있다.

본원에 사용될 때, "가혹한(stringent)" 혼성화 조건이란 본 출원인에 의해 사용된 조건에서와 동일한 정도 또는 거의 동일한 정도의 혼성화 특이성을 달성할 수 있는 조건을 의미한다. 특히, 서던 블롯 상에 고정된 DNA와³²P로 표지된 유전자-특이적 프로브의 혼성화는 표준 방법에 의해 수행된다(Maniatis, T., E.F. Fritsch, J. Sambrook [1982]Molecular Cloning; A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). 일반적으로, 혼성화 및 뒤이은 세척은 타겟 서열의 검출을 위하여 허용되는 가혹한 조건하에서 수행되었다. 이중-가닥 DNA 유전자 프로브의 경우, 혼성화는 6X SSPE, 5X 덴하르트 용액, 0.1% SDS, 0.1mg/㎖ 변성 DNA 내에서 DNA 혼성체(hybrid)의 용융 온도(melting temperature, "Tm")로부터 20-25℃ 미만에서 밤새 수행되었다. 용융 온도는 다음 공식에 의해 결정된다(Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas,and F.C. Kafatos [1983]Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman and K. Moldave [eds.] Academic Press, New York 100:266-285):

Tm=81.5℃+16.6 Log[Na+]+0.41(%G+C)-0.61(%포름아미드)-600/이중가닥의 염기쌍 길이

세척은 전형적으로 다음과 같이 수행된다:

(1) 1X SSPE, 0.1% SDS 내에서 15분 동안 실온에서 2회(낮은 가혹도 세척)

(2) 0.2X SSPE, 0.1% SDS 내에서 15분 동안 Tm-20℃에서 1회(중간 가혹도 세척).

올리고뉴클레오티드 프로브의 경우, 혼성화는 6X SSPE, 5X 덴하르트 용액, 0.1% SDS, 0.1㎎/㎖ 변성 DNA 내에서 혼성체의 용융 온도(Tm)로부터 10-20℃ 미만에서 밤새 수행되었다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 Tm은 다음의 공식에 의하여 결정되었다:

Tm(℃)=2(T/A 염기쌍의 수)+4(G/C 염기쌍의 수)

(Suggs, S.V., T. Miyake, E.H. Kawashime, M.J. Johnson, K. Itakura, and R.B. Wallace [1981]ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes, D.D. Brown [ed.], Academic Press, New York, 23:683-693).

세척은 전형적으로 다음과 같이 수행되었다:

(2) 1X SSPE, 0.1% SDS 내에서 15분 동안 혼성화 온도에서 1회(중간 가혹도 세척).

유전자 및 독소의 변형. 본 발명에 따라 유용한 유전자 및 독소는 특이적으로 예시된 서열뿐만 아니라, 본원에 특이적으로 예시된 단백질의 특징적인 살충 활성을 보유하고 있는, 일부영역(portions) 및/또는 단편(fragments)(전장 단백질에 비하여 내부 및/또는 말단 결실을 포함하고 있는), 변이체(variants), 돌연변이체(mutants), 치환체(치환된 아미노산을 보유한 단백질), 키메라(chimerics), 및 융합 단백질(fusion proteins)을 포함한다. 본원에 사용될 때, 유전자의 "변이체(variants)" 또는 "변이(variations)"라는 용어는 동일한 독소를 코딩하거나 또는 살충 활성을 보유한 동등한 독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 본원에 사용될 때, "동등한 독소(equivalent toxin)"라는 용어는 타겟 해충에 대하여 청구된 독소와 동일하거나 또는 근본적으로 동일한 생물학적 활성을 가진 독소를 의미한다.

표준기술을 사용하여, 유전자는 변형될 수 있으며, 유전자의 변이가 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들면, 점 돌연변이(point mutation)를 만들기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 예를 들면, 미국특허 제 5,605,793호는 무작위 단편화(random fragmentation) 이후에 DNA를 재조립(reassembly) 함으로써 추가적인 분자 다양성을 생성하는 방법을 기술하고 있다. 전장 유전자의 단편은 상업적으로 입수가능한 엑소뉴클라아제 또는 엔도뉴클라아제를 사용하여 표준 기술에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면,Bal31과 같은 효소 또는 부위-특이적 돌연변이유발법(site-directed mutagenesis)은 이들 유전자의 말단으로부터 뉴클레오티드를 체계적으로 절단해내는데 사용될 수 있다. 또한, 활성 단편을 코딩하는 유전자는다양한 제한효소를 사용하여 수득될 수 있다. 프로테아제는 이들 독소의 활성 단편을 직접적으로 수득하는데 사용될 수 있다.

동등한 독소 및/또는 이들 동등한 독소를 코딩하는 유전자는 본원에서 제공되는 가르침에 따라B.t. 분리주 및/또는 DNA 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 살충성 독소를 수득하기 위한 다수의 방법이 있다. 예를 들면, 본원에 개시되고 청구된 살충성 독소에 대한 항체는 단백질 혼합물로부터 다른 독소를 동정하고 분리해내는데 사용될 수 있다. 특히, 항체는 독소의 부위 중 가장 항구적이고 다른B.t. 독소들과 가장 잘 구별되는 부위에 대하여 만들어질 수 있다. 이러한 항체들은 이어서 면역침강법, 효소결합 면역흡착 검정법(ELISA), 또는 웨스턴 블롯팅으로 특징적인 활성을 가지고 있는 동등한 독소를 특이적으로 동정하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 독소 또는 동등한 독소 또는 이들 독소의 단편에 대한 항체는 당업계의 표준 방법을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다. 이어서, 이들 독소를 코딩하는 유전자는 미생물로부터 수득될 수 있다.

유전자 코드의 중복성(redundancy) 때문에, 다양한 상이한 DNA 서열이 동일한 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 동일한 또는 근본적으로 동일한 독소를 코딩하는 이러한 대체 DNA 서열을 생산하는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자의 기술 내에 있다. 이들 변이 DNA 서열은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 사용될 때, "근본적으로 동일한(essentially the same)" 서열이란 살충 활성에 심각하게 영향을 미치지 않는 아미노산 치환, 결실, 부가, 또는 삽입을 지닌 서열을 의미한다. 살충 활성을 보유한 단편 또한 이러한 정의에 포함된다.

동등한 독소는 예시된 독소와 아미노산 유사성(및/또는 상동성)을 가질 것이다. 아미노산 유사성/상동성은 전형적으로 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상일 것이며, 95% 이상일 수 있다. 본 발명의 바람직한 폴리뉴클레오티드 및 단백질은 또한 보다 특정한 상동성 및/또는 유사성 범위의 측면에서 정의될 수 있다. 예를 들면, 상동성 및/또는 유사성은 본원에 예시된 서열과 비교하여 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%일 수 있다. 달리 한정되지 않으면, 본원에 사용된 두 핵산 간의 퍼센트 서열 상동성 및/또는 유사성은 Karlin and Altschul (1993),Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:5873-5877에서처럼 변형된 Karlin and Altschul (1990),Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:2264-2268의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 그러한 알고리즘은 Altschulet al. (1990),J. Mol. Biol.215:402-410의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 내로 통합된다. 원하는 퍼센트 서열 상동성을 가진 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해, BLAST 뉴클레오티드 서치가 NBLAST 프로그램(score=100, wordlength=12)를 사용하여 수행된다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬(gapped alignments)을 얻기 위해, Gapped BLAST가 Altschulet al. (1997),Nucl. Acids Res.25:3389-3402에 기술된 바와 같이 사용된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램(NBLAST 및 XBLAST)의 디폴트 파라미터(default parameters)가 사용된다. http://www.ncbi.nih.gov를 참조하라. 상동성 스코어는또한 상기 "배경기술" 항목에 기술된 Crickmoreet al.의 방법 및 알고리즘을 사용하여 계산될 수 있다.

아미노산 상동성은 생물학적 활성에 책임이 있거나, 또는 궁극적으로 생물학적 활성에 책임이 있는 3차원 형상의 결정에 관여하는 독소의 중요 영역 내에서 가장 높을 것이다. 이러한 측면에서, 만일 어떤 아미노산 치환이 활성에 중요하지 않은 영역 내에 있거나 또는 분자의 3차원 형상에 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환이라면, 이러한 아미노산 치환은 허용가능하며 기대될 수 있다. 예를 들면, 아미노산은 다음의 클래스에 속할 수 있다: 비극성, 전하를 띠지 않은 극성, 염기성, 및 산성. 한 클래스의 아미노산이 동일한 종류의 다른 아미노산으로 치환되는 보존적 치환(conservative substitution)은, 그러한 치환이 화합물의 생물학적 활성을 심하게 변화시키지 않는 한, 본 발명의 범위 내에 포함된다. 표 1은 각 클래스에 속하는 아미노산 예의 목록이다.

아미노산 클래스	아미노산 예
비극성	Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
전하를 띠지 않은 극성	Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
산성	Asp, Glu
염기성	Lys, Arg, His

몇몇 경우에, 비보존적 치환 또한 만들어질 수 있다. 중요한 인자는 이러한 치환이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는 식물의 능력 또는 독소의 생물학적 활성을 심각하게 손상시키지 않아야 한다는 것이다.

본원에서 사용될 때, "분리된(isolated)" 폴리뉴클레오티드 및/또는 "정제된(purified)" 독소는 이들이 자연계에서 발견될 당시에 함께 발견되곤 하는다른 분자들과 결합되어 있지 않을 때의 분자를 의미한다; 이러한 용어는 그들의 식물에서의 사용을 포함한다. 따라서, "분리된" 및/또는 "정제된"이란 용어는 본원에 기술된 "인간의 손(hand of man)"의 개입을 의미한다.

본 발명이 합성 유전자의 특정 실시양태를 제공하긴 하나, 본원에 예시된 유전자와 기능적으로 동등한 다른 유전자 또한 숙주, 바람직하게는 식물 숙주를 형질변환시키는데 사용될 수 있다. 합성 유전자를 생산하기 위한 방법은, 예를 들면, 미국특허 제 5,380,831호에서도 찾아볼 수 있다.

재조합 숙주. 본 발명의 독소-코딩 유전자는 매우 다양한 미생물 또는 식물 숙주 내로 도입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 독소 유전자의 발현은 직접적으로 또는 간접적으로 살충성 단백질의 세포내 생산 및 유지를 초래한다. 형질전환(transgenic)/재조합(recombinant)/형질변환(transformed) 숙주 세포가 해충에 의해 섭취될 때, 그 해충은 독소를 섭취하게 될 것이다. 이것은 해충과 독소를 접촉시키기 위한 바람직한 방법이다. 그 결과는 해충의 구제(말살 또는 병들게 함)이다.

본 발명의 몇몇 실시양태에 있어서, 형질변환된 미생물 숙주는, 예를 들면, 결국 바람직한 실시양태에서 식물 세포 및 식물체를 본 발명의 유전자에 의해 코딩되는 독소를 발현하도록 형질변환시키는데 사용될 전구체(precursor)를 제조하기 위한 예비 단계에 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 형질변환되고 사용되는 미생물은 본 발명의 범위 내에 있다. 재조합 미생물은, 예를 들면,B.t.,이.콜라이, 또는슈도모나스(Pseudomonas)일 수 있다.

다양한 재조합 생물의 생산은 당업계의 숙련가에 의해 표준 기술을 사용하여 이루어 질 수 있다. 이러한 형질변환에 필요한 재료는 본원에 개시되어 있거나, 또는 그렇지 않으면 당업계의 숙련가에게 쉽사리 입수가능하다. 매우 다양한 방법들이 독소를 코딩하는B.t. 유전자를 그 유전자의 안정적인 유지 및 발현을 허용하는 조건하에서 타겟 숙주 내로 도입하는데 사용가능하다. 이러한 방법은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있으며, 예를 들면, 본원에 참고자료로 포함된 미국특허 제 5,135,867호에 기술되어 있다.

본 발명의 독소-코딩 유전자는 적절한 벡터를 통해 다양한 미생물 및 식물 숙주 내로 도입될 수 있다. 옥수수, 밀, 벼, 목화, 콩 및 해바라기와 같은 관심있는 다수의 곡물이 있다. 본 발명의 어떤 유전자는 폴리펩티드 살충제 발현 유전자의 형질변환된 식물 내에서의 안정적인 유지 및 발현을 제공하는데 특히 적합하며, 바람직하게는 환경적인 분해 및 불활성화로부터 상기 살충제를 보다 효과적으로 보호한다. 독소 유전자의 발현은, 직접적으로 또는 간접적으로, 살충성 단백질의 세포내 생산 및 유지를 초래한다. 따라서, 타겟 해충은 그 해충에 독성을 갖는 살충성 단백질을 함유한 식물 조직을 섭취함으로써 살충성 단백질과 접촉할 수 있다. 그 결과는 해충의 구제이다. 이와 달리, 적절한 미생물 숙주, 예를 들면,슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)가 해충의 서식처에 적용될 수 있으며, 거기에서 그들 중 몇몇은 증식하고, 결국 타겟 해충에 의해 섭취될 수 있다. 독소 유전자를 보유하고 있는 미생물은 독소의 활성을 지속시키고 세포를 안정화하는 조건 하에서 처리될 수 있다. 그런 다음, 독성 활성을 보유하고 있는 처리된세포는 타겟 해충에 있는 환경에 적용될 수 있다.

B.t. 독소 유전자가 적절한 벡터를 통해 미생물 숙주 내로 도입되고, 상기 숙주가 살아있는 상태로 해충의 서식처에 적용되는 경우, 특정 숙주 미생물이 사용되어야 한다. 관심있는 하나 또는 그 이상의 농작물의 "피토스피어(phytosphere)"(phylloplane, phyllosphere, rhizosphere, 및/또는 rhizoplane)를 점령하는 것으로 알려진 미생물 숙주가 선택된다. 이들 미생물은 특정 환경(농작물 및 기타 다른 곤충 서식처)에서 야생형 미생물과 성공적으로 경쟁할 수 있고, 폴리펩티드 살충제를 발현하는 유전자의 안정적인 유지 및 발현을 제공하며, 바람직하게는, 상기 살충제에 환경적인 분해 및 불활성화로부터의 향상된 보효효과를 제공하도록 선택된다.

다수의 미생물이 매우 다양한 중요 농작물의 필로플레인(식물 잎의 표면) 및/또는 리조스피어(식물 뿌리 주위의 토양)에 서식하는 것으로 알려져 있다. 이러한 미생물에는 박테리아, 조류(algae), 및 진균류(fungi)가 포함된다. 특히 중요한 미생물은 박테리아, 예를 들면,슈도모나스(Pseudomonas),어위니아(Erwinia),세라티아(Serratia),클렙시엘라(Klebsiella),크산토모나스(Xanthomonas),스트렙토마이세스(Streptomyces),리조비움(Rhizobium),로도슈도모나스(Rhodopseudomonas),메틸로필러스(Methylophilus),아그로박테리움(Agrobacterium),아세토박터(Acetobacter),락토바실러스(Lactobacillus),아트로박터(Arthrobacter),아조토박터(Azotobacter),류코노스톡(Leuconostoc),및알칼리제네스(Alcaligenes) 속(屬); 및, 진균류, 특히 효모, 예를 들면,사카로마이세스(Saccharomyces),크립토코커스(Cryptococcus),클류버로마이세스(Kluyveromyces),스포로볼로마이세스(Sporobolomyces),로도토룰라(Rhodotorula), 및아우레오바시디움(Aureobasidium) 속(屬)이다.슈도모나스 시린재(Pseudomonas syringae),슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens),세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens),아세토박터 자일리눔(Acetobacter xylinum),아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens),로도슈도모나스 스페로이데스(Rhodopseudomonas spheroides),크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris),리조비움 멜리오티(Rhizobium melioti),알칼리제네스 엔트로퍼스(Alcaligenes entrophus), 및아조토박터 빈란디(Azobacter vinlandii)와 같은 피토스피어 박테리아 종; 및로도토룰라 루브라(Rhodotorula Rubra),알.글루티니스(R. glutinis),알.마리나(R. marina),알.아우란티아카(R. aurantiaca),크립토코커스 알비더스(Cryptococcus albidus),씨.디풀루엔스(C. diffluens),씨.라우렌티(C. laurentti),사카로마이세스 로자이(Saccharomyces rosei),에스.프레토리엔시스(S. pretoriensis),에스.세레비지애(S. cerevisiae),스포로볼로마이세스 로제우스(Sporobolomyces roseus),에스.오도루스(S. odorus),클류버로마이세스 베로내(Kluyveromyces veronae), 및아우레오바시디움 폴루란스(Aureobasidium pollulans)와 같은 피토스피어 효모 종이 특히 중요하다. 색소를 함유한 미생물이 특히 중요하다.

독소를 코딩하는B.t.유전자를 그 유전자의 안정적인 유지 및 발현을 허용하는 조건하에서 타겟 숙주 내로 도입하기 위하여 다양한 방법이 이용가능하다. 이러한 방법은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 본원에 참고자료로 포함된 미국특허 제 5,135,867호에 기술되어 있다.

세포 처리. 상기에서 언급한 같이,B.t. 또는B.t. 독소를 발현하는 재조합 세포는 독소 활성을 지속시키고 세포를 안정화하도록 처리될 수 있다. 형성된 살충제 마이크로캡슐은, 상기 마이크로캡슐이 타겟 해충이 있는 환경에 적용될 때 독소를 보호해줄 안정화된 세포 구조물 내에 있는B.t. 독소를 포함한다. 적절한 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포를 포함할 수 있으나, 일반적으로 포유동물과 같이 보다 고등한 생물에 유해한 물질을 생산하지 않는 세포들에 제한된다. 그러나, 그 유해한 물질이 불안정하거나 또는 적용 수준이 포유동물 숙주에 대해 독성을 나타낼 임의의 가능성을 피하기에 충분할 정도로 낮은 경우에는, 고등한 생물에 유해한 물질을 생산하는 개체가 사용될 수도 있다. 숙주로서, 원핵세포 및 진균류와 같은 하등한 진핵세포가 특히 중요할 것이다.

세포는 일반적으로 완전하며, 어떤 경우에는 포자가 사용되기도 하지만, 처리시에 포자형보다는 대체로 증식형으로 존재할 것이다.

미생물 세포, 예를 들면B.t. 독소 유전자를 포함하는 미생물의 처리는, 처리기술이 독소의 특성을 파괴하거나 독소를 보호하는 세포의 능력을 감소시키지 않는 한, 화학적 또는 물리적 수단에 의해, 또는 화학적 및/또는 물리적 수단의 조합에 의해 이루어질 수 있다. 화학적 시약의 예는 할로겐화제, 특히 원자번호 17-80의 할로겐이다. 보다 상세하게, 요오드는 순한 조건(mild condition) 하에서 원하는 결과를 달성하기에 충분한 시간 동안 사용될 수 있다. 다른 적절한 기술은 글루타르알데히드와 같은 알데히드; 제피란 클로라이드(zephiran chloride) 및 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride)와 같은 항-감염제; 이소프로필 및 에탄올과 같은 알코올; Lugol 요오드, Bouin's 고정제, 다양한 산 및 Helly's 고정제와 같은 다양한 조직학용 고정제(참조: Humason, Gretchen L.,Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Company, 1967); 또는 세포가 숙주 환경에 투여되었을 때 그 세포 내에서 생산되는 독소의 활성을 보존하고 지속시키는 물리적(열) 및 화학적 제제의 조합에 의한 처리를 포함한다. 물리적 수단의 예는 감마-방사 및 X-방사와 같은 단파장 방사, 냉동, UV 조사, 동결건조 등이다. 미생물 세포의 처리 방법은 본원에 참고자료로 삽입된 미국특허 제 4,695,455호 및 제 4,695,462호에 개시되어 있다.

상기 세포들은 일반적으로, 환경 조건에 대한 내성을 증대시켜줄 증강된 구조적 안정성을 가질 것이다. 살충제가 전구체 형태(proform)로 존재하는 경우, 세포 처리방법은 그 전구체가 타겟 해충 병원체에 의해 성숙형으로 프로세싱되는 것을 저해하지 않도록 선택되어야 한다. 예를 들면, 포름알데히드는 단백질을 교차결합시킴으로써 폴리펩티드 살충제의 전구체가 프로세싱되는 것을 저해할 수 있다. 처리방법은 최소한 독소의 생물학적 유용성(bio-availability) 또는 생활성에 실질적인 부위를 유지해야만 한다.

생산 목적으로 숙주 세포를 선별하는데 있어서 특히 중요한 특징은B.t. 유전자의 숙주 내로의 도입의 용이함, 발현 시스템의 활용가능성, 발현 효율, 숙주내에서 살충제의 안정성, 및 보조 유전적 능력의 존재를 포함한다. 살충제 마이크로캡슐로서 사용하기 위한 중요한 특징은 두터운 세포벽, 착색(pigmentation), 및 세포내 패키징 또는 봉입체 형성과 같은 살충제 보호 특성; 수성 환경에서의 생존; 포유동물 독성의 결여; 살충제를 섭취하도록 해충의 유인; 독소에 손상을 주지 않는 사멸 및 고정의 용이함 등을 포함한다. 다른 고려사항은 조성물화(formulation) 및 취급의 용이함, 경제성, 저장 안정성 등을 포함한다.

세포 성장.B.t. 살충성 유전자를 함유한 세포 숙주는, 실질적으로 모든 또는 모든 세포들이B.t. 유전자를 보유하도록 선별 배지를 제공하면서, 바람직하게는 DNA 구조물이 선별의 유리함을 제공하는 임의의 편리한 영양배지에서 생육될 수 있다. 이러한 세포들은 이어서 통상의 방법에 따라 회수된다. 이와 달리, 세포들은 회수 이전에 처리될 수도 있다.

본 발명의B.t. 세포는 표준 배지 및 발효 기술을 사용하여 배양될 수 있다. 발효 주기가 완료되자마자, 우선B.t. 포자 및 결정을 당업계에서 공지된 수단에 의해 발효 브로쓰로부터 분리함으로써 세균이 회수될 수 있다. 회수된B.t. 포자 및 결정은 계면활성제, 분산제, 불활성 담체, 및 특정 타겟 해충의 취급 및 그에의 적용을 용이하게 하는 다른 성분을 첨가함으로써, 적실 수 있는 분말(wettable powder), 액상 농축물, 과립 또는 기타 다른 조성물로 제조될 수 있다. 이러한 조성물 및 적용 과정은 당업계에 공지되어 있다.

조성물(formulations). 유인물질(attractant) 및B.t. 분리주의 포자 및 결정을 포함하는 조성물화된 먹이 과립, 또는 본원에 개시된B.t. 분리주로부터 수득가능한 유전자를 포함하는 재조합 미생물이 토양에 적용될 수 있다. 조성물화된 제품은 또한 경작 주기의 후기 단계에서 종자-코팅제, 뿌리 처리제, 또는 전체 식물 처리제로서 적용될 수 있다.B.t. 세포로 된 식물 및 토양 처리제는 유기 미네랄(필로실리케이트, 카보네이트, 설페이트, 포스페이트 등) 또는 식물성 물질(분말화된 옥수수 속대, 쌀겨, 호두 껍질 등)과 같은 다양한 불활성 물질과 혼합함으로써, 적실 수 있는 파우더, 과립 또는 분말로서 사용될 수 있다. 상기 조성물은 분무기-스티커 매질(adjuvant), 안정화제, 기타 다른 살충성 첨가제, 또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 액상 조성물은 수성계 또는 비수성계일 수 있으며, 거품, 젤, 현탁액, 유상액화 될 수 있는 농축물 등으로서 사용될 수 있다. 유동성 제제(rheological agents), 계면활성제, 유상액화제, 분산제, 또는 중합체가 성분으로 포함될 수도 있다.

당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하고 있듯이, 살충성 농도는 특정 조성물의 성질, 특히 그 조성물이 농축물인지 또는 직접 사용될 것인지의 여부에 따라 크게 달라질 수 있다. 상기 살충제는 적어도 1 중량%로 존재할 것이며, 100 중량%일 수도 있다. 액상 조성물은 일반적으로 액체상 중에 고형성분을 약 1 내지 60 중량% 포함하는 것에 반하여, 건조한 조성물은 살충제를 약 1 내지 95 중량% 포함할 것이다. 세포를 함유한 조성물은 일반적으로 약 10²내지 약 10⁴세포/㎎를 포함할 것이다. 이러한 조성물들은 헥타르 당 약 50㎎(액상 조성물 또는 건조한 조성물) 내지 1㎏ 또는 그 이상의 양으로 적용될 수 있다.

상기 조성물은 분무, 살포, 흩뿌림 등에 의해 해충의 서식처, 예를 들면 토양 및 잎에 적용될 수 있다.

돌연변이주. 본 발명의 분리주의 돌연변이주는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 무포자 돌연변이주는 분리주의 에틸메탄 술포네이트(EMS) 돌연변이유발법을 통해 수득될 수 있다. 돌연변이주는 당업계에 공지된 과정에 따라 자외선 및 니크로소구아니딘을 사용하여 제조될 수 있다.

무포자 돌연변이주의 보다 적은 퍼센티지는 연장된 발효기간 동안 완전하게 남아있을 것이며 용균되지 않을 것이다; 이들 균주는 용균 마이너스(-)로 지정된다. 용균 마이너스 균주는 진탕 플라스크 배지 내에서 무포자 돌연변이주를 검색(screening)하고, 발효 종료 시점에 여전히 완전하게 남아있으며 독소 결정을 함유하고 있는 돌연변이주들을 선별함으로써 동정될 수 있다. 용균 마이너스 균주는 보호받는 캡슐화된 독소 단백질을 생산하게 될 세포 처리 공정에 적합하다.

상기 무포자 돌연변이주의 파아지-내성 변이체를 제조하기 위하여, 파아지 용해질의 분취량을 영양 아가 상에 도말하고 건조시킨다. 이어서, 파아지-감수성 박테리아 균주의 분취량을 건조된 용해질 상에 직접 도말하고 건조시킨다. 상기 플레이트를 30℃에서 인큐베이션한다. 상기 플레이트는 2일 동안 인큐베이션되는데, 그때 다수의 콜로니가 아가 상에서 자라는 것을 볼 수 있다. 이들 콜로니 중 몇개를 찍어, 영양 아가 플레이트 상으로 계대배양한다. 이러한 분명한 내성 배양균들은 파아지 용해질과 교차 획선(cross streaking)을 그어봄으로써 내성에 대하여 검사된다. 파아지 용해질을 하나의 선으로 플레이트 상에 획선을 긋고 건조시킨다. 이어서, 상기 추정적 내성 배양균을 상기 파아지 선과 교차하여 획선을 긋는다. 내성 박테리아 배양균은 30℃에서 밤새 인큐베이션된 후에 상기 파아지 선과 교차하는 획선의 어느 부위에서도 용균 현상을 보이지 않는다. 파아지에 대한 내성은 이어서 상기 내성 배양균을 영양 아가 플레이트 상에 도말함으로써 재확인된다. 감수성 균주도 양성 대조구로 사용하기 위해 동일한 방법으로 도말된다. 건조 후에, 파아지 용해질 한방울을 상기 플레이트의 중심에 떨어뜨리고, 건조시킨다. 내성 배양균은 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션된 후에 파아지 용해질을 떨어뜨린 영역 내에서 용해 현상을 전혀 보이지 않는다.

본원에서 언급하거나 인용된 모든 특허, 특허출원, 가출원 및 간행물은 본 명세서의 명백한 가르침과 일치하는 한 전문 그대로 참고자료로서 첨부된다.

실시예 1 - 검은 뿌리 잘라먹는 벌레(아그로티스 입실론( Agrotis ipsioln ); 인시류목(Lepidoptera); 밤나방과(Noctuidae))에 대한 Cry1F의 바이오어세이

Cry1F의 검은 뿌리 잘라먹는 벌레(black cutworm, "BCW") 유충에 대한 생물학적 활성은 MR872(미국특허 제 5,840,554호에 개시된cry1Fa/cry1Ab 키메라 유전자를 발현하는슈도모나스 플루오레슨스클론)의 동결건조된 분말 조제물을 사용하는 표준 바이오어세이 방법에 따라 결정되었다. BCW 바이오어세이는 검사 시료를 인공 먹이에 혼합하고, 유충에게 처리된 먹이와 처리되지 않은 먹이를 먹임으로써 수행되었다. 모든 어세이는 BCW 인공 먹이(BioServ Corporation, Frenchtown, NJ)를 사용하여 수행되었다. 먹이 혼합 시험은 시료를 인공 먹이(미리 55℃ 또는 그 이하로 냉각된)와 6㎖ 현탁액 + 54㎖ 먹이의 비율로 혼합함으로써 수행되었다. 다단계 처리 농도는 계단희석에 의해 생성되었다. 볼텍싱 후에, 이 혼합물을 24-웰 트레이 당 약 30㎖ 먹이의 비율로(각 웰이 절반쯤 채워짐) 3㎖씩 칸막이된 플라스틱 트레이(Nutrend Container Corporation, Jacksonville, FL) 내로 부었다. 보다 큰 웰을 가진 Nutrend 트레이는 3령 또는 그보다 성숙한 곤충을 사용한 바이오어세이에 사용되었다; 이들 역시 인공 먹이로 약 절반쯤 채워졌다. 검사 물질을 전혀 함유하지 않은 물 블랭크가 대조구로 사용되었다. 먹이가 냉각되어 응고되도록 최소한 30분 정도 경과한 후, 유충(French Ag Resources, Lamberton, MN)을 웰당 한 마리씩 상기 먹이 혼합물 위에 올려놓았다. 이어서, 웰을 고정용 다리미(tacking iron)를 사용하여 Mylar 시트(ClearLam Packaging, IL)로 밀봉하고, 가스가 교환되도록 각 웰에 몇개의 바늘구멍을 뚫어두었다. 유충을 25℃에서 6일 동안 14:10(낮:밤) 유지실에서 유지하였다. 약 6일 후에 치사율 및 성장 저해율을 기록하였다. LC₅₀바이오어세이를 위해서는, 최소한 3번의 반복실험을 수행하였으며, 각 반복실험마다 처리량 당 약 24마리의 곤충을 사용하여 5-7가지 처리량으로 실험하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다(MR872 Cry1F 동결건조 분말 조제물을 사용한 1령 및 3령의아그로티스 입실론유충에 대한 바이오어세이).

령(齡)	시험일수	LC₁₀	LC₅₀	LC₉₀	기울기	시험 곤충수	대조 곤충수	% 대조 치사율
1	5	9	46	249	1.8	790	220	6
3	3	4	17	67	2.2	249	75	0

실시예 2 - 검은 뿌리 잘라먹는 벌레 유충에 대한 Cry1F 미끼의 효능

미끼 조성물을 사용하여 검은 뿌리 잘라먹는 벌레에 대한 Cry1F의 활성을 검사하였다. MR872 클론을 상업적인 미끼(SoilServ, Salinas, CA)와 혼합하고, 그 혼합물을 화분에 심은 밀 묘종(Feekes 성장 단계 1.5)의 토양 표면 위에 50 lb 미끼/에이커의 비율로 살포하였다. 미끼에 상이한 양의 독소를 첨가함으로써, 에이커당 6.25g 및 12.5g Cry1F 독소의 비율에 상당하는 두 가지 농도의 Cry1F를 시험하였다. 식물은 5 그루의 식물당 곤충 약 1 마리의 비율로 3령 또는 4령의 유충으로 감염되었으며, 24-48 시간 후에 식물의 손상 정도를 측정하였다. 손상 등급은 0-4로 나뉘는데, 여기서 0은 식물이 완전히 지면까지 절단된 경우에 해당하고, 4는 가시적인 손상이 전혀 없는 경우에 해당한다. 대조구로는 미끼가 전혀 첨가되지 않은 식물("미끼 없음"), 미끼는 첨가되었으나 독소는 없는 식물("블랭크 미끼"), 및 미끼 및 곤충이 전혀 첨가되지 않은 식물("대조구")이 포함되었다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 도시하였다.

실시예 3 - 곤충 성장과 치사, 및 식물 손상에 의해 측정된 아그로티스 입실론에 대한 형질전환 Cry 1F 해바라기 식물의 효능

식물 처리:

·V2 단계의 대조 묘종

·V2 단계의B.t. 묘종(고정된 유전자 패턴을 가진 공여자); 이들 식물은 실질적으로 서열 3에 도시된 유전자를 발현함.

곤충: 아그로티스 입실론, 2령 유충(3번째 실험실 세대)

시험: B.t. 묘종: 5회 반복, 매회 반복마다 5그루의 묘종, 묘종 한 그루당 유충 한 마리

대조구:5회 반복, 매회 반복마다 5그루의 묘종, 묘종 한 그루당 유충 한 마리

프로토콜:

·각 반복시험은 투명한 직사각형 트레이(15㎝×25㎝)에 심겨있으며 유충을가두기 위해 뚜껑이 덮인 다섯 그루의 묘종으로 구성되었다.

·각 반복시험은 다섯 마리의 유충에 의해 감염되었다. 트레이는 25℃, 75% 습도 챔버 내에 유지되었다. 평가는 감염 후 24, 48, 72 및 96시간 째에 수행되었다.

·평가

1. 식물 - 손상되지 않은 식물, 손상된 식물(줄기, 떡잎 또는 잎이 물어 뜯김), 또는 떡잎 이하에서 절단된 식물로 분류하였다. 또한, 각 반복시험 마다 등급을 매겼다: 1(손상되지 않은 식물 또는 줄기가 약간 물어 뜯긴 식물) 내지 9(전체 식물이 절단되고 조직의 80% 이상이 먹혔음).

2. 곤충 - 감염 96시간 이후, 사망한 유충의 수를 세고, 생존한 유충의 중량을 측정하였다.

3. 분할표(contingency table) 분석을 통해 데이터를 분석하였다.

결과:반복시험 4.의 결과를 도시한 도가 제공된다(감염 후 48시간 및 96시간).아그로티스 입실론에 의한 감염으로부터 24, 48, 72 및 96 시간 이후의 반복시험 평가결과를 보여주는 데이터가 하기의 표에 제공된다.

감염 후 24시간

반복	손상되지 않은 식물의 수	손상된 식물의 수	절단된 식물의 수	등급
반복	B.t.	대조구	B.t.	대조구	B.t.	대조구	B.t.	대조구
1	2	2	2	0	1	3	1	5
2	3	3	0	1	2	1	3	4
3	3	2	2	0	0	3	2	5
4	3	1	0	2	0	2	2	3
5	4	2	0	2	1	1	2	3

감염 후 48시간

반복	손상되지 않은 식물의 수	손상된 식물의 수	절단된 식물의 수	등급
반복	B.t.	대조구	B.t.	대조구	B.t.	대조구	B.t.	대조구
1	2	1	1	1	2	3	3	7
2	2	0	1	2	2	3	3	7
3	1	1	1	0	3	4	3	7
4	2	1	0	0	3	4	4	7
5	2	1	1	1	2	3	3	7

감염 후 72시간

반복	손상되지 않은 식물의 수	손상된 식물의 수	절단된 식물의 수	등급
반복	B.t.	대조구	B.t.	대조구	B.t.	대조구	B.t.	대조구
1	2	0	1	0	3	5	3	9
2	0	0	3	0	2	5	4	9
3	1	0	1	0	3	5	5	9
4	1	0	0	0	4	5	6	9
5	2	0	0	0	5	5	5	9

감염 후 96시간

반복	손상되지 않은 식물의 수	손상된 식물의 수	절단된 식물의 수	등급	사망한 유충의 수
반복	B.t.	대조구	B.t.	대조구	사망한 유충의 수	B.t.	대조구	B.t.	대조구
1	3	0	0	0	2	5	3	9	4
2	0	0	2	0	3	5	7	9	0
3	1	0	0	0	4	5	5	9	0
4	0	0	0	0	5	5	6	9	0
5	1	0	0	0	4	5	6	9	0

감염 후 96시간 째의 유충 중량(mg)^*

반복	반복시험 당 유충
반복	1	2	3	4	5	평균
2	B.t.	100	95	65	115	75	90
2	대조구	230	170	205	175	175	191
3	B.t.	150	135	85	115	120	121
3	대조구	215	200	90	120	160	157
4	B.t.	110	80	110	85	150	107
4	대조구	170	160	185	200	155	174
5	B.t.	120	65	95	60	45	77
5	대조구	120	190	210	255	110	177

^*반복시험 1.에서 유충이 사망하였기 때문에, 네번의 반복시험 만을 나타내었음.

결론: B.t. 묘종은 높은 감염 수준(1 유충/묘종)의아그로티스 입실론에 대하여 활성을 시현한다. 이러한 활성은 구제가 달성되도록 뿌리 잘라먹는 벌레의 성장을 저해하기에 충분하다.

실시예 4 - 신규 Cry1F 옥수수 품종에 의한 검은 뿌리 잘라먹는 벌레(BCW)의 구제

요약. 10 가지의 Cry1F 옥수수 품종(실질적으로 서열 3의 폴리뉴클레오티드를 발현하는)의 야생 환경 하에서의 검은 뿌리 잘라먹는 벌레(아그로티스 입실론(Hufnagel))에 대한 구제 능력을 2 가지 비-Bt 하이브리드(대조구 1 및 대조구 2)와 비교하였는데, 이때 비교를 위해 한 하이브리드는Cry1Ab 단백질을 발현하고, 나머지 한 하이브리드는Cry9C 단백질을 발현하였다. 모든Cry1F 품종은 비-Bt 하이브리드에 비하여 입목(立木) 손실에 대한 우수한 보호 효과를 제공하였다.

재료 및 방법. 제 1일에 각 품종 당 25개의 종자를 Almaco 옥수수 파종기를 사용하여 파종하였다. 네 세트를 재현하였다-각 세트는 개별적으로 무작위화되었다. 열은 쌍을 이루었으며, 각 쌍의 열 사이에는 파종되지 않은 통로가 있었다. 각 소구획은 높이가 8 인치이고 폭이 2.5 피트이며 길이가 6 피트인 아연 강판 철책으로 둘러쳐졌다. 상기 철책은 제 13일과 제 14일에 약 2인치 깊이로 땅속에 박혔다. 철책의 가장자리는 유충의 탈출을 방지하기 위해 페트롤리움 젤리로 처리되었다. 뿌리 잘라먹는 벌레에게 은신처를 제공해주기 위하여, 밀짚을 상기 철책 내에 흩어놓았다. 발아 직후에,Cry1F를 보유한 시험식물을 ELISA 스트립(strip)으로 검사하고, 비발현 식물 또는 잉여 발현 식물을 제거함으로써 입목을 10그루로 솎았다. 3개의 소구획 내에, 최종적인 입목은 8 또는 9 그루였다. 비-Cry1F 식물 역시 10그루로 솎았다. 각 식물 뒤에 작은 플라스틱 말뚝을 놓아두어, 만일 식물이 사라지는 경우 눈에 띠도록 하였다. 제 15일에, 즉 식물이 V1 후기 또는 V2 초기에 이르렀을 때, 검은 뿌리 잘라먹는 벌레의 3령 유충 3 마리를 각 식물 옆에 놓아두었다. 제 19일에, 식물당 BCW의 4령 유충 2 마리에 의한 2차 감염이 시행되었다.

제 16일 부터 제 26일에 이르기까지 날마다 소구획들을 조사하였다. 추가적인 등급 판정이 제 29일에 수행되었으며, 최종적인 등급 판정은 제 34일에 이루어졌다. 손상을 입은 모든 식물을 그 앞에 작은 플라스틱 말뚝을 놓아둠으로써 표시하고, 손상 유형을 데이터 시트에 기록하였다. 시험 종료시에, 최종적인 입목의 수를 확인하였다.

결과. 이 시험에서, 검은 뿌리 잘라먹는 벌레에 의한 손상은 적절한 수준으로 이루어져, 몇몇 비-Bt 시험식물에서 입목의 감소가 초래되었다. 알려지지 않은 이유로 인하여, 이 시험에서는 BCW가 식물을 절단하는 대신 완전히 손상시키는 경향이 있었다. 따라서, 손상된 식물에 관한 데이터 또한 비교되었다.

표 8은 식물의 종류, 및 각 식물 종류별 퍼센트 입목 감소율(percent Stand Reduction, %SR) 및 손상된 식물의 백분율(percent damaged plants, %Dam)을 보여준다. 입목 감소는 식물이 사멸하였음을 의미한다. 손상된 식물은 분명한 섭취 손상을 가지고 있으나, 생장점은 잃지 않은 식물을 의미한다.

처리/Cry1F 발현종	%SR	%Dam
비-B.t. 대조구 1	47.5	60
비-B.t. 대조구 2	32.5	45
Cry9C	7.5	20
Cry1Ab	15	43
308	2.5	5
188	0	5
218	7.5	15
386	7.5	15
538	2.5	18
778	2.5	15
366	3.1	11
663	5	18
058	2.8	9
227	0	5

이러한 결과는 도 3 및 4에 그래프로 도시되어 있다.

모든 실험식물이 손상을 입었을 지라도, 모충(毛蟲)은 식물이 죽을 때까지 먹어야 하기 때문에 이는 놀라운 일이 아니다. 그러나, 요약하자면, 완전히 절단된 대조 식물 바로 옆의 거의 공격을 받지 않은Cry1F 식물을 보여주는 사진이 입수가능하다.

실시예 5 - 식물 내로의 독소 유전자의 삽입

본 발명의 한 측면은 살충성 독소를 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열로 식물을 형질변환 시키는 것이다. 형질변환된 식물은 타겟 해충에 의한 공격에 대하여 내성을 갖는다. 본 발명에 따른 용도를 위해 바람직한 유전자는 식물에서의 사용을 위하여 최적화 된다. 본 발명에 따른 용도를 위한 뿌리 잘라먹는 벌레-활성 독소 및 유전자의 예는 서열 1-8에 도시되어 있다. 서열 1 및 2의 단백질 및 유전자가 바람직하다.

분명히, 식물에서 유전자를 발현할 수 있는 프로모터 영역이 필요하다. 따라서, 식물내 발현(in planta)을 위하여, 본 발명의 DNA는 적절한 프로모토의 조절 하에 있으며 작동가능한 방식으로 그에 연결된다. 그러한 구조물(constructs)을 사용함으로써 식물내 발현을 달성하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다.

본원에 기술된, 살충성 독소를 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들면,이.콜라이의 복제 시스템 및 형질변환된 세포의 선별을 가능케 하는 마커를 포함하는 다수의 클로닝 벡터가 외부 유전자를 고등 식물 내로 도입하기 위한 준비에 이용될 수 있다. 상기 벡터에는, 예를 들면, pBR322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, pACYC184 등이 포함된다. 따라서,B.t. 독소를 코딩하는 서열은 적절한 제한효소 부위에서 상기 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이로부터 얻어진 플라스미드는이.콜라이를 형질변환시키는데 사용된다. 상기이.콜라이세포는 적절한 영양 배지 내에서 배양된 후, 수확되어 용균된다. 상기 플라스미드는 회수된다. 서열 분석, 제한효소 분석, 전기영동, 및 다른 생화학적-분자적 생물학적 방법이 분석방법으로서 일반적으로 수행된다. 각 조작 후에, 사용된 DNA 서열은 절단되어 다음 DNA 서열에 연결될 수 있다. 각 플라스미드 서열은 동일한 또는 다른 플라스미드 내에 클로닝될 수 있다.

원하는 유전자를 식물 내로 삽입하기 위한 방법에 따라, 다른 DNA 서열이 필요할 수도 있다. 만일, 예를 들면, Ti 또는 Ri 플라스미드가 식물 세포 형질변환에 사용된다면, Ti 또는 Ri 플라스미드 T-DNA의 적어도 오른쪽 경계(border), 보다 바람직하게는 오른쪽 및 왼쪽 경계가 삽입될 유전자의 측접 영역(flanking region)으로서 연결되어야 한다. 식물 세포의 형질변환을 위한 T-DNA의 사용은 활발히 연구되어 왔으며, EP 120 516; Hoekema (1985) In:The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter 5; Fraleyet al., Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46; 및 Anet al. (1985)EMBO J. 4:277-287에 충분히 기술되어 있다.

일단 삽입된 DNA가 게놈 내에 통합되면, 그것은 거기에서 비교적 안정하며, 대체로 다시 빠져나오지 않는다. 그것은 보통 형질변환된 식물 세포에 특히 카나마이신, G418, 벨로마이신, 하이그로마이신 또는 클로람페니콜과 같은 생물치사제(biocide) 또는 항생제에 대한 내성을 부여하는 선별 마커를 포함하고 있다. 따라서, 개별적으로 사용된 마커는 삽입된 DNA를 포함하고 있지 않은 세포보다는 오히려 형질변환된 세포의 선별을 허용하여야 한다.

DNA를 식물 숙주 세포 내로 도입하는 데에는 다수의 기술이 이용가능하다. 그러한 기술에는아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)를 형질변환제로 사용하는 T-DNA에 의한 형질변환(transformation), 융합(fusion), 주입(injection), 바이오리스틱스(미세입자 충격법) 또는 일렉트로포레이션 뿐만 아니라 기타 다른 가능한방법들이 포함된다. 만일 형질변환을 위해 아그로박테리아가 사용된다면, 삽입될 DNA는 특별한 플라스미드, 즉 매개 벡터(intermediate vector) 또는 이원성 벡터(binary vector) 내로 클로닝되어야 한다. 매개 벡터는 T-DNA 내의 서열에 상동적인 서열 때문에, 상동 재조합(homologous recombination)을 통해 Ti 또는 Ri 플라스미드 내로 통합될 수 있다. Ti 또는 Ri 플라스미드 또한 T-DNA의 전달에 필요한vir영역을 포함한다. 매개 벡터는 아그로박테리아 내에서 스스로 복제할 수 없다. 매개 벡터는 헬퍼 플라스미드에 의해아그로박테리움 투메파시엔스내로 전달된다(conjugation, 접합). 이원성 벡터는이.콜라이및 아그로박테리아 내에서 스스로 복제할 수 있다. 그들은 선별 마커 유전자, 및 오른쪽 및 왼쪽 T-DNA 경계 영역에 의해 구획된 링커 또는 폴리링커를 포함한다. 그들은 아그로박테리아 내로 직접 형질변환될 수 있다(Holsterset al. [1978]Mol. Gen. Genet.163:181-187). 숙주 세포로 사용되는아그로박테리움은vir영역을 지닌 플라스미드를 포함하여야 한다.vir영역은 T-DNA를 식물 세포 내로 전달하는데 필요하다. 추가적인 T-DNA가 포함될 수도 있다. 그렇게 형질변환된 박테리아는 식물 세포를 형질변환시키는데 사용된다. 식물 외식편(explants)은 DNA를 식물 세포 내로 전달하기 위해아그로박테리움 투메파시엔스또는아그로박테리움 리조게네스와 함께 유리하게 재배될 수 있다. 이어서, 전체 식물은 선별을 위한 항생제 또는 생물치사제를 포함하기도 하는 적절한 배지 내에서 감염된 식물 재료(예를 들면, 잎 조각, 줄기 조각, 뿌리, 원형질, 또는 현탁 배양된 세포)로부터 재생될 수 있다. 그와 같이 수득된 식물은 삽입 DNA의 존재 여부에 대하여 검사된다. 주입 및 일렉트로포레이션의 경우에는플라스미드에 대한 특별한 요구 사항은 없다. 예를 들면 pUC 유도체와 같은 통상의 플라스미드를 사용하는 것이 가능하다.

형질변환된 세포는 식물 내에서 보통의 방식으로 성장한다. 그들은 생식세포(germ cell)를 형성하고, 형질변환된 형질(들)을 자손 식물로 전달할 수 있다. 그러한 식물은 보통의 방식으로 생육될 수 있으며, 동일한 형질변환된 유전 인자 또는 다른 유전 인자를 가지고 있는 식물과 교배될 수 있다. 그로부터 얻어지는 잡종 개체는 상응하는 표현형적 특징을 가지고 있다.

본원에 기술된 실시예 및 실시양태는 오로지 설명의 목적을 위한 것으로, 그러한 측면에서 다양한 변형 또는 변화가 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 제안될 것이며, 본원의 정신과 권한 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되어야 함이 이해되어야 한다.

본 발명의Cry1F 독소 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 사용하면 뿌리 잘라먹는 벌레(cutworm)를 용이하게 구제할 수 있다.

Claims

뿌리 잘라먹는 벌레(cutworm) 해충을 구제하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 해충을Cry1F 독소와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 독소는Cry1Fa 독소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 독소는 절두된 독소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 독소는 상기 독소를 생산하는 식물 세포 내에 있고, 상기 해충은 상기 식물 세포를 섭취함으로써 상기 독소와 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은아그로티스(Agrotis) 속(屬)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은아그로티스 말레피다(Agrotis malefida)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은포로사그로티스(Porosagrotis) 속(屬)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은포로사그로티스 자이파에티아나(Porosagrotis gypaetiana)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은자일로마이게스(Xylomyges) 속(屬)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은자일로마이게스큐리알리스(Xylomyges curialis)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은 아그로티니(Agrotini) 족(族)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은펠티아(Feltia) 속(屬)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은펠티아 자큘리페라(Feltia jaculifera)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은육소아(Euxoa) 속(屬)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은육소아 메소리아(Euxoa messoria)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은육소아 스캔덴스(Euxoascandens)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은육소아 옥실리아리스(Euxoa auxiliaris)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은육소아 데테르사(Euxoa detersa)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은육소아 테셀라타(Euxoatessellata)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은육소아 오크로가스터(Euxoa ochrogaster)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은페리드로마(Peridroma) 속(屬)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뿌리 잘라먹는 벌레 해충은페리드로마 소시아(Peridroma saucia)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 식물은 옥수수인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 식물은 해바라기인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 식물은 콩인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 식물은 캐놀라인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 식물은 목화인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 접촉 단계 이전에 상기 독소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물의 종자를 파종하는 단계가 선행하는 것을 특징으로 하는 방법.