RO122431B1 - Metodă de combatere a dăunătorilor în stadiul de omizi - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la o metodă pentru combaterea dăunătorilor în stadiul de omizi, care cuprinde aducerea în contact a dăunătorului menţionat cu o toxină Cry1F.

Description

Prezenta invenție se referă la o metodă pentru combaterea dăunătorilor în stadiul de omizi.

Insectele și alți dăunători îi costă pe fermieri miliarde de dolari anual, ca urmare a pierderilor de recolte și a cheltuielilor pentru menținerea acestor dăunători sub control. Pierderile cauzate de dăunătorii insecte în mediile de producție agricolă includ scăderea producției agricole și reducerea calității recoltelor. Costurile ridicate de recoltare sunt de asemenea un rezultat al infestării cu insecte.

Problemele legate de insecte au fost abordate parțial prin metode de cultivare, cum arfi rotația culturilor, și prin fertilizarea cu niveluri ridicate de fosfat pentru a stimula creșterea unui sistem puternic de rădăcini la plante. Totuși, rotația culturilor poate fi întreruptă, de exemplu, de o trăsătură care apare la doi ani, diapauza (sau hibernarea) omizilor de porumb Diabrotica barberi. Insecticidele chimice reușesc cu greu să mențină controlul dorit.

Pesticidele chimice s-au dovedit o metodă eficientă de control al dăunătorilor. Totuși, oamenii au început să fie preocupați de cantitatea de substanțe chimice reziduale care pot fi găsite în hrană, apa din sol și oriunde în mediu. Prin urmare, pesticidele chimice sintetice sunt cercetate din ce în ce mai mult pentru eventualele lor consecințe împotriva mediului. Anumite pesticide chimice sintetice pot otrăvi solul și pânzele freatice, pot polua suprafața apelor ca urmare a deversărilor și pot distruge forme de viață care nu au fost vizate. Anumiți agenți de control chimici sintetici au dezavantajul suplimentar de a prezenta pericole pentru siguranța publică atunci când sunt aplicate în zone în care animale de casă, animale de fermă sau copiii vin în contact cu ele. Acestea pot de asemenea să prezinte pericole pentru sănătate celor care le aplică, în special dacă nu sunt urmate tehnicile adecvate de aplicare. Agențiile de reglementare din întreaga lume limitează și/sau interzic utilizarea multor pesticide sintetice, în particular pe acelea care sunt persistente în mediu și intră în lanțul trofic. Noi restricții severe în ceea ce privește utilizarea pesticidelor și eliminarea unora de pe piață pot limita opțiunile economice și controlul costisitor al dăunătorilor.

Datorită problemelor asociate cu utilizarea multor pesticide chimice sintetice, este clar nevoie să se limiteze utilizarea acestor agenți și să se identifice agenți de control alternativi, înlocuirea pesticidelor chimice sintetice, sau a combinației acestor agenți cu pesticide biologice, poate reduce nivelurile de substanțe chimice toxice din mediu.

Un agent biologic cu activitate pesticidă care este utilizat din ce în ce mai mult, este microbul solului Bacillus thuringiensis (B.t.). Microbul solului Bacillus thuringiensis (B.t.) este o bacterie Gram-pozitivă producătoare de spori. Majoritatea tulpinilor de B.t. nu prezintă activitate pesticidă. Anumite tulpini B.t. produc incluziuni proteice parasporale cu activitate pesticidă. Aceste incluziuni proteice apar adesea la nivel microscopic ca niște cristale distinct formate. Forma și tipul de incluziuni cristaline potfi utilizate pentru a caracteriza tulpinile de B.t.. δ-endotoxinele prezente în incluziunile cristaline, care în mod obișnuit au activitate pesticidă specifică, sunt diferite de exotoxinele care au un domeniu gazdă nespecific.

Utilizarea comercială a pesticidelor B.t. a fost la origine restrânsă la un domeniu îngust al dăunătorilor lepidoptere (omizi). De exemplu, preparatele din spori și cristale de B. thuringiensis subspecia kurstakiau fost utilizate mulți ani drept insecticide comerciale pentru dăunătorii lepidoptere. Mai recent, totuși, cercetătorii au descoperit pesticide B.t. cu specificități pentru un domeniu mult mai larg de dăunători. De exemplu, B.t israelensis și morrisoniau fost utilizate comercial pentru a controla insecte din ordinele Diptera și respectiv Coleoptera (Gaertner, F.H. [1989] Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-living Microorganisms in Controlled Delivery of Crop Protection Agents, R.M. Wilkins, editura Taylor and Francis, New York și Londra, 1990, pag. 245-255.

RO 122431 Β1

Acum au fost identificate noi subspecii de B.t. și genele responsabile de proteine 1 active de δ-endotoxine au fost izolate și secvențiate (Hofte, H., H.R. Whiteley [1989] Microbiological Reviews 52 (2): 242-255. Hofte și Whiteley au clasificat genele proteinei 3 cristaline B.t. în patru clase majore. Clasele au fost cryl (specifice Lepidopterelor), cryll (specifice Lepidopterelor și Dipterelor), crylII (specifice Coleopterelor) și crylV (specifice 5 Dipterelor). A fost prezentată descoperirea de tulpini toxice în mod specific pentru alți dăunători (Feitelson, J.S., J. Payne, L. Kim [1992] Bio/Technology 10:271-275. De exemplu, 7 denumirile de CryV și CryVI au fost propuse pentru două noi grupuri de toxine active împotriva nematodelor. 9

Multe proteine de δ-endotoxine de Bacillus thuringiensis sunt compuse din două segmente funcționale. Aceste proteine de lungime totală sunt alcătuite dintr-o toxină 11 centrală rezistentă la pretează care corespunde aproximativ primei jumătăți (porțiunea Nterminală) a moleculei proteice. Structura tridimensională a segmentului central a unei δ- 13 endotoxine B.t. CrylllA este cunoscută și s-a propus ca toate toxinele înrudite să aibă aceeași structură globală (Li, J., J. Caroll, D.J. Ellar [1991] Nature 353:815-821). Ne referim 15 adesea la a doua jumătate (porțiunea C-terminală) a moleculei ca la segment protoxină.

Se crede că segmentul protoxină participă la formarea cristalelor (Arvidson, Η., P.E Dunn, 17

S. Ștrand A.I Aronson [1989] Molecular Microbiology 3:1533:1534; Choma, C.T., W.K. Surewicz, P.R. Carey, M. Pozsgay, T. Raynor, H. Kaplan [1990] Eur. J. Biochem. 189:523- 19

527). Molecula completă a toxinei de 130 kDa este de obicei procesată la segmentul de nucleu rezistent la pretează în intestinul insectei. Segmentul protoxină poate astfel să poarte 21 o specificitate parțială la insecte a toxinei prin limitarea accesibilității nucleului la insectă prin reducerea procesării de către pretează a moleculei toxinei (Haider, M.Z., B.H. Knowles, D.J. 23 Ellar [1986] Eur. J. Biochem 156:531-540) sau prin reducerea solubilității toxinei (Aronson,

A.I., E.S. Han, W. McGaughey, D. Johnson [1991] Appl. Environ. Microbiol. 57:981-986). 25

Nomenclatorul și schema de clasificare din 1989 ale lui Hofte și Whiteley s-au bazat atât pe secvența de aminoacizi dedusă cât și pe domeniul gazdei toxinei. Acest sistem a fost 27 adaptat să acopere 14 tipuri diferite de gene de toxine care au fost împărțite în cinci clase majore. A fost propusă o schemă de nomenclator revizuită, care se bazează doar pe 29 identitatea aminoacizilor (Crickmore și al. [1996] Society for Invertebrate Pathology, 29^tn Annual Meeting, lllrd International Colluquium on Bacillus thuringiensis, University of 31 Cordoba, Cordoba, Spania, Septembrie 1-6, 1999, rezumat). Mnemonica cry a fost menținută pentru toate genele de toxine cu excepția cytA și cytB, care au rămas o clasă 33 separată. Cifrele romane au fost schimbate cu cifre arabe în primul rang iar parantezele din rangul trei au fost eliminate. Limitele curente reprezintă aproximativ 95% (rangul trei), 75% 35 (rangul doi) și 48% (primul rang) identitate de secvențe. Multe dintre numele originale au fost menținute, deși o parte dintre ele au fost reclasificate. A se vedea de asemenea Revisions 37 of the Nomenclture for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins N. Crickmore,

D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum și D.H. Dean. 39 Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) voi. 62:807-813; și Crickmore, Zeigler, Feitelson, Schnepf, Van Rie, Lereclus, Baum și Dean Bacillus thuringiensis toxin 41 nomenclature (1999) http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt/index.html. Acest sistem utilizează aplicațiile software libere CLUSTAL W și PHYLIP. Aplicația NEIGHBOR din 43 pachetul PHYLIP utilizează un algoritm de medii aritmetice (UPGMA).

Izolarea noilor izolate de B.t. și a genelor de toxine ale acestora, cât și determinarea 45 domeniului precis al activității pesticide a toxinelor, a fost un proces empiric lent. Ca rezultat al cercetării extensive și al investițiilor în resurse, au fost depuse cerei de brevete pentru noi 47 izolate, toxine și gene de B.t. și pentru noi utilizări ale toxinelor și izolatelor B.t. cunoscute.

RO 122431 Β1

A se vedea pentru documentare și Feitelson ș/' al, supra. Totuși, descoperirea de noi izolate B.t. și noi utilizări ale izolatelor și toxinelor B.t. rămâne un domeniu imprevizibil, empiric.

Smulevitch și al. ([1991] FEBS Lett. 293:25-26), Gleave și al. ([1991] JCM 138:5562), și Shevelev și al. ([1993] FEBS Lett. 336:79-82) descriu caracterizarea toxinelor Cry9 active împotriva lepidopterelor. Lambert șz al. (Lambert, B., L. Buysse, C. Decock, S. Jansens, C. Piens, B. Saey, J. Seurinck, K. van Audenhove, J. Van Rie, A. Van Vliet, M. Peferoen [1996] Appl. Environ. Microbiol 62(1):80-86) și aplicațiile PCT publicatei WO 94/05771 și WO 94/24264 descriu de asemenea izolate B.t. și toxine Czy9C active împotriva dăunătorilor lepidoptere.

Brevetele US 5126133; 5188960; 5246852 și 5691308 dezvăluie o toxină Czy1 Fa și o genă (81 IA) din izolatul de B.t. PS81I. Brevetele US 5527883; 5508264; 5827514 și 5840554 se referă la toxine himerice C/ylF. WO 99/24581 dezvăluie diverse gene czylF optimizate pentru plante. Brevetul US 5686069 dezvăluie o toxină Czy1 Fb și o genă din izolat de B.t. PS91C2.

Odată cu folosirea tehnicilor de inginerie genetică, sunt în dezvoltare diverse abordări pentru livrarea toxinelor B.t. mediilor agricole. Clonarea și expresia unei gene de proteină cristalină de B.t. în Escherichia coli a fost descrisă în literatura publicată cu mai bine de 15 ani în urmă (Schnepf, H.E., H.R. Whiteley [1981] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:28932897). Brevetul US 4448885 și US 4467036 dezvăluie amândouă, expresia unei proteine B.t. cristaline în E. coli. Produsele B.t. pe bază de ADN recombinat au fost produse și aprobate pentru utilizare, inclusiv utilizarea plantelor modificate genetic cu gene B.t. pentru rezistența la insecte și utilizarea celulelor microbiene, stabilizate, drept purtători de livrare a proteinelor B.t. S-au realizat diverse îmbunătățiri prin modificarea toxinelor B.t. și/sau a genelor acestora. De exemplu, brevetele US 5380831 și 5567862 se referă la producerea de gene de proteină cristalină sintetice, cu activitate insecticidă care au o acțiune îmbunătățită în plante. Astfel, genele de endotoxine B.t. izolate încep să aibă valoare comercială.

Obstacolele pentru utilizarea cu succes a toxinelor B.t. includ dezvoltarea rezistenței la toxinele B.t. de către insecte. în plus, anumite insecte pot fi refractare la efectele B.t. Acestea din urmă includ insecte cum ar fi gărgărița capsulelor cu semințe și omizile care altă dată nu au demonstrat sensibilitate aparentă la majoritatea δ-endotoxinelor B.t.

Omizile trec prin mai multe stadii de larve. Deși mâncarea răsadurilor de către stadiile finale ale larvelor produce distrugerea cea mai evidentă și pierdere economică cea mai mare, hrănirea cu frunze are ca urmare de obicei pierderi în recolte cum ar fi cele de porumb. La atingerea stadiilor finale (trei către patru, de exemplu), larvele încep să taie plantele și părți din plante, în special lăstarii. Datorită deviațiilorîn comportamentul de hrănire, populații care provoacă distrugeri economice pot apărea pe neașteptate cu foarte puține semnale de avertizare înainte. Omizile mari pot distruge mai mulți lăstari pe zi și o infestare masivă poate elimina recolte întregi. Obiceiul nocturn al omizilor și comportamentul de a se îngropa în sol fac problematice de asemenea detectarea și tratamentul.

Buha semănăturilor (Agrotis ipsilon (Hufnagel); Lepidoptera: Noctuidae) este un dăunător serios al multor culturi incluzând porumb, bumbac, culturi de varză (Brassica, broccoli, verze, verze chinezești) și gazon. Plante gazdă secundare includ sfeclă, Capsicum (ardei), năut, fasole fabacee, salată verde, lucerna, ceapă, cartofi, ridichii, rapiță de toamnă (canola), orez, soia, căpșuni, sfeclă de zahăr, tutun, roșii și arbori de pădure. în America de Nord, dăunătorii de genul Agrotis se hrănesc cu trifoi, porumb, tutun, cânepă, ceapă, căpșuni, mure, zmeură, lucerna, orz, fasole, varză, ovăz, mazăre, cartofi, cartofi dulci, flori de grădină, iarbă, lucerna, porumb, asparagus, struguri, aproape orice fel de frunze, plante

RO 122431 Β1 și multe alte culturi și plante de grădină. Alte omizi din Tribe Agrotini sunt dăunători, în 1 particular aceia din genul Feltia (de exemplu F.jaculifera (Guenee); echivalente cu ducens subgothica) și Euxoa (de exemplu E. tessellata (Harris), E. scandens (Riley), E. auxiliaries 3 (Smith), E. detersa (Walker), E. tessellate (Harris), E. ochrogaster (Guenee). Omizile cum ar fi Peridroma saucia pot fi de asemenea dăunători semnificativi. Plantele de citrice, de 5 exemplu, pot fi de asemenea ținta atacurilor omizilor (omida citricelor Xylomyges curialis este un exemplu). 7

Omizile sunt de asemenea dăunători și în afara Americii de Nord și cei mai semnificativi dăunători din punct de vedere economic atacă năutul, grâul, legumele, sfecla, 9 lucerna, porumbul, cartofii, napii, rapița, salata verde, căpșunile, hibrizii de zmeură și mure, inul, bumbacul, soia, tutunul, sfecla, varza chinezească, roșiile, vinetele, trestia de zahăr, 11 pășunile, verzele, arahide, Cucurbita, napi, floarea soarelui, Brassica, ceapa, praz, țelina, susan, asparagus, revent, cicoare, culturi de seră și spanac. Buha semănăturilor A. ipsilon 13 apare ca dăunător în afara Americii de Nord, inclusiv în America Centrală, Europa, Asia, Australia, Africa, India, Taiwan, Mexic, Egipt și Noua Zeelandă. 15

Principalele specii de omizi din Argentina sunt Agrotis malefida, Porosagrotis gypaetiana și Agrotis ipsilon (scris de asemenea și ypsilon). Aceste omizi atacă, de exemplu, 17 culturile de porumb, soia și floarea soarelui. Aceste insecte pot reduce serios populația de răsaduri și, în cazurile de atacuri grave, pot distruge total parcele întregi. 19

Controlul culturilor pentru A. ipsilon cum ar fi controlul buruienilor periferice poate ajuta prevenirea infestărilor masive; totuși, asemenea metode nu sunt întotdeauna realizabile 21 sau eficiente. Infestările sunt foarte sporadice, iar aplicarea unui insecticid anterior plantării sau la plantare nu s-a dovedit eficientă în trecut. Sunt disponibile anumite momeli pentru 23 controlul omizilor din culturi. Pentru a proteja gazonul cum ar fi iarba vântului, s-au utilizat insecticide chimice. Utilizarea pesticidelor chimice este o preocupare particulară în zonele 25 acoperite cu gazon (de exemplu terenuri de golf, terenuri pentru atletism, parcuri sau alte zone de recreere, peisaje profesionale și terenuri domestice) datorită contactului apropiat pe 27 care oamenii îl au cu aceste zone. Produsele naturale (de exemplu nematode și azadiractină) au rezultate slabe în general. 29

Până în prezent, produsele din Bacillus thuringiensis pentru controlul dăunătorului buha semănăturilor nu au fost utilizate pe scară largă datorită lipsei eficienței. Comporta- 31 mentele de hrănire rapidă și îngropare a omizilor au făcut ca acestea să fie dificil de controlat cu soluții curente pentru dăunători pe bază de materiale biologice. De exemplu, toxinele 33 Czy1 A(b) sunt în esență ineficiente împotriva omizilor.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă în combaterea dăunătorilor în 35 stadiul de omizi din culturile ce pot fi afectate de aceștia.

Metoda de combatere a dăunătorilor în stadiul de omizi, conform invenției, înlătură 37 dezavantajele menționate mai sus prin aceea că, cuprinde aducerea în contact a dăunătorului menționat cu o toxină Cry1 F. 39 într-o realizare preferată, în metoda conform invenției, toxina menționată este o toxină Cry1 Fa sau o toxină trunchiată, toxina menționată aflându-se într-o celulă de plantă care a 41 produs toxina menționată și în care dăunătorul menționat vine în contact cu toxina menționată prin ingerarea celulei de plantă menționată. 43 în alte realizări preferate, în metoda conform invenției, dăunătorul în stadiul de omidă menționat este: din genul Agrotis, un Agrotis ipsilon, un Agrotis malefida, din genul 45 Porosagrotis, un Porosagrotis gypaetiana, din genul Xylomyges, un Xylomyges curialis, din Tribe Agrotini, din genul Feltia,un Feltia jaculifera, din genul Euxoa, un Euxoa messoria, un 47 Euxoa scandens, un Euxoa auxiliaries, un Euxoa detersa, un Euxoa tessellate, un Euxoa ochrogaster, din genul Peridroma, un Peridroma saucia. 49

RO 122431 Β1 într-o altă realizare preferată, în metoda conform invenției, planta menționată este o plantă de porumb, o plantă de floarea soarelui, o plantă de soia, o plantă de răpită de toamnă, o plantă de bumbac.

într-o altă realizare preferată, în metoda conform invenției, etapa de contactare este precedată de etapa de plantare a seminței unei plante care cuprinde o polinucleotidă ce codifică toxina menționată.

Prezenta invenție se referă la descoperirea surprinzătoare a faptului că proteinele CryîF sunt active împotriva omizilor cum ar fi cele de buha semănăturilor (Agrotis ipsilon). Astfel, prezenta invenție furnizează metode pentru controlul acestor dăunători, metodele menționate cuprinzând aducerea în contact a dăunătorilor menționați cu o cantitate de toxină de Bacillus thuringiensis cu activitate pesticidă care cuprinde cel puțin o porțiune cu activitate pesticidă a toxinei Cry1 F. Prin urmare, folosirea proteinelor complete, trunchiate și himerice Cry1F și genelor este inclusă în prezenta invenție. în alcătuiri preferate, toxina CrylF este o toxină CrylFa. Conform prezentei invenții pot fi utilizate proteinele Cry1 F sintetice și de tip natural. Astfel, utilizarea polinucleotidelor (și/sau a complementelor lor, de preferință complementele lor cu lungime totală) care hibridizează cu gene cry1F cunoscute, de preferință porțiunile care codifică toxina nucleu, sunt incluse în această invenție. în alcătuirile preferate sunt utilizate polinucleotîde optimizate pentru plante.

Prezenta invenție include utilizarea gazdelor transgenice incluzând gazde vegetale, cum arfi porumb, bumbac și floarea soarelui. într-o alcătuire preferată, prezenta invenție se referă la celule de plante transformate cu cel puțin o secvență de nucleotide a prezentei invenții, cum arfi celule de plante transformate, care exprimă proteine cu activitate pesticidă în țesuturile consumate de dăunătorii vizați. Asemenea transformare a plantelor poate fi realizată folosind tehnici binecunoscute specialiștilor din domeniu și, în mod obișnuit, implică modificarea genei pentru a optimiza expresia toxinei în plante.

Fig. 1 arată masa de răsaduri intacte de grâu și evaluarea relativă a distrugerilor la 24 ore după infestarea cu larve de buha semănăturilor în stadiul 4 și după diverse tratamente.

Fig. 2 arată greutățile răsadurilor de porumb infestate cu larve de buha semănăturilor în stadiul 3, la 48 ore după infestare și după diverse tratamente.

Fig. 3 și 4 ilustrează rezultatele discutate în Exemplul 4.

SECV ID NR:1 este o secvență de polinucleotîde pentru o genă hibrid crylF/crylA(b) de lungime totală, optimizată pentru plante, denumită 1F1AB-PO.

SECV ID NR:2 este o secvență de aminoacizi pentru o toxină himerică CrylF/CrylA(b) de lungime totală, optimizată pentru plante. Gena 1F1AB-PO codifică această toxină.

SECV ID NR:3 este o secvență de polinucleotîde pentru o genă crylF trunchiată, optimizată pentru plante, denumită 1F-T-PO.

SECV ID NR:4 este o secvență de aminoacizi pentru o toxină trunchiată, optimizată pentru plante CrylF. Genele denumite 1F-T-PO, 1F-7G-PO și 1F-7Z-PO codifică această toxină.

SECV ID NR:5 este secvența nativă de polinucleotîde a genei toxinei B.t. de tip natural, de lungime totală, denumită 81 IA (crylFa).

SECV ID NR:6 este secvența de aminoacizi a toxinei de lungime totală, de tip natural B.t. denumită 81 IA (CrylFa).

SECV ID NR:7 este o secvență de polinucleotîde pentru o genă denumită 1F-7G-PO care este optimizată pentru a se exprima în bumbac.

SECV ID NR:8 este o secvență de polinucleotîde pentru o genă denumită 1F-7Z-PO, care este optimizată pentru a se exprima în porumb.

RO 122431 Β1

Prezenta invenție se referă la descoperirea surprinzătoare că proteinele Cry1 F sunt 1 active împotriva omizilor cum ar fi cele de buha semănăturilor (Agrotis ipsilon). în particular, surprinzătoare sunt descoperirile că larvele de stadiul 3 sau mai mare, sunt controlate de 3 către toxinele și genele conform prezentei invenții. Controlul larvelor de omizi de stadiul întâi și al doilea este mai puțin important decât controlul stadiilor finale. Deși era cunoscut că 5 toxinele Cryl sunt active împotriva lepidopterelor în general, se credea că omizile sunt recalcitrante la toxine B.t. în general, așa cum s-a discutat mai detaliat anterior. 7

Prezenta invenție include utilizarea gazdelor recombinate și asigură secvențe de polinucleotide optimizate pentru plante. Aceste secvențe de polinucleotide includ gene 9 optimizate pentru plante, denumite 1F1AB-PO, 1F-T-PO, 1F-7G-PO și 1F-7Z-PO. Aceste gene sunt dezvăluite în WO 99/24581. Gazde vegetale preferate includ porumb, soia, 11 bumbac, grâu, rapiță de toamnă și floarea soarelui.

în anumite alcătuiri ale prezentei invenții, genele codifică o toxină CrylF care este 13 trunchiată comparativ cu toxina de lungime totală C/ylF. Toxinelor trunchiate ale prezentei invenții le lipsește de obicei tot sau o porțiune din segmentul protoxină. De asemenea, 15 genele trunchiate prezentate aici pot fi folosite pentru producerea de gene himerice și proteine. Un exemplu este gena optimizată pentru plante care cuprinde o porțiune crylF și 17 o porțiune crylA(b), în care gena hibridă codifică o toxină himerică. Genele și toxinele himerice preferate sunt dezvăluite în brevetele US 5527883 și 5840554. Alte gene și toxine 19 himerice care pot fi utilizate conform prezentei invenții sunt dezvăluite în brevetele US 5508264 și 5827514. într-o alcătuire preferată, porțiunea CrylF a toxinei himerice are ea 21 însăși activitate pesticidă. Toxinele de fuziune pot fi de asemenea utilizate conform prezentei invenții. 23 într-o alcătuire preferată, prezenta invenție se referă la celule de plante transformate cu cel puțin o secvență de polinucleotide astfel încât celulele de plante transformate exprimă 25 toxinele cu activitate pesticidă în țesuturi consumate de dăunătorii vizați, care astfel iau contact cu proteina cu activitate pesticidă. Asemenea transformare a plantelor poate fi 27 realizată folosind tehnici binecunoscute specialiștilor în domeniu, și de obicei implică modificarea genei pentru a optimiza expresia toxinei în plante. 29

Trebuie să fie evident unui specialist în domeniu, că date fiind secvențele genelor prezentate aici, genele prezentei invenții pot fi obținute prin mai multe mijloace. în alcătuiri 31 preferate, genele prezentei invenții de exemplu, pot fi construite sintetic prin folosirea unui sintetizator de gene. Genele specifice exemplificate aici, pot fi de asemenea obținute prin 33 modificarea, conform prezentei invenții, a anumitor gene de tip natural (de exemplu, prin tehnici de mutație punctiformă) din anumite izolate depozitate într-un depozit de culturi așa 35 cum este prezentat mai jos. De exemplu, o genă crylF de tip natural poate fi obținută din izolat B.t. PS811. De asemenea, porțiunile crylA(b) ale genelor hibride ale prezentei invenții 37 pot fi produse sintetic sau pot fi derivate prin modificarea genelor de tip natural. Toxinele și genele C/ylA(b) au fost descrise de exemplu, în Hofte și al. (1986) Eur. J. Biochem. 161:273; 39

Geiser și al. (1986) Gene 48:109; și Haider și al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10927. Clonele și izolatele de tip natural adiționale au fost discutate mai detaliat, anterior și în lista 41 de mai jos.

Culturile discutate în această cerere au fost depozitate, în conformitate cu tratatul de 43 la Budapesta, la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL, Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, SUA. 45 Tulpinile depozitate listate mai jos sunt dezvăluite în brevetele de referință discutate mai sus.

RO 122431 Β1

Subcultură	Număr de acces	Data de depozit
B.t. PS81I	NRRL B-18484	19 aprilie 1989
E. coli (NM522)(pMYC1603) (81 IA)	NRRL B-18517	30 iunie 1989

Trebuie înțeles că disponibilitatea unui depozit nu constituie un permis pentru punerea în practică a prezentei invenții în derogarea drepturilor brevetului acordat prin acțiune guvernamentală.

Gene și toxine. Polinucleotidele prezentei invenții pot fi utilizate pentru a forma gene complete pentru a codifica proteine sau peptide într-o celulă gazdă dorită. De exemplu, așa cum vor recunoaște specialiștii din domeniu, unele dintre polinucleotidele din lista de secvențe atașată sunt arătate fără codonii stop. De asemenea, polinucleotidele prezentei invenții pot fi plasate în mod adecvat sub controlul unui promotor într-o gazdă de interes, așa cum este știut în domeniu.

Așa cum vor recunoaște specialiștii din domeniu, ADN-ul există de obicei într-o formă dublu catenară. în această dispunere, o catenă este complementară celeilalte catene și viceversa. Pe măsură ce ADN-ul este replicat într-o plantă (de exemplu) adițională, sunt produse catene complementare ale ADN-ului. Astfel, prezenta invenție include utilizarea polinucleotidelor exemplificate arătate în lista de secvențe atașată și catenele complementare ale acestora. Catena de codificare este adesea utilizată în domeniu pentru a se referi la catena care se leagă cu catena anti-sens. Pentru a exprima o proteină in vivo, o catenă a ADN-ului este de obicei transcrisă într-o catenă complementară de ARNm, care este utilizată ca matriță pentru translația proteinei. ARNm este transcris de fapt din catena anti-sens a ADN-ului. Catena sens sau de codificare are o serie de codoni (un codon reprezintă trei nucleotide care pot fi citite toate trei în același timp pentru a produce un aminoacid particular) care poate fi citit ca un cadru de citire deschis (ORF) pentru a forma o proteină sau peptidă de interes. ARN și ANP (acizi nucleici peptidici) care sunt echivalent funcționali cu ADN-ul exemplificat sunt incluse în prezenta invenție.

De exemplu, genele și toxinele prezentei invenții pot fi identificate, obținute și caracterizate prin utilizarea probelor de oligonucleotide. Probele sunt secvențe de nucleotide detectabile. Polinucleotidele exemplificate în mod specific ale prezentei invenții, inclusiv porțiuni ale acestora care sunt suficiente pentru a codifica o toxină activă, pot fi ele însele utilizate ca probe. Probele pot fi ADN, ARN sau ANP (acizi nucleici peptidici). Aceste secvențe pot fi detectabile în virtutea unei etichete adecvate incluzând sau fiind inerente făcute fluorescente, de exemplu, așa cum este descris în cererea internațională WO 93/16094. Așa cum este binecunoscut în domeniu, dacă molecula de probă și mostra de acid nucleic hibridizează prin formarea unei legături puternice între cele două molecule, se poate presupune în mod rezonabil că proba și mostra au o omologie substanțială. De preferință, hibridizarea este condusă în condiții de stringență prin tehnici binecunoscute în domeniu, așa cum sunt descrise de exemplu, în Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, NY, pag. 169-170. De exemplu, așa cum este afirmat aici, condițiile de hibridizare de înaltă stringență pot fi realizate mai întâi printr-o spălare cu 2xSSC (citrat salin standard)/0,1% SDS (sulfat dodecil de sodiu) timp de 15 min la temperatura camerei. Sunt realizate de obicei două spălări. Exigența poate fi realizată prin reducerea concentrației de sare și/sau prin ridicarea temperaturii. De exemplu, etapa de hibridizare de mai sus poate fi urmată de spălarea cu 0,1xSSC/0,1% SDS timp de 15 min la temperatura camerei, care la rândul ei poate fi urmată de spălarea cu 0,1xSSC/0,1% SDS timp de 30 minute la 55°C. Temperaturile folosite pentru aceste etape pot fi de asemenea

RO 122431 Β1 folosite cu alte protocoale discutate aici (unde se folosește SSPE în loc de SSC de exemplu), 1 așa cum este cunoscut în domeniu. 2xSSC/0,1 % SDS poate fi preparată prin adăugarea de 50 ml de 20xSSC și 5 ml de SDS 10% în 445 ml de apă. 20xSSC poate fi preparată prin 3 combinarea NaCI (175,3 g/0,150 M), citrat de sodiu (88,2 g, 0,015 M) și apă până la 1 litru, urmată de ajustarea pH-ului la 7,0 cu NaOH 10 N. SDS 10% poate fi preparată prin 5 dizolvarea a 10 g de SDS în 50 ml de apă autoclavizată, diluare la 100 ml și alicotare.

Detectarea probei asigură un mijloc pentru determinarea într-un mod cunoscut a 7 faptului că hibridizarea a avut loc. O asemenea analiză a probei asigură o metodă rapidă pentru identificarea genelor care codifică toxina prezentei invenții. Segmentele de nucleotide 9 care sunt folosite ca probe conform invenției pot fi sintetizate folosind un sintetizator de ADN și proceduri standard. 11

Așa cum este utilizat aici, condiții stringente pentru hibridizare se referă la condiții care realizează același sau aproximativ același grad de specificitate al hibridizării ca și 13 condițiile utilizate de solicitanții curenți. în mod specific, hibridizarea ADN-lui imobilizat pe Southern blot cu probe specifice genelor marcate cu 32P, a fost realizată prin metode 15 standard (Maniatis, T., E.F. Fritsch, J, Sambrook [1982] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). în general, hibridizarea 17 și spălările ulterioare au fost realizate în condiții stringente care au permis detectarea secvențelor țintă. Pentru probele de gene de ADN dublu catenar, hibridizarea a fost realizată 19 peste noapte la 20-25°C sub temperatura de topire (Tm) a hibridului ADN în 6xSSPE, 5x soluția lui Denhardt, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml ADN denaturat. Temperatura de topire este 21 descrisă de către formula următoare (Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas și F.C. Kafatos [1983] Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman și K. Moldave, 23 Academic Press, New York 100:266-285).

Tm = 81,5°C + 16,6 Log[Na+] + 0,41(%G+C) - 0,61(%formamidă) - 600/lungimea 25 duplex în perechi de baze.

Spălările sunt realizate de obicei după cum urmează: 27 (1) De două ori la temperatura camerei timp de 15 min în IxSSPE, 0,1% SDS (spălare de stringență redusă). 29 (2) O dată la Tm-20°C timp de 15 min în 0,2xSSPE, 0,1 % SDS (spălare de stringență moderată). 31

Pentru probele de oligonucleotidă, hibridizarea, a fost realizată peste noapte la 1020°C sub temperatura de topire (Tm) a hibridului în 6xSSPE, 5x soluția lui Denhardt, 0,1% 33

SDS, 0,1 mg/ml ADN denaturat. Tm pentru probele de oligonucleotide a fost determinată cu formula următoare: 35

Tm(°C) = 2(număr T/A perechi de baze) + 4 (număr G/C perechi de baze) (Suggs,

S.V., T. Miyake, E.H. Kawashime, M.J. Johnson, K. Itakura și R.B. Wallace [1981] ICN-UCLA 37

Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes, D.D. Brown, Academic Press, New York, 23:683693). 39

Spălările s-au realizat în mod obișnuit după cum urmează:

(1) De două ori la temperatura camerei timp de 15 min în IxSSPE, 0,1% SDS 41 (spălare de stringență redusă).

(2) O dată la temperatura de hibridizare timp de 15 min în IxSSPE, 0,1% SDS 43 (spălare de stringență moderată).

Modificarea genelor și a toxinelor. Toxinele și genele utile conform prezentei 45 invenții includ nu numai secvențele specific exemplificate, ci și porțiuni și/sau fragmente (inclusiv deleții interne sau/și terminale în comparație cu proteinele cu lungime totală), 47 variante, mutanți, substitute (proteine care au aminoacizi substituiți), proteine de fuziune și

RO 122431 Β1 himerice care păstrează caracteristicile activității pesticide ale proteinelor exemplificate în mod specific aici. Așa cum sunt folosiți aici, termenii variante sau variații ale genelor se referă la secvențe de nucleotîde care codifică aceleași toxine sau care codifică toxine echivalente care au activitate pesticidă. Așa cum este utilizat aici, termenul toxine echivalente se referă la toxine care au aceeași sau esențial aceeași activitate pesticidă față de dăunătorii vizați ca și toxinele revendicate.

Genele pot fi modificate, iar variațiile genelor pot fi ușor construite, folosind tehnici standard. De exemplu, tehnicile pentru realizarea mutațiilor punctiforme sunt binecunoscute în domeniu. De asemenea, brevetul US 5605793 descrie metode pentru generarea de diversitate moleculară adițională prin folosirea de reasamblare de ADN după fragmentarea aleatoare. Fragmentele de gene de lungime totală pot fi realizate folosind endonucleaze disponibile comercial, iar exonucleazele pot fi folosite conform tehnicilor standard. De exemplu, enzimele cum ar fi 6a/31 sau mutageneză direcționată către situs, pot fi utilizate pentru a decupa sistematic nucleotîde de la capetele acestor gene. De asemenea, genele care codifică fragmente active pot fi obținute folosind o varietate de enzime de restricție. Proteazele pot fi folosite direct pentru a obține fragmente active ale acestor toxine.

Toxinele echivalente și/sau genele care codifică aceste toxine echivalente pot fi derivate din izolate B.t. și/sau bănci de ADN folosind noțiunile furnizate aici. Există un număr de metode pentru obținerea toxinelor cu activitate pesticidă ale prezentei invenții. De exemplu, anticorpii anti-toxine cu activitate pesticidă dezvăluite și revendicate aici pot fi utilizate pentru a identifica și izola alte toxine dintr-un amestec de proteine. în mod specific, anticorpii pot fi crescuți la porțiunile toxinelor care sunt cel mai constante și distincte de alte toxine B.t. Acești anticorpi pot fi apoi folosiți pentru a identifica in mod specific toxine echivalente cu activitate caracteristică prin imunoprecipitare, testul cu anticorpi adsorbiți legați de enzime (ELISA), sau Western blotting. Anticorpii anti-toxine dezvăluiți aici, sau ai toxinelor echivalente, sau fragmentelor acestortoxine, potfi preparați ușor folosind proceduri standard din acest domeniu. Genele care codifică aceste toxine pot fi obținute apoi din microorganism.

Datorită redundanței codului genetic, o varietate de secvențe ADN diferite pot codifica aceleași secvențe de aminoacizi. Este la îndemâna unui specialist din domeniu să creeze aceste secvențe ADN alternative care codifică aceleași, sau esențial aceleași toxine. Aceste variante de secvențe ADN sunt în cuprinsul prezentei invenții. Așa cum este utilizată aici, referința la secvența esențial aceeași se referă la secvențe care au substituții, deleții, adiții sau inserții de aminoacizi care nu afectează material activitatea pesticidă. Fragmentele care păstrează activitatea pesticidă sunt de asemenea incluse în această definiție.

Toxinele echivalente vor avea similaritate de aminoacizi (și/sau omologie) cu o toxină exemplificată. Identitatea/similaritatea aminoacizilor va fi în mod obișnuit mai mare de 60%, de preferință mai mare de 75%, și mai preferat mai mare de 80%, chiar și mai preferat mai mare de 90%, și poate fi mai mare de 95%. Polinucleotidele și proteinele preferate ale prezentei invenții pot fi de asemenea definite în termeni de domenii de identitate și/sau similaritate mai particulare. De exemplu, identitatea și/sau similaritatea pot fi 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, sau 99% comparativ cu o secvență exemplificată aici. Dacă nu se specifică altfel, așa cum este utilizat aici, procentul de identitate și/sau similaritate a secvenței a doi acizi nucleici este determinat folosind algoritmul lui Karlin și Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificat ca în Karlin și Mschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Un asemenea algoritm este incorporat în programele NBLAST și XBLAST ale lui Altschul și al.

RO 122431 Β1 (1990), J. Mol. Biol. 215:402-410. Căutările de nucleotide BLAST sunt realizate cu programul NBLAST, scor=100, lungime cuvânt=12, pentru a obține secvențe de nucleotide cu procentul de identitate dorit. Pentru a obține alinieri spațiate în scopuri comparative, se folosește Gapped BLAST așa cum este descris în Altschul ș/' al. (1997) Nuci. Acids Res. 25:33893402. Atunci când se utilizează programele BLAST și Gapped BLAST, sunt folosiți parametrii impliciți ai programelor respective (NBLAST Șl XBLAST). A se vedea http://www.ncbi.nih.gov. Scorurile pot fi de asemenea calculate folosind metodele și algoritmii lui Crickmore și al. așa cum este descris mai sus.

Omologia aminoacizilor va fi cel mai ridicată în regiunile critice ale toxinei care contează pentru activitatea biologică sau sunt implicate în determinarea configurației tridimensionale, care, în ultimă instanță, este răspunzătoare pentru activitatea biologică. în această privință, sunt acceptabile anumite substituții de aminoacizi și pot fi de așteptat dacă aceste substituții sunt în regiuni care nu sunt critice pentru activitate sau sunt substituții conservatoare de aminoacizi care nu afectează configurația tridimensională a moleculei. De exemplu, aminoacizii pot fi plasați în clasele următoare: non-polari, neîncărcați polar, bazică și acidă. Substituțiile conservatoare în care un aminoacid dintr-o clasă este înlocuit cu alt aminoacid de același tip sunt în întinderea prezentei invenții atâta timp cât substituția nu modifică material activitatea biologică a compusului. Tabelul 1 furnizează o listă de exemple de aminoacizi care aparțin fiecărei clase.

Tabelul 1

Clasa de aminoacid	Exemple de aminoacizi
Non-polari	Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
Neîncărcați polar	Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin
Acizi	Asp, Glu
Bazici	Lys, Arg, His

în anumite cazuri, se pot face de asemenea substituții neconservatoare. Factorul critic este acela că aceste substituții nu trebuie să devieze semnificativ de la capacitatea plantelor de a exprima secvențele ADN ale prezentei invenții sau de la activitatea biologică a toxinei.

Așa cum este folosit aici, referirea la polinucleotide izolate și/sau toxine purificate se referă la acele molecule atunci când ele nu sunt asociate cu alte molecule cu care ele ar fi găsite în natură; aceasta va include utilizarea lor în plante. Astfel, referirea la izolate și/sau “purificate” semnifică implicarea mâinii omenești, așa cum s-a descris aici.

Deși prezenta invenție prevede alcătuiri specifice ale genelor sintetice, alte gene care sunt funcțional echivalente cu genele exemplificate aici pot fi folosite pentru a transforma gazdele, de preferință gazde vegetale. Un ghid suplimentar pentru producerea de gene sintetice poate fi găsit în brevetul US 5380831.

Gazde recombinate. Genele care codifică toxinele prezentei invenții pot fi introduse într-o largă varietate de gazde microbiene sau plante. în alcătuirile preferate, expresia genei toxinei are ca urmare, direct sau indirect, producerea intracelulară și menținerea pesticidelor. Atunci când celulele gazdă transgenice/recombinate/ transformate sunt ingerate de dăunători, dăunătorii vor ingera toxina. Acesta este modul preferat în care se realizează contactul dintre dăunător și toxină. Rezultatul este un control (uciderea sau îmbolnăvirea) al dăunătorului.

în anumite alcătuiri ale prezentei invenții, gazdele microbiene transformate pot fi folosite în etapele preliminare pentru prepararea precursorilor, de exemplu, care vorfi utilizați în final pentru a transforma, în alcătuirile preferate, celule de plante astfel încât acestea să

RO 122431 Β1 exprime toxinele codificate de genele prezentei invenții. Microbii transformați și folosiți în acest mod sunt în cuprinsul prezentei invenții. Microbii recombinați potfi, de exemplu, B.t., E. coli., sau Pseudomonas.

Producerea de diverse organisme recombinate poate fi realizată de specialiștii din domeniu folosind tehnici standard. Materialele necesare pentru aceste transformări sunt dezvăluite aici sau sunt disponibile oricum cu ușurință specialiștilor din domeniu. O mare varietate de metode sunt disponibile pentru introducerea genei B.t. care codifică o toxină întro gazdă țintă, în condiții care permit o menținere stabilă și a expresiei genei. Aceste metode sunt binecunoscute specialiștilor din domeniu și sunt descrise, în brevetul US 5135867, care este dat aici ca referință.

Genele care codifică toxina prezentei invenții pot fi introduse, prin intermediul unui vector adecvat, într-o mare varietate de gazde vegetale și microbiene. Există multe culturi de interes, cum arfi porumb, grâu, orez, bumbac, soia și floarea soarelui. Anumite gene ale prezentei invenții sunt, în particular, adecvate pentru asigurarea menținerii stabile și expresiei, în plantele transformate, a genei care exprimă pesticidul polipeptidic și, de dorit, să asigure protecție îmbunătățită a pesticidului față de degradarea mediului și inactivare. Expresia genei toxinei are ca urmare, direct sau indirect, producerea intracelulară și menținerea proteinelor pesticide. Astfel, dăunătorul vizat poate lua contact cu proteinele cu activitate pesticidă prin ingestia țesutului de plantă care conține proteinele cu activitate pesticidă, care sunttoxice pentru dăunător. Rezultatul este controlul dăunătorului. Alternativ, zonei dăunătorului îi pot fi aplicate gazde microbiene, de exemplu Pseudomonas fluorescens, unde unele dintre ele pot prolifera și sunt ingerate de către dăunătorii vizați. Microbul care găzduiește gena toxinei poate fi tratat în condiții care prelungesc activitatea toxinei și stabilizează celula. Celula tratată, care păstrează activitatea toxică, poate fi apoi aplicată mediului dăunătorului vizat.

Acolo unde gena toxinei B.t. este introdusă prin intermediul unui vector adecvat într-o gazdă microbiană, și gazda menționată este aplicată mediului într-o stare in vivo, trebuie folosite anumite gazde microbiene. Gazdele microorganisme care sunt selectate sunt cunoscute ca ocupând fitosfera (filoplanul, filosfera, rizosfera și/sau rizoplanul) uneia sau mai multor culturi de interes. Aceste microorganisme sunt selectate astfel încât să fie capabile de a fi competitive cu succes într-un mediu particular (cultură și alte habitate ale insectelor) cu microorganismele de tip natural, să asigure o menținere stabilă și expresia genei care exprimă pesticidul polipeptidic, și, de dorit, să asigure o protecție îmbunătățită a pesticidului față de degradarea mediului și inactivare.

Este cunoscut un mare număr de microorganisme care trăiesc în filoplan (suprafața frunzei plantelor) și/sau rizosfera (solul care înconjoară rădăcinile plantelor) a unei mari varietăți de culturi importante. Aceste microorganisme includ bacterii, alge și ciuperci. De un interes particular sunt microorganismele cum ar fi bacteriile, de exemplu genurile Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc și Alcaligenes; ciuperci, în particular drojdii, de exemplu genurile Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Phodotorula și Aureobasidium. De interes particular sunt acele specii de bacterii din fitosfera cum ar fi Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus și Azotobacter vinlandir,

RO 122431 Β1 și specii de drojdii din fitosferă cum ar fi Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. 1 aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae și 3 Aureobasidium pollulans. De interes particular sunt microorganismele pigmentate.

O largă varietate de căi sunt disponibile pentru introducerea unei gene B.t. care 5 codifică o toxină în gazda vizată, în condiții care permit o menținere stabilă și expresia genei.

Aceste metode sunt binecunoscute specialiștilor din domeniu și sunt descrise, în brevetul 7 US 5135867 care este dat aici ca referință.

I

Tratarea celulelor. Așa cum s-a menționat mai sus, celulele B.t. sau celulele 9 recombinate care exprimă o toxină B.t. pot fi tratate pentru a prelungi activitatea toxinei și a stabiliza celula. Microcapsulă de pesticid care se formează cuprinde toxina B.t. într-o 11 structură celulară care a fost stabilizată și va proteja toxina atunci când microcapsulă este aplicată mediului dăunătorului vizat. Celulele gazdă adecvate includ atât procariote cât și 13 eucariote, fiind limitate în mod normal la acele celule care nu produc substanțe toxice organismelor superioare, cum ar fi mamiferele. Totuși, organismele care produc substanțe 15 toxice pentru organismele superioare pot fi folosite, acolo unde substanțele toxice sunt instabile sau nivelul de aplicare suficient de redus încât să se evite posibilitatea de toxicitate 17 pentru o gazdă mamifer. Drept gazde, de interes particular vor fi procariotele și eucariotele inferioare, cum ar fi ciupercile. 19

Celulele vor fi în mod obișnuit intacte și vor fi substanțial în forma proliferativă atunci când vor fi tratate, decât în formă de spori, deși în anumite situații pot fi utilizați sporii. 21

Tratarea celulei microbiene, de exemplu un microb care conține gena toxinei B.t. poate fi făcută prin mijloace chimice sau fizice, sau printr-o combinație de mijloace fizice 23 și/sau chimice, atâta timp cât tehnica nu afectează negativ proprietățile toxinei, nici nu diminuează capacitatea celulară de protecție a toxinei. Exemple de reactanți chimici sunt 25 agenții de halogenare, în particular halogenii cu număr atomic 17-80. în particular, poate fi folosit iod în condiții blânde și suficient timp pentru a realiza rezultatele dorite. Alte tehnici 27 adecvate includ tratamentul cu aldehide, cum arfi glutaraldehida; anti-infecțioase cum arfi clorură de zefiran și clorură de cetilpiridin; alcooli, cum ar fi izopropil și etanol; diverși fixativi 29 histologici, cum ar fi iod Lugol, fixativ Bouin, diverși acizi și fixativ Helly (a se vedea Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman și Comp., 1967); sau o 31 combinație de agenți fizici (căldura) și chimici care păstrează și prelungesc activitatea toxinei produsă în celulă atunci când celula este administrată mediului gazdă. Exemple de mijloace 33 fizice sunt radiația cu lungime de undă joasă, cum ar fi radiația gamma și radiația X, înghețarea, iradierea cu UV, liofilizarea și altele asemănătoare. Metodele pentru tratarea 35 celulelor microbiene sunt dezvăluite în brevetele US 4,695,455 și 4,695,462 care sunt date aici ca referință. 37

Celulele vor avea în general stabilitate structurală îmbunătățită, ceea ce va îmbunătăți rezistența la condițiile de mediu. Acolo unde pesticidul este într-o formă 39 prematură, metoda de tratare a celulei trebuie selectată astfel încât să nu inhibe procesarea formei premature către forma matură a pesticidului prin patogenul dăunătorului vizat. De 41 exemplu, formaldehida va reticula proteine și ar putea inhiba procesarea formei premature unui pesticid polipeptidic. Metoda de tratament trebuie să rețină cel puțin o porțiune 43 substanțială din biodisponibilitatea sau bioactivitatea toxinei.

Caracteristicile de interes particular în selectarea unei celule gazdă în scopul 45 producției, includ ușurința introducerii genei B.t. în gazdă, disponibilitatea sistemelor de expresie, eficacitatea expresiei, stabilitatea pesticidului în gazdă și prezența capacităților 47 genetice auxiliare. Caracteristicile de interes pentru utilizarea ca microcapsulă de pesticid

RO 122431 Β1 includ calități protectoare pentru pesticid, cum ar fi pereți celulari groși, pigmentare și împachetare intracelulară sau formarea de corpuri de incluziuni; supraviețuirea în medii apoase; lipsa toxicității față de mamifere; atractivitatea pentru dăunători în scopul ingerării; ușurința de ucidere și fixare fără deteriorarea toxinei; și altele asemănătoare. Alte considerații includ ușurința formulării și manipulării, considerente economice, stabilitate de stocare și altele asemănătoare.

Creșterea celulelor. Gazda celulară care conține gena cu activitate insecticidă B.t. poate fi crescută în orice mediu nutritiv convenabil, de preferință acolo unde construcția ADN asigură un avantaj selectiv, asigurând un mediu selectiv astfel încât substanțial toate sau toate celulele să rețină gena B.t.. Aceste celule pot fi apoi recoltate în conformitate cu metodele convenționale. Alternativ, celulele pot fi tratate anterior recoltării.

Celulele B.t. ale invenției pot fi cultivate folosind medii și tehnici de fermentare standard în domeniu. La completarea ciclului de fermentare, bacteriile pot fi recoltate, separând mai întâi sporii B.t. și cristalele din zeama de fermentare prin mijloace binecunoscute în domeniu. Sporii B.t. recuperați și cristalele pot fi formulate într-o pudră cu capacitate de umezire, concentrat lichid, granule sau alte formulări prin adăugarea de surfactanți, dispersanți, purtători inerți și alte componente pentru a facilita manipularea și aplicarea pentru dăunători particulari vizați. Aceste formulări și proceduri de aplicare sunt binecunoscute în domeniu.

Formulări. Granulele formulate sub formă de momeală care conțin un element care le face atractive și spori și cristale de izolate B.t., sau microbi recombinați care cuprind genele ce pot fi obținute din izolate B.t. dezvăluite aici, pot fi aplicate pe sol. Produsul formulat poate fi de asemenea aplicat sub formă de înveliș al seminței sau tratament al rădăcinilor sau tratament total al plantei în stadii târzii ale ciclului de cultură. Tratamentele plantei și ale solului cu celule B.t. pot fi utilizate ca pudre cu capacitate de umezire, granule sau prafuri, prin amestecarea cu diverse materiale inerte, cum ar fi minerale anorganice (filosilicați, carbonați, sulfați, fosfați și altele asemănătoare) sau materiale botanice (coceni măcinați, coji de orez, coji de nucă, și altele asemănătoare). Formulările pot include adjuvanți de împrăștiere și aderență, agenți de stabilizare, alți aditivi cu activitate pesticidă, sau surfactanți. Formulările lichide pot fi apoase sau neapoase și utilizate ca spume, geluri, suspensii, concentrate emulsifiabile sau altele asemănătoare. Ingredientele pot include agenți reologici, surfactanți, emulsifianți, dispersanți sau polimeri.

Așa cum va fi apreciat de către un specialist în domeniu, concentrația activității pesticide va varia larg în funcție de natura formulării particulare, în particular dacă este un concentrat sau dacă se va utiliza direct. Pesticidul va fi prezent cel puțin 1% în greutate și poate fi 100% în greutate. Formulările uscate vor avea aproximativ 1-95% în greutate din pesticid în timp ce formulările lichide vor fi în general de la aproximativ 1-60% în greutate din solide în fază lichidă. Formulările vor avea în general de la aproximativ 10² până la aproximativ 10⁴ celule/mg. Aceste formulări vor fi administrate la aproximativ 50 mg (lichid sau uscat) până la 1 kg sau mai mult la hectar.

Formulările pot fi aplicate mediului dăunătorului, de exemplu solului sau frunzelor prin pulverizare, prăfuire, stropire sau altele asemănătoare.

Mutanți. Mutanții izolatelor invenției pot fi realizați prin proceduri binecunoscute în domeniu. De exemplu, un mutant nesporogen poate fi obținut prin mutageneza cu etilmetan sulfonat (EMS) a unui izolat. Mutanții pot fi realizați folosind lumină utltravioletă și nitrozoguanidină prin proceduri binecunoscute în domeniu.

Un mic procent din mutanții nesporogeni vor rămâne intacți și nu vor liza pe perioade extinse de fermentație; aceste tulpini sunt denumite liză minus (-). Tulpinile liză minus pot fi identificate prin sortarea mutanților nesporogeni în medii în recipiente agitate și selectarea

RO 122431 Β1 acelor mutanți care sunt intacți și conțin cristalele de toxină la sfârșitul fermentației. Tulpinile 1 liză minus sunt adecvate pentru un proces de tratarea a celulelor care va produce o proteină de toxină, încapsulată, protejată. 3

Pentru a prepara o variantă rezistentă a fagelor, a mutantului nesporogen menționat, o alicotă a lizatului de fage este împrăștiată pe agar nutritiv și este lăsată să se usuce. O 5 alicotă a tulpinei bacteriene sensibilă la fage este apoi pusă peste Uzatul uscat și este lăsată să se usuce. Plăcile sunt incubate la 30°C. Plăcile sunt incubate timp de 2 zile și, în acel 7 moment, pe agar potfi văzute crescând numeroase colonii. Unele dintre aceste colonii sunt adunate și subcultivate pe plăci de agar nutritiv. Aceste culturi aparent rezistente sunt testate 9 la rezistență prin încrucișare cu lizatul de fage. O linie a lizatului de fage este întinsă pe placă și lăsată să se usuce. Culturile prezumtiv rezistente sunt întinse apoi încrucișat peste lizatul 11 de fage. Culturile bacteriene rezistente nu vor prezenta liză nicăieri în linia încrucișată cu lizatul de fage după incubarea peste noapte la 30°C. Rezistența la fage este apoi 13 reconfirmată prin placarea unui strat de cultură rezistentă pe o placă de agar nutritiv. Tulpina sensibilă este de asemenea placată în același mod pentru a servi drept control pozitiv. După 15 uscare, o picătură din lizatul de fage este plasată în centrul plăcii și lăsată să se usuce. Culturile rezistente nu au prezentat liză în zona unde lizatul de fage a fost plasat după 17 incubarea la 30°C timp de 24 de ore.

în continuare sunt date 5 exemple care ilustrează procedurile pentru punerea în 19 practică a invenției. Aceste exemple nu trebuie considerate ca fiind limitative.

Exemplul 1. Testarea biologică a Cry1F împotriva larvelor de buha semănăturilor 21 (Agrotis ipsilon; Lepidoptere: Noctuidae)

Activitatea biologică a Cry1 F împotriva larvelor de buha semănăturilor (BCW) a fost 23 determinată utilizând proceduri de testare biologică standard folosind preparate liofilizate, sub formă de pudră de MR872 (o clonă de Pseudomonas fluorescens care exprimă o genă 25 himerică cry1 Fa/cry1 Ab dezvăluită în brevetul US 5,840,554). Testele biologice BCW au fost conduse prin incorporarea mostrelor de test într-o dietă artificială și testarea larvelor cu dieta 27 tratată și netratată. Toate testele au fost conduse cu dietă artificială BCW (BioServ Corporation, Frenchtown, NJ.) Testele de incorporare a dietei au fost conduse prin 29 amestecarea mostrelor cu dietă artificială (răcite mai întâi la 55° C sau mai jos) cu o rată de 6 ml suspensie plus 54 ml dietă. Concentrații multiple de tratament au fost generate prin 31 diluare în serie. După amestecare, acest amestec a fost turnat în tăvi de plastic cu compartimente de 3 ml (Nutrend Container Corporation, Jacksonville, FL) la o rată de 33 aproximativ 30 ml dietă pe tavă cu 24 de godeuri (fiecare godeu umplut pe jumătate). Tăvile Nutrend cu godeuri mai mari au fost utilizate pentru testarea biologică cu insecte în stadiul 35 trei sau mai mare; acestea sunt de asemenea umplute aproximativ jumătate cu dietă artificială. Un control apă care nu conține material de testare a servit drept reper. După cel 37 puțin 30 min, pentru a permite dietei să se răcească și să se stabilească, au fost plasate larve (French Ag Resources, Lamberton, MN) pe amestecul de dietă, o larvă per godeu. 39 Godeurile au fost apoi acoperite cu foi de Mylar (ClearLam Packaging, IL) folosind un fier provizoriu pentru montaj și în fiecare godeu au fost făcute mai multe orificii mici pentru a 41 asigura schimbul de gaze. Larvele au fost menținute la 25°C timp de 6 zile într-o cameră de păstrare la 14:10 (lumină:întuneric). Mortalitatea și atrofierea au fost înregistrate după 43 aproximativ șase zile. Pentru testele biologice LC₅₀ au fost executate un minimum de 3 reluări, fiecare cu 5-7 doze și aproximativ 24 insecte/doză. Rezultatele sunt arătate în 45 tabelul 2 (Teste biologice pentru larve de Agrotis ipsilon în stadiul întâi și stadiul 3, cu preparat din pudră liofilizată de Cry1F de MR872). 47

RO 122431 Β1

Tabelul 2

Stadiu	Date de test	LC10	lc50	LC90	pantă	insecte de test	insecte de control	% mortalitate controale
1	5	9	46	249	1,8	790	220	6
3	3	4	17	67	2,2	249	75	0

Exemplul 2. Eficiența momelii Cry1F împotriva larvelor de buha semănăturilor

Cry1 F a fosttestată pentru activitate împotriva larvelor de buha semănăturilorfolosind o formulare de momeală. Clonele MR872 au fost amestecate cu momeală comercială (SoiIServ, Salinas, CA), iar amestecul rezultat a fost împrăștiat pe suprafața solului cu răsaduri de grâu în ghivece (Stadiu de creștere Feekes 1,5) cu o rată de 50 Ib momeală/acru. Au fost testate două concentrații de Cry1 F prin adăugarea de diferite cantități de toxină la momeală, producând rate echivalente cu 6,25 g și 12,5 g de Cry1F toxină/acru. Plantele au fost apoi infestate cu larve în stadiul 3 sau 4 la o rată de aproximativ 1 insectă per 5 plante și s-a măsurat distrugerea plantelor după 24-48 ore. Scala distrugerilor se întinde de la 0 până la 4, cu 0 pentru plante tăiate total la nivelul solului, iar 4 pentru nicio distrugere vizibilă. Controalele au inclus plante fără momeală adăugată (fără momeală), cu momeală adăugată dar fără toxină (momeală control) și plante fără momeală sau insecte (control). Rezultatele sunt arătate în fig. 1 și 2.

Exemplul 3. Eficiența plantelor de floarea soarelui Cry1F transgenice împotriva Agrotis ypsilon conform măsurătorilor făcute pentru creșterea și mortalitatea insectelor și distrugerea plantelor

Tratamentele plantelor:

- răsaduri de control în stadiul V2

- răsaduri B.t. în stadiul V2 (donori cu matriță fixă de gene); aceste plante au exprimat o genă substanțial ca cea arătată în SECV ID NR:3

Insecte: Agrotis ypsilon. Larve în stadiul doi (a treia generație de laborator)

Test: răsaduri B.t., cinci repetări, cinci răsaduri per repetare, o larvă per răsad.

Control: cinci repetări, cinci răsaduri per repetare, o larvă per răsad.

Protocol:

- fiecare repetare a constat din cinci semințe care au fost plantate în tăvi dreptunghiulare transparente (15 cm x 25 cm) și acoperite pentru a permite recluziunea larvelor de insecte.

- fiecare repetare a fost infestată cu cinci larve. Tăvile au fost ținute într-o cameră la 25°C și 75% umiditate. Evaluarea s-a făcut la 24, 48, 72 și 96 ore după infestare.

- Evaluare

1. Plante - clasificate ca nedistruse, distruse (tulpină mușcată, cotiledoane sau frunze) sau tăiate sub cotiledoane. S-a făcut de asemenea o clasificație a fiecărei repetări: de la 1 (plante nedistruse sau cu tulpini cu câteva mușcături) până la 9 (toate plantele tăiate și mai mult de 80% din țesut mâncat).

2. Insecte - s-au numărat larvele moarte la 96 ore după infestare, iar larvele care au supraviețuit au fost cântărite.

3. Datele au fost analizate prin intermediul analizei probabilității tabelelor.

Rezultate: Sunt disponibile imagini care arată repetarea nr. 4 (48 și 96 ore după infestare). Datele sunt raportate în tabelele următoare, care arată evaluarea repetărilor 24, 48, 72 și 96 ore după infestarea cu Agrotis ypsilon.

RO 122431 Β1

Tabelul 3 ore după infestare

Rep.	Nr. plante nedistruse	Nr. plante distruse	Nr. plante tăiate	Clasificare
B.t.	control	B.t.	control	B.t.	control	B.t.	control
1	2	2	2	0	1	3	1	5
2	3	3	0	1	2	1	3	4
3	3	2	2	0	0	3	2	5
4	3	1	0	2	0	2	2	3
5	4	2	0	2	1	1	2	3

Tabelul 4 ore după infestare

Rep.	Nr. plante nedistruse	Nr. plante distruse	Nr. plante tăiate	Clasificare
B.t.	control	B.t.	control	B.t.	control	B.t.	control
1	2	1	1	1	2	3	3	7
2	2	0	1	2	2	3	3	7
3	1	1	1	0	3	4	3	7
4	2	1	0	0	3	4	4	7
5	2	1	1	1	2	3	3	7

Tabelul 5 ore după infestare

Rep.	Nr. plante nedistruse	Nr. plante distruse	Nr. plante tăiate	Clasificație
B.t.	control	B.t.	control	B.t.	control	B.t.	control
1	2	0	1	0	3	5	3	9
2	0	0	3	0	2	5	4	9
3	1	0	1	0	3	5	5	9
4	1	0	0	0	4	5	6	9
5	2	0	0	0	5	5	5	9

Tabelul 6 ore după infestare

Rep.	Nr. plante nedistruse	Nr. plante distruse	Nr. plante tăiate	Clasificare	Nr. larve moar te
B.t.	control	B.t.	control	B.t.	control	B.t	control
1	3	0	0	0	2	5	3	9	4
2	0	0	2	0	3	5	7	9	0
3	1	0	0	0	4	5	5	9	0
4	0	0	0	0	5	5	6	9	0
5	1	0	0	0	4	5	6	9	0

RO 122431 Β1

Tabelul 7

Greutatea larvelor (mg) 96 ore după infestare*

Repetare	Larve per repetare
1	2	3	4	5	medie
2	B.t.	100	95	65	115	75	90
control	230	170	205	175	175	191
3	B.t.	150	135	85	115	120	121
control	215	200	90	120	160	157
4	B.t.	110	80	110	85	150	107
control	170	160	185	200	155	174
5	B.t.	120	65	95	60	45	77
control	120	190	210	255	110	177

* patru repetări, deoarece într-o repetare larvele au murit

Concluzie: Răsadurile B.t. arată activitate împotriva Agrotis ypsilon la un nivel înalt al infestării (1 larvă/răsad). Această activitate este suficientă pentru a afecta negativ creșterea omizilor astfel încât controlul este realizat.

Exemplul 4. Controlul dăunătorului buha semănăturilor (BCW) cu noi evenimente Cry1F pentru porumb

Sumar. Capacitatea a zece evenimente Cry1F pentru porumb (care exprimă substanțial polînucleotidă din SECV ID NR:3) de a controla dăunătorul buha semănăturilor (Agrotis ipsilon (Hufnagel)) în condiții de câmp a fost comparată cu doi hibrizi non-S.f. (Control 1 și Control 2), un hibrid care exprimă CrylAb și un hibrid care exprimă proteina Cry9C în scopuri comparative. Toate evenimentele Cry1F au asigurat o bună protecție împotriva pierderilor în stand în comparație cu hibrizii non-S.f.

Materiale și metode. Au fost plantate 25 de semințe pentru fiecare intrare, folosind un plantator conic Almaco în ziua 1. Au fost plantate patru replicări - fiecare randomizată separat. Rândurile au fost în perechi, cu o alee neplantată între fiecare pereche de rânduri. Fiecare parcelă a fost inclusă într-o barieră de oțel galvanizat cu înălțimea de 8 inci, lățimea de 2,5 inci și lungimea de 6 inci. Barierele au fost presate în pământ până la o adâncime de aproximativ 2 inci în Zilele 13 și 14. Marginile barierei au fost tratate cu vaselină rectificată pentru a descuraja fuga larvelor. în interiorul barierelor au fost împrăștiate paie de grâu pentru a asigura adăpostul omizilor. La scurt timp după răsărire, plantele care conțineau Cry 1F au fost testate cu benzi ELISA, iar standurile au fost rărite la 10 plante prin îndepărtarea plantelor fără expresie sau a celor cu surplus de expresie. în trei dintre parcele, standul final a fost de 8 sau 9 plante. Non-Cry1 F au fost de asemenea rărite la 10 plante. în spatele fiecărei plante a fost plasat un mic arac de plastic astfel încât să fie evidentă dispariția unei plante, dacă acest lucru se întâmpla. în ziua 15, atunci când plantele au atins stadiul V1 sau V2 timpuriu, pe fiecare plantă au fost plasate trei larve de buha semănăturilor în stadiul trei. O a doua infestare cu 2 larve de buha semănăturilor în stadiul 4 per plantă a fost făcuta în ziua 9.

Parcelele au fost examinate în fiecare zi din ziua 16 până în ziua 26. O clasificare suplimentară a fost făcută în ziua 29, iar clasificarea finală a fost făcută în ziua 34. Orice plantă care a fost distrusă a fost marcată cu un mic arac de plastic în fața ei, și s-a înregistrat tipul distrugerii pe o foaie de date. La sfârșitul testului s-a efectuat numărătoarea finală a standului.

RO 122431 Β1

Rezultate. în acest test s-a realizat un nivel moderat de presiune a dăunătorului buha 1 semănăturilor, având ca rezultat o reducere a standului la câteva intrări non-β.ί. Din motive necunoscute, a existat o tendință în acest test, ca buha semănăturilor să usuce plantele în 3 loc să le taie. Din acest motiv, datele despre plante distruse au fost de asemenea comparate.

Tabelul 8 arată tipul de plantă și procentul de reducere a standului (%RS) și procentul 5 de plante distruse (%Dis). Reducerea standului înseamnă că planta a fost omorâtă. Plantele distruse au avut deteriorări evidente în hrănire, dar nu și-au pierdut vârful vegetativ. 7

Tabelul 8 9

Tratament/eveniment Cry1F	%RS	%Dis.
Control 1 non-S.f.	47,5	60
Control 2 non-S.f.	32,5	45
Cry9C	7,5	20
Cry 1Ab	15	43
308	2,5	5
188	0	5
218	7,5	15
386	7,5	15
538	2,5	18
778	2,5	15
366	3,1	11
663	5	18
058	2,8	9
227	0	5

Aceste rezultate sunt arătate grafic în fig. 3 și 4.

Deși nici o intrare nu a fost fără distrugeri, acest lucru nu este surprinzător deoarece 27 omizile trebuie să mănânce plantele pentru a muri. Totuși, în sumar, au fost disponibile fotografii care au arătat clar plantele Cry1 F ușor afectate față de plantele control tăiate 29 complet.

Exemplul 5. Introducerea genelor de toxine în plante 31

Un aspect al prezentei invenții este transformarea plantelor cu secvențele de polinucleotide ale prezentei invenții care codifică toxinele cu activitate insecticidă. Plantele 33 transformate sunt rezistente la atacul dăunătorului vizat. Genele preferate pentru utilizarea conform prezentei invenții sunt optimizate pentru folosirea în plante. Exemple de gene și 35 toxine cu activitate împotriva omizilor pentru folosirea conform prezentei invenții sunt arătate în SECV ID NR: 1-8. Sunt preferate proteina și gena din SECV ID NR: 1 și 2. 37

Evident, este necesară o regiune promotor capabilă să exprime gena într-o plantă.

Astfel, pentru expresia in planta, ADN-ul prezentei invenții este sub controlul unei regiuni 39 promotor adecvată și lincată funcțional de aceasta. Tehnicile pentru obținerea expresiei in planta folosind asemenea construcții sunt cunoscute în domeniu. 41

Genele care codifică toxinele cu activitate pesticidă, așa cum au fost dezvăluite aici, pot fi inserate în celule de plante folosind o varietate de tehnici care sunt binecunoscute în 43 domeniu. De exemplu, un mare număr de vectori de donare care cuprind un sistem de replicare în E. coli și un marker ce permite selecția celulelor transformate sunt disponibile pentru 45 prepararea și inserarea de gene străine în plante superioare. Vectorii cuprind, de exemplu,

RO 122431 Β1 serii pBR322, pUC, serii M13mp, pACYCI 84 etc. în consecință, secvența care codifică toxina B.t. poate fi inserată in vector la un situs de restricție adecvat. Plasmidul care rezultă este folosit pentru transformarea în E. coli. Celulele de E. coli sunt cultivate într-un mediu nutritiv adecvat, apoi sunt recoltate și lizate. Plasmidul este recuperat. Analiza secvențelor, analiza restricției, electroforeza și alte metode biologice, de biochimie moleculară sunt în general realizate ca metode de analiză. După fiecare manipulare, secvența de ADN folosită poate fi clivată și unită la secvența ADN următoare. Fiecare secvență de plasmid poate fi donată în același plasmid sau în alte plasmide.

Depinzând de metoda de inserare a genelor dorite în plantă, pot fi necesare alte secvențe ADN. Dacă de exemplu, se folosește plasmidul Ti sau Ri pentru transformarea celulei de plantă, atunci trebuie ca cel puțin marginea dreaptă, dar adesea marginea dreaptă și stângă a ADN-T a plasmidului Ti sau Ri trebuie să fie unită ca regiunea de flancare a genelor care se inserează. Folosirea ADN-T pentru transformarea celulelor de plante a fost cercetată intensiv și suficient descrisă în EP 120 516; Hoekema (1985): The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B.V. Alblasserdam, capitol 5; Fraley și col., Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46 și An și col. (1985) EMBO J. 4:277-287.

Odată ce ADN-ul inserat a fost integrat în genom, acesta este relativ stabil acolo și ca regulă, nu mai iese afară. Acesta conține în mod normal un marker de selecție care conferă celulelor de plante transformate rezistență la un biocid sau un antibiotic cum ar fi kanamicina, G418, bleomicina, higromicina sau cloramfenicol, inter alia. Markerul utilizatîn mod individual trebuie în consecință să permită mai degrabă selecția celulelor transformate decât a celulelor care nu conțin ADN-ul inserat.

Sunt disponibile un număr mare de tehnici pentru inserarea de ADN într-o celulă gazdă vegetală. Aceste tehnici includ transformarea cu ADN-T folosind Agrobacterium tumefaciens sau Agrobacterium rhizogenes ca agent de transformare, fuziune, injecție, biolistică (bombardament cu microparticule) sau electroporare cât și alte metode posibile. Dacă se folosește Agrobacteria pentru transformare, ADN-ul de inserat trebuie donat în plasmide speciale, și anume fie într-un vector intermediar, fie într-un vector binar. Vectorii intermediari pot fi integrați în plasmidele Ti sau Ri prin recombinarea omoloagă ce conține secvențele care sunt omologe secvențelor din ADN-T. Plasmidele Ti sau Ri cuprind de asemenea regiunea vir necesară pentru transferul ADN-T. Vectorii intermediari nu se pot replica ei înșiși în Agrobacteria. Vectorul intermediar poate fi transferat în Agrobacterium tumefaciens prin intermediul unui plasmid helper (conjugare). Vectorii binari se pot replica ei înșiși atât în E. coli cât și în Agrobacteria. Aceștia cuprind o genă marker de selecție și un linker sau poli-linker care este încadrat de regiunile de margine ADN-T stângă și dreaptă. Aceștia pot fi transformați direct în Agrobacteria (Holsters și al. [1978] Mol. Gen. Genet 163:181-187). Agrobacterium folosite ca celulă gazdă trebuie să cuprindă un plasmid care poartă o regiune vir. Regiunea v/reste necesară pentru transferul ADN-T în celula de plantă. Poate fi conținut ADN-T suplimentar. Bacteria transformată astfel este folosită pentru transformarea celulelor de plantă. Plantele explantate pot fi cultivate în mod avantajos cu Agrobacterium tumefaciens sau Agrobacterium rhizogenes pentru transferul ADN în celula plantei. Plante întregi pot fi apoi regenerate din materialul vegetal infectat, (de exemplu, bucăți de frunză, segmente de tulpină, rădăcini, dar de asemenea protoplaști sau celule cultivate în suspensie) într-un mediu adecvat, care poate conține antibiotice sau biocide pentru selecție. Plantele obținute astfel pot fi testate pentru prezența ADN-ului inserat. Nu sunt condiții speciale pentru plasmide în cazul injectării și electroporării. Este posibil să se folosească plasmide obișnuite cum ar fi, de exemplu, derivați pUC.

RO 122431 Β1

Celulele transformate cresc în interiorul plantei în modul obișnuit. Acestea pot forma celule germinative și transmit trăsătura(ile) plantelor urmași. Asemenea plante pot fi crescute în modul normal și încrucișate cu plante care au aceiași factori ereditari transformați sau alți factori ereditari. Indivizii hibrizi rezultați au proprietățile fenotipice corespunzătoare.

Claims (19)

1 24. Metodă conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că planta menționată este o plantă de porumb.

1 21. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este un Euxoa ochrogaster.

1. Metodă de combatere a dăunătorilor în stadiul de omizi, caracterizată prin aceea că, cuprinde aducerea în contact a dăunătorului menționat cu o toxină Cry1F.

2. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că toxina menționată este o toxină Cry1 Fa.

3 22. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este din genul Peridroma.

3. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că toxina menționată este o toxină trunchiată.

4. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că toxina menționată este într-o celulă de plantă care a produs toxina menționată și în care dăunătorul menționat vine în contact cu toxina menționată prin ingerarea celulei de plantă menționată.

5 23. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este un Peridroma saucia.

5. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este din genul Agrotis.

6. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este un Agrotis ipsilon.

7. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este un Agrotis malefida.

8. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este din genul Porosagrotis.

9 25. Metodă conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că planta menționată este o plantă de floarea soarelui.

9. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este un Porosagrotis gypaetiana.

10. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este din genul Xylomyges.

11 26. Metodă conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că planta menționată este o plantă de soia.

11. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este un Xylomyges curialis.

12. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este din Tribe Agrotini.

13 27. Metodă conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că planta menționată este o plantă de rapiță de toamnă.

13. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este din genul Feltia.

14. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este un Feltia jaculifera.

15 28. Metodă conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că planta menționată este o plantă de bumbac.

15. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este din genul Euxoa.

16. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este un Euxoa messoria.

17 29. Metodă conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că etapa de contactare este precedată de etapa de plantare a seminței unei plante care cuprinde o polinucleotidă

17. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este un Euxoa scandens.

18. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este un Euxoa auxiliaris.

19. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este un Euxoa detersa.

20. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că dăunătorul în stadiul de omidă menționat este un Euxoa tessellata.

RO 122431 Β1

19 ce codifică toxina menționată.