UA72897C2 - Спосіб боротьби з шкідником совкою - Google Patents

Abstract

Винахід стосується способу боротьби зі шкідником совкою. В одному з бажаних втілень винаходу, Cry1Fa білки використовують для боротьби з совкою ipsilon.

Description

були замінені на арабські цифри у первинному розряді, а круглі скобки у третинному розряді були видалені.

Існуючі границі представляють приблизно 9595 (третинний розряд), 7590 (вторинний розряд) та 48905 (первинний розряд) амінокислотної ідентичності. Було залишено багато оригінальних найменувань, хоча ряд було перекласифіковано. Див. також "Перегляд номенклатури для пестицидних кристалічних білків

ВасшШив (пигіпдіепвів" М. СпсКтоге, О.В. 7еїдіег, 9. Рейеївоп, Е.5сПпері, 9. Мап Віеє, 0. І егесійв, у. Ват, О.Н.

Оєап Місгоріоюду апа Моїесшаг Віооду Немієме (1998) МоІ.б2: 807-813 та Стгісктоге, 2еїідіег, Рейеї5оп,

Ззсппері, Мап Кіе, Іегесіи5, Вайт, Оеап "Номенклатура токсинів Васійи5 ІПигіпдіеп5іб" (1999) пЕрмлум.ріоїв. вих. ас. ик/Ноте/Меї! Стісппоге/Ві/паех.піт!і. Ця система використовує вільно доступне програмне забезпечення СГ ОБТАЇ УМ та РНМІІР. МЕІСНВОК усередині пакета РНМІІР використовує алгоритм арифметичного усереднення (ШРОМА).

Виділення нових ізолятів Ві та генів їх токсинів, як і оцінка спектру пестицидної активності токсину, представляє собою повільний емпіричний процес. В результаті екстенсивної дослідницької та винахідницької роботи, були видані патенти на нові ізоляти В.ії., токсини, гени та деякі нові прояви активності токсинів та ізолятів ВІ. Див. Фейтелесон та ін. (наведено вище) як огляд. Проте, відкриття нових ізолятів ВІ, та нових проявів ізолятів та токсинів ВІ. залишається емпіричною та непередбачуваною роботою.

Зтиїеміїсп еї аІ. М1991) РЕВ5 І ей. 293: 25-26), Сіваме аї а. ((1991) УСМ 138: 55-62), Зпемеїєм 6вї аї.

Ї1993) РЕВ5 Іей. 336: 79-82| описали та охарактеризували Студ токсини, що є активними проти лускокрилих. Гатрбегі еї аї. |СГатрбеті, В., Г. Виуззе, С. ЮОесоде, 5. дапзепв, С. Ріеп5, В. заєу, 9. Зешгіпск, К.

Мап А!йдеппоме, У. Мап Віє, А. мап Міїєї М. Реїегоєп (1996) Аррі. Епмігоп. Місторіо! б2 (1): 80-86), та опубліковані заявки РСТ МУ/О94/05771 та М/О94/24264 також описують ізоляти ВІ. та Сгту9сС токсини, активні проти лускокрилих шкідників.

Патенти США Мо5,126,133; 5,188,960; 5,246,852 та 5,691,308 розкривають Сгуіга токсин та ген (811А), виділені з ізоляту В. РБЗУО1І. Патенти США Мое5,527,883; 5,508,264; 5,827,514 та 5,840,554 стосуються Сту1г химерних токсинів. М/О 99/24581 розкриває Стгу! Ер токсин та ген ізоляту ВІ. РБЗО1С2.

При використанні методів генетичної інженерії розвиваються різноманітні підходи до доставки токсинів

Ві. до навколишнього середовища. Клонування та експресія гена кристалічного білка Ві. в Е5сПпегіспіа сої було описано в опублікованій літературі більше, ніж 15 років тому |(Зсппері, Н.Е., Н.В. М/пісеІєу (1981) Ргос.

Май. Асай. сі. ОБА 78: 2893-2897). Патенти США Ме4,448,885 Мо4,467,036 розкривають експресію кристалічного білка ВІ. в Е.соїї. Продукти, що базуються на рекомбінантній ДНК ВІ., були одержані та схвалені для використання, включаючи використання рослин, генетично модифікованих за допомогою генів

ВІ. для надання стійкості до комах та використання стабілізованих бактеріальних клітин як векторів для доставки білків ВІ. Були розроблені різноманітні методи на основі модифікації токсинів В.ї. та/або їх генів.

Наприклад, Патенти США Ме5,380,831 та 5,567,862 стосуються одержання синтетичних генів інсектицидних кристалічних білків, що мають покращену експресію в рослинах. Таким чином, ізольовані гени ендотоксинів

ВІ. є комерційно доступними.

Перешкоди до успішного сільськогосподарського застосування токсинів Ві. включають розвиток стійкості до токсинів В.І. у комах. Крім того, деякі комахи є стійкими до впливів В... Останні включають таких комах, як довгоносик та совка, які, крім того, не демонструють явної чутливості до більшості б-ендотоксинів вах

Совки в своєму розвитку проходять через кілька стадій розвитку як гусінь. Хоча паростки, пошкоджені гусінню більш пізніх етапів розвитку, завдають найбільшої шкоди та викликають економічні втрати, споживання ними листя призводить до втрати врожаю такої культури як кукурудза. Після досягнення більш пізніх етапів розвитку (від третього до четвертого, наприклад) личинка починає об'їдати рослини та частини рослин, особливо паростки. У результаті змін у поведінці споживання їжі, економічно пошкоджені популяції можуть непередбачувано відбудовувати при використанні попередньо ранніми запобіжних заходів. Великі совки можуть знищити декілька паростків за день, а при тяжкому зараженні можуть знищувати весь врожай культури. Нічний спосіб життя совок та їх звичка рити нору у землі також роблять їх виявлення та лікування рослин проблематичним.

Совка іпсілон (Адгоїії5 ірзіоп (Ниїпадеї!): Герідорієга: Мосіцідає) є серйозним шкідником багатьох культур, включаючи, кукурудзу, бавовник, капусні культури: Вгазвзіса, брокколі, капуста, китайська капуста), а також дерен. Вторинні рослини-хазяї включають, буряки, Сарзісит (перець), турецький горох, боби, латтук, люцерну, цибулю, картоплю, редиску, капусту (Сапоїа), рис, сою, полуниці, цукрові буряки, тютюн, томати та лісові дерева. У Північній Америці шкідники роду Адгоїїз живляться на конюшині, пшениці, тютюні, коноплях, цибулі, полуниці, смородині, малині, люцерні, ячмені, бобах, капусті, вівсі, горосі, картоплі, топінамбурі, томатах, садових квітах, траві, люцерні посівній, кукурудзі, спаржі, винограді, майже будь-яким видом листя, на бур'яновій траві, та на багатьох інших культурах та садових квітів. Інші совки триби Адгоїїпі представляють собою шкідників, зокрема тих, що відносяться до родів Рейіа (наприклад, Р.|асційтега (сцепее); еквівалентна дисеп5 5!Иирдоїіса) та Еихоа (наприклад, Е.тевззогіа (Нагті5), Е.5сапаег5 (Кіїеу),

Е.айхійагіє зт, Е.деїегза (Умаїкег), Е леззеїада (Наїті5), Е.оспгодавіег (сцепее). Такі совки, як Регідгота зацйсіа також є небезпечними шкідниками. Цитрусові рослини, наприклад, також можуть служити мішенню для нападу совок ("цитрусова совка" Хуіотудез сигіаї5 представляє собою такий приклад).

Совки є шкідниками і за межами Північної Америки, та найбільш значних збитків завдають шкідники турецькому горохові, пшениці, овочам, цукровому буряку, люцерні, кукурудзі, картоплі, турнепсу, капусті, латуку, полуниці, логановій ягоді, льонові, бавовнику, сої, тютюну, коренеплодам, китайські капусті, томатам, баклажанам, цукровій тростині, пасовищним травам, капусті, земляному горіху, Сисигойга, турнепсу, соняшнику, Вгаззіса, цибулі, цибулі-порею, селері, сезаму, спаржі, ревеню, цикорію, культурам, що вирощуються у теплицях та шпінатові. Совка іпсілон А.ірзіоп є відомим шкідником за межами Північної

Америки, включаючи Центральну Америку, Європу, Азію, Австралію, Африку, Індію, Тайвань, Мексику,

Єгипет та Нову Зеландію.

Основними видами совки в Аргентині є Адгоїї5 таїейда, Рогозадгоїїз Сераєйапа та Адгоїї5 ірзіоп (що також вимовляється як урзіїоп). Ці совки нападають на пшеницю, сою та культивари соняшника, наприклад.

Ці комахи можуть серйозно пошкодити популяцію сходів, а у випадку жорсткого нападу можуть повністю знищити ділянку.

Культуральні контролі на Адгоїї5 ірзіоп, такі як периферичний контроль бур'яну, можуть допомогти запобігти тяжкому зараженню, проте, такі методи не завжди можливі або ефективні. Зараження є дуже спорадичним, а застосування інсектициду перед висаджуванням або при висаджуванні не є ефективним у майбутньому. Деякі принади є доступними для боротьби з совками на культурах. Для захисту дерену, наприклад, польової трави, не можна використовувати хімічні інсектициди. Використання хімічних пестицидів представляє собою особливу турботу на ділянках, що вкриті дереном (наприклад, на майданчиках для гольфу, на атлетичних майданчиках, парках та інших районах відпочинку, при професійному ландшафуванні та на власних маєтках), оскільки люди мають тісний контакт з цими районами. Природні продукти (наприклад, нематоди та азадірахтін), як правило, використовуються не широко.

На сьогоднішній момент продукти Васіїи5 (пигіпдіепві5 для боротьби з совкою іпсілон використовуються не досить широко з причини відсутності достатньої ефективності. Швидке споживання їжі та поведінка при створенні нір совками іпсілон роблять їх особливо складними для боротьби за допомогою існуючих на сьогоднішній день біологічних розчинів на основі пестицидів. Наприклад, СгутА(Б) токсин є неефективним проти совки.

Предмет винаходу пов'язаний з несподіваним відкриттям того факту, що СгуїЕ білки є активними проти совок, таких як совка іпсілон (Адгоїїз ірзіоп). Таким чином, предмет даного винаходу забезпечує методи боротьби з цими шкідниками, при цьому вказаний метод передбачає контакт вказаного шкідника з пестицидною кількістю токсину Васіїййи5 Іпигіпдіепзіз, що включає, принаймі, пестицидну кількість Сгу1їЕ токсину. Таким чином, використання СгуїЕ білків повної довжини, вкорочених, химерних, білків та генів, представляє собою предмет винаходу. У бажаних втіленнях Сгтуїб токсин представляє собою СгуРа токсин. СтуїЕ білки дикого типу або синтетичні СгуїЕР білки можуть використовуватись згідно з предметом даного винаходу. Таким чином, використання полінуклеотидів (та/або їх комплементів, більш бажано, їх комплементів повної довжини), що гібридизуються з відомими генами сгуїЕ, більш бажано тих частин, що кодують внутрішній токсин, також складає предмет даного винаходу. Оптимізовані для рослин полінуклеотиди використовуються у більш бажаних втіленнях.

Предмет винаходу включає використання трансгенних хазяїв, включаючи хазяйські рослини такі, як пшениця, бавовник та соняшник. У бажаному втіленні, предмет винаходу стосується рослинних клітин, трансформованих, принаймні, однією полінуклеотидною послідовністю, що є предметом винаходу, так, що трансформовані рослинні клітини експресують пестицидні білки у тканинах, що споживаються цільовими шкідниками. Такі трансформовані рослини можуть бути одержані при використанні методик, що добре відомі спеціалістам у даній галузі, та можуть типово включати модифікації гена для оптимізації експреси токсину у рослинах.

Фігура 1 показує масу непошкоджених паростків пшениці та відносне значення збитків через 24 години після зараження гусінню совки іпсілон 4-ої стадії розвитку, а також після різноманітних обробок.

Фігура 2 показує сиру вагу паростків пшениці, заражених гусінню совки іпсілон 3-ої стадії розвитку через 48 годин після зараження та після різноманітних обробок.

Фігури З та 4 ілюструють результати, що обговорюються у Прикладі 4.

Короткий опис послідовностей

ЗЕО ОО МО:1 представляє собою оптимізовану для рослин полінуклеотидну послідовність повної довжини, гібридного гена сгуІР/сгуіА(бБ), позначеного як 1ТЕТАВ-РО.

ЗЕО ІЮ МО:2 представляє собою амінокислотну послідовність химерного токсину Сгуіг/СтуІА(Б) повної довжини, оптимізованого для рослин. Ген 1Е1АВ-РО кодує цей токсин.

ЗЕО 10 МОЗ представляє собою полінуклеотидну послідовність для вкороченого гена сгіЕ, оптимізованого для рослин, і позначеного як 1Е-Т-РО.

ЗЕО ІЮ МО:4 представляє собою амінокислотну послідовність для вкороченого токсину СУК, оптимізованого для рослин. Гени, позначені як Т1Е-Т-РО, 1Е-705-РО та 1Е-72-РО, кодують цей токсин.

ЗЕО ІЮО МО:5 представляє собою нативну полінуклеотидну послідовність дикого типу гена токсину В.ї. повної довжини, позначеного як 911А (СтуїІГа).

ЗЕО ІЮ МО:6 представляє собою амінокислотну послідовність повної довжини токсину В.1ї. дикого типу, позначеного як 811А (сгу!Ра).

ЗЕО ІЮ МО:7 представляє собою полінуклеотидну послідовність для гена, позначеного як 1Е-7(3-РО, який є оптимізованим для експресії у бавовнику.

ЗЕО ІЮ МО:8 представляє собою полінуклеотидну послідовність для гена, позначеного які Е-772-РО, який є оптимізованим для експресії у кукурудзі.

Предмет винаходу пов'язаний з несподіваним відкриттям, що Сту!ЕР білки є активними проти совок, таких як совка іпсілон (Адгоїїз ірзіоп). Особливо несподіваним було відкриття, що гусінь 3-ого етапу розвитку та більш пізніх етапів розвитку контролюються токсинами та генами згідно з предметом даного винаходу. Боротьба з гусінню першого та другого етапів розвитку менш важлива, ніж боротьба з гусінню більш пізніх етапів розвитку. У той час, як відомо, що Сгу!Ї токсини є активними по відношенню до лускокрилих, взагалі, совки є стійкими до токсинів В.ї. взагалі, як це обговорювалось більш детально вище у розділі "Передумови винаходу".

Предмет винаходу включає використання рекомбінантних хазяїв та забезпечення полінуклеотидних послідовностей, оптимізованих для рослин. Ці полінуклеотидні послідовності включають оптимізовані для рослин гени, позначені як 1ЕТАВ-РО, 1БЕ-Т-РО, 1Б-705-РО та 1Б-72-РО. Ці гени розкриті у заявці

М О99/24581. Бажані рослини-хазяї включають кукурудзу, сою, бавовник, пшеницю, сапоїа та соняшник.

У деяких втіленнях згідно з предметом винаходу, гени, які кодують СтуїЕ токсин, є вкороченими у порівнянні з токсином СгуїЕ повної довжини. У вкорочених токсинах згідно з предметом даного винаходу відсутній увесь протоксиновий сегмент або його частина. Вкорочені гени згідно з предметом винаходу можуть також використовуватись для одержання химерних генів та білків. Одним прикладом може бути оптимізований для рослин ген, що включає частину сгуїЇЕ та частину сгуІА(б), при цьому гібридний ген кодує химерний токсин. Бажані химерні гени та токсини розкриті у патентах США Ме5,527,883 та 5,840,554. Інші химерні гени та токсини, які можуть використовуватись згідно з предметом даного винаходу, розкриті у патентах США МоМо 5,508,264 та 5,827,514. У бажаному втіленні частина сгуїє химерного токсину є пестицидною. Злиті токсини можуть також використовуватись згідно з предметом даного винаходу.

У бажаному втіленні предмет винаходу стосується рослинних клітин, трансформованих за допомогою, принаймні, однієї полінуклеотидної послідовності, таким чином, що трансформовані рослинні клітини експресують пестицидні токсини у тканинах, що споживаються цільовими шкідниками, які, таким чином, вступають у контакт з пестицидним білком. Така трансформація рослин може бути виконана при використанні методик, добре знайомих для спеціалістів у даній галузі, та типово передбачає модифікацію гена для оптимізації експреси токсину у рослинах.

Для спеціаліста у даній галузі зрозуміло, що послідовності генів, які наведені, та самі гени, що складають предмет винаходу, можуть бути одержані різними способами. У бажаних втіленнях гени, що складають предмет винаходу, можуть бути одержані синтетично при використанні, наприклад, генного синтезатора. Специфічні гени, представлені у даній заявці, можуть також бути одержані шляхом модифікації певних генів дикого типу (наприклад, шляхом техніки точкового мутагенезу) з певних ізолятів, які депоновані у депозитаріях, як це обговорюється нижче, згідно з наведеними способами, що складають предмет винаходу. Наприклад, ген сгуІЄ дикого типу може бути одержаний з ізоляту ВІ. РБЗО11І. Крім того, частини сгуіА(Б) гібридних генів, що складають предмет даного винаходу, можуть бути одержані синтетично або можуть бути одержані шляхом модифікації генів дикого типу. СтуіА(б) токсини та гени описані, наприклад, у НКе єї а!. (1986) Єиг. У. Віоспет. 161: 273 ; Сеївег єї а!. (1986) Сепе 48: 109; Наїдег є! а. (1988)

Мисіеєїс Асід5 Кев. 16: 10927. Клони та додаткові ізоляти дикого типу обговорювались більш детально вище, у розділі, що називається "Передумови винаходу" та у списку, наведеному нижче.

Культури, що розглядаються у цій заявці, були депоновані згідно з Будапештським Договором у

Сільськогосподарській дослідницькій сервісній патентній колекції культур (МКК), Північний регіональний дослідницький центр, 1815, Пеорія, штат Іллінойс, США. Депоновані штами, наведені нижче розкриті у патентних посиланнях, як це обговорювалось раніше у розділі, що називається "Передумови винаходу". номер депонування 1989 року рМУС1603)(91А 1989 року

Зрозуміло, що доступність депозиту не складає ліцензії для використання предмету винаходу у порушенні патентних прав, що гарантуються урядом.

Гени та токсини. Полінуклеотиди, що складають предмет винаходу, можуть використовуватись для створення повних генів для кодування білків або пептидів у бажаній хазяйській клітині. Наприклад, як відомо спеціалісту в даній галузі, деякі представлені полінуклеотиди у наведеній послідовності представлені без стоп-кодонів. Крім того, полінуклеотиди, що складають предмет винаходу, можуть бути розміщені під контролем промотора у хазяїні, що представляє інтерес, як це добре відомо у даній галузі.

Як відомо спеціалісту у даній галузі, ДНК звичайно існує у формі подвійного ланцюга. Згідно з цим, один ланцюг є комплементарним до іншого ланцюга та навпаки. Коли ДНК реплікується в рослині (наприклад), утворюються додаткові комплементарні ланцюги ДНК. Таким чином, предмет винаходу включає також використання представлених полінуклеотидів, представлених у наведених послідовностях та комплементарних до останніх ланцюгів. Термін "кодуючий ланцюг" часто використовується у даній галузі для позначення ланцюга, що зв'язується з антисмисловим ланцюгом. Для того, щоб експресувати білок іп мімо, ланцюг ДНК звичайно транскрибується у комплементарний ланцюг мРНК, який використовується як матриця для трансляції білка. мРНК фактично транскрибується з антисмислового ланцюга ДНК. "Смисловий" або "кодуючий" ланцюг має ряд кодонів (кодон представляє собою три нуклеотиди, які одночасно зчитуються для одержання певної амінокислоти), що можуть зчитуватись як відкрита рамка зчитування (ОКР) для створення білка або пептида, що представляє інтерес. РНК та ПНК (пептидні нуклеїнові кислоти), які є функціональними еквівалентами до наведеної ДНК, також включаються у предмет даного винаходу.

Гени та токсини, які складають предмет винаходу, можуть бути ідентифіковані, одержані та охарактеризовані при використанні, наприклад, олігонуклеотидних проб. Проби представляють собою нуклеотидні послідовності, що можуть бути визначені. Наведені специфічні полінуклеотиди, що складають предмет винаходу, включаючи частини останніх, що достатні для того, щоб кодувати активний токсин, можуть самі по собі використовуватись як проби. Проби можуть представляти собою ДНК, РНК або ПНК (пептидна нуклеїнова кислота). Ці послідовності можуть визначатись за допомогою включення придатної мітки, або можуть бути зроблені флуоресцентними, наприклад, як це описано у міжнародній заявці

УМО93/16094. Як добре відомо у даній галузі, якщо проба молекули та зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються шляхом утворення сильних зв'язків між двома молекулами, то на цій підставі можна стверджувати, що проба і зразок мають суттєву гомологію. Бажано, щоб гібридизація проходила у жорстких умовах при використання способів, що добре знайомі спеціалістам у даній галузі, як описано, наприклад, у

КепПег, б.Н., М.М. Мапак (1987) ОМА Ргоре5, БіосКіоп Рге55, Мем/ Могк, МУ., рр.169-170. Як описано у цій статті, гібридизаційні умови високої жорсткості можуть бути досягнуті першим промиванням за допомогою 2х 55С (стандартний розчин хлориду та цитрату натрію)/0,196 5О5 (додецил сульфат натрію) протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Звичайно проводять два промивання. Вища жорсткість може бути досягнута шляхом зниження концентрації солі та/"або шляхом підвищення температури. Наприклад, описаний етап гібридизації може бути досягнутий шляхом промивання за допомогою 0,1х 55С/0,196 505 протягом 15 хвилин при кімнатній температурі, що може бути замінено на промивання 0,1х 55С/0,195 505 протягом 30 хвилин при 55"С. Температура, яка використовується на цьому етапі, може також використовуватись згідно з іншими прописами, які обговорюються у даній заявці (замість 55С може використовують З5РЕ, наприклад), що добре відомо у даній галузі. 2х 55С/0,195 505 можна приготувати шляхом додання 5О0мл 20х 55С та 5мл 1095 505 до 445мл води. 20х 55С можна приготувати шляхом поєднання Масі (175,3г /0,150М), цитрату натрію (88,2г/0,015М) та води до 1л, з наступним доведенням рн до 7,0 за допомогою 10М Маон. 1095 505 можна приготувати шляхом розчинення 10г 5О5 у 50мл автоклавованої води, розведення до 100мл та подальшим аліквотувуванням.

Визначення проби забезпечує засіб для визначення відомим способом, чи досягнуто гібридизації. Такий аналіз проби забезпечує швидкий метод для ідентифікації генів, які кодують токсин, що складає предмет даного винаходу. Нуклеотидні сегменти, які використовуються як проби згідно з даним винаходом, можуть бути синтезовані при використанні ДНК-синтезатора та стандартних способів.

Як такий, що використовується у контексті даної заявки, термін "жорсткі" умови гібридизації відноситься до умов, що дають змогу досягти такого самого, або майже такого самого ступеня специфічності гібридизації, що і умови, які використовують у наведених прописах. Специфічно, гібридизація імобілізованої

ДНК на Саузерн-блотах з 3З2Р-міченою ген-специфічною пробою, виконується за допомогою стандартних способів |Маніатіс Т., Фріч Е.Ф. Самбрук Дж. (1982) Молекулярне клонування: Лабораторний метод,

Лабораторія Колд Спрінг Харбор, Колд Спрінг Харбор, МУ). Взагалі, гібридизація та відповідне промивання виконують у жорстких умовах, що дозволяють виявляти цільові послідовності. Для проб генів, що мають дволанцюгову ДНК, гібридизацію виконують протягом ночі при температурі, що на 20-257С нижча від температури плавлення (Тт) гібридної ДНК у бх 55РЕ, 5х розчині Денхарда, 0,195 505, 0,1мг/мл денатурованої ДНК. Температура плавлення описується наступною формулою |Вейня, б.А., К.А. дасорв, Т.Н.

Біскризи, Р.Т. Спеграх та Б.С. Каїаюз (1983) Меїпоаз ої Епгутоіоду, К. УМи, Г. сгоз5тап, К. Моїдаме (еаз.)

Асадетіс Ргез5, Мем Хоїк 100:266-2851).

Тт-81,57С--16,6І одіМач|нО,41(900535-0)-0,61(96 формаміду)-600/довжина дуплекса у парах основ.

Промивання звичайно виконують так, як описано нижче: (1) Двічі при кімнатній температурі протягом 15 хвилин у 1 х 55РЕ, 0,195 505 (промивання низької жорсткості) (2) Один раз при Тт-20"С протягом 15 хвилин у 0,2 х 55РЕ, 0,195 505 (промивання а умовах помірної жорсткості).

Для олігонуклеотидних проб гібридизацію виконують протягом ночі при температурі на 10-207С нижче температури плавлення Тт гібриду у 6 х 55РЕ, 5 х розчині Денхарда, 0,195 505, 0,1мг/мл денатурованої

ДНК. Тт для олігонуклеотидних проб визначають за допомогою наступної формули:

Тт("С)-2(кількість Т/А пар основ)а4(кількість С/Спар основ)

Ібидоз, 5.М., Т. Міуаке, Е.Н. Камавзпіте, М.). допзоп, К. МКакига, А.В. УМаїІасе (1981) ІСМ-ОСІ А Зутри.

Оєу. Віо!. Овіпд Ригійєа Сепез, 0.0. Вгомлп (єд.), Асадетіс Ргев5, Мем Хогк, 23:683-6931І.

Промивання звичайно виконують так, як описано нижче: (1) Двічі при кімнатній температурі протягом 15 хвилин у 1 х 55РЕ, 0,195 505 (промивання низької жорсткості) (2) Один раз при температурі гібридизації протягом 15 хвилин у 1 х 55РЕ, 0,195 505 (промивання в умовах помірної жорсткості).

Модифікація генів та токсинів. Гени та токсини, корисні згідно з предметом винаходу, включають не тільки специфічні наведені послідовності, але також і частини та/або фрагменти (включаючи внутрішні та/або термінальні делеції у порівнянні з білками повної довжини), варіанти, мутанти, замісники (білки, що мають заміщені амінокислоти), химери та злиті білки, які зберігають характерну пестицидну активність білків, наведених у даній заявці. Як такі, що використовується у контексті даної заявки, терміни "варіанти" або "варіації" генів відносяться до нуклеотидних послідовностей, які кодують такі самі токсини, або які кодують еквівалентні токсини, що мають таку саму або суттєво таку саму біологічну активність проти цільових шкідників, що і заявлені токсини.

При використанні відомих методик гени можуть бути модифіковані, а також можуть бути сконструйовані варіації генів. Наприклад, методика для здійснення точкових мутацій добре відома у даній галузі. Також

Патент США Мо5,605,793, наприклад, описує способи для одержання молекулярної різноманітності при використанні ДНК, розщепленої після рендомної фрагментації. Фрагменти генів повної довжини можуть бути створені при використанні комерційно доступних ендонукпеаз та екзонуклеаз, а також при використанні відомих способів. Наприклад, такі ферменти, як Ва!31! або сайт-направлений мутагенез, можуть використовуватись для систематичного відрізування нуклеотидів від кінців цих генів. Крім того, гени, які кодують активні фрагменти, можуть бути одержані при використанні різноманітних ферментів. Протеази можуть використовуватись для прямого одержання активних фрагментів цих токсинів.

Еквівалентні токсини та/або гени, що кодують ці еквівалентні токсини, можуть бути одержані з ізолятів

ВІ. та/або ДНК бібліотек при використанні методик, що наведені у даній заявці. Існує цілий ряд методів одержання пестицидних токсинів згідно з даним винаходом. Наприклад, антитіла до пестицидних токсинів, розкриті та заявлені у даній заявці, можуть використовуватись для ідентифікації та ізоляції інших токсинів з суміші білків. Зокрема, антитіла можуть бути одержані до частин токсинів, які відрізняються постійністю, та є найбільш відмітними серед інших токсинів В.І. Ці антитіла можуть потім використовуватись для специфічної ідентифікації еквівалентних токсинів з характеристичною активністю за допомогою імунопреципітації, фермент-зв'язуючого імуносорбентного аналізу (ЕГІБА), або методу вестерн-блотгінгу. Антитіла до токсинів, розкритих у даній заявці, або еквівалентів токсинів, або фрагментів цих токсинів можуть бути легко одержані при використанні стандартних методик, відомих у даній галузі техніки. Гени, які кодують ці токсини, можуть потім бути одержані з мікроорганізму.

Завдяки виродженості генетичного коду, широка різноманітність різних послідовностей ДНК може кодувати ті самі амінокислотні послідовності. Для спеціаліста у даній галузі не складає труднощів створити ці альтернативні послідовності ДНК, що кодують такі самі, або суттєво такі самі, токсини. Ці варіантні послідовності ДНК також складають предмет даного винаходу. Як таке, що використовується у контексті даної заявки, позначення "суттєво така сама" послідовність відноситься до послідовностей, що мають заміни амінокислот, делеції, вставки, або інсерції, які суттєво не впливають на пестицидну активність.

Фрагменти, що зберігають пестицидну активність, також включаються у дане визначення.

Еквівалентні токсини будуть мати амінокислотну подібність (талабо гомологію) з представленим токсином. Амінокислотна подібність/ідентичність буде типово більшою, ніж 6095, бажано більшою, ніж 75905, більш бажано більшою, ніж 8095, навіть більш бажано більшою, ніж 9095, та може бути більшою, ніж 9595.

Бажані полінуклеотиди та білки, що складають предмет винаходу, можуть також бути визначені у певних інтервалах особливої ідентичності та/або подібності. Наприклад, ідентичність та/або подібність може бути 49,50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, або 9995 у порівнянні з послідовністю, представленою у даній заявці. Якщо не визначено інше, то як такий, що використовується у контексті даної заявки, процент ідентичності послідовності та/або подібності двох нуклеїнових кислот, визначається при використанні алгоритму Кагіїп, Ай5спиі (1993), Ргос. Майї. Асад. Зсі. ОБА 90: 5873-5877.

Вказаний алгоритм включений у МВІАЗ5Т, ХВІА5Т програми АЇївепциїЇ еї аї. (1990), 9У. Мої. Віої. 215: 402-410.

ВГА5Т нуклеотидне дослідження проводили за допомогою програми МВІАБТ, рахунок-100, загальна довжина-1!2, для одержання нуклеотидних послідовностей з бажаним процентом ідентичності послідовності. Для одержання геп вирівнювання з метою порівняння використовували сарреа ВІ А5Т так, як описано у Ай5Бсепиі еї аї. (1997), Мисі. Асіаз Ке5. 25: 3389-3402. Коли використовували ВІ А5Т та Саррей

ВГА5Т програми, користувались відсутніми параметрами відповідних програм (МВГАЗТ, ХВІА5Т). Див. пЕр:у/лумлиу.пері.піп.дому. Значення ідентичності також підраховували, використовуючи методи та алгоритми

СкКкгісктоге еї аї. як описано у розділі "Передумови винаходу" вище.

Амінокислотна гомологія буде найвищою у критичних ділянках токсину, які відповідають за біологічну активність або втягнені у визначення трьохвимірної конфігурації, яка відповідає за біологічну активність. У цьому зв'язку, певні заміни амінокислот є прийнятними, і очікується, що коли ці заміни знаходяться у ділянках, які не критичними для активності або є консервативними амінокислотними замінами, що не впливають на трьохвимірну конфігурацію молекули. Наприклад, амінокислоти можуть знаходитись у наступних класах: неполярні, незаряджені полярні, основні та кислотні. Консервативні заміни, коли амінокислота одного класу замінюється іншою амінокислотою того самого типу, також охоплюються предметом даного винаходу, оскільки така заміна матеріально не змінює біологічну активність сполуки.

Таблиця 1 забезпечує список амінокислот, що належать до кожного класу.

Таблиця 1

РПпе, Тр полярні сп

У ряді випадків, можуть бути зроблені також і неконсервативні заміни. Критичним фактором є той факт, чи не будуть ці заміни суттєво зменшувати здатність рослин експресувати послідовності ДНК, що складають предмет винаходу, або чи не будуть вони впливати на біологічну активність токсину.

Як такий, що використовується у контексті даної заявки термін "ізольовані" полінуклеотиди та/або "очищені" токсини відноситься до таких молекул, які не асоційовані з іншими молекулами, разом з якими їх знаходять у природі: це може включати їх використання у рослинах. Таким чином, поняття "ізольований" та/або "очищений" означає привнесення людської діяльності, як описано у даній заявці.

У той час як предмет винаходу забезпечує специфічні використання синтетичних генів, інші гени, які є функціональними еквівалентами генів, представлених у даній заявці, також можуть використовуватись для трансформації хазяїв, бажано рослинних хазяїв. Додаткові вказівки для одержання синтетичних генів можуть бути знайдені у, наприклад, патенті США Ме5,380,831.

Рекомбінантні хазяї. Гени, що кодують токсин згідно з предметом винаходу, можуть бути вбудовані у широку різноманітність мікроорганізмів або рослинних хазяїв. У бажаних втіленнях, експресія гену токсину приводить прямо або опосередковано до внутрушньоклітинного утворення та наявності пестициду. Коли трансгенні/рекомбінантні/ трансформовані хазяйські клітини споживаються шкідниками, шкідники будуть споживати також і токсин. Це є бажаним способом, який забезпечує контакт шкідника з токсином. Результат є контролем (вбитий або ослаблений) шкідника.

У деяких втіленнях предмету винаходу, трансформовані мікроорганізми-хазяї можуть використовуватись на попередніх етапах для приготування попередників, наприклад, які принагідно будуть використовуватись для трансформації, у бажаних втіленнях, рослинних клітин та рослин, що експресують токсини, які кодуються генами згідно з предметом винаходу. Трансформовані мікроорганізми, що використовуються таким чином, потрапляють у сферу предмету винаходу. Рекомбінантними мікроорганізмами можуть бути, наприклад, В.., Е.соїї, або Рзендотопав.

Одержання різноманітних рекомбінантних організмів може бути здійснене спеціалістом у даній галузі за допомогою стандартних способів. Матеріали, що необхідні для здійснення трансформації, розкриті у даній заявці або у протилежному випадку вони обмежуються тими, що є в наявності у спеціалісті у даній галузі.

Широка різноманітність способів доступна для вбудовування гена В.ї., що кодує токсин, у цільового хазяїна в умовах, що дозволяють одержати стабільну наявність та експресію гена. Ці методи добре знайомі спеціалістам у даній галузі, та описані, наприклад, у Патенті США Ме5,135,867, який включено у дану заявку як посилання.

Гени, що кодують токсин згідно з предметом винаходу, можуть бути вбудовані при використанні придатного вектора у широку різноманітність мікроорганізмів та рослинних хазяїв. Існує багато культур, що представляють інтерес, такі як кукурудза, пшениця, рис, бавовник, соя та соняшник. Певні гени, що складають предмет винаходу, є особливо придатними для забезпечення стабільного вмісту та експресії у трансформованій рослині гена, що експресує пестицидний поліпептид, та, бажано, забезпечує покращений захист пестициду від деградації та інактивації в умовах навколишнього середовища . Експресія гену токсину приводить прямо або опосередковано до інтрацелюлярного одержання та унаявності білків пестициду.

Таким чином, цільовий шкідник може контактувати з пестицидними білками шляхом споживання рослинних тканин, що містять пестицидні білки, які є токсичними для шкідника. Результат представляє собою контроль шкідника. Альтернативно, придатні мікроорганізми-хазяї, наприклад, Рзендотопах Яцогезсеп5, можуть бути застосовані у місцях, де є шкідники, та де деякі з них можуть розмножуватись, та споживатись цільовими шкідниками.

Коли токсин В.І. вбудовується за допомогою придатного вектора у мікроорганізм-хазяїн, та вказаний хазяїн застосовують у навколишньому середовищі у живому вигляді, можуть використовуватись певні мікроорганізми-хазяї. Мікроорганізми-хазяї вибирають з тих, що відомі як такі, що охоплюються поняттям "фітосфера" (філоплан, філосфера, ризосфера та/або ризоплан) для однієї або більше культур, що представляють інтерес. Ці мікроорганізми вибирають таким чином, щоб вони були здатними до успішної конкуренції у конкретному навколишньому середовищі (в залежності від культури та особливостей комахи) з мікроорганізмами дикого типу та забезпечували стабільні існування та експресію гена, що кодує поліпептидний пестицид, та, бажано, забезпечували покращений захист пестициду від деградації та інактивації в умовах навколишнього середовища.

Відома велика кількість мікроорганізмів, що населяють філоплан (поверхня листя рослин) та/або ризосферу (грунтове оточення коренів рослин) широкої різноманітності важливих культур. Такі мікроорганізми включають бактерії, водорості та гриби. Особливий інтерес представляють собою такі мікроорганізми, як бактерії, наприклад, родів Рзейдотопав5, Егміпіа, Зегтайа, КіерзіеІ( а, Хапіпотопав,

Зігеріотусез, АПігобішт, АПподорзейдотопавз, Меїпуорпіїйй5, Адгорасієпйт, Асеїобасієг, ІасюбБасйив,

Агпіпгорасіег, Агоїорасіег, Іеисоповіос, Аїісаїдепев5; гриби, особливо дріжджі, наприклад, роди бБасспаготусев5, Сгуріососси5, Кідумеготусе5, Зрогороїотусез5, ЕПоадоїогица, Аєйцгеоразідішт. Особливий інтерес представляють собою такі бактеріальні види фітосфери, як Рзендотопах зугіпдае, Рзендотопав

Порогезсеп5, Зеїтайа тагсезеєп5, Асеїйорасієг хуїїпит, Адгобасієгт Шштеїасієп5, Аподорзендотопав врпегоїдез, Хапіпотопав сатревігів, ВНпПігобрішт теїїоїї, АІсаїдепе5 епігорпив5, Агоїобасіег міпіапаії; види дріжджів фітосфери такі, як КПподоїогшіа гирга, МК. дішіпі5, К. тагіпа, К. ашгапіаса, Стуріососсив5 аїрідив, б.атеепв, С.Іашйгепії, Засспаготусевз гозеї, 5.ргеюгпепвів, 5.сегемівіає, 5рогороотусев гозеив5, 5.0догив,

Кіпумеготусев5 мегопає, Айгеоравзідішт ройшіап5. Особливий інтерес представляють пігментовані мікроорганізми.

Існує широка різноманітність шляхів для вбудовування гена Ві., що кодує токсин, у цільові хазяї в умовах, які передбачають існування та експресію гена. Ці методи добре відомі спеціалісту у даній галузі, та описані, наприклад, у Патенті США Мо5,135,867, що введений у дану заявку як посилання.

Обробка клітин. Як було згадано вище, клітини В.І. або рекомбінантні клітини, що експресують токсин

Ві, можна обробляти для пролонгування активності токсину та стабілізації клітини. Пестицидні мікрокапсули, що утворюються, включають токсин В. усередині клітинної структури, яка є стабілізованою та захищає токсин у тому випадку, коли мікрокапсула буде використовуватись в умовах навколишнього середовища для боротьби з цільовою комахою. Придатні клітини-хазяї можуть включати як прокаріотичні, так і еукаріотичні клітини, звичайно вони обмежені тими клітинами, що не продукують токсичних для вищих організмів, таких як ссавці, речовин. Проте організми, які виробляють речовини, токсичні для вищих організмів можуть використовуватись у тому випадку, коли токсичні речовини є нестабільними або рівень застосування достатньо низький і дозволяє уникнути будь-якої можливості токсичності для клітин ссавців.

Хазяями, що представляють собою особливий інтерес, можуть бути прокаріоти та нижчі еукаріоти, такі, як гриби.

Клітини звичайно повинні бути непошкодженими, та при цьому бажано, щоб вони були суттєво у проліферативній формі під час обробки, а не у формі спор, хоча у деяких випадках можуть використовуватись спори.

Обробка клітини мікроорганізму, наприклад, клітини мікроорганізму, що містить ген токсину ВІ., може бути проведена хімічним або фізичним методами, або шляхом комбінації хімічних та/або фізичних методів, таким чином, щоб метод не мав руйнівного ефекту на властивості токсину, та не знижував здатності клітин захищати токсин. Прикладами хімічних реагентів є галогенові агенти, особливо галогени з атомним номером 17-80. Зокрема, йод може використовуватись у м'яких умовах та протягом достатнього часу для досягнення бажаних результатів. Інші придатні методи включають обробку альдегідами, такими як глутаральдегід; антиінфекційними агентами, такими як зефіран хлорид та цетилпіридин хлорид, спиртами, такими як ізопропіл та етанол; різноманітними гістологічними фіксаторами, такими як йодний розчин

Люголю, фіксатор Буїнса, різноманітні кислоти та фіксатор Геллі |див. Нитапзоп, Огеїспеп Г.., Апітаї! Тіз5це

Тесппідиез, М.Н. Егеетап апа Сотрапу, 1967); або комбінацію фізичних (теплових) та хімічних агентів, які зберігають та підтримуують активність токсину, що виробляється у клітині, якщо клітина призначена для застосування в умовах навколишнього середовища. Прикладами фізичних методів є радіація хвилями короткої довжини, такими як гамма-радіація, Х-радіація, тощо, а також заморожування, ультрафіолетова радіація, ліофілізація, тощо. Методи обробки клітин мікроорганізмів розкриті у патентах США Мо4,695,455 та 4,695,462, які включені у дану заявку як посилання.

Клітини звичайно будуть мати покращену структурну стабільність, що буде поліпшувати резистентність до умов навколишнього середовища. Якщо пестицид знаходить у проформі, метод обробки клітини може бути вибраний таким чином, щоб не інгібувати процесування проформи у зрілу форму пестициду цільовою комахою шкідником. Наприклад, формальдегід може перехресно зв'язувати білки та буде інгібувати процесування проформи поліпептидного пестициду. Спосіб обробки повинен зберігати, принаймні, суттєву частину біодоступності або біоактивності токсину.

Характеристики, що представляють особливий інтерес у виборі хазяйської клітини з метою одержання токсину, включають легкість вбудовування гену Вії. у хазяїна, доступність експресійних систем, ефективність експреси, стабільність у хазяїні та присутність допоміжних генетичних можливостей.

Характеристики, що представляють інтерес для використання як пестицидні мікрокапсули, включають протективні якості для пестициду, такі як товщина клітинних стінок, пігментація та внутрішньоклітинне спаковування або формування тіл включення; здатність до виживання в умовах водного навколишнього середовища; відсутність токсичності для ссавців; привабливість для шкідників як джерела живлення; легкість знищення та фіксації без пошкодження токсину, тощо. Інші положення включають легкість приготування та застосування, економічні показники, стабільність при зберіганні тощо.

Вирощування клітин. Клітинний хазяїн, що містить інсектицидний ген В.ї., можна вирощувати на будь- якому придатному поживному середовищі, бажано на тому, де для ДНК конструкції забезпечується умови селективної переваги, а також такому селективному середовищі, що забезпечує, збереження гена В. усіма клітинами. Ці клітини можна потім збирати прийнятними способами. Альтернативно, клітини можуть піддаватись обробці перед збиранням.

Клітини В. згідно з винаходом можуть культивуватись при використанні стандартного середовища та способів ферментації. Після закінчення ферментаційного циклу бактерії можна збирати шляхом першого відокремлення спор В.І. та кристалів з ферментаційного бульону за допомогою методів, відомих у даній галузі техніки. Відновлені спори В. та кристали можуть бути введені у порошки, здатні до змочування, рідкі концентрати, гранули або інші прописи шляхом додання сурфактантів, диспергуючих речовин, інертних носіїв та інших компонентів для покращення приготування та застосування для певних цільових комах. Ці методи приготування та застосування добре відомі у даній галузі техніки.

Приготування. Приготовлені гранули принади, що містять атрактант, спори та кристали ізолятів В.І., або рекомбінантні мікроорганізми, що включають гени, одержані з ізолятів В.ї., розкритих у даній заявці, можуть застосовуватись для грунту. Приготовлений продукт може також використовуватись для обробки насіння або обробки коренів або загальної обробки рослини на більш пізніх стадіях розвитку культури. Обробка грунту та рослини клітинами Вії. може проводитись порошками, здатними до змочування, гранулами та дуетами шляхом змішування з різноманітними інертними матеріалами, такими як неорганічні мінерали (філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати та інш.) або ботанічними матеріалами (роздрібненими початками кукурудзи, рисовим лушпинням, горіховою шкаралупою, тощо). Прописи можуть включати склеювальні агенти, ад'юванти, стабілізуючі агенти, інші пестицидні добавки, або сурфактанти. Рідкі прописи можуть базуватись на воді або неводній основі та застосовуватись як піни, гелі, суспензії, емульговані концентрати, тощо. Інгредієнти можуть включати реологічні агенти, сурфактанти, емульгуючі речовини, або полімери.

Як може бути зрозуміло для спеціаліста у даній галузі, концентрація пестицидів може варіювати у широких межах в залежності від природи певного пропису, зокрема від того, чи може концентрат або композиція застосовуватись безпосередньо. Пестицид може бути присутній у кількості, що складає принаймні 195 від ваги, а може складати 100905 від ваги. Сухі прописи можуть містити пестицид у кількості приблизно 1-9595 від ваги пестициду, у той час як рідкі прописи мають приблизно 1-6095 по вазі твердої речовини у рідкій фазі. Прописи звичайно будуть містять приблизно від 102 до приблизно 10"клітин/мг. Ці прописи будуть призначатись у кількості від приблизно 50мг (рідкий або сухий препарат) до 1кг або більше на гектар.

Прописи можуть застосовуватись в умовах навколишнього середовища, де знаходяться шкідники, наприклад, на фунті, листі, шляхом розпилення, розбризкування, тощо.

Мутанти. Мутанти ізолятів згідно з винаходом можуть бути одержані за допомогою методів добре знайомих спеціалісту у даній галузі. Наприклад, аспорогенний мутант може бути одержаний шляхом етилметан сульфонатного мутагенезу ізолятів. Мутанти можуть бути одержані при використанні ультрафіолетового світла та нітрозогуанідину за допомогою методів, що знайомі спеціалісту у даній галузі.

Менша кількість аспорогенних мутантів буде залишатись непошкодженою та не піддається лізису протягом ферментаційного періоду, ці штами позначають як лізис мінус (-). Лізис (- штами можуть бути ідентифіковані шляхом відбору аспорогенних мутантів у перемішуваному середовищі, при цьому відбирають ті мутанти, які залишаються непошкодженими та містять кристали токсину у кінці ферментації.

Лізис мінус штами є придатними для процесу обробки клітин, що дає змогу одержувати захищений, інкапсульований білок токсину.

Для приготування резистентного до фагу варіанту вказаного аспорогенного мутанту, аліквоти фагового лізату переносять у поживний агар та піддають висушуванню. Аліквоти чутливого до фагу бактеріального штаму потім висаджують безпосередньо на висушений лізат та піддають висушуванню. Чашки інкубують при температурі 30"С. Чашки інкубують протягом 2 днів, у цей час можна побачити незлічені колонії, що ростуть на агарі. Деякі з цих колоній відокремлюють та піддають субкультивуванню на поживному агаровому середовищі. Ці явно резистентні культури випробують на резистентність шляхом висівання штрихом фагового лізату. Фаговий лізат висівають штрихом на чашку та піддають висушуванню. Культури, як передбачається, є резистентними, не демонструють лізису ніде при посіві штрихом фагового лізату після інкубації протягом ночі при температурі 30"С. Стійкість до фагу потім повторно підтверджують шляхом висівання шару стійкої культури на поживному агаровому середовищі. Чутливий штам також висівають таким самим чином для позитивного контролю. Після висушування краплю фагового лізату переносять у центр чашки та піддають висушуванню. Стійкі культури не демонструють лізису у зоні, де наявний фаговий лізат після інкубації при температурі 30"С протягом 24 годин.

Усі патенти, патентні заявки, та публікації що згадуються або цитуються у даній заявці введені у дану заявку як посилання.

Нижче наведені приклади, що ілюструють способи для здійснення винаходу. Вказані приклади не повинні сприйматися як такі, що обмежують даний винахід.

Приклад 1- біологічний аналіз активності СгУ1Е проти гусені совки іпсілон (Аадгоїї5 ірзіоп: І ерідоріега:

Мосшідає)

Біологічну активність СтуїЕ проти гусені совки іпсілон (ВСМ/) визначали при використанні стандартної процедури біоаналізу за допомогою МК872 (клон Рзейдотопаз Пиогезсеп5, що експресує сгу!Ра/сгут АБ химерний ген, розкритий у патенті США Ме5,840,554), ліофілізованими порошковими препаратами. ВСУМ біоаналізи проводили шляхом введення тестових зразків у штучні раціони та прилучення гусені до обробленого та необробленого раціонів. Усі аналізи проводили зі штучними раціонами ВСУУ (Віобегм

Согрогайоп, Егепспіомуп, МУ). Тести проводили шляхом перемішування зразків зі штучними раціонами (попередньо охолодженими до 55"С або нижче) у кількості бмл суспензії плюс 54мл раціону. Численні концентрації для обробки готували шляхом серійних розведень. Після перемішування суміш переносили у пластикові лотки, що були розділені на компартменти по Змл (Мишїгепі Сопіаіпег Согрогайоп, УЧаскзопміІе,

ЕУ) при нормі приблизно ЗОмл раціону на 24 комірковий лоток (кожна комірка наповнювалась наполовину).

Лотки з більшими комірками використовували для проведення біоаналізів з комахами третього етапу розвитку або старшими, вони також наповнювались приблизно наполовину штучним раціоном. Контролем служили комірки, наповнені водою без додання матеріалу, що піддавали тестуванню. Після 30 хвилин витримування для охолодження та осадження раціонів, гусінь (Ггепсп Ад Кезоигсе5, Іатрепоп, ММ) переносили на поживну суміш, при нормі одна особина на комірку. Комірки потім запечатували за допомогою мелованого паперу (Сіеагі ат Раскадіпа, І), використовуючи цвяхи, та робили декілька дірок у кожній комірці для забезпечення газообміну. Гусінь витримували при 25"С протягом б днів при витримуванні при 14:10 (світлостемрява) в кімнатних умовах. Смертність та затримку у рості визначали приблизно через 6 днів. Для І Сво біоаналізу проводили мінімум З повтори, кожний з 5-7 дозами та при кількості приблизно 24 комахи на дозу. Результати представлені у Таблиці 2 (Біоаналізи проти гусені Адгоїі5 ірзіоп першого та третього етапу розвитку з МК872 Сту1Е ліофілізованим роздрібненим препаратом)

Таблиця 2 розвитку | тестування комах комах смертності 1 5 5 юЮюжю«кКУГг 9 | 46 | 249 | 178 | 790 | 220 | 6 3 | з | 4 | 717 | 67 | 22 | 249 | 75 | 0

Приклад 2 - Ефективність Стуї1Е принад проти гусені совки іпсилон

Стуї1 тестували на активність проти гусені совки іпсілон, використовуючи прописи принади. Клони

Ме872 змішували з комерційною принадою (5оїЇбегм, Заїіпа5, СА), та одержану суміш розбризкували на поверхню грунту поблизу проростків пшениці (ростова стадія 1,5) при нормі 50 ІБ принади на акр. Дві концентрації Стуїб тестували шляхом додання різної кількості токсину до принади, отримуючи норми, еквівалентні 6,25г та 12,5г Сгу1Е токсину /акр. Коли рослини потім заражали гусінню 3-ього та 4-ого етапу розвитку при нормі приблизно 1 комаха на 5 рослин, пошкодження рослин визначали через 24-48 годин.

Значення пошкоджень коливалось від 0 до 4, 0 визначали для рослин, що були винищені повністю до грунту, та 4 для рослин, що не мали явних пошкоджень. Контролі включали рослини, біля яких не розкладували принаду ("без принади"), принаду додавали без токсину ("порожня принада") та рослини без принади або без комах ("контроль"). Результати представлені на фігурах 1 та 2.

Приклад З - Ефективність трансгенних Сг/1Е рослин соняшника проти Аогоїї5 урзіоп, що вимірювалась як показник росту комах та їх смертність, а також пошкодження рослини

Обробка рослин: - Контрольні сходи на М2 стадії - ВІ. сходи на М2 стадії (донори з фіксованими моделями генів); ці рослини експресували ген суттєво такий, що представлений ЗЕО ІЮ МО:З

Комаха: Адгоїїз урзіїоп. Гусінь другого етапу розвитку (третє лабораторне покоління).

Випробування: ВІ. проростки: п'ять повторів, п'ять проростків на повтор, одна гусінь на проросток.

Контроль: п'ять повторів, п'ять проростків на повтор, одна гусінь на проросток.

Пропис: - Кожний повтор складався з п'яти насінин, які висаджували прозорі прямокутні піддони (15см х 25см) та закривали для обмеження розвитку гусені. - Кожний повтор інфікували за допомогою п'яти гусеней. Піддони витримували у кімнаті при температурі 25"7С та 7595 вологості. Оцінку проводили через 24, 48, 72 та 96 годин після інфікування.

Оцінка: 1. Рослини відносили до непошкоджених, пошкоджених (пошкоджене стебло, сім'ядолі або листя) або пошкоджені нижче сім'ядолей. Оцінку наведено для кожного повтору: 1 (непошкоджені рослини або зі стеблом, що має декілька пошкоджень) до 9 (усі рослини пошкоджені та більше 8095 тканин з'їдено). 2. Комахи - через 96 годин після зараження підраховували кількість гусені, що загинула, а гусінь, що вижила, зважували. 3. Дані аналізували шляхом випадкового аналізу таблиці.

Результати: Представлені таблиці, які показують чотири повтори (через 48 та 96 годин після зараження). Дані представлені у наступних таблицях, що показують оцінку повторів через 24, 48, 72 та 96 годин після зараження Адгоїї5 урзіїоп.

Таблиця З

Через 24 години після зараження

Днів піді стовй Піст НІС

Повтор рослин рослин рослин 1 | 2 | 2 1 2 | 0 | 1! | з | 1! | 5 2 | 3 | з | 0 | 1! | 2 | 1! | з | 4 3 | з | 2 | 2 | 0 | 0 | з | 2 | 5 4 | з | 1 | 0 | 2 | 0 | 2 | 2 | з

| 4 | 2 | 0 | 2 | 1! | 1! | 2 | з

Таблиця 4

Через 48 години після зараження

ЕЕ нин Бій ній Поні НСС

Повтор рослин рослин рослин 2 | 2 | 0 | 1 | 2 | 2 | з | з | 7 3 Ї 1 ЇЇ 1 1 1 | 0 | з | 44 | з | 7 4 ЇЇ 2 | 1 1 0 | 0 | з | 44 | 44 | 7

Таблиця 5

Через 72 години після зараження

Енн іні аніній Пі стіній НС

Повтор рослин рослин рослин 1 2 | 0 | 1 | 0 | з | 5 | з | 9 2 | 0 | 0 | з | 0 | 2 | 5 | 4 | 9 3 | 1 | 0 1 | 0 | з | 5 | 5 | з 4 ЇЇ 1 | 0 11 0 | 0 | 4 | 5 | 6 | 9 5 | 2 | 0 | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 | з

Таблиця 6

Через 96 годин після зараження таня ретинол они ІЖтУУ

Повтор Інепошкоджених рослин рослин рослин померлої гусені 1 ЇЇ 3 | 0 | 0 | 0 |2| 5 | з | 9| 4 2 | 0 ЇЇ 0 | 2 | 0 |з | 5 | 7 | 9 | о 3 | 1 ЇЇ 0 | 0 | 0 | 4 | 5 | 5 | 9| о 4 | 0 | 0 | о | о | 5 | 5 | 6 | 9 | о 5 | 1 | 0 | 0 | 0 | 4 | 5 | 6 | 9 | о

Таблиця 7

Вага гусені (мг) через 96 годин після зараження

Кількість гусені на повтор

Середнє значення 90 191 121

Конт. | 215 | 200 | 90 | 120 | 60 | 157 4 -вЕ----5- 107 174 5-0 77 177

Чотири повтори, оскільки в одному повторі гусінь загинула

Висновок: ВІ. проростки показали активність проти Адгоїї5 урзіоп при високому рівні зараження (1 гусінь на проросток). Ця активність була достатньою для негативного ефекту на ріст гусені у порівнянні з контролем.

Приклад 4 - Контроль совки іпсілон (ВСМ/) з новим Сгу1Е видом кукурудзи

Резюме. Здатність десяти Сгуїб дослідів кукурудзи (що експресують суттєво полінуклеотид послідовності 5ЕО ІЮ МО:3 до боротьби з совкою іпсілон (Адгоїїв ірзіоп (Нитадеї)) у польових умовах порівнювали з двома гібридами, що не містять ВІ. (контроль 1 та контроль 2), гібридом, що експресує

СгуїАБ, та гібридом, що експресує Сгту9С білок. Усі досліди Сгу1!Е забезпечували добрий захист проти пошкодження насаджень у порівнянні з гібридами, що не містять В...

Матеріали та методи. 25 насінин кожного повтору, занесеного у список, висаджували, використовуючи конусний висадник Альмако протягом першого дня. Висаджували чотири повтори - кожний вирощували окремо. Ряди висаджували попарно з незасадженою стежкою між кожною парою рядів. На кожній ділянці ставили огорожу за допомогою електричного металевого бар'єру, що сягав 8 дюймів у висоту, 2,5 фути завширшки та б футів у довжину. Бар'єр закопували у землю на глибину 2 дюйми на 13-14 день. Краї бар'єру оброблювали бензиновим желе для відлякування гусені. Пшеничну солому розкидували за бар'єрами для забезпечення сховища для совок. Зразу ж після появи занесені у список рослини, що містили СгуїР, тестували зі смугами Еїїза та насадження проріджували до 10 рослин шляхом видалення рослин, що не мали експресії або тих рослин, що мали понадекспресію. На трьох ділянках кількість рослин, що залишилася, складала 8 або 9. Рослини, що не містили Сгуї!Е, також проріджували до 10 рослин.

Невеликі пластикові кілочки розміщували за кожною рослиною, коли ставало очевидно, що рослина зникла, якщо це траплялося. На 15 день, коли рослини досягали пізньої М1 або ранньої Ма2 стадії, три гусені совки іпсілонтретього етапу розвитку переносили на кожну рослину. Друге зараження двома гусенями совки іпсілон четвертого етапу розвитку проводили на 19 день.

Ділянки перевіряли кожного дня від 16 до 26 дня. Додаткову оцінку проводили на 29 день на заключний підрахунок на 34 день. Будь-яку рослину, що мала пошкодження, помічали за допомогою маленького пластикового кілочка попереду рослини, а тип пошкодження записували на сторінці з даними. У кінці досліду та при заключному підрахунку кілочки збирали.

Результати. Середній рівень пошкоджень совками іпсілон був досягнутий у цьому досліді, що призводив до зменшення у деяких варіантах, що не мали В. З невідомих причин у цьому досліді Існувала тенденція до загибелі рослин замість їх поїдання. З цієї причини дані на загиблих рослинах також порівнювали.

Таблиця 8 показує тип рослини та процент зменшення насаджень (95 5К) та процент пошкоджених рослин (96 Юат) для кожного типу рослин. Зменшення насаджень означало, що рослина загинула.

Пошкоджені рослини мали очевидні пошкодження, але не втрачали своєї точки росту.

Таблиця 8 дослід насаджень рослин

Без Ві Контрольї| 475 | 60 7188007 | 0 | Б щящ5 058 2 щЩщЩ | 28 | 9 227 | 0 | ж жщЩ 5

Ці результати графічно представлені на Фігурах З та 4.

Хоча у жодному з дослідів не були відсутні пошкодження, це не є несподіваним, оскільки гусінь мусить з'їсти рослину до її загибелі. Проте, одержані фотографії ясно показують як слабко пошкоджені Сгуїг рослин, так і повністю з'їдені контрольні рослини.

Приклад 5 - Вбудовування генів токсину у рослини

Одним з аспектів предмету винаходу є трансформація рослин за допомогою полінуклеотидних послідовностей, що складають предмет винаходу, та кодують інсектицидні токсини. Трансформовані рослини є стійкими до нападу цілього шкідника. Бажані гени для використання згідно з предметом винаходу оптимізовані для використання на рослинах. Приклади активних по відношенню до совки іпсілон токсинів та генів для використання згідно з предметом винаходу показані у ЗЕО ІО МО:1-8. Білок та ген, що представлені послідовностями 1 та 2, є найбільш бажаними.

Очевидно, що необхідна промоторна ділянка, здатна до експреси гена. Таким чином, для експресії у рослині ДНК згідно з предметом винаходу повинна знаходитись під контролем та повинна бути оперативно зв'язана з придатною промоторною ділянкою.

Методи для одержання експреси у рослині при використанні таких конструкцій добре відомі у даній галузі техніки.

Гени, що кодують пестицидні токсини, як розкрито у даній заявці, можуть бути вбудовані у рослинні клітини при використанні різноманітних способів, що добре відомі у даній галузі. Наприклад, велика кількість клонуючих векторів, що включають систему реплікації в Е.соїї та маркер, що дозволяє відбирати трансформовані клітини, є доступними для вбудовування сторонніх генів у вищі рослини. Такі вектори включають, наприклад, рВКЕ322, рис серію, МІЗтр серію, рАСУС184, тощо. Згідно з цим, послідовність, що кодує токсин Ві., може бути вбудована у вектор у придатному рестрикційному сайті. Одержана плазміда використовується для трансформації в Е.соїї. Клітини Е.соїї культивують у придатному поживному середовищі, потім збирають та піддають лізису. Плазміду відновлюють. З цією метою звичайно використовують аналіз послідовності, рестрикційний аналіз, електрофорез та інші біохімічно-молекулярні біологічні методи. Після кожної маніпуляції послідовність ДНК, що використовується, може бути очищена та приєднана до наступної послідовності ДНК. Кожна плазмідна послідовність може бути клонована таким самим чином, або для цієї мети можуть використовуватись інші плазміди.

В залежності від методу вбудовування бажаних генів у рослину, можуть бути необхідні інші послідовності ДНК. Якщо, наприклад, використовуються Ті- або Ві- плазміди для трансформації рослинних клітин, то, принаймні, правий кінець, але часто як правий, так і лівий кінці плазмідної ДНК Ті- або Ві- плазміди мають приєднуватись як фланкуючі ділянки генів, що вбудовуються. Використання Т-ДНК для трансформації рослинних клітин було інтенсивно досліджене та достатньо описане у заявці ЕР 120516;

Ноекета (1985) Іп: Тне Віпагу Ріапі Месіюог Зузіет, Огвеї-ашкКкКегі) Капієїз В.М., АІрбаззегаат, Спарієг 5;

ЕгаїІєу еїга)ї., Стії. Веу. Ріапі сі. 4:1-46; Ап еї а). (1985) ЕМВО 9. 4: 277-287.

Вбудована ДНК інтегрується у геном, вона є відносно стабільною, та як правило, не виходить з нього знову. Така ДНК у нормі містить селекційний маркер, що надає трансформованим клітинам стійкості до біоциду або до антибіотику, такого як канаміцин, 5418, блеоміцин, гігроміцин, або хлорамфенікол, поміж інших. Маркер, що індивідуально використовується, повинен дозволяти проводити відбір трансфоромованих клітин, що не містять вбудованої ДНК.

Велика кількість методів є доступною для вбудовування ДНК у хазяйські рослинні клітини. Такі методи включають трансформацію за допомогою Т-ДНК при використанні Адгобасіегішт іштеїасіеп5 або

Адгорасіегішт гілодепе5 як агентів трансформації, злиття, інжекцію, балістичні методи (бомбардування мікрочастинками) або електропорація, а також інші можливі методи. Якщо для трансформації використовується агробактерія, ДНК, що вбудована, може бути клонована у спеціальні плазміди, а також у вектор-посередник або у бінарний вектор. Вектори- посередники можуть бути вбудовані у Ті- або РВі- плазміду шляхом гомологічної рекомбінації завдяки послідовностям, що є гомологічними з послідовністю Т-

ДНК. Тті- або ві- плазміди також включають ділянку міг, необхідну для переносу Т-ДНК. Вектори-посередники не можуть реплікуватись самостійно в агробактерії. Вектори- посередники можуть бути перенесені в

Адгорасіегіцшт їитеїтасіеп5 за допомогою хелперної плазміди (кон'югація). Бінарні вектори можуть реплікуватись самостійно як в Е.соїї, так і в агробактерії. Вони включають маркерний ген та лінкер або полілінкер, який обмежений правою та лівою ділянками Т-ДНК. Вони можуть бути трансформовані безпосередньо в агробактерію |Ноїбвіег еї а. (1978) Мої. Сеп. Сепеї. 163: 181-187). Адгорасіегічт, що використовується як хазяйська клітина, включає плазмідну міг-ділянку. мі-ділянка необхідна для переносу

Т-ДНК у рослинні клітини. Також може міститися додаткова Т-ДНК. Бактерія, трансформована таким чином, використовується для трансформації рослинних клітин. Рослинні експлантати культивувують з

Адгорасієегічт їштеїасієп5 або Адгорасіегічт гігодепе5 для переносу ДНК у рослинні клітини. Цілі рослини потім регенерують з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, частинок листя, сегментів стебла, коренів, а також протопластів або суспензійно культивованих культур) у придатному середовищі, яке може містити антибіотики або біоциди для селекції. Одержані таким чином рослини можуть потім тестуватись на пристуність вбудованої ДНК. Нема ніяких спеціальних вимог до плазмід у випадку інжекції та елекгропорації. Можливо використовувати звичайні плазміди, такі як, наприклад, похідні рос.

Трансформовані клітини вирощують усередині рослин звичайним чином. Вони можуть утворювати зародкові клітини та передавати ознаки трансформації подальшим поколінням рослин. Такі рослини можна вирощувати звичайним чином та схрещувати з рослинами, що мають такі самі трансформовані наслідкові фактори або інші наслідкові фактори. Одержані гібридні Індивідуальні рослини мають відповідні фенотипічні властивості.

Зрозуміло, що приклади та втілення, описані у даній заявці, наведені тільки з метою ілюстрації та різноманітні модифікації та зміни у світлі останнього можуть бути запропоновані для спеціаліста у даній галузі, та можуть включатись згідно з духом та статтею заявки та пунктів формули, що додаються.

Зараження проростків пінениці гусінню совки іпсілон четвертого етапу розвитку. Маса непонкоджених про- растків- та відповідне значення пошкодження рослин. череч 24 години з 8. сек їЖ

Б Ж В ї сп в У 2 Оцінка ! - г птн 5 МасВ ; Кі ї и шо Ж Є З -Ж : :

ЩЕ щи 5 в й ї. гли

З 5 о й ЗШ. . як ШЕ.

Ж Без Порожня схууче спйсли Контроль принади принада

Фіг.

Е Сира вага прорістків пшениці. заражених гусінню третього

Кеі етапу розвитку через 4 тодин після зараження 5 в 8 но ж я м я в й й й сім - - - - с ні дл- а ШИ

Ге ши пою я ї- ж. Й пос аснния яеЄтНт ох шк в принади принада зущоа Тег» ! Фіг. 2

КТ НН

Ковтроль і "пики ов р он а ові ЩІ

ЗВАНИМИ ПИВ СНИ ПИЗОИИНЕ | ! що : Сей о ДЕННЯ ПИ сш но ШК зт Й З й | | й ! пизики жали | Ї ї стос ПИВ пд !

ДИ кома же : звз жона | : | і денно я я І ! й

Й зро БК Й : - і Її. | | | ! зВБ: і І ! з» питан яння і - і | Й ! зве пенні я ! ! | ЩЕ щ і ; ! і зве рвана І | | ; де Н і і р

М и | | н ї тов нії ! 1 І 1 зхРїв | І Й ння питання пе х пре рем 10 20 зо зо 50 ви ти

Бідсоток пошкоджених рослин

Фіг.З 0 Вознодій тестованих рослин, що грунтується на їх пошкодженні

Контроль З ами ліниво вн нс пивний винних

Контроль нави : пакрежннає " стулль нед вдснкавика і зав ВИННИКИ мая й и сую : 5533 х. І. ж й кущ тей . зо НН за тр | : - по чад ха збо чої аа

С- я - Відсоток зменшення насаджень (загибель рослин)

ФігА Розподіл тестових рослин, що базується на захисті від зменшення насаджень (загибель рослин)

СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ І

«10» Майкоджен Корпорейши «1202 Способи боротьби зі шкідником совкою «1305 МАТІОС «140» «1415 «1505 В «ЇТ0» Расзпств Уєт. 2.0 «2ійх 1 : «211з 3444 «212» ДНК «813»: Штучна послідовність жЕгаз «22із Синтетичний ген В. С токсину «йо» 1 асууачазса асасасадаа бсадтасавс сссбаснасс чесбсаасаа бсосдазоєа во чачаєссстса зсдазчацеу чисуастоус азаседсояс сачасавсве сосчесесеве 120 зсасатьссс сескЧссєча чсксостсса дусосоодая ссосчсккач согесксдас МО схсасссвууУ чесссассає сссаксосуає бЄодацестсе стстукстсса чассузасад 240 ссЧаскоаас зазосассуа зассвсоуаа зузазесячу ссабсастає сесесчвадо 306 «хтадсачаса шссзесчЧачає сезсаєкуза усастайаза ачсаоуааоє сСазссстаає 360 засусссває суачазазуа сокусуєакя сесссруєка асасядаєця вуссбсуаво 450 асадссасса асзассссас сестассацс сесчадаєсо стостссото даьстакукь а: саауссусста зссоцеассс дуссастасся сасчаєсчеко суссзсксза дсазачсказ 540 чаассоцчаса садссзсеує савасзаєсає сасзасзуас ссазбсаассу давссаєсча бо сасасцуааас асггсусекоча касесасазе садудассо адаасссчад заухассааєс 650 асссуссаз: чадссачаих сзассацесс здозсадчасс сезсасссає кобекрачає 720 асачекцскс тскскссуда стасдаєчс: суусасссзсс суаєссанас десаєсесза 780 сетасаачоч ачаєскасис садцессадес асеЧазцасс сессвуєввс косуваєсаса 840 ссезасоусе ссласауоде суадсскода бесвдассвс бесасстсає ддассссаєу 500 застссссує стосуассос ададассуєс азассссааа ссусосудчу адуасасеста 360 дссаусссас дсзасасдос судсаассеє абозассккс екадстасзу чассттсває 1020 " втсуудовся ссатссяцає сосадавуцаа дасссасуво сьсвсеавссу Чассеєчєса ї08о чассссотсє гсуєсссчача аододсессуче азсссесасє абсасасесоу ссесяасоаддча 1140 чечасссЕсе зесазаскач касузатсаєс ассосчсасах бсзачаастс бучдассаєт 15200

Чассссссад асувуасасс ассссазуає засачечусч сассссдоза єЧассасссс 1269 сасдкдссда ассасаствс стуссуснсуєс сучесауаєо ачакстсаду скссуаскся 1320 судачацсас сазкоуссссе ссодасосах сусадсеска сесссасаай сассасєдай 1380 ссадачадай ссасксачає ссессссоуєє задодсасяса сассесадес здсайскаса 1440 десусааугу Здоссуцечсс сасудоаеоча засабссксос дасусаєетаєч кусадуаєса 1500 стсусусаса ссатссутсва сассзасоду сваєтссосос азауусасся Сдссадчаєа 1550 суесасуссе ссоастассяа сстаауазес сасуссасод ссусацаста зсудаєсстев 1620 шетачссаяс псвасаацас засодасайс зусцасссяас ссасаєсссв абосссстсєс 1680 кзсчесаста ссзасассус чессассесє ссазветчачсс азадсачесс сасзусачеає ї740 чсесуасасст: ссзусссзодуа саасчвачеку сасассуаса зУуссечаечеє Частесвосе 1800 ассуссасас Ссдадчеача Фчкссуасско Чазацазчсас ачазучечус чаасчекску 1860 сссассссує ссаассачає содусссаау асачасуєча сксуастаєса саєсчаєсус 1320 чеккссаасс ссчссдаскоа сессесскоає дачесесьУєе сучаєсчачая дазочачесе 1980 сгсссачаао ссаззсасус саачечаєссс адечасдаде чузастсуєсс ссзачаєссс 2040 засестсус9 дчассзасая дсзасстачає счусоуасоача дч9ч3а9двас пцдасаєсасо 3100 асхссазоузу чечаїсзасує дессзадцач взассасуєса счссссточУ сасссссчаї 2160 чазсуссзсс саасасассс усассздазч асачасєчазу сдваастсяла адссстасаса 2990 ззасассзасє счуауачасса сассззачас зУссзачасо ссЗауаєсса ссесассача 4280 тасзасусєса азсасуацас ачесаасусу сссчочасоу чессассска чдесасескса 2340 чЧесссаацес ссассудесав деососссах сасксасасс вссбсксссс оддасасачас 24600 зсестлссаса сечасстува ссаачзссіс сусгусасоазу суасссссва Чассвацаст 4460 сззчасуцсс асоссачесі адусзаакску зазсеескад зачадзаасс зсссЧекуча 25320 заздссссся ссадачедаа дадодссчає аадаачезої чедасзачач ададаадксу 580 чаасуюдузай сазасассує чдсасаздачаа дссзаадааа усЯесдасче кесчєскос 2640 зассстсазс асдчасазчусс ссзадссчає зссзасабач ссаєчаєсса сусктосачає 7709 зазсусечсес зсадсасссу чозадетксас сессссуаас сбазсуєчає сссодуєаєс 2760 аахуссосса ссетсосуаача зссадаадоя сосакстсса ссдсабссссй сесоєзсдає 2820 чесадезасо ссассааува содсуасессс авсаакудсс саксссуєсо уазесусувавй 2880 чаЧсасосач агдсачазда асациасзає сасесуссссе кссЕшЧесЯс ссссцчачеча 7940 чезчедозач ссссаслаза ачессчечес судвсетачес чечуссасає ссессякчсе 3000 зссосусаса задазоцаса сузадаачує сусуєсасса сасасуадає суауаасааєс 30650 зссдасчауес сузадессад саассосоєсс даздадуавя сссзсссава сазасассяква 3120 зсстусазеу ассасассос засстсаацає саддсасуаду укасессасас сесксосзлає 3190 счзаочасасу зсодадсста сдадачевас ксссстоатає ссуседаєста сусаєсвуєс З540 кассасчача зЧчусесасас счасузаєує адччасавос сетусуваєс сазасзчачує 3309 тасусачасе асавсассаєтт ассацчссяде саботсасса зачадеєсача усасексксеса 3360»

Чаааседаса зочккссодає сдадчассода дззасочааз даасасесає суссчасаде 3429: здеоддааєсас сесвузеуда чуда : 3444 «2105 3 «її 8 «жі2: ВИТ «7х3» Цнучна послідовність «та» . «223» Токсин, що кодеється синтетичним геном В, ї. «00» З мес 015 АЗп о АбЗп оїіє сій Азп бій Суб Чаї вхо Тух дп Сув Бей дви м 5 10 15 дап зжо біз Уаї бій Х1е бебодап сО1й с1й АкУ бех ТВх 01У АК печ , 29 25 о вто зе яв Іі8 бек Пей беж Бей Так Аг Ре Пец Бо бех 015 ве 85 20 45

Ма) Рто біу Маї Сіу уаї Аіа РМНе біу пез Рне Авр без ї1є ТкробІТу о во пе їїа Тит РХОо Зег Авр Тр баг рей Ре йез Пбей біп Ті біо біп 70 78 во печз її 019 бід Аха ї1їє бі) тн без біз Ах звп Ак Аїз Її Те 90 З5

ТВт без дку О1у пев іа Авр беж Тут О1ч Їїе Тук її сії Аза Ге 00 їа5 їх вахз біз ТЕр бів Аза Аяп Ро Ап о Аяп Ага біп їз Акч біз Двр уаї 115 120 125

Ахкч ї1е Аку Ре Аїі4 Ав ТЕ Аве Авр о Аза пе ї1іє Та Аїа Т1е дя 130 їл5 140

Азп оре Тих рей ТВх Бех Рце С1й І1і2 Ро їйез реч Бек Уулі Тук Уві 145 150 155 160 ій Аза Аза Авп обей Нія рей бек пез Бе Ак Аз о А1їа уаї бак рве 1655 то 375 бІ1У біп сіу Тер о біу ей Азр о ї1є Аза ТВу Уаї дяп Аяп о Нів тТухк Аяй 8о 185 1530

Акт цей І1е Дей печ І1їє Нів Аку Тук ТВУ йуз Ніз Су без Авр ТНЕ: 155 200 205

Туж дявп бій біу Пен біч дви їеч Акч о біу Тк Аяп ТВх Аха біп Тгр іо 515 20

Аіа Ага рРпе Аза Сіп Уце Ауу дк Аяр Пам ТВі Пен ТВ Узі пей сАво 225 й 230 235 240

Іі Уаї іа йез Зве ро АзпотТук Авроуаі Ах ТБ тує РКО Хв бів 259 253

Тпг бек Зак О1й без Тих Акч біч іє Тут Твж бек бек Чаї ї1е Фа 260 255. 270

АзроЗег Рго Уа) Бек Аїа двзп ї16 Рко Азп о бпіу РйЄ Аяп Аку діа сій 2475 280 885 пе біу Узі Аху рхо ?хо Нів Тем Меб Аво Ре Мебс Азп о бех цем ВНе ) 293 85 зай

Уаї Тк Аза біз Ту Уві ду бек бів Тнж Уві ТЗ б1у біу нів без 305 319 - 315 320

Уа бек Бех АхЯ дяп ТВ Аза С1у Аза АхУ їі Авй Рие ро бек Тут 325 330 315 сіу чаї це Аяп ро с1у біу Ата ті Тх5 їі Ма АвБ бій Авр РКО 345 3845 355 да Рхго Ббе Туг Ахч ТВг ем бех дар рРго Уаї Ве Уаї Ако 01у 01У 555 зей 365 рРне С1у Авп Рто Нія Тук Узі Беч біу без Агу біу уаї Дів рне дів

Зо 375 з8о

Сіп Тпг б1у ТВх Азо Нія ТВ Ака ТВК бе дк дев бег б1іу Твх 11 385 199 395 400

АБ Бек їй Азр бі ге Рко рко бів Авр дяп о Зеу О1у Аїа ро Тхр ч05 419 жів

Аза АзроТут бех Ніз Чаї без Аза Нів Уаї Тк Рпе уаії Ак Тер рхо 420 25 430 7 сбіу ій Ті бех біу бек Вяв Бех Тер Ака Аіа Бо мес Ре Зех тТхВ 35 "449 ав

Тнг Ніз Акч бег Аза ТВу Рто Так Азд Таг Ї16 Азрорго 41ч Ах І16 59 485 40

Таж бій хз рхо без Уаї Був Аза Нія ТЕ беб бін Зех пту Так ТВЕ звї АТО 275 480.

Маї чаї Акхо сіу Рто С1іу Бе ТВвх с1у 01у Авр Ті Бе Ах вЕв ТВ 485. 4930 - 85.

Яег біу 01у Ро це діа Тук ТБх Іїє Узі Абп їі дяп 01у ій еф 00 505 ІВ ' рРхо бів Аху Тут Аху Аза Ажхч Її Ак Тут Ала бек Тк ТВК Ап їмо 515 й 529 57 БВ ж

Аха ї1є тук Уаї Тну Уаї Аіа б1у бій Ак І16 Ре хія 01у бів Ре 530 .-535 зай зап Був ТВх Меб Азр о ТВх 1 Дер Рто без Так Ре бід бех ЗНае беж 54 550 555 зво їУук іа ТІК ї1ї1е деп ТВ діа Ре ТВ бе Рго Меб беє дій Бах ех 570 575

Рпе тік Уа! б1у А1а Ар ТЛ РНе бек бек біу йяп бім Уа1ї Тук Ї16 і «80 "Ба5 58.

Ачр ака пе біц бе Т1е Бхо Уаї ТВ Аїа Тву без бїб5 іа 1 еко 55 ОО 05

Авр пес бі Аг діа біб уз Аза Уві ДЛЯп Лія Пец Ва ТВх Бех бе

Іо 65 вхо дяп біп іє 01іу Бе буя ТВх Авроуаї ТВЖх Азр о Тук Нів Тіє Азб АхУ 55 Се | 635 540

Уаї бек Авп Бен Уаї бім Сув бен бет Азов біц Ре Суз без дяр ві ва 655 уз буз піз цей бег біч уз Уаї Ббуз Нія Ала пуб Ахч йеч чех Авр веб Б 670 біч Аг дп це пе біп Азрорго Яви Бе Ак С01уУ І1е Дно Ага бів 575 Ба 685 їмез Аяр о Аху П1у Ткр Ахч сіу бех ТНх Ано ї1е ТВу їїе біп паіУ біх 880 695 700

Ачо Алр уаї Ре пуз О1ц дяп Тух Уаї ТВж Пец ви аїу Так вве Ар 705 то тів 7 таб січ Суз Тут Рхо Твх тТук бе тТук біп Був Ї1е Азр о з1й беї був Цей 735 739 735 йуз діа Тук Тах Аку Тут П01п без Аку біу Тук Її біц Двр бек піп 7ай та 750

Азробез біч ї1є Тук бео Ії1ї8 Ах Тух Авп Аза уз нія бід ТВи Уві 755 тей 75 дяп уаї рео сіу Твт бО1у Зех беч То Ро Без бак діа Рхо бек Вхо та 775 тва І її п1у уз Суз Аїа Нів Ніз бек нів Нів Ре бЗех рей Аяв Ї16 Азр 785 750 758 7" оо

Маї біу Суз тТве Авр Пец Азп о бтіЬ Авр бо с1у Маї Ткр о Уаї Т1е ре! - 05 вто ще

Буз тів цуз ТВвх бій Азр 01у Нів Аза дл Безсо3у двпорец 1 вве: ща : 825 в3о реч біз біз цу Во цеч Маї О1у Січ Аїа без діа Аке: Чак пув хо 835 8430 ваз

АїТа ст був цує Ткр ака АЗр буз АкЯ біл Зуз бей пі Тер Ха ТНх 859 855 вк о Авп ЖІе чаї Тут уз сіб Аїа Пузв біз бек Уаї Азр хіа пей рве Уві . ВБ5 579 875 880

Авп бек бій тТук Азр Аку Беца сій АІа АБр Твт Ав І16 Ата Мек ще

Зх 8250 вз5 нія Аза Аз Авр уз Ату Маї Нія Зех Ії Аху бів діа Тут ев ро з00 305 зо: сій Бей Чет Уаї Їїеє ро біУу Уаі дявп А1їа Атїа І185 Ре 01 віч ей 515 950 525 січ сьЬу Ак Ії Вбе Тв Аза Ре бех пен Тух АзО Аза Ак Аяв Уаї 339 335 840

Іі цух Авп 01уУ Азр Бе деп Ази Ч1у пен бек Сує Ткр дяп Ук) уз 945 з50 55 80 . сіу дів Уаї Авр Уаї біз бім бів Азп Ай Ні Ах бек Уві Пез Уаї 565 570 875

Уа) Ро сіб Тр о біб А1їз бід Уаї бек бів біз Ууаі Ак Уаї Сухє рто «во чав | 596 сіу Агу П1у Тут Т16 ви Ату Узі ТНК Ліз Тут цуз Січ О1у Тух щу 395 000 2025 7

О1з 0іу Суз узі Тк ті нів біз тіж б1з Азп Ап Таг дяр 61 тез 1230 05 1950 я цуз рпе Бег деп Суя Уаї сій сії біш Уві Тух рРго Авп Ав Те Уаї 19025 1030 1035 ! 1040

ТнЕ Суз Ап о Авр Тук Тк Аза Тк Сіп бій січ Ту біб сіу тн Тух : 5045 1050 1055

Тит Зах Ак Аво джу 01у тТук о Аврос1у Аза тує піз бех Ан бек Бек 1960 їо855 Ома

Уаї Рко Аїа Азр тТук А1а бек Аїв Тук 01 біз Ббуя Віа тТук ТЕ Авр 1075 І ово 1055 піу аку Аха Авр Аа Рко Сув бій Бех яп Аху біу Тук сіу дяр тує : 1050 о85 І 1199 . .

ТВЕХ Рко цес рхо ліз біу Тук Чаї тах Буз іч пеш Оїч тТух ВБа. рхо хо5 мо: мі . мав біз Тпх Азо Бпуя Узі Тез Ті 013 І1їе сі біч тис січ о1у Таг ве 1125 1130 1135

Її Уві А5у Зек Маї біз рей цей цен Ме Зі ЩІ : 1140 мав - «2105 3 «її» 5815 : - «гі2» ДНК хх13» Штучна послідовність «320» «271» (динтетичний ген В. ї. токсину «4005 3 акуузачаса асясасвоаа ссзусусуєс ссскасвасс чесбесгасава ссседаааки БО чачаскстса асозачасвая Чесуаскуце здассцссує садасасссс ссеусссссв 120 асасуськос куссувсскуа деко ссса зусчсчачас сусчессЯу сстссссуас КВ сксасесоуЯ дссссассає сссзсссуає Кодауєсьох сесесстсса чассовасац 440 ссуассдзас зааууаєсда дасссссода зучаассочу ссассассає сесесукоуе 300 ссадсадаса детакдадає ссасаєтовза усассааоач зчсодЧазаче сазесссавас 360 засусссаас сдадачазоа сосасясаса суссесуєса асасачаєча кустесдабс 420 зсачессасса асаассссас соссассачс сссоаЧаксо сесскссово чЧсессасасс 480 сазуссусса асссусасьс дбсассаску счсуасуєтя куссЯєеЕсод усааауесоє 540 дчассауаса сацетассує сзасааєсає сгасвзасачаєс ссассаассеї часссассуз 6500 касасдалас аксосЕсоада сСасссасзає сачучаєсочу зузасексозу адусассазос 689 асссоссває дозсесазусе сааєсацесс аудачадаєс Екасасссас сосчсскачас 720 зкачсгассс ЕсеЕсссува стасчакчєс сзсасссаєсс суассслаає збсабсосаа 780 сссасзадоу адакстасає сзохесвуєс асбдвачаєт ссссазчессс сСусуаасаєса 840 сессазкуусс ссзасачаЧе саЧеЕвсочЧа чесачассяс ссесассесас учасессаке 500 зассссстос ссусзассує ададассусс аЧаєсссаза ссосусусаоє адчасасста 960 чесадсссас дсазсасудс судсазесчє ассааскссс сезуссасоч ЧдУєсвесаає 1020 сстсзччучеЯ ссасссоудчає сусадасуаа часссасчсс ссстестассу дасескосса ТО80 чассекусст ссусгессазоч зачссесочс зассетсаєт агосисссуд ссесадучуа 1150 сЕЧосссобсс засазассце сСледалєсас асесосасає Есадузастс суучЧассвеє 1290 дасссксстач агуацасасс асстсазачає гасадсуусу сассстодчава ссдастаєсст 1969 сасусссса ассакчссас сессбасоує соЧчесачасу ачассссача сспсдассса 1320 гоЧачадсас сааєуксссе ксодасясає сусаусуєта ссессасава сассаєсвчає 1380 ссзчачачав ссасссачає ссссстеусЯ засдсясаса саехссачке аддзастаса 1349

ФЕсЧезачач усе: сасодозода дасатссссс дасусассач Єсоадчасса 1500 кссусусаса ссастуєсав сассзаєсуду саассссссс азадусаєсЯ соссадцаса 1560 сдсезсасте сстасстассза сссзачдааєс Єзсуссасат Екасазоачеда асучасоссс 1629 четадессасе сеозасазадас загозакасс дуусозессас ксасаєтссаяа ассктвссесс 1680 стасасесаста ссаасассує чсссдесскЕе ссааєузчєс ачачсацект сасадезучє 1740 чдстдасассс ссачкссаду сзасуаачеу басастуаса зусегтоауєв дасессадеї 7800 астчесасас єсчад : 1815 «газ «її» 605 Й «25 рт 52135. Штучна послідовність «Ох «215 Тиксин, що кодеється синтетичним геном В. ї. або» 4

Мет сі Аза Аве ті бів дез із Суй Уа) ро тух дап Сузв пец Ав і 5 19 15 лап вто ЗІ уУаі біз ї16 пез Аза біб сіб дху бек Тк оаїу да пей тхо бен авр їі бег зе оЯег бем ТНК Аху рад бец еп чех біб вве. 48

Уаї рРкго Зіу Уаїі Біу Уаї Аза Ре 01у цем Ре Анробем Ії Ттр с1у во тпе ї1є ТИЖ рхо бек дзр Тхр Бак ви Ре Меч Бей бів її їв аїв 25 7 75 85

Шцец їіє біз бід Агу Т1іє 919 ТБх без З1й Яку дво дДхч ія ї1і8 Тв 85 зо 5 твЕ Без ку б1У Бей Авіа Або бек Тух 3 їТіє Тук ї1іє сіб дів печ 16ба 155 1хо

Ахч Чіш Тер біч Аза Авп о бго дДяп дяп Аза Сб1п їжу дк із дев уві 115 129 135

АкЧ І16 аку рве діа Азп ТНК Авр одяр Аза ей т16 ТВЕ Аіа ї16 два 130 135 140 :

Авп о рйе Тпк рез ТВУ Бех ре сій Гі Ро без рез бек уаї Тут чаї 145 ВО 155 : а сіп Аза Аза Ап обец Ніз Бец бегопец Брец Ак Авродіа угї ЧЗежш ве 165 170 175 сіу бід біу Тер Ч1у беи дер Х16 Аза Тв Уаї два деп о Нія Тук Ля 80 ї85 аа

Агч бесш Хіє Авп о бец Її Нів Ака Тух ТК пуз Ні Суп ей Ар ТАХ 155 200 215

Тух Азп бів б1іу цен б1ї Авп о пец Аку б1у Тк Авп о ТБг Аху СІЙ Тер 210 215. 229

Аза ку вне АвпобСів Рце Аху Ака Ав пез ТВ Без тТвжЖ Уаї без двр 225 230 235 240 їїє чаї Аза й рпе Рго Ач Тух дар За) Ата Твх Тухк ро тів біб 245. 250 255 тТвх бек Бех Збій Без ТВ Ах біч іє Тук ТНК бег беб Узі І16 ОБ 289 2655 та

Аво Заг руб Уаї Бех дія Ап от1їв рко Аяпобіу рапе Ап вату Аза 3 275 " 280 245 це С1у Уаї Ауш бго рго Нія реп Меє Ззрорпе Меб двп Зех вич ре 250 295 309 ше уах так Аза біз Твк Уа) Ах бек ій Тцк Уві Тр осіу ОТу Бія без 305 с Зв 315 320

Уаії бег Яст АкчЧ Ази ТВг діа 1у деп о адху Ііє йвп бе Рко бек Тухк й 325 330. 445

Сіу Чаї Рне й5п Рго біу біу Аза їїе Тхр ї1е Аза Ар бів Азр рго 140 345 350. дхЯ бо Ре Тух Ат Тнх Пем бах Авр ро Чаї Ре Узі дк Зі у 155 зво 365

Ре сіу Авп орго Чі Тух Уві без б1у реч Ак О1у уаї Аза РБе бід 370 75 зво бів тв біу Твг Авд Ні Твг оду Твх ре ага яп бех б1у Твг Ї1е 185 зза 195 | ща дер Зех без дер бій Т1є го рРто біп дер дяп бек б1у Аза Рхо Ттр зах 410 415

Аза днр Тук бех Ніз лі во Азп нів Уа) Тнх РНе уаї Акч Тер Ро 429 ча5 4зо пі біз ї1є бек біу бе дар бЯек ТтроАхЯ Аза хо Меє Не бек Ткр 4135 440 445

ТЕ піз дк бек діа То РКО ТБ АзпотТЬу Іі Алр орто 01: Аху 16 450 455 450 х

Тк Зіп Ї1їє Вкго Бем Уа) уз Аіа Нів Тну їж» бій бек О1у ТВх ТВЕ 255 70 ат зва узі Уаї Ах піу рго біу віце ТЕ 01у п01у Ар Т1ів ев Ага Аку ТВХ 455 290 85

Бек сіу біу рго Рее- Азії Ту ТВЕ І16 Узі Авп о ї1іє Авц ОІУу Чіп ев 500 505. 10 ро біп аку Тух ху Аа Ага хі Аку Тут Аза Зех ТВ тах Авп без .

Б 520 5125

Аг гів Тух Укі тих Уаї Діз сіу а1: Аху хі РБе Аза Зіу бів рве 510 545 40 :

Аза буз ТВк Ме Авр Таж О1у дер РтТо Пец Ту Кце 010 Зеж Де Бех 545. 550 555 :: явй

Тух аАїа ТВЖ І1б Авп о ТВЕ Аза Ре ТБх бе бхо Меє Зех біп бек Ве: 585 579 75

Ра ТНХ Чаї біу 313 Дяр Так Ре бего зЗех сіу Авп пів чаї Тут Ще . 580 585 595

АЛлроАха Те Сім йец Т1е Рхуо Уаії ТВу Аїа ТК Мей Щи 595 609 05 «хі 5 : «-21ї» 352 І «132» ДНК ча». ВасшШов іНуйіпеієпвів «4149й5 5 акодадазса асакссввнай ссвасуєуса ссссасавеє зчексааасаа бесвбузачеса 69 пекти ху абуззуааац зачсассодс ачассасосче сачахсасасс ссбасесоеке 120 зсакуссисис «сскуачсча ассбчккоса учкесеччач ссосусевоч ассассєдив 180 ссаасасоуу ясСексасває сссттссдає содадессає сбесбераса дассодаасаи 250 ксчассдясс азадаасада засассуцаа адуваєсоуч саассассяє актасузочу 300

ЕхаЧсадЧака десведазає ссакаседав зсассвачат адсзуувасе авассстває 369 закусасзає Казудузача сосусусаск счаскстусса асасадаєча сусесбазка 430 асвадсаахаа зсаассссас асссасвачі кКеСкуазаєсо сесескбаєс чУусессасесс 48 саадсучеча асссасаєсе ассассасса ауацасчєссо сассоскесоя зсадечксоя 540 ччассуцчаса сачссастує раасзаєссазб сасзасачас Саасаааєст Касссасада 600 стасассааас ассчсссода сасзсасзає савусаєтад зазасссяао адосассзає 889 асессзаєзає очадсвачасєс саассаоуксс аоздзсачасу сзасасстас сасаєсзаає 720 аєсаяссасеьс ссссссосдаа ссасчасоєсс ачаасасасс свтаєссяааєе чесассссая 7850 сезасазаучу авабсссасас ваусссазчса ассочзоачасс сессачесес сСсуссаабавба 840 сстазсчусс сСЕзасадчує дузасссооа чекадасеяє сесаксеває счассеькасч 500 застссесчс ссосзассос здчазасеоєе здазуєсава сптусЯсоєєу асуасасєсса 960 чекаЧессаєс дазасасуде садсаасесче акзазсссес стастстасуч зчсссссяаєс 1020 секочкачен сезессозає сусачаїєсач уаєссасяєс сессссаєсу часаєкакся 1050 чассесастс Есодсссцуаду зочасссоду заксскисацх абусаскоця чессачудда 1140 чезодсасскс засзаассуу сСзсуаассазс зсесузасає ссздазасаєт соддассата 1500 чзаскстства асозазсссс ассісвоадає засада саєсскоЗаз счассасацче 1250 сасчсастаз зссасусєкає збссЧсасза сосссазасз ачасзссаоу заусуасксяа 1390 сусаздацесес саакчуєсссс ссздасчсає сусачевусаз сссскасааа сасзаєстає 1389 ссучададуа Сбасусаааб зссассоуєз азадсасяха сасстсачес задсассасс 1440

Ччесдсаноау засесоЗасс сасусзачча часабссссс сасуаасаау содаодасса 1500 скскосссаса сеассугсза бабазасуду сааксасссо вазвсочтаєсу бдслачаака 1560 сассведесе ссассасаваа сссяаЗааес сасчсзасач сесевачсца зсодахссес 1620 чЧевосссває сбаасзааає аасуцасасе чусдасссає сазсастсса ассссекацчі 1680 сасусазеса Єсбзасасвос соссасакто ссаасавосс ауадсааєсс сасацбтадає 1740

Ччехззкастї Єстачессаза дзасозачес сабабсзуаса закстоязайс зассссауви 1509 аседсвзасає сесазусазза зкасзаєсса зааасчадсас адаазасоде озасзсаск 860 сббассксса сСааассадає зодоазсзаза асачасчеча стазссасса сасссчаєссаа 1599 дсасссаасб саздсучаєса сстсабсвсахє савкессесо спдасоуазаз уеуазаасеся 1980

Ессдацазач ссзавсавоє чдааусдасстс аосоуасоащце дозассткась ссаздаєссз 2040 зассссавау чсаєссвасаєя зезастадає сасодесача звадзадсас зчакаскасс 2100 асссзавчва чЗачасуасеє асссаазуза ааксабуєса састассацу басссскчає 160 чачсодстасс сазсусаєсь агассазава зсадавазас суазассяаа зссстасасе 3529 сЧесассаває скаачдасууса сассузучає ацссзачаєх хачазасссє сссЧасссує 2880 сасзасзсза азсасоавас ачсааасосу севочсасоя дессопегакч дссуєсессся 2340 цессзавуєс санесачаза чусососачаз сеузассчає чеЗсуссаса ссссузасою 2400 засестчаєс сзуаксдеєсс ссусадаєнс зЗадуаадааає зсусзсаєса Ебсосаєсає 2480

Кессссссоч асасссасеє седчасзсаса часесазасз аочасусацча сусасочуєа 2520 атасксаада Ссзачасуса зцасочссає зпсаачассач зазассзсауа Уккксесчай 7580 чадаазесає садессучуча адусассаусе сусчсчавга чачсидаааа зазабучада 2649. чакавасУсу зазазссода асгточазаса засассясис: зеааачачуує зааачаасся 7700

Чезуасосис касекусава сстессаасає дасесаассас зассодабає дазсаєсчсс 27650 асувсссатя содсачаєаа асусчєссах ачзаєссоду задсутаксхї кесадчачеса 2859 ссічечЧассс ссооуєуєааа сасадасаєс Ссссувачаає саазададсЯ басстссасєс 2880 чезстссссс басаєдаєує Задааасуєс асбсаазлайся здосастссва садсоцесса 2940 ксакустсода асзсцазазу чсаєчсачає чдсачазозас азаасзаєсся ссзсксоЗсо 3959 сетуссуєхс содазессоча здсзузаадку ссасааувау тисусакеса Ессодассо 3060 ччетакассе сксусуссас адсусасазу даздуЧасака сачазочесу сусзассаве 3120 сассачассу адаасвасас зуасозассу засссзуса зстцодбсаца здаддвачис 3180 С сассслваса асасчасаас чкоусааєЧає басасстусава вссзазаача зсасучуУє зво чЧечсасасьтс сссукаассу бодасабаає уаавсессаєа даачелавскс шеЕсстоасассаз 300

Чсечасвасу соссадеєва ссзададава ссубсабсасад ассдасчзад адчасзаєссє 3350 каса пі сг ду. со: асассасвсає сачсвучста сесцасаааа 3430 чаассаузус зсгссосауі зассуастаза чеасззаєсо адассауада азсудааєдча 3480 асасєсасся сСочасачеУб дузаєсассс ессасодацча аа 3527 «210 6 «21132 1174 «212з РЕТ «Ф213з Васііїїчн сЄВигідчієнпзівя

«400» 6 шили я

Мек зів дев Авв ЇТ1е со10 дви а1й Су Маї то Тух дей Су Бе АвВ хя 5 19 : 5

Ави о рРто 01 Уа! Стій ї)е без Азп бі бі Агу бег Твх бФ1у Акад бешо ркга беч Авр Т1є Бех Бе бек Бец ТВЖ дк Бе пес без дек біз рве ай 45

Уаї рРто біу Уаі б1у Узі Аїа Ре сіу Бей рРпе дяр То її Тгр ФУ во

Ре І1є ТВг рРго бек Авр Ттр бех беч Рпе Бем пйец 01п ї1е 013 бів 55 70 І 75 во їец Пе бі біп АхЧч 116 О1ї ТУ Бей 015 Ахо Аза Аку Аза тів Те в за 95

Тих реч вха сіу Беч Аза дор бек Ту бій ї1е тук Хі бій Аза Пем 100 105 110

Ахч біз Тр 01 діа АБ орто дай дяп діа біп без дхч О1м дяр уві 115 120 ї25 | н аку Щіе Ач рНе Аза Аяп о їТйху дер оаврод1а без Її Твт лЛіа Її дев ї30 35 тай деп рве Тнгспец ТВ Чек орце бі Г1е рго печ тем бак уаїстук Чаї 145 150 ! 155 ї69 дів діа Аза лап о бей Нія пец бек цей без Аху Аяо о ліа Уаї бех Ве ї55 й що 375 сіу чіп біу Тгр ЗІіУу бей дав їіє Аїа Твх Уаї деп дав Нів Тух Ав ї80 ї185 ї159 :

Акч Пвч т12 Авп ей Ї1е Нівз Ах Тух Ту пуя Біб Суз без АвроТВх ії55 298 505

Тук вай бів с0їу бер За Аяй цем Зх Сіу Тих Ап твж Аг бід ТЕр 210 215 220

Аїа Аку Ре Анп бій Рне Дху Ах Авробва Тк Бей їде Уяії ей Аяв 225 230 235 240

Хіз Уві Аіа бе ро Ро Авп оТук Аяр Уаї Ах Твж Тухк Рко її 0165 245 250 255

Ти Бек бетх біп цец Ти дху 014 І1е Ту Ти бек бек Ууаї ті біч 250 жа. та:

Авр бек рко Уаі бек Аза Аза їЇ1е рго дяй сіу рве Дно Ак Аза бій 275 20 85 вне сіу уаї Ах Бгто Рко Ні їжи Ме Аво пе Мес Авп бек бай Ве 250 295 390

Уаї Твх Аїа біз Тнх Уаї Акд бек біб ТВг Уаї Ттр сіу б1у нів печ 305 310 3Зї5 : зо

Угі Бех Бек АкЧ Аза ТК Аїз біу Азподха Ї1е дяп рве рго бек Тут 325 330 з з15

Сіу Узі Рце Ази о Вго біу П1іу Аза ТІв Ттр Хі Аза йяр 01 Лев РІО 3450 345 350

Ахч Вка Рпе Тук Аку Тс Пец бек Азр ро Чаї Ре Узі Аху піу с1уУ 355 350 зх вне діу Азп Руо Нія Тук Уаї Пец біу без Ах піу Чаї Аї1а Рве бій «370 375 380 о Фіа тих сіу Так Аяо Ніз Тви Асу Тк Ре с Аху яп бек сіу Твк Це 385 320 355 . 400 авр Чек рей Ар бій Т16 рко Рго біз Ав Ав бе сту Аіа'рко Тр -а8, . ч10 415.

Ап оАяр Тут пек Нія Чаї Пез Азп Нія Уаі Тк Бе Чаї Аху Тер вка: 420 за 430 о спіу бій ї18 бех біуУу Бек Авр о бек тт Аха Аіа рго Ме: Ре бак Тер; а 445 ої 1425

ТНк нів. Ах ех Аіа Ту руб Тис Ав ТВк їі Аз ро іч Аку Т1є 450 І - 455 4680 ; Що Я

Тих бій Ті Рко без Уаї буз Аїа Щіз Тик Бей сій бек б1у тих Тих 455 470 475 : «во

Чаї уаї Ах б1у Рко б1у рве твг сіу біу Авр о ї1з Бей Аку Аку ТВх 485 490 495

Бек Ту біу Рко РНе Аїа Тух Тс Ії16 Узі Анв оїіе лей З1У іп беч ; 560 55 іо рго сів Аку Тут АхЯ йїа Акч її Ахч Тук Аїа бЗет ТВх ТВЕ яв Без 515 5 зи5

Ак ї1е Тук уаіїі Тс уаї Аза сіу біз АкЯ т1є Ре Аза су біп вве 530 зав 54й

Лави буз ТНХ Меє Авр ТВг біу Авр ро Бен ТЕ Ре бій бек Ре чег 345 550 555 580

Ттух Аїа ТВЕ Ті Авп ТВ Діа рпе Ту Ре бко Мебє бех чів Бех Бех 570 575 ве Твх Уаії С1у Аза Авр ТВх РБе бек бек 0іу дяп бій Чаї Тух ЇТ1е

Ба 585 550 дер Акч Рпє біз Пец І1ее рго Уаї Тиголіа Тахо рве С1й Аза бій тук 598 500 БО

Авр без бій Ак Аза бів пуз Аїа Уві дяп Ата Бец Ре Тк бек ї16 510 575 540 дей сів ї1їе 01Уу гів Пух тТНЖ о АвроУаі Твх Двр отух Нівз ї11є6 Авробів «25 630 ві5 640

Чаї бек Аяп ойец Уаї Авр Сув Пе баг дяр піз Бпе Суя бе дДяр 1 ев 53

Буз Ахч ої Без бек с1із Був уаії уз Ніз Аїа уз Акч Бей бех Аво 50 ве 570 -біч Ак Авв о Бей Пез бів Авр орго АвповнНе Буз с1у ї16 дей Аху Вій 75 сао ви5

Тез лір Ахч Чіу їжр Зх П1у бех ТІ Аяр о Ї1ї6 Тих І16є біл лкЯ щу 899 5З5 та ! зр Азр Уаі ВБа пує Сі Аза Тух Уаії Твх Бевз рто біу Таж РВесАвро- 795 710 715 та біз Сує Тук рРто Три Тук Бей Тук 010 Буз І1е Авр сій бех Був ей: м тав 733. | «5 їжа Рко Тух Тв оду Тух бів бен ха біу тує ті 015 Аву Бех бів "740 ; тав 750

Авр без бі Тіз Лук Пец ї16 Ака Тут Дяп Аза буз Нів біз Таж Уаї 755 тео твБ5

АвпоУгі Пец біу тк Я1іу Зах пес Тто Рко йеб бех Уві бін Зех Вко тла : 775 тва

І1е дк був Сує С1у біш рхо Авп о Ако Сує Ліа Рхо Чів Пез бів Тер 788 750 Що 795 ваз

Авп о РТО Авр Пец Аяр о Сув бек Сув ку Дяр с1у біз уз Су Аза нія: ої 19 15 -Нів бех Нія Ніз рРпе Бех ей Аяр І12 Авр Чаї б1іу Суа ТНЕ Авр Гей ва 825 830.

Абп обі Авр Гей Аяр Ууаї Тхр Уаї Тіє ре Пцуз 112 буз ТВк бій Авр зай 845 сіу нів Аза Ахч пева біу Авп без біз Ве ез біз 013 Пуз рхо їз 850 855 во

Узі сіу сії Аія цей А1а Аг Уді пуз злкЯ Азїа біз Ббуз буя Ткр Ах 865 878 875 | вво

Авр буз Аху Сіш пуб ви біб Пем біз ТВх Ав Ї1в Узі Тух був 01. ваз ЗО 895 аіз цуз біз бек Маї Авр АТа ей рРпе Уві Ази бек біп Тук Авро бів зп0о з05 910 беч біп Аіа Азр Тит Ава ї12 Аза Меб тіє Ні Аза йіа Авр буя АхЗ

ЗІ5 929 325

Ж ло і їн то БА: Аза Тут їва Ро бій Бей бех Маії Т1є6 РхО 330 935 вай сіу уУаі Аза Узі Авр ї1є Бе бтіш біз Пез буз 01у АкаЯ 116 Ре ТЕ

За за5 369 - Аза рне Ре цеч Тут Або діа дсу Аепочаї їїіє був дев 41іу Авр ове 965 970 5 двп Ав сіу рей Бек Сув Ткр и Аяп Маї Пув ШіУ Нія Уві Азр уаії СМ з80 335 -с950 січ біл Азо Аза Ніз Аха бех уаії Пей Уаї аз рхо іш Ттр'а А1а 355 2802 хва5 бів узі бег сій біц уаї-Агу Чаї Сузоркго сФіу ака с1іу Тук тів бе" 1010 1015 ' "5029 | ' «джу Чаї Твх Аїа Тук буз піч с1у Тух піу 10 с1у Суз ЧУ) Тих Ії 1925 1030: 1835 16040

Ніа сії т1іе Піч Аєп Аза ТВУ Авр бій ей був це зах дяс Сув Чаї 1045 5589 1055 січ Фіз бій Уа! Тук хо АДвподйсй Тнх Уаії Так Суз'знп йзо Тух тах 1060. 5 ато

Аіз Азп бід бії бін Тух біу б1іу Аза тТук Тнх бек дк айва Ах 01уУ 1075 1980 Мав5

Тукс Аяр бій Тк Ту 01у нек Аза бек Чек узі вхо Азія дер тує АІа ща50 1095 109 бек Узі Тут бі сій пу Зек Тук Твк дер 01у Ак Ага Аво Ап о рко 1105 3ІТо 5 і 1120 сСуз сії бек Аяп Ак біу тук сіу Авю тТух ТвЕ вВко би Рхб Аа Фу 1125 1130 1135

Тук Уаї ТБк цу с1ч пез піз Тук рне рхо біз Те Авробув Улі Тер 1149 1145 50

Іїе Січ ї1є 01У біб їх бід біу Твах Ре Ії Ууаії Дяр бек уаії 15 1155 1160 4165 їес ви йвмоМеє бії дій 1579 «йїйж «Вїї1з 1815 «хх ДНК «211» (нучна послідовність ще «80 «2232 Синтетичний ген В. Її. токсину ; «00 7 акуузозаса асасасачаа ксаусусуєс сестасзаєсс досесаасаз пссосузадса 60 чазчастсстса асуаачаазу уссзассчче зуайссдссяє садасавскс сседесссес 120 асазсчасссе суссууєсєва чессассосе счечевозва сеЧсЧчесео9у сесссссдчас во сесастсвод чактсасезо сссасссоває коЧичесьсе сСесссссаса зчассцаасву 240. сгозссузас агзучаєссяз засестадаз задаассодо сеассяссає астрезкоче 300 ссацсазцчаса чссасуацає ссасасктуза усассавазо ауєчудчаавує сзаксссзас 350. засссзсдас єЧдачачазоа Соусдсусаса сустседета асасачикса буссссуаєс 456 зсаздссзса асааєттсас асстасспує сссуауаєссо спсстесесбс чуадсставсосо 480 сзассхтзсстя асскксаєто дссассассу здоддастсся суссуєксод ссазацесоя 550 чзасіздаса сзустастос сласаассас зсаазсацас ссассваєсоі дЧасссаєсоз 600 й сасастанас ассуєссодЧа сасстасазс сачусаєтос зузгасссуан здасассааєс 66 з аєксцісзає чоадесазчуєє сазссвосес зудачадчасе сбасасстаєй счусуссацас 720 асасстчечте кстктссуаз ссасуакуєс сусасссзес суасесзааас зчасабсссаа 780 сстасзаєда аччасссасас саустсачес асбсуавоаех сессаусссс сосувасака 840. ссуаасаскї сезасацячЧи счугасссуча чесадасссс ссевкстсає ууасексаєу зва. заптттисхчс «бЧЕцастяс адазасьуєь адасечевна сеЧечедоЗУу вуучасвесска 350 четассссза дуаасасоує соусзаєсує атсдасссестстауссвсуч чесна с 1020 сссосасесч сезсссадає косадакєчаа дабсосасокс есссотавсоу дасссвасся 1080 чассттухс: ссусссочазчу задесесучс васссссасс аспктаєстача ссссазччца 1140

Чедуссетсс засазассоу сасузаєсяс асасусасає бсадуааєсс сосухсрає: 1200 чЧаст:тствуа асдачакасс зсстсзадає засачесзусу сассскоауаа суастастоя 1260 сакутустча азксасоєкас сускусЧсує кочесаууху здакссссуц кессчасвся 1350 скучЧасацсас скасоесесе сеоуасусає счсацезета сасспсясвай сассасецах 380 ссзбдазасла ссасссадає кссствЧесо аздчсасаса тастссачсс: вдузастаса х440 пстшсзаочад дЧоссооаЧе: сасозузоча Засасвосвс Чазосассад содаууаєса 1500 тесосзсвса ссасеодссаа саксааєзау сазстксссє зазччсаєсч сссзодаєях іч89 сусизсяссє ссассассва сссасудаєс сабсчесасує ссосадуєча зсччарсьсе 1520 депутесаче рбсазсзауає засодасаєс зусчастсевас сбасасссовз авссссскес 1680 І басуссаска ссаасассуєсє чсссвсссесо ссавсуачсс ауаосаускс сасачеачУує 1740

Четоасасит ссзукссауч Ччазсузачеу сасакточаса часа: чассссачет 1800 застдствезс стад | 1815 «102 8 «311» 1815 «и : «Тіз» Штучна поспідовність «2205 «723» Синтетичний ген В. Є токсину

«ах В ! зсуузузаса асасасачаа ссаусусуке ссссасааєт уососаасла сссбовудса 60 чачаєсксскса асчазчачач чссзчасучує ачаєссоссче кудЧасаєсес сесчссосссе 120 асасуссскс ксесацессуа Ччеесоксеса дукчєдадач ссчсУкккуч сосбдессцЧає 180 сесаєстодчу чесесаксаєс сссуссзчаб судацчсстсс КЕссссесса чаксзачеау 240 сКксуаєсозас ачадуаєсца зассссодЧад зуддазесояча ссаєсассаєс сссссчсоде 300

Есадсадчаса зессасавчає ссазсаєстчза чесстасзсч зусудчазує саасесссави 359 засоасссаас сусуччазча сусусчкасс сасессусуз асассцчаєча сасЕсечасес 550 зссуссасса асаассесас ссктассаде сссопадасас ссскоссссо зуссксаєчьс 480 сзачсеЕчеца ассстчсаст: згсассасед сосдасзсвту сассасесоо здсазучасуЯ 549 чусскоуаса ссассзсуче саасзассас касазсецсс ссаксзаксе часесассцза 509 стасасаааас астчьсвоча басесасаєт свуЗосссоа ачазсссоЯвЯ азокасозає 680 асссчссаче зддссваусс садассауєсс адасчсдасе сезсасткає касассучас 749 астачссчесс Кесссссоаа ссасчасчьс сасасессбасс сдчакссадаєс уадсссссвЯ 80 ссгассачач зчЧчасстасас сааскесуєс ассузачасс ссесауецее доусчзасаса 840 сесвзаєцчусе Сесзасачадс бдадсссуца Зсесзссстас сссакстсає дадассссзку 900 ааскскобує ссокдассоує адачаскоєе адаєссссааа судсесачуч яозуссассва 960 чЧчесачеиксає девасаєсчає сщсаассуч ассаасьсес сбазуссасод сосчевеваєс 1020 ссесочцучеу ссасссоучаб сосачасзчаа часссзсуче сетсстассу чассскассес 5080 чассесдстст ссуєссдацу адчессеоує засестсвеє асубасксуу чсссачудує 140 чеччсстксе засадассзу басчааєсас асссусасає ссаузасес судуассаєс 1200 чЧастссссау асдаасссс Чдесссаадас аасадсодод сасессодаа сдассасссс 1950 сасоасасеча ассасусєсас сессудсоасас Содссзаухвз аздассссауу сссодассса 13520 коудсуєцеас сзасаєссто усудзсусяс сусвоусЯсвсз йсессасада сассасецчає 1380 ссочададаа ксасксадає ссссктдасоЯ засососаєса свесосзаєс вадсасуаса 1440 чесдесаовоа сдесодазес сасодузуча уасасссессс дасочсаєтад суцезчасса 1500

Ессусяєаса ссактуєоза сассзасоцеа саческсоссе ааасдчсассу сусозазака 15650 сосрабсоссс ссассассва ссбасусакс басассасод гозсавусча дездасебсс 1630 зсчччассаче ссзасзацає сабоуасаєс дусазессає ксзсаєссоса зссбсксесес 1680

Касуссасча ссаасассяс зексассстес ссчаєчадес аддадсадесе сасачтадує 5740 зссдакассе ссачесссся сзасузазчі сасаєкдаса часа Забоссачех 18500 астдесасає сода . й 3815