KR20010017847A

KR20010017847A - 콘드로이틴 황산을 포함하는 황소개구리 건조엑스

Info

Publication number: KR20010017847A
Application number: KR1019990033581A
Authority: KR
Inventors: 김영식; 한범수; 우송지; 도시히코도이다
Original assignee: 김영식
Priority date: 1999-08-16
Filing date: 1999-08-16
Publication date: 2001-03-05
Also published as: KR100390472B1

Abstract

본 발명은 황소개구리(Rana catesbeiana) 건조물을 프로테아제를 효소원으로 사용하여 분해시켜 제조한 황소개구리 건조 엑스 및 이로부터 분리·정제한 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)류에 관한 것으로, 본 발명의 황소개구리 건조엑스는 칼슘이 풍부할 뿐만 아니라 글리코사미노글리칸류의 함량이 높아 점안제, 관절염 치료제, 신생혈관 성장억제제 등으로 사용될 수 있으며, 골다공증은 물론 간기능 개선 및 갱년기장애 치료에도 매우 효과적으로 이용될 수 있다. 또한 황소개구리로부터 얻어지는 건조엑스 또는 글리코사미노글리칸류를 이용함으로써, 생태계에 큰 위협이 되고 있는 황소개구리 퇴치에도 효과적이다.

Description

콘드로이틴 황산을 포함하는 황소개구리 건조엑스{Dried extract of Rana catesbeiana including chondroitin sulfate}

본 발명은 식용으로 사용되는 북아메리카산 황소개구리(Rana catesbeiana) 건조물을 프로테아제를 효소원으로 사용하여 분해시켜 제조한 황소개구리 건조 엑스 및 이로부터 분리·정제한 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)류에 관한 것이다.

글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan, 이하 "GAG" 라고 약칭함)은 생합성 과정에서 부분적인 변화를 통해 구조적으로 다양하고 복잡한 형태를 지니게 된다. GAG류의 기본적인 골격은 우론산(uronic acid)과 글루코사민(glucosamine)의 반복이면서 부분적으로 설페이트화가 이루어져 있는데, 이러한 복잡한 화학 구조에 의해 여러 종류의 생리 활성을 나타낼 수 있게 된다. 동물의 GAG류로는 히얄우론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate), 케라틴 황산(keratin sulfate), 헤파린 황산 (heparan sulfate), 헤파린(heparin) 등이 알려져 있다. 이들 GAG류는 주로 연결조직에 분포하며 헤파린만 예외로 간, 허파, 피부 점막내의 동맥에 있는 마스트(mast) 세포 내의 과립에 존재한다. 또한, 하등 동물인 연체동물에서도 GAG류가 발견되고 있는데, 조개류에서 3-O-설페이트기를 가지고 있는 헤파린과 유사한 GAG류의 존재가 보고되었고[Pejler 등, J. Biol. Chem. (1986) 262, 11413-11421], 해삼, 성게류에서도 설페이트기가 치환된 콘드로이틴 황산류가 발견되었으며[Mourao 등, Trends in Glycobiology and Glycoscience (1995) 7, 235-246], 오징어의 각막에서도 콘드로이틴 황산이 존재함이 알려졌다[Karamanos 등, Int. J. Biochem. (1991) 23, 67-72]. 최근에는 식용 달팽이에서도 헤파린 황산과 유사한 GAG류가 발견되어 구조와 생물학적 활성에 대한 연구가 진행되고 있는 실정이다[Kim 등, J. Biol. Chem. (1996) 271, 11750-11754, Wang 등, Biochem, Biophy. Res. Commun. (1997) 235, 369-373].

글리코사미노글리칸 의약품으로서 널리 사용되는 것은 헤파린으로, 약간의 부작용이 있긴 하지만 항응고제로서 혈전 치료제, 수술후, 신장투석, 인공혈관 등에 광범위하게 사용되고 있다. 최근에 들어서는 부작용을 낮춘 저분자량의 헤파린이 동일한 목적으로 사용되고 있으며, 또한 콘드로이틴 황산B인 더마탄 황산(dermatan sulfate)이 항혈전제로 임상 실험중에 있다. 히얄우론산은 화장품의 첨가물로 많이 쓰이고 있다.

콘드로이틴은 크게 세 종류로서, 황산기의 위치와 우론산의 종류에 따라서 콘드로이틴 황산 A, 콘드로이틴 황산 B, 콘드로이틴 황산 C로 분류하고 있다. 콘드로이틴 황산 A와 C는 N-아세틸-D-갈락토사민과 D-글루쿠론산이 1,3결합과 1,4결합이 번갈아가며 연결된 2당(糖)류의 중합체이며, 2당당(糖當) 한 개의 황산 에스테르기를 갖는다(도 1a, 1c). 콘드로이틴 황산 B는 D-글루쿠론산 대신에 L-이두론산을 함유하고 있으며, 이들을 β-헤파린 또는 더마탄 황산이라고도 한다(도 1b). 콘드로이틴 황산 A, C에서 황산기를 약산처리 또는 효소 설파타아제(sulfatase)로 제거한 것을 콘드로이틴이라고 한다.

의약품으로 사용되는 콘드로이틴 황산은 상어의 척추 연골 및 소의 기관지에서 얻어지고 있는데, 점안제, 관절염치료제로 사용되어 왔으며, 최근에는 강장 드링크류 등으로 사용되고 있다. 또한, 콘드로이틴 황산은 환자에게 고통 및 행동 제한과 관절의 변형을 나타내는 질환인 골관절염 (osteoarthritis)의 치료에 사용되는데, 글루코사민 황산과 함께 투여시 통증을 감소시킬 뿐만 아니라 연골을 보호할 수 있다고 알려져 있다[Paroli E, Int. J. Clin. Pharmacol. Res. (1993) 13 suppl:1-9]. 실제적으로, 환자를 대상으로 콘드로이틴을 이용한 골관절염과 퇴행성 관절염의 치료에서 콘드로이틴 또는 글루코사민 황산이 퇴행성 관절염의 진행 속도를 늦추고 환자의 고통을 감해준다는 사실이 보고된 바 있다[Kelley, Altern. Med. Rev. (1998) 3, 27-39]. 이러한 결과를 바탕으로 흔히 부작용을 수반하는 비스테로이성 소염제 대신 대체 약물요법으로서 글루코사민 황산, 콘드로이틴 및 글루코사민 황산 복합체를 이용한 골관절염 치료제의 임상 3상 실험이 진행 중에 있다(미국 보건연구원 11차 대체의학 자문위원회 보고서, 9.24-25, 1998). 관절은 연골 조직으로 구성되어 있으며 혈관이 없기 때문에 새로이 생성이 되지 않는다. 따라서 연골 조직의 주성분인 GAG류를 보충해 주어야만 한다. 투여한 콘드로이틴 황산의 약 70 가 효소에 의해서 대사를 받아 N-아세틸갈락토사민, 글루쿠론산, 황산 이온으로 분해되어 흡수되는데, 이러한 과정을 거쳐 약 8 가 연골조직에 도달하는 것으로 알려져 있다. 이러한 점에서 콘드로이틴 투여에 의한 치료 방법은 상당히 좋은 결과를 얻고 있다고 볼 수 있다.

북아메리카산 황소개구리(Rana catesbeiana)는 1973년 양식용으로 일본에서 들어왔다. 황소개구리는 한번에 1-2 만개의 알을 낳은 빠른 번식력으로 10년만에 제주도를 제외한 전국 저수지에 퍼졌으며, 현재 그 수는 30 만 마리 이상으로 추산된다. 또한, 황소개구리는 3년만에 몸통길이 25 cm, 다리 길이 35 cm가 자라며 몸무게가 1 kg이상 증가하여 토착종 개구리는 물론 뱀까지도 마구 잡아먹어 환경생태계를 위협하고 있다.

최근, 황소개구리의 이용에 관한 연구가 많이 보고되고 있는데, 한국과학기술원의 생물학과 김선창 교수팀은 황소개구리의 위(stomach)로부터 강력한 항균 물질을 분리하였으며[조선일보, 12.22, 1997], 동신대 한의과 대학에서는 황소개구리의 쓸개(하마담)에서 웅담과 유사한 성분을 검출하였다[한겨레신문, 3.16, 1999]. 또한 황소개구리의 무게는 약 300 g 정도로 칼슘과 단백질이 풍부해 건강 식품으로 사용되고 있으며, 특히 뒷다리가 식용으로 많이 활용되고 있다. 이에 반해 황소개구리의 뇌 부분과 뼈는 거의 활용되고 있지 않는 실정이다. 그러나, 북아메리카산 황소개구리를 건강식품으로 이용하기 위한 과학적인 근거는 아직 미약하다고 볼 수 있다.

본 발명자들은 황소개구리의 퇴치를 통하여 환경생태계를 보호하고자 황소개구리로부터 유용한 물질을 찾는 연구를 계속한 결과, 북아메리카산 황소개구리(Rana catesbeiana) 건조물을 프로테아제를 효소원으로 사용하여 분해시켜 황소개구리 건조 엑스를 제조하고, 이로부터 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan)류를 분리·정제하여 그 구조를 규명하고 특성을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)류를 포함하는 황소개구리 건조 엑스를 제공하는 것이다.

도 1a는 콘드로이틴(chondroitin) 황산 A의 구조를 나타낸 것이고,

도 1b는 콘드로이틴 황산 B의 구조를 나타낸 것이고,

도 1c는 콘드로이틴 황산 C의 구조를 나타낸 것이며,

도 2a는 본 발명의 GAG류의¹H-NMR의 결과를 나타낸 것이고,

도 2b는 도 2a의 화살표 부분을 확대하여 나타낸 것이고,

도 3a는 콘드로이티나제(chondroitinase) ABC와 본 발명의 GAG류 및 표준품 콘드로이틴 황산 A를 반응 시켰을 때 시간에 따른 생성물의 동력학 결과를 나타낸 것이고,

(a) 본 발명의 GAG류 (b) 표준품 콘드로이틴 황산A

도 3b는 콘드로이티나제 ABC와 본 발명의 GAG류 및 표준품 콘드로이틴 황산 A와의 반응에 의한 생성물을 고속 액체 크로마토그라피 (high performance liquid chromatography)로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 4는 콘드로이티나제 AC와 본 발명의 GAG류와의 반응에 의해 생성된 이당류의 구조를 나타낸 것이고,

(I) △UA-β-(1-〉3)-GalNAc(△Di-OS,Ch-OS);

(Ⅱ) △UA-β-(1-〉3)-GalNAc-6S (△Di-6S, Ch-6S);

(Ⅲ) △UA-β-(1-〉3)-GalNAc-4S (△Di-6S, Ch-4S)

이 때, △ H-4, H-5의 이중결합 UA : 우론산 (uronic acid)

GalNAc : N-아세틸갈락토사민 (N-acetylgalactosamine)

OS : 무황산염 4S : 4-황산염

6S : 6-황산염

도 5는 표준품 시료가 컬럼(column)을 통과한 부피와 분자량에 대한 대수를 취하여 얻은 검량선을 나타낸 것이다.

(A) 콘드로이틴 황산(40,000 달톤);

(B) 콘드로이틴 황산(15,000 달톤);

(C) 콘드로이틴 황산(13,000 달톤);

(D) 덱스트란 황산(10,000 달톤);

* 황소개구리로부터 얻은 GAG류(14,000 달톤)

본 발명은 황소개구리 건조물을 프로테아제를 효소원으로 사용하여 분해하여 제조되는 황소개구리 건조 엑스 및 이로부터 분리·정제한 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan)류를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 황소개구리 건조 엑스 및 글리코사미노글리칸의 제조방법을 제공한다.

아울러 본 발명은 상기 황소개구리 건조 엑스 또는 이로부터 분리한 글리코사미노글리칸류를 유효성분으로 하는 연골관절 보호제용 약학적 조성물 및 신생혈관생성 억제제용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 황소개구리 건조 엑스의 제조를 위해서는 식용으로 사용되는 북아메리카산 황소개구리 건조물을 사용할 수 있다. 상기 건조물로부터 황소개구리 건조 엑스의 제조 방법은 다음과 같다.

황소개구리의 내장을 분리시킨 후 아세톤, 헥산, 톨루엔 등의 유기용매로 처리하여 지방을 제거한다. 필요에 따라서 근육질, 내장, 뇌, 뼈조직을 분류하여 각각 같은 처리를 행할 수 있다. 건조시켜 딱딱하게 된 조직을 분쇄기를 이용하여 잘게 부수고 체를 통과시켜 일정한 크기의 분말을 얻는다. 이렇게 얻은 황소개구리 건조 분말을 pH 8.0 ~ 9.0 범위를 유지할 수 있는 완충용액 또는 NaOH 용액에서 현탁시킨다. pH를 약알칼리로 유지시킨 완충용액을 사용한 이유는 단백질을 제거하기 위해 사용되는 프로테아제인 알칼라제의 최적 pH가 약알칼리이기 때문이다.

본 발명에서는 프로테아제로 알칼라제를 사용할 수 있는데, 상기 알칼라제는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)로부터 생산되며 모든 종류의 단백질을 분해시킬 수 있는 프로테아제로서 활성도는 0.6AU/g이다. 주효소는 섭틸리신 (subtilisin) A로 엔도프로테아제의 일종이다. 최적 반응온도는 기질에 따라서 50 ~ 70 ℃이고 최적 pH는 6.5 ~ 9.0이다. 반응시간은 24시간에서 48시간 정도가 바람직한데, 이는 대부분의 단백질이 소화되도록 하기 위함이다. 알칼라제 이외에도 프로테아제로 파파인 프로테아제를 사용할 수 있으나, 경제성면에서 알칼라제가 가장 유리하다. 이외에도 단백질 제거를 위해 NaOH 용액을 사용할 수 있으나, 이 경우 강알칼리 용액이기 때문에 강염산을 이용하여 중화시켜야 한다. 그러나, 프로테아제를 사용하는 경우에는 중화시킬 필요가 없다.

이와 같이 프로테아제 또는 NaOH로 단백질을 분해한 후, 상등액에 1 mM의 염화칼슘 용액과 5트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, 이하 "TCA"라 칭함)을 처리하여 남아 있는 단백질 및 핵산을 침전시킨다. 염화칼슘 용액은 다당류와 칼슘염을 만들어 다당류를 안정화시킬 수 있다. 침전물을 5000xg에서 원심분리한 후, 에탄올에 대한 용해도 차에 의해서 분획하기 위해 고분자 탄수화물이 녹아 있는 상등액에 3배의 에탄올을 넣어 4^oC에서 하룻밤 방치시킨 후 5000xg에서 원심분리 시켜 침전물을 다시 모은다. 침전물을 무수 에탄올로 씻어서 감압 하에 건조시킨 후 분말화하여 황소개구리 건조 엑스를 얻는다.

이렇게 제조된 황소개구리 건조엑스의 분말성분 중에 포함되어 있는 산성당을 정제하기 위하여 삼급 및 사급 암모늄염을 이용한다. 사급 암모늄염으로는 세틸피리디움 클로라이드(세타블론, cetylpyridinium chloride)나 트리메틸아민 클로라이드(trimethylamine chloride)가 이용될 수 있다. 암모늄염의 첨가로 생성된 침전물 복합체를 강염으로 용해시키고, 에탄올로 재침전시켜 정제된 글리코사미노글리칸류를 얻는다.

상기 황소개구리 건조 엑스로부터 얻어진 글리코사미노글리칸류의 구조를 규명하기 위하여, 고자장 핵자기 공명(NMR)과 콘드로이티나제(chondroitinase) AC, B 및 ABC를 이용하였다. 콘드로이티나제 AC와 B의 기원은 플라보박테리움 헤파리늄(Flavobacterium heparinum)인 토양미생물이고 콘드로이티나제 ABC는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 미생물이다. 콘드로이티나제 AC는 콘드로이틴 A와 C에 대하여 특이적으로 작용하여 주로 4-설페이트와 6-설페이트기를 가진 콘드로이틴 황산 이당류를 생성한다. 콘드로이티나제 ABC는 세종류의 콘드로이틴을 분해시키고 콘드로이틴나제 B는 콘드로이틴 B에 대하여서만 기질 특이성을 가지고 있다. 세종류의 콘드로이티나제를 이용하여 콘드로이틴 황산의 구조적 특징을 확인할 수 있다.

콘드로이티나제 AC를 이용하여 얻어진 이당류를 고속 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatoraphy)로 분석한 결과, 콘드로이틴 황산과 비교할 때 분리 시간이 일치하였으며 또한 얻어진 이당류를 표준품과 함께 핵자기 공명(NMR)을 이용하여 분석할 때 정확히 일치함을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터, 본 발명의 황소개구리 건조엑스로부터 분리한 글리코사미노글리칸류가 콘드로이틴, 콘드로이틴 황산 C 및 콘드로이틴 황산 A로 구성됨을 알 수 있다. 보다 구체적으로는 본 발명의 글리코사미노글리칸류는 콘드로이틴(I) 6.0, 콘드로이틴 황산 C(Ⅱ) 26.9및 콘드로이틴 황산 A(Ⅲ) 67.1로 구성된다.

(I) →4)-2-N-아세틸갈락토사민 설페이트(acetylgalctosamine sulfate)-β-(1→3)글루쿠론산(glucuronic acid)-β-(1→

(Ⅱ) →4)-2-N-아세틸갈락토사민-6-설페이트-β-(1→3)글루쿠론산-β-(1→

(Ⅲ) →4)-2-N-아세틸갈락토사민-4-설페이트e-β-(1→3)글루쿠론산-β-(1→

황소개구리의 콘드로이틴 황산의 평균분자량은 고속 액체 크로마토그라피와 겔 여과 컬럼 (gel-filtration)을 이용하여 14,000달톤으로 결정하였다.

본 발명의 황소개구리 건조 엑스 및 이로부터 분리된 글리코사미노글리칸류는 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

본 발명의 황소개구리 건조 엑스 및 글리코사미노글리칸류의 유효 용량은 1,200 mg/day이고, 바람직하기로는 800 mg/day 이며, 하루 3 회 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1〉 황소개구리 건조 엑스의 제조

(1-1) 1.0 N NaOH 용액을 이용

황소개구리 건조 분말 50g을 무게에 대한 용량비로 5배 부피의 아세톤에 현탁하여 48시간 동안 방치하였다. 이를 1.0 N의 NaOH 용액 80 ml에 침적시켜 25℃ 에서 24시간 동안 배양한 후 미제거 단백질의 분해를 위해 알칼라제 25 ml를 첨가하여 60℃에서 24시간 200 rpm의 교반 반응조에서 소화시켰다.

단백질 분해가 종결되면 1 mM의 염화칼슘 용액과 TCA(trichloroacetic acid)를 가하여 4℃에서 10분간 방치한 후 원심분리하여 상등액을 취하고, 여기에 상등액에 대한 3배 부피의 에탄올과 5아세트산 칼륨(potassium acetate)을 첨가하여 4 ℃에서 1일간 방치하였다. 생성된 침전물을 2~5ml의 무수 에탄올로 1회 씻은 다음 60^oC, 10 mmHg하에서 건조하여 조GAG류 3.5g(수율 7.0)을 얻었다.

(1-2) 2.5N NaOH 용액을 이용

황소개구리 건조분말 50g을 2.5N NaOH 용액 40 ml에 침적시켜 실시예 (1-1)과 동일한 방법으로 추출하여 조GAG류 3.1g(수율 6.2)를 얻었다.

(1-3) 5.0N NaOH 용액을 이용

황소개구리 건조분말 50g을 5.0N의 NaOH 용액 40 ml에 침적시켜 실시예 (1-1)과 동일 방법으로 추출하여 황소개구리 조GAG류 2.9 g(수율 5.8)를 얻었다.

(1-4) 0.05M 탄산나트륨 완충용액 및 프로테아제를 이용

황소개구리 건조분말 80g을 현탁한 0.05M 탄산나트륨 완충용액(sodium carbonate, pH 9.0) 800 ml에 프로테아제 11 ml를 첨가하여 60℃에서 72시간 동안 200 rpm으로 교반하면서 효소반응에 의해 분해시켰다. 최종 농도가 5TCA와 1 mM 염화칼슘이 되도록 가하여 4℃에서 2시간 방치한 후, 원심분리하여 상등액만을 취하였다. 상등액에 3배의 에탄올과 5아세트산 칼륨 (potassium acetate)을 첨가하여 4℃에서 24시간 방치한 후 침전물을 얻었다. 침전물을 2~5ml의 무수 에탄올로 1회 씻은 다음 20~25^oC, 10 mmHg하에서 건조하여 조GAG류 6.2g (수율 7.8)을 얻었다.

(1-5) 0.05M 탄산나트륨 완충용액 및 프로테아제를 이용

황소개구리 분말 50g을 현탁한 0.05M 탄산나트륨 완충용액(sodium carbonate buffer, pH9.0) 50 ml에 프로테아제 25 ml를 첨가하여 60℃에서 48시간동안 200 rpm으로 교반하면서 효소반응에 의해 단백질을 분해시켰다. 1 mM 염화칼슘과 5TCA를 가하여 4℃에서 10분간 방치한 후, 셀라이트(celite)를 사용하여 여과하고, 여액을 취하였다. 여기에 여액에 대한 3배 부피의 에탄올과 1아세트산 칼륨 (potassium acetate)을 첨가하여 4℃에서 24시간 방치한 후 침전물을 얻었다. 침전물을 2~5ml의 무수 에탄올로 1회 씻은 다음 20~25^oC, 10 mmHg하에서 건조하여 조GAG류 7.62g(수율 13.8)를 얻었다.

〈실시예 2〉 조GAG류의 정제 및 확인

상기 실시예 1로부터 얻은 조GAG류(1g)를 20ml의 0.2 M 염화나트륨에 녹여 5000xg에서 원심분리한 다음 상등액에 5세틸피리디니움 클로라이드 4ml를 가하여 1시간 동안 상온에서 방치하였다. 이를 다시 원심 분리하여 얻은 침전물 복합체를 5 ml의 2.5 N 염화나트륨 용액으로 녹이고, 다시 5배의 알코올로 침전시켰다. 이를 원심분리하여 침전물을 얻은 후 다시 5ml의 물에 녹여 투석을 시킨 다음 동결건조하여 비교적 정제된 GAG류를 얻었다. 이렇게 정제된 GAG류를 10 mg/ml의 용액으로 제조하고, 카바졸(carbazole) 시약을 이용한 우론산 정량법[Bitter, T. and Muir, H.M. Analytical Biochemistry (1962) 4, 330]에 따라 GAG류의 존재를 확인하였다. 구체적으로는 농황산-사붕산나트륨(0.025 M) 1.0 ml를 시험관에 넣고 4 ℃에서 식힌 후, 상기 정제된 GAG류 용액 0.16 ml를 살며시 가하였다. 이 혼합물을 잘 섞은 후 10분간 열탕에서 가열하고, 시험관을 찬물에서 식힌 다음 카바졸 시약 40 μl를 넣었다. 이 용액을 다시 열탕에서 15분간 끓여 식힌 후 530 nm에서 흡광도를 읽고, 콘드로이틴 A에 대한 표준 검량선에 대하여 함량을 계산하였다.

〈실시예 3〉 GAG류의 구조규명

(3-1) 핵자기 공명(NMR)의 이용

NMR 측정을 통하여 상기 실시예 2에서 정제한 GAG류의 구조를 규명하고자 하였다.

정제한 GAG류 10 mg을 D₂O로 세번 치환 시키고 동결건조 시킨 후 데시케이타내에서 P₂O₅와 함께 건조시킨 다음, 마지막으로 99.96의 D₂O로 다시 처리하고 동결 데시케이타내에서 P₂O₅와 함께 건조시켰다. 이를 99.96 의 D₂O에 녹여서 300 MHz 핵자기공명(NMR)을 수행하였다. NMR은 배리언(Varian)사 제품으로 썬 마이크로시스템(Sun Microsystem) 컴퓨터 시스템이 달린 300 MHz 제미니(Zeminy)-500 스펙트로미터를 사용하였다.

핵자기공명후 두 개의 아노머(anomer) 수소의 케미칼 쉬프트(chemical shift)에서 GalNA4Scα1-〉은 4.66 ppm, GlcAp α1-〉은 4.58 ppm으로 확인되었다(표 1). 표준품인 소의 기관지로부터 분리된 콘드로이틴황산 A(콘드로이틴 황산A 70, 콘드로이틴 황산C ＆ 무황산 콘드로이틴 30, Sigma)와 비교하였을 때 일치하였다(도 2a, 2b).

황소개구리로부터 분리한 GAG류의¹H-NMR 데이타(data)

	D-GluA(ppm)	D-GalNAc(ppm)
	D-GluA(ppm)	OS	4S	6S
H-1	4.58	4.60	4.66	4.62
H-2	3.47	4.09	4.09	4.08
H-3	3.68	3.88	4.08	3.91
H-4	3.85	4.18	4.83	4.23
H-5	3.92	3.88	3.85	4.04
H-6		3.85	3.83	4.29
NHCOCH₃		2.08	2.11	2.10

(3-2) 콘드로이티나제의 이용

정제한 GAG류와 콘드로이틴나제 AC, B 및 ABC를 반응시켜 생성된 이당류에 대한 고속 액체 크로마토그래피 분석 및 NMR 측정을 통하여, 상기 실시예 2에서 정제한 GAG류의 구조를 규명하고자 하였다. 고속 액체 크로마토그래피는 미국 스펙트라 피직스(Spectra Physics)사 제품의 자외선 검출기가 부착된 것을 사용하였으며, 분석용 컬럼은 페노메넥스(phenomenex) 강음이온 컬럼(5 mm x 250 mm)을 사용하였다.

정제한 GAG류 1 mg에 콘드로이티나제 AC 또는 ABC, 각 10 mU/ 50 μl 및 50 mM 트리스염산 완충용액/60 mM 초산나트륨(pH 8.0)을 가하여 전체 용액을 700μl로 하여 37 ℃에서 반응시켰다. 기질을 넣고 10분간 반응시킨 후 (반응 시작 1분 후에 초기 속도 측정) 반응물에 대하여 고속 액체 크로마토그래피로 물과 염화나트륨의 농도 구배(0~60 )에 따라 1시간 동안 흘려주면서 분석함으로써, 232 nm에서 흡광도가 지속적으로 증가하고 있음이 확인하였다. 같은 조건하에서 표준품의 콘드로이틴 황산 A(소 기관지)와 콘드로이티나제 ABC를 반응시켰을 때 232 nm에서 흡광도의 증가(초기속도)를 비교한 결과, 표준품의 1분당 흡광도 변화 (dAbs/min)는 1분당 0.033이고 황소개구리 GAG류는 0.072이었다(도 3a).

GAG류와 콘드로이티나제 AC 또는 ABC와의 반응에 의한 생성물을 분석하기 위해, 24시간 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 위와 같은 조건에서 분석하였다. 콘드로이티나제 B의 경우엔 50 mM 에틸렌 디아민/30 mM 염화나트륨/초산(pH 8.0) 완충액에 기질을 용해시킨 후 25 ℃에서 10분간 반응시켰으며, 초기속도는 반응시작후 1분과 2분 사이에 측정하였다. 콘드로이티나제 B에 의해서는 기정제한 GAG류와 반응이 전혀 또는 거의 일어나지 않았으나, 콘드로이티나제 AC와 ABC는 정제한 GAG류를 완전히 분해시켜 이당류를 생성하였다. 콘드로이틴 AC 또는 ABC와 반응시켰을 때 고속 액체 크로마토그래피에 의해서 얻어진 결과는 세 종류의 콘드로이틴 황산으로부터 유래된 콘드로이틴 이당류 △Di-OS; △UA-β-(1-〉3)-GalNAc, △Di-6S; △UA-β- (1-〉3)-GalNAc- 6S, △Di-4S; △UA-β-(1-〉3)-GalNAc-4S를 표준품과 비교하였을 때 정확히 일치하였다(도 3b, 4). 또한 생성된 이당류를 표준품과 함께¹H-NMR을 행하였을 때 정확하게 일치하게 나타났다.

이러한 결과를 종합할 때, 황소개구리로부터 분리한 GAG류가 황산기가 없는 콘드로이틴 6.0, 콘드로이틴 C 26.9, 콘드로이틴 황산A 67.1로 구성되어 있음을 알 수 있다.

(3-3) 고속액체크로마토그라피를 이용한 분자량 측정

황소개구리의 GAG류에 대한 분자량을 측정하기 위하여 BIOSEP SEC-5400 컬럼 (7.5 x 600 mm)을 스펙트라 피직스(spectra physics) 고속 액체 크로마토그라피에 설치하고 1.0 ml/min의 유속으로 0.2 M NaCl 용액을 흘려주면서 평형을 유지시켰으며 시료를 주입 후에 UV 검출기를 이용하여 215 nm에서 모니터링 하였다. 분자량 측정을 위한 표준품으로 일본 생화학회사의 제품인 (A) 콘드로이틴 황산(평균 분자량 40,000 달톤), (B) 콘드로이틴 황산(평균분자량 15,000 달톤, (C) 콘드로이틴 황산 (평균 분자량 13,000 달톤) 및 덱스트란 황산 (평균 분자량 10,000 달톤)을 사용하였다. 시료의 주입양은 표준품과 검체 시료 모두 30 μg이었다.

얻어진 결과에 대하여 도 5에 나타낸 검량선을 이용하여 분자량을 계산한 결과, 황소개구리로부터 얻은 GAG류의 평균 분자량이 14,000달톤임을 확인하였으며, 이러한 결과는 소 기관지에서 정제한 콘드로이틴 황산 A와 유사함을 알 수 있었다(도 5).

본 발명의 황소개구리 건조 엑스 및 이로부터 분리한 GAG류는 기존의 GAG류의 효능과 유사한 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 건강식품으로 이용되고 있는 황소개구리로부터 유래된 것이기 때문에 골다공증을 포함하여 간 기능효과 및 갱년기 장애에도 매우 효과적으로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 GAG류를 구조적으로 변형시킬 경우(예: 탈아세틸화, 황산화, 새로운 올리고 GAG류화) 부작용이 적은 항응고제로서 사용할 수 있으며, 황산화된 올리고 당이 섬유 아세포 성장인자와의 결합에 필요한 구조적 특징을 제공하므로 세포의 성장 및 분화와 신생혈관성장억제 작용에도 관여할 수 있다.

또한, 본 발명의 GAG류는 반복적인 이당류의 단순한 구조를 지니고 있기 때문에 설페이트기 전이효소를 이용한 반응의 모델 화합물로서도 이상적이다.

Claims

콘드로이틴, 콘드로이틴 황산 C 및 콘드로이틴 황산 A로 구성되는 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)류를 포함하는 황소개구리(Rana catesbeiana) 건조 엑스.
제 1항에 있어서, 글리코사미노글리칸류는 평균분자량이 14,000 달톤으로서 콘드로이틴 6.0, 콘드로이틴 황산 C 26.9및 콘드로이틴 황산 A 67.1를 포함하는 것을 특징으로 하는 황소개구리 건조 엑스.
(1) 황소개구리 건조 분말을 완충용액 또는 NaOH 용액에 현탁하는 단계;

(2) 상기 (1) 용액에 프로테아제를 첨가하여 반응하는 단계;

(3) 염화칼슘 용액과 트리클로로아세트산을 처리하여 단백질 및 핵산을 침전시키는 단계;

(4) 상기 (3)의 침전물을 에탄올로 재침전 시킨 후 건조하는 단계;

로 구성되는 제 1항의 황소개구리 건조 엑스의 제조방법.
제 3항에 있어서, 단계 (1)의 완충용액의 pH는 6.5-9.0인 것을 특징으로 하는 제 1항의 황소개구리 건조 엑스의 제조방법.
제 3항에 있어서, 단계 (1)의 완충용액은 0.05N 탄산나트륨인 것을 특징으로 하는 제 1항의 황소개구리 건조 엑스의 제조방법.
제 3항에 있어서, 단계 (2)의 프로테아제는 섭틸리신(subtilisin)과 같은 알칼라제인 것을 특징으로 하는 제 1항의 황소개구리 건조 엑스의 제조방법.
(1) 제 1항의 황소개구리 건조 엑스를 염화나트륨 용액에 용해한 후, 4급 암모늄염을 가하여 침전물 복합체를 생성하는 단계;

(2) 상기 (1)의 침전물 복합체를 강염으로 용해시키고, 에탄올로 재침전 시키는 단계;

로 구성되는 제 1항의 황소개구리 건조 엑스로부터 글리코사미노글리칸류를 분리·정제하는 방법.
제 7항에 있어서, 단계 (1)의 4급 암모늄염은 세틸피리디움 클로라이드(cetylpyridium chloride) 또는 트리메틸아민 클로라이드 (trimethylamine chloride)인 것을 특징으로 하는 제 1항의 황소개구리 건조 엑스로부터 글리코사미노글리칸류를 분리·정제하는 방법.
제 1항의 황소개구리 건조 엑스 또는 이로부터 분리한 글리코사미노글리칸류를 유효성분으로 하는 연골 관절 보호제용 약학적 조성물.
제 1항의 황소개구리 건조 엑스 또는 이로부터 분리한 글리코사미노글리칸류를 유효성분으로 하는 신생혈관생성 억제제용 약학적 조성물.