KR20010044489A - 항스트레스 기능, 항피로 기능 및 뇌신경영양인자로서의기능을 갖는 효모 유래 기능성 펩타이드 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안전성이 입증된 효모로부터 유래된 항스트레스, 항피로 및 천연 뇌신경영양인자로서의 기능을 갖는 기능성 펩타이드(peptide) 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 양질의 단백질과 미네랄, 비타민 B군을 다량 함유한 효모를 최대증식기까지 증식시킨 후, 고온, 초음파, 진동, pH 변화 등의 적절한 물리적 또는 화학적 스트레스를 가하여 인체에 유익한 항스트레스성 물질을 다량 생성, 분비하게 한 다음, 자가 소화시킨 후 정제함으로써 제조된다.

본 발명의 기능성 펩타이드는 스트레스 해소, 신경 안정, 불안 제거, 긴장 완화, 숙면 유도, 피로 회복, 자율신경조절기능 회복 등과 같은 항스트레스제제, 항피로제제 및 천연 뇌신경영양제로서의 기능을 가지므로, 상기 기능들을 가지는 의약품 및 기능성 식품의 소재로서 사용될 수 있다.

Description

항스트레스 기능, 항피로 기능 및 뇌신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 유래 기능성 펩타이드 및 그 제조방법{Peptide derived from yeast having activities as anti-stress, anti-fatigue and natural brain-neurotrophic factor and preparing process thereof}

본 발명은 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 천연 뇌신경영양인자로서의 기능을 가지는 효모 유래 기능성 펩타이드 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 단백질계 건강 기능성 식품소재로 허가되어 있는 효모를 가수분해하고 정제함으로써 얻어지는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 뇌 신경영양제로서의 기능을 갖는 기능성 펩타이드에 관한 것이다.

현대인은 여러 가지 스트레스 속에서 살아가는데 이러한 스트레스로 유발된 다양한 감정 상태는 체내의 자율신경계와 호르몬 및 면역기능의 변화를 일으켜 건강에 영향을 미친다.

일반적으로 스트레스를 받으면 자율신경계 중의 교감신경의 흥분으로 호르몬이 분비되는데, 특히 아드레날린의 분비가 촉진된다(Corrodi H, Fuxe K, Hokfelt T. The effect of immobilization stress on the activity of central monoaminergic neuron, Life Sci 7: 108-112, 1968). 인체는 이러한 불균형을 저지하기 위하여, 즉 이러한 계속적인 교감신경의 흥분을 저지하기 위해서 자연적으로 부교감 신경을 흥분시켜 아세틸콜린을 분비하여 전체적인 자율신경계의 균형을 유지하려고 노력한다. 그러나 스트레스를 계속하여 받으면, 몸이 지쳐서 교감 신경계에 축적된 스트레스 에너지를 더 이상 효과적으로 관리할 수 없게 되어 결국 자율신경계의 균형을 깨뜨리게 되고 세포 및 체액 면역기전에 직접적인 영향을 미쳐 면역기능이 떨어지는 기능적 질환이 발생하고 이러한 상태가 지속되면 결국 기질적으로 이상이 생기는 기질적 질환이 발생하게 되는 것이다.

이로 인해 많은 증상의 병을 유발하는데, 이러한 질환으로는 소화성 궤양, 고혈압, 암, 당뇨병, 과민성 대장염, 심장병, 기관지 천식, 긴장성 두통, 관절염, 신경 피부염 등을 들 수 있다. 또한 증상으로는 전신적으로 몸이 나른하고 쉽게 피곤해지며 생활에 끈기가 없어지고 잠잘 때 깊이 잠들지 못하고 땀을 많이 흘린다든지 몸이 차갑게 느끼게 되고 어깨에 통증이 있으며 가슴이 답답하고 목에 무언가 걸려 있는 듯한 느낌, 어지러움증, 남성에게는 성욕감퇴, 여성에게는 불임의 원인이 될 수도 있다.

종래, 상기와 같은 스트레스성 질환의 증상을 개선하기 위하여, 불안완화제로서 디아제팜, 메프로바메이트, 메틸펜티놀, 및 에티폭신; 신경이완제로서 크로르프로마진, 프로메타진, 및 아자페론; 베타-아드레날린성 차단제로서 부니트롤; 항우울제로서 단독으로 사용되거나 신경이완제와 함께 사용되는 삼중고리, 사중고리 화합물; 정신흥분제로서 카페인, 암페타민 또는 이들의 유도체; 그리고 진정제 및 최면제로서 페노바르비탈과 코데인의 조합물 등의 향정신성 약물을 사용하는 것이 공지되어 있다.(Poldinger,W.,Schmidlin,P.E., Wider,F., Index Psychopharmacorum,H.Huber, Bern ) 그러나 이들 향정신제는 스트레스에 대한 원인 병리 작용 없이 우세한 증상적 약물 치료만을 나타내는 단점을 가지며, 이들 약제는 스트레스에 의해 야기되는 만성손상을 감소시키지 못하고, 이화작용성 재생을 통해 스트레스에 대항하는 작용을 하지 못하고, 신체 적응의 정상적(항스트레스) 반응을 변형시키며, 다수의 역반응을 야기시킨다. 또한, 불안완화제 및 정신흥분제(암페타민 및 카페인 타입을 가진)는 종종 후천성 내성의 영향으로 인해 약량이 증가될 필요가 있고, 중요한 역반응으로서 정신활성 물질에 대해 의존적이 되도록 만드는 문제점이 심각하게 존재한다.

따라서 스트레스, 즉 자율신경계의 불균형을 해소하기 위해서, 다른 각도의 해결 방안이 모색되고 있는데, 그 내용은 이하에서와 같다. 즉, 스트레스는 의학적으로 인체의 평형 상태를 깨뜨리는 유해한 자극이며, 이 자극에 대응하기 위해 나타나는 생체의 반응에는 신경전달물질(neurotransmitter)들이 관여하는데, 중요한 신경전달물질로는 상기한 바와 같이 지질 콜레스테롤에서 파생된 아세틸콜린이 있다. 아세틸콜린은 이완을 촉진하는 신경전달물질로서 자율신경계인 부교감신경에서 발생된다. 이외에도 지금까지 발견된 신경전달물질은 약 50여가지가 있다.

이러한 신경전달물질은 반드시 수용체(receptor)라고 하는 상보적인 대상이 있어야 제 기능을 다할 수 있는데 신경전달물질이 많아도 신경전달물질에 상보적으로 결합되어 작용하는 펩타이드 구조의 수용체가 없으면 그 기능을 다할 수 없다. 아세틸콜린과 결합하는 무스카린성 수용체는 결합에 중요한 역할을 하는 아스파르트산 및 글루탐산 잔기와 이를 둘러싸는 소수성 아미노산 군을 포함하는 펩타이드로 이루어져 있다(Gearien 1999). 그래서, 이러한 펩타이드를 포함하는 신경영양인자(neurotrophic factor)가 체내에 공급되면 신경세포에 영양이 공급되어 신경 세포의 성장이 유도되고 부작용이 없이 파킨슨씨 병과 같은 각종 신경질환을 해결할 수 있게 되고 아울러 충분한 신경전달 물질과 신경전달물질의 수용체 생성 촉진을 통해, 과도한 스트레스(자극)에 의한 신경 충격(impulse)을 잘 흡수, 전달하여 과부하를 방지함으로서 스트레스에 의한 질환을 해결할 수 있다. 그러므로 신경계 강화를 위해 신경전달 물질을 많이 섭취하는 것도 중요하지만 신경전달물질의 수용체 생성에 도움을 주는 펩타이드, 즉 신경영양인자를 많이 섭취하는 것도 중요하다. 또한, 수용체로 작용하는 펩타이드는 다량 섭취하여도 신경전달물질 본체의 양에 따라 반응이 진행될 뿐 그 이상의 반응은 진행되지 않으므로 과량 복용으로 인한 부작용은 발생되지 않는 장점이 있다.

여기서 뇌신경영양인자(brain-neurotrophic factor)라 함은, 뇌와 척수 등의 신경 조직에 영양 물질로 작용하여 신경 세포 또는 신경교 세포의 성장에 도움이 되는 영양 물질로서 작용되는 인자를 의미한다. 그동안 뇌 신경 세포는 성장하지 않는 것으로 알고 있다가 뇌에 특정 영양분을 공급함으로서 뇌 신경 세포가 성장,분화를 유지한다는 사실이 밝혀짐에 따라 신경 영양 물질의 중요성이 강조되었고 이에 따라 신경 세포에 영양을 공급하여 신경 세포의 성장과 분화를 유지 조절하는 것을 촉진하는 뉴로트로핀들이 태아나 동물의 뇌에서 검색,발굴되어 그들의 펩타이드 서열이 밝혀지게 되었다. 이와 같이 신경 조직의 성장 또는 증식을 자극시켜 신경 또는 신경교 세포의 생존을 촉진하고 분화를 유지하는, 펩타이드로 이루어진 신경영양인자는 신경계 질환을 해결할 수 있는 중요한 요소로서 신경세포 퇴화 및 신경 퇴화성 질병에서 발생하는 기능 상실 증세, 예컨대 파킨슨씨병이나 알츠하이머병을 치료하는데 유용하게 쓰인다고 밝혀졌다(바론(Varon) 및 번지(Bunge) 1997. Ann.Rev. Neuroscience 1:327: 퉤넨(Thoenen) 및 에드가(Edgar) 1985. Science 229:238 참조).

지금까지 발견된 중요한 신경영양인자 또는 향신경인자로는 신경 성장 인자(NGF,nerve growth factor), 뇌-유래 신경 영양 인자(BDNF, brain derived neurotrophic factor), 신경교세포-유래 신경 영양 인자(GDNF, glial cell derived neurotrophic factor), 뉴로트로핀-3 (NT-3) 및 뉴로트로핀-4/5(NT-4/5)등이 있으며 이들 역시 단백질로서 펩타이드로 이루어져 있다. 그러나, 새로운 신경영양인자를 검색 발굴하기 위해서는 사람의 뇌나 태아의 뇌를 이용해야 하는 데, 그 영양인자의 양이 극미량이어서 검출이 어렵고 사망후 적출해야 함으로 윤리적으로도 제재가 많아 지금까지 발견된 신경영양인자는 몇 개에 불과한 정도이다. 오히려 지금까지 발견된 신경영양인자보다 훨씬 더 많은 종류의 신경영양물질이 존재할 것으로 추측된다.

또한, 지금까지는 신경영양인자 또는 신경전달물질을 펩타이드 합성기나 PCR 증폭을 통한 유전자 재조합 방법을 이용하여 합성 펩타이드나 재조합 펩타이드의 형태로 인위적으로 제조하여 왔는데, 이들은 비용이 고가이고 안전성 등의 문제로 상업적으로 이용되기가 쉽지 않으며, 이들의 대부분은 분자량이 30,000 달톤 이상의 거대분자로 뇌 혈관 장벽(Brain Blood Barrier) 통과할 수 없어 경구투여로는 뇌 신경 세포에 도달할 수 없으므로 반드시 뇌에 직접 주사 방식으로 주입해야만 하는 단점이 있다(메디칼 리포트 1998, 1,2월호).

따라서, 이러한 유전자 재조합 방법 등의 복잡한 공정을 사용하지 않고, 본 발명과 같이 식품 등급의 효모로부터 효모 추출물이나 효모 펩타이드를 제조하여 비교적 소량 복용으로도 인체 내의 신경계에 작용하여 항 스트레스, 항 불안, 숙면 유도 등의 신경 생리 활성 작용을 나타내고, 스트레스 억제를 통한 항 피로효과 등을 나타낸다면 이는 유전자 재조합을 이용하여 발굴되었던 기존의 신경 영양 인자(뉴로트로핀, NT-3, BDNF, NGF 등)에 비해 상업적 유용성 면에서도 뛰어나고 유전자 변형체(GMO)로서 의심될 수 있는 안전성 문제도 해결할 수 있다.

효모는 인체에 무해한 GRAS급으로 인정되고 50%이상이 양질의 단백질과 다량의 미네랄, 비타민B군 등이 함유되어 있어 주류나 제빵산업용 외에도 여러 유용물질인 단백질, 핵산(nucleic acids), 효소, 지질, 비타민, 미네랄 등의 원료로 사용되어 왔으며(Roman et al., Food Biotechnology, 6, 225, 1992) 효모의 자가소화(autolysis)효소와 기타 단백 분해 효소로 가수분해되어 생산되는 효모 추출물(yeast extract)은 미생물 발효 배지, 조미료, 건강식품 등의 원료로 사용되어 왔다(Bioindustry, 14, 53, 1997). 그러나, 아직까지 효모를 가수분해하여 만든 효모 추출물이나 효모 유래 펩타이드들의 기능을 밝혀 항스트레스 및 뇌 신경영양제(천연 신경영양인자)로서의 특정 용도로 사용한 바가 없고, 이를 실험 확인, 분석한 예가 없으며 이를 소재로 하여 항 스트레스 제제나 항 불안 제제, 수면 보조제 등으로 이용한 바도 없고 또한 공개된 바도 없다.

이에 본 발명자들은 효모가 생장 배지의 환경에 따라 혐기적 또는 호기적으로 반응하고 또 환경이 좋지 않을 때에는 생장을 중지하고, 이형 접합 등을 통해 외부의 열악한 환경에 대처하는 등 다른 미생물과는 달리 외부의 영향에 민감하게 대응하는 기능을 가지고 있다는 점과, 모든 유기체는 스트레스를 처음 지각하면 스트레스에 대항하여 경고반응이 나타나서 신체자원을 동원하는 생리적 각성 반응이 나타나다가, 스트레스가 계속되면 유기체는 저항단계에 들어가서 스트레스에 대한 대응노력이 효과가 있어 생리적 변화는 안정된다 (Seyle,1956 )는 사실에 착안하여, 효모를 최대 증식기까지 증식시킨 후, 효모가 사멸되지 않는 범위 내에서 정상적인 생장활동을 할 수 없는 범위의 적절한 물리적 또는 화학적 스트레스, 즉 고온, 초음파 또는 진동 ,pH 변화 등을 생장 배지에 가하여 항 스트레스 물질(단백질,효소)을 다량 생성, 분비하도록 한 다음, 효모를 자가소화나 단백 분해 효소 등으로 가수분해하여 만든 효모 추출물과, 이를 한외 여과막으로 정제하여 만든 효모 유래 펩타이드가 항 스트레스 제제나 항 불안 제제, 수면 보조제 등 자율 신경 질환 치료 및 예방제, 그리고 뇌 신경 영양제(천연 신경 영양 인자)로서의 기능이 있음을 새롭게 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명에서는 효모를 가수분해함으로써 얻어지는 항스트레스, 항피로 및 천연 뇌신경영양인자로서의 기능을 갖는 새로운 효모 추출물 및 기능성 펩타이드(peptide)를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명에서는 스트레스로 인한 인체의 병을 해결하고 자율신경계의 균형을 유지하기 위하여, 상기 효모 추출물 또는 효모 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 복합 천연 신경영양인자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명에서는 스트레스로 인해 발생되는 자율신경계 질환을 포함하는 신경성 질환의 치료를 위하여, 상기 효모 추출물 또는 효모 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 항 스트레스, 항 불안, 신경 안정, 수면보조 활성을 갖는 항스트레스제를 제공하는 것을 목적으로 한다

또한, 본 발명에서는 스트레스와 밀접한 관련을 갖는, 운동 근육 피로에 대한 항 피로 효과를 갖는 효모 추출물 또는 효모 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피로 회복 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명에서는 심각한 부작용을 안고 있는 약물이 아닌 안전성이 입증된 자연유래 물질로부터 천연 항스트레스성 물질을 추출하여 이를 포함하는 기능성 음료를 제공함으로써, 손쉽고 안전하게 스트레스 완화 물질을 섭취할 수 있도록 하고자 하는 데에 있다.

도 1는 무스카린성 아세틸콜린 수용체 지도를 개략적으로 도시한 도면이고,

도 2는 본 발명의 항 스트레스 실험(1) 결과를 나타낸 그래프이고,

도 3는 본 발명의 항 스트레스 실험(2) 결과를 나타낸 그래프이고,

도 4은 항 피로 효과를 측정하기 위한 마우스용 지구력 측정 장치(流水 pool 운동 장치)를 도시한 도면이고,

도 5는 본 발명의 항 피로 실험 결과를 나타낸 그래프이고,

도 6은 본 발명의 인체에 대한 항 스트레스 효과를 임상 시험한 결과를 나타낸 사진이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모에서 추출된 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 추출물을 제공한다.

본 발명의 효모 추출물에서, 효모는 양질의 단백질과 미네랄, 비타민 B군을 다량 함유하고 있으며, 그 효모를 당업계에 공지되어 있는 통상적인 추출방법, 예컨대 자가분해효소 또는 단백질 분해효소를 사용하여 추출할 수 있다. 아울러 시판되고 있는 기존의 효모추출물에서도 본 발명에 따른 항스트레스제제, 항피로제제 및 뇌신경영양제로서의 기능이 있는 것으로 밝혀졌다.

또한, 본 발명은 효모를 35℃ 내지 70℃, 바람직하게는 50℃ 내지 60℃의 온도에서 자가소화시킨 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 추출물을 제공한다.

본 발명의 효모 추출물은 35℃ 이상의 고온에서 자가소화를 시키는 것만으로도 유효한 항스트레스 활성을 갖는 효모추출물을 제공할 수 있는데, 이는 고온을 가함으로 해서 효모균에 스트레스를 주는 효과를 얻게 되고, 효모균은 자가소화와 동시에 스트레스에 저항하기 위해 스트레스 저항 물질을 분비하게 되기 때문인 것으로 생각된다. 더 나아가 여기에 초음파나 진동 등의 스트레스를 줌으로써 스트레스에 저항력이 강해진 개량 균주를 선발하고, 이 개량 균주에 다시 스트레스를 가하여 스트레스 저항 물질을 더욱 활발히 생산하게 함으로써 더욱 우수한 항스트레스 활성을 갖는 추출물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 효모를 상기와 같이 자가소화시킴과 동시에 또는 자가소화시킨 후에, 단백질 분해효소로 단백질을 가수분해시킨 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 효모를 상기와 같이 가수분해시킨 것을 원심분리하여 상등액만을 취한 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기와 같이 원심분리한 상등액을 초미세여과용 한외여과막을 사용하여 여과하여 10,000 이하의 분자량만을 취한 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 효모 펩타이드에서, 분자량을 10,000 으로 cut-off 한 것은, 일반적으로 분자량 10,000이하의 것을 펩타이드라 하고, 이 펩타이드가 기능성 식품 소재로서 다양한 생리활성을 나타내는 생체 조절 기능에 관여하기 때문이며 (2000 신기술 동향조사 보고서, 기능성 식품, 특허청 p 41), 특히 뇌혈관 보호를 위해 분자량 15,000이상의 거대 분자는 뇌혈관을 통과하지 못하도록 하는 인체내의 뇌혈관 장벽(brain blood barrier)을 쉽게 통과할 수 있도록 하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 글루탐산과 아스파르트산이 15 내지 25몰% 함유된 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 효모 펩타이드는 아세틸콜린이 결합하는 무스카린성 수용체를 형성할 수 있는 아미노산인 글루탐산과 아스파르트산이 풍부히 함유되어 있으므로, 자율신경계의 불균형으로 인한 스트레스성 질환에 큰 효과가 있다.

또한, 본 발명은 효모 균주를 최대증식기까지 배양하는 단계; 상기 배양된 효모를 35℃ 내지 70℃의 온도에서 자가소화시키면서, 동시에 단백질 분해 효소를 더 첨가하여 효모 단백질을 가수분해시키는 단계; 그리고 상기 가수분해된 것을 원심분리하여 상등액만을 분리하여 취하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 추출물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 효모 추출물의 제조방법은, 바람직하게는 효모를 최대증식기까지 배양하기 전에 효모가 사멸하지 않는 범위의 고온, 초음파, 진동, pH 변화 등을 가하면서 배양하여 살아남은 균주만을 선별함으로써 효모 균주를 개량하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 효모 추출물의 제조방법은, 바람직하게는 효모를 자가소화시키기 전에 효모가 사멸하지 않는 범위의 고온, 초음파, 진동, pH 변화 등의 적절한 물리적 또는 화학적 스트레스를 가하여 스트레스에 견디기 위한 대사물질의 분비를 유도하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

이는 모든 유기체는 스트레스를 처음 지각하면 자극에 대항하여 경고반응이 나타나서 신체자원을 동원하는 생리적 각성 반응이 나타나다가, 스트레스가 계속되면 유기체는 저항단계에 들어가서 스트레스에 대한 대응노력이 효과가 있어 생리적 변화는 안정된다는 것을 근거로 하여(Seyle,1956) 효모도 스트레스를 받으면 그 스트레스에 대항하기 위해 각종 효소를 분비하게 되고 그 분비된 효소는 저분자량의 단백질로서, 스트레스를 겪는 인체에 유익한 신경 생리 활성 제제로 작용한다는 데에 착안한 것이다.

본 발명의 효모 추출물의 제조방법에서, 효모의 항 스트레스 물질의 생성, 분비를 유도하기 위해 효모에 가하는 물리적 또는 화학적 스트레스로서는 효모가 사멸되지 않는 범위내에서 생장 적정온도보다 고온인 35℃ 내지 45℃의 고온, 초음파 또는 진동, pH 변화 등의 자극을 들 수 있다.

본 발명의 효모 추출물의 제조방법은, 보다 바람직하게는 효모 균주에 초음파와 진동을 가하면서 배양하여 살아남은 균주만을 선별하는 균주 개량 단계; 상기 선별된 개량 균주를 YM배지에 접종하여 22℃ 내지 25℃에서 대수성장기까지 배양한 후 원심분리하여 균체를 모은 후 1% pepton 완충액으로 희석하는 단계; 생장 적정온도보다 고온인 35℃ 내지 45℃의 고온도 및 초음파와 진동의 스트레스를 8시간동안 가하여 효모로 하여금 스트레스를 견디기 위한 대사물질을 생성 분비하도록 하는 단계; 50℃ 내지 60℃의 온도로 자가소화시키면서, 동시에 단백질 분해 효소를 더 첨가하여 효모 단백질을 가수분해시키는 단계와, 상기의 가수분해된 것을 원심분리하여 상등액만을 분리하여 취하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 효모 추출물의 제조방법에서 원심분리하여 취한 상등액을 초미세여과용 한외여과막을 사용하여 여과하여 10,000 이하의 분자량을 갖는 펩타이드만을 취하는 단계를 포함하는 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 펩타이드의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 효모 펩타이드의 제조방법에서는, 상기 원심분리하여 취한 상등액을 cut-off 10,000의 초미세여과용 한외여과막을 사용하여 여과하여 10,000이하의 저분자량의 펩타이드만을 취함으로써 추출물의 효능을 떨어뜨리는 기타 물질을 제거하여 주고, 인체의 흡수가 더욱 용이하여 생체이용률이 높은 저분자만을 분리 정제하게 할 뿐만 아니라, 특히 뇌 혈관 장벽(blood-brain barrier)을 쉽게 통과할 수 있도록 해준다.

본 발명의 효모 추출물 또는 효모 펩타이드의 제조방법에서는, 상기의 방법들에 의해 제조된 효모 추출물 또는 효모 펩타이드를 건조시켜 분말상태로 만드는 단계를 더 포함할 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기한 제조방법에 의해 제조된 효모 추출물 또는 효모 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항스트레스 제제를 제공한다.

본 발명의 항스트레스성 제제는 신경 안정, 긴장 완화, 불안 제거 또는 수면 보조 등의 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기한 제조방법에 의해 제조된 효모 추출물 또는 효모 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항피로 제제(피로회복제)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기한 제조방법에 의해 제조된 효모 추출물 또는 효모 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 신경영양제(신경영양인자)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기한 제조방법에 의해 제조된 효모 추출물 또는 효모 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 항스트레스성, 항피로성 및 신경영양성 기능성 음료를 제공한다.

본 발명의 기능성 음료는 안정성이 입증된 효모균에 스트레스를 주어 항스트레스 물질을 분비하게 하고, 이렇게 항스트레스 물질을 함유하도록 만들어진 효모 추출물 또는 효모 펩타이드로 음료를 제조함으로써, 안전하고 복용이 용이하면서도 신경안정, 긴장완화 및 수면보조 등의 효과를 갖는 항스트레스성 음료를 제공할 수 있도록 한다.

본 발명의 기능성 음료는, 바람직하게는 효모 추출물 또는 효모 펩타이드 0.1 내지 10 중량%, 감미제와 산미제등의 통상의 음료 첨가물 10 내지 25 중량%, 나머지 중량%의 물을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 기능성 음료에서 통상적인 음료 첨가물로서는, 액상 과당, 설탕, 말토덱스트린, 포도당, 구연산, 니코틴산아미드, 판토텐산, 안식향산나트륨, 풍미제, 향미제 등이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 매실 과즙 등의 과즙을 더 첨가하여 음료를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 효모 균주를 최대증식기까지 배양하는 단계; 상기 배양된 효모를 35℃ 내지 70℃의 온도에서 자가소화시키면서, 동시에 단백질 분해 효소를 더 첨가하여 효모 단백질을 가수분해시키는 단계; 상기 가수분해된 것을 원심분리하여 상등액만을 분리하여 취하는 단계; 상기 상등액을 활성탄과 함께 물에 넣고 교반한 후 가압 살균하는 단계; 그리고, 이렇게 살균된 것을 감압 여과하여 무색으로 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항스트레스성, 항피로성 및 신경영양성 기능성 음료의 제조 방법을 제공한다.

상기 항스트레스 물질을 함유하는 효모 추출물을 음료 제제로 만들기 위하여는, 정제 과정을 거침으로써 효모 특유의 냄새를 제거하여야 한다. 이를 위한 정제 방법으로는, 제조된 효모 추출물을 활성탄과 함께 물과 섞어서 교반시킨 후 가압살균하여 여과한다. 이는 아미노산이 활성탄(active carbon)에 거의 흡착되지 않는 성질(송형익·신중엽, 현대 발효공학, 1998, 293)을 이용하여 탈색과 탈취를 목적으로 활성탄과 혼합한 것이다.

이렇게 여과된 음료 농축물을 희석하여 항스트레스성 음료를 제조한다. 음료는 통상적인 음료의 제조 방법에 따라 제조하며, 본 발명의 방법에 따라 제조된 효모추출물을 포함하는 한 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명의 기능성 음료의 제조방법은, 바람직하게는 효모가 사멸하지 않는 범위의 고온, 초음파, 진동, pH 변화 등을 가하면서 배양하여 살아남은 균주만을 선별함으로써 효모 균주를 개량하는 단계와, 효모가 사멸하지 않는 범위의 고온, 초음파, 진동, pH 변화 등의 적절한 물리적 또는 화학적 스트레스를 가하여 스트레스에 견디기 위한 대사물질의 분비를 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 기능성 음료의 제조방법에서, 자가소화 온도는 50℃ 내지 60℃인 것이 바람직하고, 가압살균은 약 1.5 정도의 기압, 100℃ 내지 125℃의 온도에서 10 내지 15분간 행하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

자율신경계의 불균형, 즉 스트레스로 인한 계속적인 교감신경의 흥분으로 인해 발생되는 여러 장기의 변화를 정상으로 하기 위해서는, 부교감신경의 흥분 전달이 원활하도록 하여 각 장기에 미치는 변화가 정상으로 되도록 하여야 한다. 그러기 위해서는 시냅스에서의 신경전달물질인 아세틸콜린이 잘 분비되어야 하고, 시냅스에서 아세틸콜린이 다음 신경 세포로 잘 전달되기 위해서는 아세틸콜린 수용체가 존재하여야 한다. 아세틸콜린은 도 1에 나타낸 바와 같이 무스카린성 수용체(muscarinic receptor)와 결합한다. 따라서 시냅스에서 아세틸콜린이 잘 전달되기 위해서는 시냅스에 무스카린성 수용체가 많아야 하며, 이러한 무스카린 수용체가 많이 만들어져야 한다. 무스카린 수용체는 7개의 분절로 이루어진 단백질로 구성되어 있고 이중 수용체의 역할을 위해서는 아세틸콜린의 4급 암모늄염이 무스카린성 활성에 중요하므로 수용체에 이 부위와 결합할 수 있는 음이온 부위가 있을 것으로 추측되어지고 있으며 이것은 산성 아미노산 잔기에 의할 것이라고 생각되어지고 있다. 가능한 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 생각할 수 있다.(강건일, 1992, 의약화학입문 10:131 참조).

따라서, 아세틸콜린의 수용체인 무스카린성 수용체를 형성할 수 있는 원재료로 쓰일 펩타이드 제제 중에서도 아스파르트산 및 글루탐산의 산성 아미노산의 함량이 풍부한 아미노산 조성을 가진 펩타이드 제제는 인체에서 무스카린 수용체의 합성을 원활히 하여 부교감 신경의 아세틸콜린의 효율적인 전달에 영향을 줌으로써 근본적으로 스트레스로 인한 교감신경의 계속적인 흥분으로 자율신경계의 불균형을 균형화 시켜줌으로써 스트레스로 인한 정신과 신체의 병을 근본적으로 예방 치유할 수 있을 것이다.

본 발명자들은 효모 추출물에 상기와 같이 무스카린성 수용체를 형성할 수 있는 아미노산이 풍부히 함유되어 있음을 밝혀내었으며, 이로써 효모 추출물이 신경계의 불균형으로 인한 스트레스성 질환에 큰 효과가 있다는 결론을 내릴 수 있었다.

본 발명의 효모 추출물은 하기하는 실시예4에 나타낸 바와 같이 18가지의 다양한 아미노산이 함유되어 있으며 특히 이중 아스파르트산과 글루탐산은 그 함량이 매우 높은 것으로 나타났다. 이 두 아미노산은 모두 마이너스 전하를 띤 R기를 가지고 있는 아미노산들이다. 이러한 결과는 부교감 신경계를 포함한 뉴런의 신경전달물질인 아세틸콜린의 수용체인 무스카린 수용체에 꼭 필요로 하는 마이너스 전하를 띤 아미노산이 많이 함유되어 있어 아세틸콜린 수용체를 체내에서 합성해야 할 때 좋은 원재료로 쓰일 수 있다는 것을 나타낸다. 그리하여 본 발명의 효모 추출물은 스트레스시 흥분하게 되는 교감신경에 균형을 맞출 부교감 신경의 신경전달을 원활히 하는데 도움을 줌으로써 항스트레스 기능을 가질 수 있는 것이다.

식품 등급 효모는 인체에 무해한 GRAS급으로 인정되고 있고 50%이상의 양질의 단백질과 다량의 미네랄, 비타민B군 등이 함유되어 있어 상기한 바와 같은 신경전달물질 또는 그 수용체의 원료가 될 수 있는 펩타이드가 풍부할 뿐만 아니라, 특히 효모에 들어있는 비타민 B군과 미네랄은 일반적인 에너지 대사뿐만 아니라 뇌와 신경세포를 활성화시키는 작용을 하여, 비타민 B₆(pyridoxin)는 세로토닌, 도파민, 노르에피네프린, GABA, 타우린과 같은 신경전달물질을 합성하는 데 없어서는 안되는 영양소로서, 부족하면 초조 불안해지고 집중이 안되며 기억력이 떨어지고, 비타민 B₁(thiamin) 이 결핍되면 기억력 장애, 무감각, 치매 등 코르사코씨병을 일으키며, B2는 뇌의 성장에 필요한 보효소로 작용하여 신경학적으로 아주 중요한 신경영양인자로 작용할 수 있다.

또한, 효모에는 뇌 신경 세포 성장에 중요한, 항산화 효소를 생성하는 데 있어 없어서는 안되는 셀레늄이 비교적 다량 존재하여 효모는 셀레늄 보급원으로도 우수한 식품으로, 셀레늄이 결핍되면 뇌 기능에 장애를 일으켜 기분이 우울해지고 불안을 느끼게 된다. 특히 효모는 셀레늄을 포함한 크롬 등의 미네랄과 유기태의 킬레이팅 결합을 이루어 미네랄 강화 효모(mineral enriched yeast)의 형태로서 인체 섭취시 흠수하기 좋은 유기태 미네랄 보충원의 역할도 하는 데(미국 특허 4.530.846호 1985.7.23 셀레늄 효모 제조 방법) 이러한 사실로 미루어 볼 때. 효모는, 효모 추출물이나 효모 펩타이드의 형태로서 우수한 뇌 신경 영양 물질로 작용하여, 항 스트레스, 항 불안, 신경안정, 스트레스로 인한 수면 장애 해소, 피로회복 등에 우수한 효능을 가지는 기능성 식품 소재 및 천연 펩타이드 소재라고 할 수 있다.

또한, 본 발명에서 생성되는 각종 분비 물질(exoenzyme)은 효모의 세포벽을 통해 분비되는 물질이므로 효모의 세포벽이 천연 멤브레인 필터로 작용하여 세포벽을 통과할 수 있을 정도로 저 분자량의 단백질이 다량 생성되게 되는 데 이를 섭취할 경우 인체에 존재하는 뇌혈관 장벽(Blood-brain barrier)을 쉽게 통과할 수 있어 뇌 신경 영양 물질로 작용할 수 있다.

또한, 효모는 자기소화 기능을 가지고 있어, 효모가 생장할 수 있는 조건(온도, pH등)에서 크게 벗어난 환경이나 혹은 영양소가 없는 기아상태에 처하게 되면 자체 효소의 작용에 의해 효모의 세포질이 가수분해되고 이때 연속적인 효소작용으로 세포벽도 함께 파괴되어지며, 이미 분해된 여러 가지 세포질은 파괴된 세포벽 사이를 통하여 세포밖으로 용출되어 효모의 생체 이용률(bioability) 을 높일 수 있는 독특한 특징이 있어, 효모를 통해 저 분자량의 항 스트레스 물질을 다량 생성하게 한 후, 효모를 자가 소화시킴으로써 효모의 내부에 함유되어 있는 각종 단백질과 미네랄,비타민 B군 등이 용해되어 보다 효율적인 신경 영양물질로 작용하여 항 스트레스 효과를 가지는 효모 펩타이드를 얻을 수 있다.

본 발명의 효모 추출물의 제조방법에 있어서, 효모에 고온, 초음파 및 진동 등의 스트레스를 가하여 이에 대항하는 물질을 효모가 생성하도록 유도하도록 하는 단계를 첨가한 것은 효모균체의 유용성분을 이용하기 위하여 치사온도보다 고온을 가하여 효모가 세포막의 선택적 투과능을 상실하여 효모 자체가 가지고 있는 protease, lipase, invertase, maltase, zymase등의 효소를 이용해 세포막이 소실 되도록 하는 자기소화 단계를 통하여 각종 정미물질(글루타민산 등의 아미노산, 5′-AMP 등의 핵산분해물질 등)이 분비되도록 하면서(송형익과 신중엽, 현대발효공학, 1998. 5:189 참조), 동시에 단백질 분해 효소인 파파인을 첨가하여 보다 효율적인 항스트레스 활성, 항 피로 활성, 그리고 신경영양제를 얻기 위함인데, 일반적으로 온도는 효모의 생육과 생존에 영향을 주는 가장 중요한 매개변수 가운데 하나이다. 대부분의 미생물들은 중온성으로 효모는 20-46℃의 생육온도 제한을 가지고 있어, 중온성 효모인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에 대한 37℃의 약한 열쇼크는 치사온도인 48-55℃에 대한 내성을 유도하기도 하는데 이러한 열내성 세포들은 최적생육온도(35℃)보다 5℃만 상승하여도 열쇼크 반응을 유도하여 이탄당 트레할로스와 함께 104, 90, 70, 60kDa의 분자량을 가진 핵심적인 열쇼크단백질이 합성된다. (Michelle L. Deegenaars and Kenneth Watson, 1998. Environmental Microbiology. 8월호 참조) 따라서 이는 효모가 열에 대한 스트레스에 대항하기 위하여 그에 필요한 항 스트레스 단백질을 합성한다는 좋은 예가 될 수 있다. 이에 착안하여 본 발명은 효모에 고온, 초음파 및 진동 등의 스트레스를 가하여 이에 대항하는 물질을 효모가 생성하도록 유도하도록 하는 제조단계를 첨가하였으며 효모균을 35℃ 내지 70℃의 고온에서 자가소화시키면서, 단백질 분해 효소를 더 첨가하여 효모 단백질을 가수분해시키는 단계와, 상기의 가수분해된 것을 원심분리하여 상등액만을 분리하여 취하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 효모 추출물 및 효모 펩타이드를 제조하였다.

본 발명의 효모추출물 및 효모 펩타이드에 대해 신경 영양보급기능을 통한 항스트레스 효과(anti-stress capacity)가 있는지 시험하기 위하여, 시험 방법으로는 하기하는 실험에서와 같이 브레크만과 다르디모브(Brekhman and Dardymov)의 방법을 응용한 부동 스트레스 실험을 실시하였다. 일반적으로 스트레스에 의해 일어나는 생체의 여러 반응들은 중추신경계의 외부 자극에 대한 감지를 통하여 시작되며, 이러한 외부 자극에 따라 부신피질 호르몬 분비에 변동을 초래하여 이에 대응하기 위하여 여러 장기 중 간장, 흉선, 갑상선 및 비장 등의 중량에 변동을 초래하고, 면역 세포들의 감소를 초래하며, 코르티코스테로이드 영향을 받아 혈중 LDH(Lactate dehydrogenase)와 ALP(Alkaline phosphatase) 효소의 변화가 나타나는 것으로 알려져 있어 이러한 지표의 변화를 항 스트레스 평가자료로 이용하고 있다.(Christina,J.,Hans,W.and Hans,M.: Haematological changes during acute mental stress, Br. J. Heanat 71:564, 1971 / Conner, R. L., Vernikos-Danelis, J. and Levine, S.: Stress, fighting and neuroendocrine function, Nature, 2:564, 1971./Munck, A., Guyre, P. M. and Holbrook, N. J.: Physiological functions of glucocorticoids in stress and their relation to pharmacological actions. Endocrine Reviews.,5:25, 1984.) 따라서 이러한 점에 염두를 두고 부동 스트레스를 가한 랫트를 이용하여 스트레스에 의해 영향을 받는 각 장기무게의 변화와 혈액생화학적 요소의 변화를 측정한 결과 항스트레스 효과가 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명 효모 추출물 및 효모 펩타이드에 대한 항 스트레스 측정 실험의 하나로 마우스의 수영 운동 능력 측정을 통한 항 피로 효과(anti-fatigue capacity)실험을 실시하였다. 스트레스가 정동반응(靜動反應), 운동기능 및 자율기능에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있고(황의완, 心身症, 서울, 행림출판사,pp.17-28, 33-49, pp.277, 1985), 일반적으로 과도한 운동(수영)은 스트레스로 간주되어, 유영 풀(pool) 측정 장치를 통해 과도한 수영을 하도록 강요된 상태에서 오래 견딜 수 있는 능력을 측정하는 수영 지구력(swimming endurance capacity) 측정을 통한 항 피로 효과 실험은 항 스트레스 효과를 측정하는 데 있어 바람직한 실험이라고 할 수 있다. 실험 결과 본 발명 효모 추출물 및 효모 펩타이드가 우수한 항 스트레스 효과 및 항 피로 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에 따른 효모 추출물 및 효모 펩타이드는 항스트레스 기능을 가지므로, 일반적으로 생체에 미치는 자극이 일정한 강도 이상이 될 경우 상해적으로 작용하여, 자극의 종류에 관계없이 긴장성 두통, 편두통, 고혈압, 소화불량, 피로, 두통 등을 일으키고, 만성적으로 지속되면 각종 신경증, 위 손상 등을 유발시키는 등의 비특이적 전신적 적응 증후군(general adaptative syndrome)을 일으키게 된다는 사실에 의거하여 (황의완, 心身症, 서울, 행림출판사,pp.17-28, 33-49, pp.277, 1985) 스트레스 억제를 통해, 본 발명 효모 추출물 및 효모 펩타이드는 신경안정제, 긴장완화제 등의 용도로 사용될 수 있으며, 특히 신경이 예민하여 잠을 못 자는 사람들은 위한 수면보조제로서 그 이용이 크게 기대된다. 또한 이러한 용도를 포함하는 뇌, 신경 영양 물질로서의 기능을 갖는 기능성 식품 소재로서 건강 보조식품 및 특수영양식품으로도 유용하게 이용될 수 있다.

따라서 이러한 점으로 비추어 볼 때, 효모 펩타이드 및 효모 추출물은 긴장을 완화하고 숙면을 유도하는 것과 같은 자율 신경 조절에 역할이 있는 것으로 보이고, 본 발명 효모 펩타이드와 효모 추출물은 신경 기능을 정상화시키는 데 있어, 다량 섭취하여도 부작용이 거의 없는, 매우 효과적인 신경 영양물질이라고 할 수 있다.

기존의 부작용이 많은 신경성 질환 및 스트레스성 질환 치료제(신경 안정제, 항 불안제, 수면제 등)를 부작용이 없는 항스트레스 효과와 천연 신경영양제로서의 기능을 가지는 효모추출물 및 효모 펩타이드를 통해 각종 스트레스 질환을 해결할 수 있게 되었고 이를 통한 자율 신경 조절 기능 회복으로 신경 안정제, 항 불안제, 수면 보조제, 피로 회복제로 사용될 수 있게 되었다.

본 발명의 항 스트레스 및 신경영양보급 기능으로서의 효모 추출물 및 효모 펩타이드는 부작용이 많은 향 정신제제 대용으로 의약품, 동물약품, 기능성 식품 등에 다양하게 이용될 수 있다. 이렇게 치료용 약제로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 효모 추출물 및 효모 펩타이드를 유효성분으로서 투여하는 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인 기준 1일 500mg, 불면증 증세가 있는 자의 경우 250mg 분말 캡슐로 1일 2회 투여된다.

실시예

이하 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나, 실시예는 본 발명을 한정하는 것으로 해석해서는 안되며, 본 발명의 범위내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

실시예 1

식품등급의 효모균인 Saccharomyces cerevisiae 균주(제니코(주) 생이스트를 구입하여 사용)를 YM 배지에서 24℃, 산소공급하에서 48시간 배양하였다.

상기와 같이 배양된 배양액을 15,000rpm으로 15분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 남은 침전물,즉 효모를 10배(v/v)멸균수로 2회 세척, 희석한 후, 50℃의 고온에서 효모가 자신을 용해시키는 자가소화(autolysis) 효소를 이용하여 자가소화를 실시함과 동시에, 효모 단백질을 펩타이드로 분해하는 것을 촉진시키기 위해 단백질 분해효소(파파인 30.000)를 1%를 첨가하여 초기 pH 4.0에서 48시간 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.

이와 같이 용해된 것을 15,000 rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하여 본 발명의 효모 추출물을 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 1"이라 하고 하기하는 실험예에서 사용하였다.

실시예 2

1) 효모의 개량 균주 선별

생명공학연구소(KCTC)에서 분양받은 식품등급의 Saccharomyces cerevisiae 7904 균주를 45 kHz의 연속적인 초음파와 수중 펌프를 통한 낙차폭을 이용하여 진동을 가하는 스트레스 조건하에서 48시간 배양한 후 이 스트레스 조건 하에서 죽지 않고 살아남은 효모를 YM 아가 플레이트(효모 추출물 3g, 맥아 추출물 3g, 펩톤 5g, 글루코스 10g, 아가 15g/L)에 스크리닝하여 플레이트 상에서 가장 빠른 성장과 큰 콜로니를 형성하는 것을 개량 균주로 선별하였다.

2) 배양

이렇게 선별된 개량균주를 YM 배지에서 24℃, 산소공급하에의 발효조에서 48시간 배양하였고, 그 배양액을 15,000rpm으로 15분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 남은 침전물인 효모 페이스트(paste)를 1% 펩톤 완충액으로 10배 희석한 후 초음파 발생장치와 진동장치가 부착된 발효조에서 35℃ 내지 45℃의 고온과 45Khz의 초음파를 5분 간격으로 30초간 가하는 행위를 총 8시간 동안 반복하고, 수중 펌프를 이용하여 낙차를 이용한 진동을 주면서 효모가 스트레스로 인해 분비하는 항 스트레스 물질의 생성이 많이 발생되게 하면서 8시간 배양하였다.

3) 자가소화 및 가수분해

상기의 2)에서 배양된 배양액을 50℃의 고온에서 효모가 자신을 용해시키는 자가소화 효소를 이용하여 자가소화를 실시하였다. 이와 함께 효모 단백질을 펩타이드로 가수분해되는 것을 촉진시키기 위해 단백질 분해효소(파파인 30.000) 1%를 첨가하고 초기 pH 4.0에서 48시간 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.

분해 후 가수분해율(%)은 상등액에 존재하는 단백질 농도를 총 효모 단백질 농도로 나눈 값으로써 결정하였다. 단백질 농도는 자가소화시킨 샘플을 원심분리하여 상등액을 회수하고 희석한 후 이 희석액을 튜브에 500㎕ 분주하고 같은 양의 단백질 정량 시약을 넣은 다음 교반하여 60℃에서 60분 반응시킨 후 스펙트로포토메터를 이용하여 562nm에서 측정하였다. 실험 결과, 가수분해율은 55%로 나타났다.

4) 가수분해 물질의 분리, 정제 및 건조

상기 3)에서와 같이 자가소화 및 가수분해된 것을 15,000 rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리, 수득하여 "시료 2"로 하여 하기하는 실험예에서 사용하였고, 침전물은 "시료 3"으로 하여 역시 하기하는 실험예에서 사용하였다. 이와 같이 수득된 상등액과 침전물을 동결 건조하여 분말상태의 효모 추출물 및 침전물을 만들었다.

실시예 3

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 효모추출물을 제조하되, 최종적으로 얻어진 상등액을 초미세여과장치를 통하여 한외여과막(MWCO=10,000)을 통과시켜 분리, 정제한 후, 동결 건조하여 분자량 10,000이하의 정제된 천연 효모 펩타이드를 제조하였다.

실시예 4

아미노산 분석

상기 실시예 2에서 수득한 효모 추출물 10g을 냉각 아세톤으로 탈수시킨 후 60℃ 드라이오븐에서 여과지에 펴서 건조시킨 후 경질 시험관에 시료 5 mg을 취해 6 N HCl 5 ml을 가하여 탈기한 후 밀봉하여 110℃에서 24시간 가수분해시켜서 2-3회 소량의 증류수로 씻은 다음 농축기로 50℃에서 건조시켜 염산을 제거하고 완충액을 용해하여 아미노산 자동 분석기(Deckman system 6300, USA)로 칼럼 Li 10cm No.338051 이온 교환을 사용하여 분석하였다. 아미노산 조성을 분석한 결과, 본 발명 효모 추출물의 아미노산 조성은 하기하는 표 1과 같았다.

아미노산	몰비(%)
글루탐산	14.2
류신	6.9
라이신	5.2
아스파르트산	5.0
알라닌	4.7
히스티딘	4.3
이소류신	3.9
페닐알라닌	3.7
발린	3.4
티로신	3.5
트레오닌	3.0
글리신	3.0
세린	2.8
아르기닌	2.3
프롤린	2.0
트립토판	1.4
메티오닌	1.5
시스테인	0.8

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 제조된 효모 펩타이드는 18가지의 다양한 아미노산이 함유되어있으며, 특히 이중 아스파르트산과 글루탐산의 함량이 매우 높은 것으로 나타났다.

상기에서 알 수 있는 바와 같이, 다양한 아미노산과 펩타이드는 신경 영양 물질로 작용하여 과도한 스트레스시 발생되는 자율 신경의 불균형을 조절할 수 있는 항스트레스 물질로 유용하게 이용될 수 있다.

실시예 5

음료의 제조

1) 여과 및 정제

상기에서 실시예 2에서 수득된 상등액을 동량의 활성탄(상등액 중량의 5%)과 혼합한 후, 약 20배의 양의 물에 넣어 교반하였다. 이렇게 교반된 것을 가압살균기에 넣고 121℃에서 15분간 살균한 후 2회 감압 여과하였다. 탈색 탈취된 무색의 정제된 효모 추출물을 얻었다.

2) 음료 조성물의 제조

상기 1)에서 제조된 효모 추출물을 70 중량부의 물에 희석하고, 여기에 액상과당 7 중량부, 포도당 4 중량부, 그리고 매실과즙 농축액 5.9 중량부를 첨가하여 음료 조성물을 제조하였다.

3) 부재료 첨가효과

효모추출물로 항스트레스 음료를 제조할 때 원재료의 특성상 기호도가 낮기 때문에 이의 기호성을 향상시키기 위하여 감미제와 산미제를 첨가하였고 이때 기호도 상승효과와 적정 배합 비율을 선정하기 위하여 5단계 평점법(1:대단히 싫다, 3:보통이다, 5:대단히 좋다)으로 관능검사를 실시하여 하기 표 2에 결과를 나타내었다.

부재료	색	향	맛	종합 기호도	비고
감미제	액상과당 3%	4.2	3.8	2.5	3.5	※매실과즙 농축액 5% 배합
	액상과당 5%	4.2	3.9	3.0	3.7
	액상과당 7%	4.4	4.1	3.5	4.0
	액상과당 9%	4.2	4.1	3.5	3.9
	포도당 2%	4.0	3.9	2.5	3.5
	포도당 4%	4.0	3.9	3.5	3.8
	포도당 6%	4.0	3.9	3.2	3.7
산미제	매실과즙 농축액 4%	3.5	3.4	3.9	3.6	※액상과당 8% 배합
	매실과즙 농축액 6%	4.0	4.0	4.3	4.1
	매실과즙 농축액 8%	4.1	4.2	4.0	4.1

상기와 같이, 첨가제의 종류에 따라 배합비율을 다르게 하여 단일효과를 검토하였으며, 예비실험을 토대로 적정 매실과즙 농도를 5%로 배합한 다음 액상과당을 점진적으로 첨가하였을 때 종합적인 기호도가 7%가 가장 좋은 것으로 나타났으며, 포도당을 점진적으로 첨가하였을때는 4%가 가장 좋은 것으로 나타났고 색과 향에는 차이가 없었으나 맛의 기호도의 변화가 있는 것으로 나타났다. 또한, 액상과당을 8%로 배합한 다음 매실과즙을 점진적으로 첨가하였을 때 6%와 8%가 같은 종합기호도를 나타내었고 향에 변화가 컸다. 즉, 액상과당이나 포도당을 첨가하였을 때 맛의 기호도가 상승하였으며 매실과즙을 첨가하였을 때 향과 산맛의 증가로 청량감이 좋아진 것으로 나타났다. 따라서 관능검사 결과를 종합적으로 볼 때 감미제인 액상과당과 포도당의 비율은 7%와 4%로, 산미제인 매실농축액의 비율은 6-8% 범위라 판단되었다.

실험예

이하 본 발명의 효모 추출의 항스트레스 활성, 항피로 활성 등을 시험하였다.

실험예 1

항스트레스 활성 시험(1) (고려대 생명공학원 김경미 박사 실험)

항스트레스 활성시험을 위한 실험 동물로는 약 180g 중량의 5주령의 수컷 스프라그-돌리 랫트(바이오링크(주)에서 구입)를 이용하였으며, 이를 구입후 일주일 간, 조명시간을 아침 7시부터 저녁 7시까지 12시간으로, 실내온도는 18-23^oC로 조절된 방에 적응시킨 후 본 실험에 사용하였다. 사료는 고형사료(동물 실험용 사료 (주)제일제당에서 구입)를 사용하였고 급수는 수돗물을 사용하였으며 사료와 급수는 제한하지 않았다. 시료는 3가지를 사용하였는데, 일반적인 효모 추출물의 제조방법으로서 50℃의 고온 하에서 가수분해시킨 시료 즉 상기 실시예 1로 제조된 것을 시료 1,초음파와 진동을 가한 후 가수분해시킨 것을 원심분리한 상등액 즉 실시예 2의 상등액을 시료 2로 하고, 그리고 실시예 3에서 원심분리후 침전된 침전물을 시료 3으로 하여, 시료 1,2,3 모두 동결 건조하여 분말로 한 후 실험하였다.

상기의 수컷 스프라그-돌리 랫트에, 증류수에 녹인 각 시료(1g/kg 체중)를 매일 1회 8일간 연속하여 경구투여하였다. 각 시료에 대해 랫트는 3마리씩 사용하였으며, 시료투여 6일 후부터 랫트를 폭 5cm, 길이 12cm의 원통의 고정틀에 넣은 후 45℃의 경사로에 고정시켜 48시간 동안 스트레스를 유발시켰다.

최종시료 투여 후 3시간만에 랫트를 에테르로 가볍게 마취시키고 흉선, 비장, 신장 및 갑상선을 적출하여 그 중량을 측정한 후, 스트레스를 가하지 않은 정상군 및 스트레스를 가하되 시료를 투여하지 않은 대조군과 비교하였다. 그 결과를 하기하는 표 3에 나타내었다.

	비장(mg/100g,B.W.)	신장(mg/100g,B.W.)	흉선(mg/100g,B.W.)	갑상선(mg/100g,B.W.)
정상군	279.28±10.24	876.62±19.79	313.89±21.69	6.96±0.27
스트레스대조군	216.13±6.77*	1043.83±55.31	221.14±21.53	5.36±0.47*
시료 1	234.11±5.31b	945.18±9.95a	236.51±29.29	7.06±0.59a
시료 2	243.82±16.28a	922.26±11.93a	251.43±3.83	5.71±0.34
시료 3	226.43±1.84b	1020.18±44.04	211.41±10.30	5.55±0.69

정상군으로부터 유의적으로 차이가 있음:^*p〈0.05,^**P〈0.01

스트레스대조군으로부터 유의적으로 차이가 있음:^aP〈0.1,^bP〈0.05

그 결과, 상기한 표 2에 나타난 바와 같이, 스트레스(스트레스 대조군)를 가한 경우, 스트레스 호르몬 생산과 면역계에 밀접한 관계가 있는 장기들이 정상군에 비하여 현저한 변동을 초래하여 비장, 흉선, 갑상선 등의 중량이 현저한 감소하였고, 신장의 중량의 증가가 관찰되었다. 이 때, 시료 1과 2를 투여한 경우에는, 스트레스에 의한 비장, 흉선, 갑상선의 감소가 유의적으로 억제됨이 관찰되었고, 스트레스에 의한 신장의 비대 역시 억제된다는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 효모를 일반적인 방법으로 가수분해 한 것과 초음파,진동 등으로 항스트레스 물질 분비를 유도한 것 모두 약간씩 차이가 있기는 하지만 모두 항스트레스 효과가 뛰어남을 관찰할 수 있었는 데 이는 가수분해하는 과정인 고온이나 생효모의 용해과정이 초음파나 진동과 같은 스트레스를 가한 것과 같은 작용을 한 것으로 보아진다.

항스트레스 활성 시험(2) (고려대 생명공학원 김경미 박사 실험)

또한, 스트레스 부과시에는 비장을 비롯한 여러 면역기관들의 비대 및 면역세포들의 감소뿐 아니라 LDH등의 혈중 효소의 변화가 나타나는 것으로 알려져 있고, 스트레스에 의한 혈중 코르티코스테로이드의 증가는 지질대사에 영향을 주어 혈중 콜레스테롤의 수치를 증가시킨다. 이런 사실들로부터 본 연구에서도 시료의 항스트레스 효과를 검토하기 위해 혈청 중 LDH, GOT(Glutamate oxaloactate transaminase), GPT(Glutamate pyruvate transaminase), ALP의 활성도와 총 콜레스테롤을 측정하였다. 그 결과를 하기하는 표 4에 나타내었다.

혈청	GOT	GPT	총콜레스테롤	LDH	ALP
정상군	124.18±2.64	40.62±1.99	81.03±6.08	538.07±66.39	48.97±8.05
스트레스대조군	203.6±59.70**	58.14±3.51	154.32±9.73**	1371.07±195.50*	12.57±1.29**
시료 1	182.24±21.73	43.10±5.09	125.0±81.51a	718.40±59.18a	15.15±1.08
시료 2	141.63±3.79a	31.50±2.07	100.59±1.56b	562.40±58.02a	17.10±0.90a
시료 3	212.69±10.61	55.37±3.37	129.04±20.87	891.07±21.36	19.10±1.00a

정상군과 유의적으로 차이가 있음:^*P〈0.05,^**P〈0.01

스트레스대조군과 유의적으로 차이가 있음:^aP〈0.05,^bP〈0.01

상기한 표 3과 같이 스트레스 부과에 의해서 LDH, 총 콜레스테롤이 증가하였으며 투여로 인하여 유의한 상승억제효과가 나타났다. 혈청 중 트랜스아미나아제 활성도를 측정한 결과 스트레스 부과시 증가하였으며 시료 1과 2의 투여에 의해서 유의적으로 감소했으며, 특히 GOT에 있어서는 유의한 상승억제효과가 있었다. 또한 혈청중 ALP 활성도는 스트레스 부과시 유의한 감소를 보였으며 시료 1, 2 및 3 투여로 인하여 유의한 감소억제효과가 나타났다.

이상의 실험결과로부터 시료 1과 2가 우수한 항스트레스 활성을 가지며, 특히 시료 2에서 현저한 항스트레스 활성을 갖는다는 것을 알 수 있었다.

실험예 2

항 피로 효과 시험(고려대 생명공학원 김경미 박사 실험)

본 발명 효모 추출물의 항 스트레스 활성도를 측정하기 위해 항 스트레스 인자와 밀접한 관계가 있는 수영 지구력(swimming endurance capacity) 측정을 통한 항 피로 효과(anti-fatigue capacity)를 측정하였다. 수영 지구력 측정에는 데이터의 재현성과 신뢰성이 높은 도 4에 도시된 바와 같은 마우스용 지구력 측정 장치 (流水 pool 운동 장치, Matsumoto 등, 1996)를 이용하였으며 실험용 마우스로는 약 28g 중량의 7주령의 수컷 마우스(Male ICR mice:한국 국제 실험동물 센터에서 구입)를 이용하여 일주일 간, 조명시간을 아침 7시부터 저녁 7시까지 12시간으로, 실내온도는 22-24^oC, 습도 50%로 조절된 방(33×23×12cm, 3마리/방)에 적응시킨 후 본 실험에 사용하였으며 사료는 고형사료(제일제당에서 구입)를 사용하였고 급수는 수돗물을 사용하였으며 사료와 급수는 제한하지 않았다.본 실험에서는, 대조군 마우스는 고형 사료를 경구 투여(1g/kg)하였고, 실험군 마우스는 50℃의 고온 하에서 가수분해시켜 얻은, 실시예1에서 제조된 것과 동일한 효모 추출물을 시료로 하여 경구투여(1g/kg) 하여 총 9일간 3회 수영 시간을 측정하였다. 대조군과 시험군의 마우스는 각 6마리씩 사용하였으며, 상기 마우스들의 수영지구력을 측정하기 위하여 도 4의 아크릴 플라스틱 수영장(90×45×45cm)에 35cm 깊이의 물을 채우고 34℃로 유지시켰으며 물의 흐름은 펌프로 8L/m로 전압을 조절해 유지했으며 물흐름 측정기(type F45500, Blue white Co, Westminster, CA, USA)로 측정하며 적당한 조건을 유지하였다.

수영 운동 능력 측정 시 마우스의 신체적 활동도와 실험 데이터의 편차를 최소한으로 줄이기 위해서 모든 운동 능력 측정 시각은 오후 1시부터 5시까지 실시하였으며, 수영 운동 시간의 한계치는 마우스가 더 이상 수영을 못하는 시점까지로 정했으며, 이는 마우스가 물 속에 빠져 7초가 경과할 때까지 물 표면으로 올라오지 못하는 상태를 육안으로 확인하여, 수영 시작 후 이 시점까지를 수영 운동 시간으로 설정하였다. (Matsumoto 등,1996) 그 결과는 하기 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명 효모 추출물을 시료로 하여 경구투여한 실험군의 경우, 대조군과 비교할 때 수영시간이 월등히 향상되었음을 확인할 수 있다. 이 결과로 미루어 보아 본 발명 효모 추출물에 항 피로 효과 및 항 스트레스 활성 효과가 있음을 확인 할 수 있었다.

실험예 3

임상실험(황 원준 신경 정신과 전문의 임상실험)

본 발명의 인체에 대한 항스트레스 효과를 임상시험하기 위해, 1. 불면증이 있는 환자, 2. 불안증이 있는 환자, 및 3. 두통이 있는 환자 등 신경정신과적 환자군을 대상으로 베이스라인(baseline) 투약 3일 후 뇌기능 검사(brain mapping)을 한 다음(2001년 2월 6일), 각각의 환자에게 3일간 하루에 본 발명의 효모 추출물 500mg을 복용시킨 후 뇌기능 검사를 실시하였다(2001년 2월 9일). 그 결과를 도 6a 및 6b에 도시하였다.

도 6a 및 6b에서 보여지듯이, 베이스라인의 검사 결과의 경우 세타파(theta)의 거의 모든 영역에서 비대칭적인 증가를 보였다. 이는 정신활동이 증가되고 정신적 긴장 상태에 있음을 의미한다. 그러나, 복용 3일 후의 검사 결과의 경우에는 세타파(theta)의 중앙-두정엽 영역에서 대칭적 분포를 보였다. 이는 긴장이 이완된 상태, 가수면 상태 또는 입면 상태 등에서 보이는 양상으로 심리적 안정을 이룬 상태를 의미한다.

본 발명은, 평범한 식품 원료로만 이용되고 있는 효모 추출물의 항스트레스 및 신경영양제로서의 새로운 용도를 밝힘으로서, 기존의 부작용이 많은 향 정신제제 대체제로서의 의약품 및 기능성 식품으로서의 활용이 가능해 지게 되었다.

아울러 종래의 유전자 재조합 균주 발현 등을 통하여 힘들게 얻었던 신경영양인자(뉴로트로핀) 대신 식품등급의 효모를 가수분해하여 효모 펩타이드를 제조함으로써 천연의 신경 영양제를 손쉽게 제조할 수 있게 되었을 뿐만 아니라 경구복용으로도 뇌혈관 장벽을 통과할 수 있도록 제조하였으며, 효모 추출물의 새로운 용도로서 항스트레스 효과와 항 피로 효과, 그리고 천연 신경영양제로서의 용도를 개발하게 되어 이로써 효모 추출물을 기능성 식품으로서 뿐만 아니라 의약품 원료로서도 사용이 가능하게 되었다.

Claims (18)

1. 효모에서 추출된 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 추출물.
2. 제 1 항에 있어서, 효모를 35℃ 내지 70℃의 온도에서 자가소화시킨 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 추출물.
3. 제 2 항에 있어서, 효모를 자가소화시킴과 동시에 또는 자가소화시킨 후에, 단백질 분해효소로 단백질을 가수분해시킨 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 추출물.
4. 제 3 항에 있어서, 효모를 가수분해시킨 것을 원심분리하여 상등액만을 취한 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 추출물.
5. 제 4 항에 따라 원심분리한 상등액을 초미세여과용 한외여과막을 사용하여 여과하여 10,000 이하의 분자량만을 취한 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 펩타이드.
6. 제 5 항에 있어서, 글루탐산과 아스파르트산이 15 내지 25몰% 함유된 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 펩타이드.
7. 제 5 항에 있어서, 뇌 혈관 장벽을 통과하는 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 펩타이드.
8. 효모 균주를 최대증식기까지 배양하는 단계;

   상기 배양된 효모를 35℃ 내지 70℃의 온도에서 자가소화시키면서, 동시에 단백질 분해 효소를 더 첨가하여 효모 단백질을 가수분해시키는 단계; 그리고

   상기 가수분해된 것을 원심분리하여 상등액만을 분리하여 취하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 추출물의 제조 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 효모를 최대증식기까지 배양하기 전에 효모가 사멸하지 않는 범위의 고온, 초음파, 진동, pH 변화 등을 가하면서 배양하여 살아남은 균주만을 선별함으로써 효모 균주를 개량하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 효모 추출물의 제조 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 효모를 자가소화시키기 전에 효모가 사멸하지 않는 범위의 고온, 초음파, 진동, pH 변화 등의 적절한 물리적 또는 화학적 스트레스를 가하여 스트레스에 견디기 위한 대사물질의 분비를 유도하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 효모 추출물의 제조방법.
11. 제 8 항 내지 제 10 항에 있어서, 원심분리하여 취한 상등액을 초미세여과용 한외여과막을 사용하여 여과하여 10,000 이하의 분자량을 갖는 펩타이드만을 취하는 단계를 포함하는 특징으로 하는 항 스트레스 기능, 항 피로 기능 및 신경영양인자로서의 기능을 갖는 효모 펩타이드의 제조방법.
12. 제 8 항 내지 제 10 항에 있어서, 원심분리하여 취한 상등액을 활성탄과 함께 물에 넣고 교반한 후 가압 살균하는 단계와, 이렇게 살균된 것을 감압 여과하여 무색으로 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항스트레스성, 항피로성 및 신경영양성 기능성 음료의 제조 방법.
13. 제 1 항 내지 제 7 항 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 효모 추출물 또는 효모 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항스트레스 제제.
14. 제 12 항에 있어서, 항스트레스성 제제는 신경 안정, 긴장 완화, 불안 제거 또는 수면 보조의 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 제제.
15. 제 1 항 내지 제 7 항 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 효모 추출물 또는 효모 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항피로 제제.
16. 제 1 항 내지 제 7 항 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 효모 추출물 또는 효모 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 신경영양제.
17. 제 1 항 내지 제 7 항 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 효모 추출물 또는 효모 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 항스트레스성, 항피로성 및 신경영양성 기능성 음료.
18. 제 17 항에 있어서, 효모 추출물 또는 효모 펩타이드 0.1 내지 10 중량%, 감미제와 산미제등의 통상의 음료 첨가물 10 내지 25 중량%, 나머지 중량%의 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 음료.