KR20000064878A - Pck형 c4 회로 - Google Patents
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Abstract
C4 광합성회로에 기여하는 복수의 효소를 C3식물에 도입함으로써 C4회로를 부여하는 C3식물의 형질전환법을 제공한다. PEPC를 코드하는 유전자와 트랜짓펩티드를 코드하는 유전자가 연결된 PCK를 코드하는 유전자를 C3식물에 도입함으로써 상기 과제를 해결하였다.
Description
본 발명은 C4 광합성회로에 기여하는 복수의 효소를 C3식물에 도입함으로써 C4 회로를 부여하는 C3식물의 형질전환법에 관한 것이다.
도 1은 PCK형 C4 광합성회로의 모식도.
도 2는 형질전환에 사용한 구축유전자의 모식도.
도 3은 표지 한 탄소화합물의 경시변화를 나타내는 그래프.
도 4는 형질전환 벼의 광합성 활성을 나타내는 그래프.
발명의 개요
본 발명의 목적은 C3식물의 광합성 능력을 향상시키기 위하여 C3식물에 C4 광합성 회로에 기여하는 복수의 효소를 도입함으로써 C3식물에 C4 광합성 회로를 부여하는 C3식물의 식물전환법을 제공하는 것이다.
또 본 발명은 이 형질전환법에 의해 C4 회로가 부여된 형질전환 식물을 제공하는 것도 목적으로 한다.
더욱 본 발명은 이 형질전환을 위한 벡터를 제공하는 것도 목적으로 하는 것이다.
본 발명자들은 예의 연구의 결과 PEPC를 코드하는 유전자와 트란짓펩티드를 코드하는 유전자가 연결된 PCK를 코드하는 유전자를 C3식물에 도입함으로써 상기 과제를 해결한 것이다.
본 발명자들은 종래기술에서는 C4 광합성에 관여하는 유전자를 세포질내에서 단독으로 발현시키고 있으므로 도입한 효소의 활성을 C3식물에 부여하는 것은 가능하지만 C4 광합성회로의 회전, 광합성 능력의 향상을 달성할 수 없는 것은 아닌가하고 생각하였다.
그래서 본 발명에서는 도입하는 효소의 세포내 국재(細胞內 局在)를 한정하여 세포질을 C4식물의 엽육세포에 선정 그리고 엽록체를 C4식물의 유관속초세포에 선정하여 C4 광합성 회로에 필요한 복수의 효소를 녹엽 엽육세포에서 동시에 발현시키도록 하였다. 그렇게 함으로써 C3식물에 단순히 효소활성을 부여하는 것이아니고 C3식물의 엽육세포 중에서 C4식물의 C4 광합성회로에 유사한 회로반응을 회전시켜 엽록체내의 이산화탄소농도를 높이는 기능, ATP 소비에 의해 광상해(光傷害)를 회피하는 기능을 부여시킬 수가 있다. 또 이들의 기능이 부여된 식물은 광합성 능력이 향상됨으로써 건물(乾物) 생산성의 향상, 건조내성능력의 향상, 고온내성능력의 향상, 강광 내성능력(强光 耐性能力)의 향상, 낮은 이산화탄소 농도 조건하에서의 광합성 능력의 향상을 기대할 수 있다.
본 발명의 광합성회로의 부여방법에서는 C3식물(벼)의 녹엽의 엽육세포내에서 C4식물의 최초의 탄소고정효소인 PEPC를 세포질로 작용시켜 C4 화합물의 탈탄소효소를 엽록체내에서 작용시켜 더욱 PEP를 재생하기 위한 효소를 세포질 또는 엽록체내의 어느 것으로 동시에 발현시킨다. 이 목적으로 사용하는 탈탄산효소로서는 PCK가 있다. PCK는 ATP를 소비하여 옥살초산(oxalacetic acid)을 탈탄산하여 PEP를 만드는는 효소이므로 PCK를 탈탄산효소로서 사용한 경우는 탈탄산 ATP 소비, PEP 재생이 하나의 효소에서 행하여진다. 이 탈탄산효소가 엽록체내에서 그 작용을 발휘하도록 하기 위하여는 이 효소를 코드하는 유전자를 트랜짓 펩티드를 코드하는 유전자와 연결하여 사용한다. 트랜짓 펩티드는 세포질내에서 발현한 탈탄소효소를 엽록체내로 운반하여 탈탄소효소가 엽록체내에서 작용하는 것을 가능하게 한다.
이와같은 형질전환에 의해 C3식물의 녹엽엽육세포에서 세포질을 C4식물의 엽육세포에 엽록체를 C4식물의 유관속초세포에 선정하여 C4식물의 조직분화와 유사한 형태의 탄산고정경로를 만들어낸다(도 1). 이것으로부터 C3식물에 탄산농축기능과 광상해 회피기능을 부여한다.
PEPC와 탈탄산효소 및 PEP를 재생하는 효소만으로 목적으로하는 C4 광합성회로는 형성되나 이것에 더하여 PEPC의 직접의 기질인 탄산수소이온을 세포에 공급하기 위하여 CA를 세포질로 동시에 발현시켜 C4 광합성회로의 흐름을 보다 원활히 하여도 된다. PEPC, PCK, CA에 더하여 PEPC의 기질인 PEP의 공급량을 증가시키기 위하여 피루빈산에서 PEP를 생성하는 효소의 PPDK를 동시에 발현시켜 C4 광합성회로의 흐름을 더욱 원활히 하는 것도 가능하다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 PEPC를 코드하는 유전자와 트랜짓팹티드를 코드하는 유전자가 연결된 PCK를 코드하는 유전자를 C3식물에 도입함으로써 C3식물에 C4 광합성회로를 부여하는 C3식물의 형질전환법이다.
이 발명에 사용되는 PEPC를 코드하는 유전자는 세균, 원생동물, 식물에 유래하는 것이 알려져 있다. 예를들면 세균유래의 것으로서는 코리네포름·글루타민산 생산균 유래의 것(특공평 7-83714) 등을 들수 있다. 그러나 바람직한 PEPC는 식물유래의 것이며 예를 들면 옥수수 유래의 것(특공평 6-30587호 공보), 아마란사스 유래의 것(Rydzik, E. and Berry, J.O., Plant Physiol., (1995) 110:713), 프라베리아·트리네루비아 유래의 것(Poetsch. W., et al., FEBS Sett., (1991) 292:133-136), 담배 유래의 것(Koizumi, N. etal., Plant Mol. Biol., (1991) 17:535:539) 대두 유래의 것(특개평 6-319567호 공보), 평지 유래의 것(특개평 6-90766호 공보), 감자 유래의 것(Merkelbach. S. et al., Plant Mol. Biol., (1993) 23:881-888), 알팔파 유래의 것(Pathariana, S.M. et al., Plant Mol. Biol., (1992) 20:437-450), 메세무블리안테우무 크리스타리누무 유래의 것(Cushman, J.C. and Bohnart, H.J., Nuc. Acid Res., (1989) 6743∼6744) 등을 사용할 수가 있으며 중에서도 옥수수 유래의 것이 특히 바람직하다.
또 본 발명에 사용되는 PCK를 코드하는 유전자로서는 ATP 의존성의 PCK를 코드하는 식물 및 세균 유래의 것이 바람직하며 식물 유래의 것으로서는 예를 들면 우로그로아·파니코이디스 유래의 것(특개평 8-80197호 공보), 오이 유래의 것(Kim, D. -J. and Smith, S.M., Plant Mol. Biol., (1994) 26:423-434) 등을 들 수 있으며, 세균 유래의 것으로서는 대장균 유래의 것(Medina, V. et al., J.Bacteriol., (1990) 172:7151-7156), 근류균족 유래의 것(Osteras, M. et al., J. Bacterio., (1995) 177:1452-1460) 등을 들 수 있으나, 식물 유래의 것이 바람직하며 특히 바람직한 것은 우로그로아·파니코이디스 유래의 것이다.
또 PCK는 상술한 것과 같이 엽록체내에서 그 작용을 발휘시킬 필요가 있다. 따라서 이 PCK를 코드하는 유전자 배열에는 트랜짓 배열을 연결하여 사용하는 것이 필요하다.
여기서 연결하는 트랜짓 배열로서는 수많은 식물의 엽록체 국재형(局在型) 단백질 유래의 것이 보고(Keegstra, K. et al., Annu. Rev. Plant Mol. Biol., (1989) 40:471-501)되어 있으나, 본 발명에서는 벼 유래의 배열이 바람직하며, 특히 바람직한 것은 후술하는 실시예의 방법에 의해 얻어지는 배열번호 2에 나타내는 벼의 루비스코소서브유닛의 배열이다. 트랜짓 배열은 PCK를 코드하는 유전자의 상류에 오픈 리딩플레임을 PCK 유전자와 일치시켜 연결시킨다. 바람직하기는 트랜짓 배열은 PCK의 구조유전자의 상류에 직접 연결된다.
본 발명에서는 또 상술한 바와 같이 PEPC의 직접의 기질인 탄산수소이온을 세포질로 공급하기 위하여 CA를 코드하는 유전자를 C3식물에 도입하여도 된다.
여기서 사용되는 CA를 코드하는 유전자는 동물 및 식물 유래의 것이 수 많이 알려져 있으나 고등식물유래의 CA 코드를 하는 유전자와 다른 생물 유래의 것으로는 염기배열의 유사성이 낮다. 또 고등식물의 CA는 무기인산에 의해 효소활성이 제어된다(Sultemeyer, D. et al., Physiol. Plant., (1993) 88:179-190).
따라서 사용하는 유전자로서는 고등식물 유래의 것이 바람직하며 고등식물 유래의 것으로서는 시금치 유래의 것(Burnell et al., Plant Physiol. (1990) 92:37-40), 완두콩 유래의 것(Roeske, C.A. and Ogren, W.L., Nuc. Acid Res., (1990) 18:3413), 애기장대 유래의 것(Raines, C.A. et al., Plant Mol. Biol., (1992) 20:1143-1148), 벼 유래의 것(WO 95/11979), 옥수수 유래의 것(WO 95/11979) 등을 들수 있으나 바람직하기는 시금치 유래의 것이다. 시금치 CA는 엽록체에 국재(局在)하는 효소이므로 본 효소를 코드하는 유전자에는 트랜짓 펩티드 배열이 부가되어 있다. 그래서 유전자 구축에는 후술하는 실시예 1에서 기술하는 것과 같이 부분 돌연변이 도입에 의해 트랜짓펩티드를 코드하는 영역을 제거한 배열번호(3)에 기재한 유전자를 사용한다.
또 본 발명에 사용되는 PDK를 코드하는 유전자로서는 옥수수 C형 PPDK 유전자(Matsuoka, M. et al., J. Biol. Chem., (1988) 263:110 80-11083), 벼 유래의 것(특개평 7-184657), 프라베리아·프린그레이 유래의 것(Rosche, E. et al., Plant Mol. Biol., (1994) 26:763-769), 메세무브리안테무우·크리스타리누무 유래의 것(Fisslthaler, B. et al., Planta, (1995) 196:492-500) 등을 들수 있으며, 본 발명에서는 옥수수 C형 PPDK 유전자가 바람직하다.
본 발명에서 PPDK 유전자는 엽록체내에서 발현시켜도 세포질내에서 발현시켜도 된다. 엽록체내에서 발현시키는 것이 요망되는 경우는 PPDK 유전자에 트랜짓 펩티드를 코드하는 배열을 연결하여 사용한다.
상술한 각 효소를 코드하는 유전자에 사용되는 프로모터 배열로서는 특히 한정되는 것은 아니지만, 광합성기관 특이적 프로모터 배열이 바람직하다. 광합성기관특이적 프로모터배열로서는 예를 들면 옥수수 C형 PPDK 프로모터 배열(Glackin et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3004-3008), 옥수수 C형 PEPC 프로모터 배열(Hudspeth, R. L. and Grula. J.W., Plant Mol. Biol., (1989) 12:579-589), 벼 Rubisco 소 서브유닛 프로모터 배열(Kyozuka, J. et al., Plant Physiol., (1993) 102:991-1000), 벼 집광클로필 a/b 결합 단백질 프로모터 배열(Sakamoto, M. et al., Plant Cell Physiol., (1991) 32:385-393) 등을 들수 있다. 본 발명에서는 옥수수 C형 PPDK 프로모터 배열이 바람직하며 후술하는 실시예에서는 배열번호(1)에 표시되는 배열을 사용하고 있다.
본 발명에서는 상기 C회로에 관여하는 각 효소를 코드하는 유전자를 별개로 유전자 도입용 구축유전자로서 C3식물에 도입, 형질전환하여도 되나 바람직하기는 각 유전자를 동일의 유전자 도입용 구축유전자상에 연결하여 이것을 C3식물에 도입, 형질전환하는 것이 바람직하다. 그때 유전자의 순번에는 특별한 제한은 없다. 필요한 유전자를 별개로 또는 같이 연결하여 함유하는 유전자 도입용 구축유전자로 C3식물세포를 형질전환하는 데는 선택된 C3식물세포에서 상법에 따라 그 세포내에 상기 구축유전자를 도입하면 된다. 도입의 방법으로서는 엘렉트로 포레이션법, 엘렉트로인젝션법, PEG 등의 화학적인처리에 의하는 법, 유전자총을 사용하는 방법등의 상법을 들수 있으나 중에서도 아그로박테륨법을 사용하여 각 유전자를 C3식물에 도입 형질전환하는 것이 바람직하다. 이 아그로박테륨법은 이 분야에서 주지이며 이것에 의해 쌍자엽식물(예를 들면 특개평 4-330234호 공보)에서나 단자엽식물(WO94/00977)에서나 형질전환할 수가 있다. 형질전환에 성공한 식물은 후에 기재하는 방법에 의해 선별할 수가 있다. 형질전환된 식물의 유전형질은 일반적 육종방법으로 고정하여 도입된 유전자를 자손식물에 전달하는 것이 가능하다.
본 발명에서 형질전환되는 C3식물로서는 이 기술은 모든 C3식물에 적용이 가능하지만 특히, 벼, 밀, 보리, 대두, 감자, 담배, 평지 등의 광합성 능력이 향상함으로써 건물생산성(乾物生産性)의 향상이 기대되는 작물에 있어서 유용하다. 본 발명에서는 단자엽식물에 적용하는 것이 바람직하며 특히 바람직하기는 벼에 적용하는 것이다.
또 본 발명에서 말하는 C4 광합성회로란 상술한 것과 같이 PEPC에 의한 탄산고정, 탈탄산효소에 의한 Rubisco 근방에서의 이산화탄소의 방출, ATP를 소비한 PEPC의 기질의 재생의 3개의 과정에 의해 형성되어 있다.
이 C4 광합성회로가 형질전환된 C3식물내에서 기능하고 있는지 없는 지의 판단방법은 후술하는 실시예에서 상술(詳述)하지만 요약하면 이하의 방법이다.
① 만들어낸 형질전환체 및 대조의 자른 잎에 방사성 동위원소로 표시한 이산화탄소(14CO2)를 단시간 취입시켜 표지한 탄소화합물의 비율을 비교하여 형질전환식물체내에서 PEPC가 기능하여 C4 광합성회로의 초기 탄산고정산물인 C4 화합물이 생성되는지의 조사 또 표지한 탄소화합물의 경시적 변화를 비교하여 도입한 C4 광합성경로가 형질전환 식물체내에서 기능하도 있는지의 조사
② 만들어낸 형질전환체 및 대조의 자른 잎에 방사성 동위원소로 표지한 사과산([14C]사과산)을 취입시켜 일정시간 후에 표지되는 자당의 비율을 비교하여 형질전환 식물체내에서 PCK가 기능하여 C4 화합물의 탈탄산이 행하여지고 있는 지의 조사
③ 만들어낸 형질전환체의 광합성활성을 측정하여 광합성 능력에 변화가 보이는지 조사.
실시예
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하나 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
A. PCK형 C4 광합성회로
실시예 1. 도입유전자의 구축
(1) 프로모터배열
옥수수 C4형 PPDK 프로모터 영역의 DNA 단편은 기지의 염기배열(Glackin, C. A. and Grula, J.W. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3004-3008)을 토대로 제작한 합성프라이머
5'-CTAAAGACATGGAGGTGGAAG-3' (5'측) (배열번호 4)
5'-GTAGCTCGATGGGTGCACG-3' (3'측) (배열번호 5)
와 옥수수 인브리드 B73 엽록에서 SDS-페놀법에 의해 전핵산을 추출하여, 염화세슘-에티듐브로마이드 초원심법에 의해 정제한 옥수수 게놈 DNA를 주형에 사용한 PCR법(Mcpherson, M.J., Quirke, P. and Taylor, GR. ed. : PCR. A practical approach. Oxford Express Press, Oxford NY (1991))에 의해 얻었다. 이 DNA 단편을 플라스미드벡터-pCR1000(미국, 인히드로겐사)의 클로닝 사이트에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 SacⅠ으로 소화하여 말단을 평활화한 후 NcoⅠ 링커를 부가하고 HindⅢ로 처리하여 얻어진 약 950bp의 PPDK 프로모터 영역 DNA 단편을 유전자구축에 사용하였다. 사용한 DNA 배열을 배열번호 1에 나타낸다.
(2) PEPC 유전자
옥수수 C4형 PEPC의 cDNA는 기지의 염기배열(Hudspeth, R.L. and Grula, J.W. (1989) Plant Mol. Biol. 12:579-589)를 기준으로 하여 제작한 합성 올리고뉴클레오티드
5'-GCCATGGCGCGGCGGGAAGCTAAGCACGGAAGCGA-3' (배열번호 6)
를 프로브에 사용하여 상법(Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. ed. : Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Horbor Labor atory Press, Cold Spring Horbor NY (1989))에 의해 옥수수, 하이브리드 품종 하베스트퀸의 발아 후 약 2주간의 싹튼 녹엽에서 구아니딘 염산법에 의해 조제한 mRNA와 λZAP벡터(미국, 스토라다딘 사)를 사용하여 첨부의 설명서에 따라 작성한 cDNA 라이브러리에서 2만개의 클론을 스크리닝하여 단리하였다. 얻어진 클론을 XhoⅠ로 소화한 후 NcoⅠ에서 부분소화하여 얻어진 약 3kbp의 DNA 단편을 유전자 구축에 사용하였다.
(3) PCK 유전자
우로그로아·파니코이디스 PCK의 cDNA는 특개평 8-80197에 기술된 바와 같이 벼 Rubisco 소 서브유닛 디트랜짓 펩티드 부분을 코드하는 영역을 부가한 구축유전자를 사용하였다. 즉 λPCK170204 및 λPCK100101을 각각의 삽입물 중에 존재하는 KpnⅠ 부위에서 접속하여 얻어진 DNA 단편을 주형으로서 합성프라이머 PCK-f2
5'-GCTCTAGATCTCTGGCACGTGAATATGGCCCCAACCTCG-3' (배열번호 7)
와 PCK-r2
5'-CAGTGCATGCCGCCGAACAGGCATACAGATTTACACCAG-3' (배열번호 8)
를 사용하여 PCR을 행하였다.
이것과는 별도로 벼의 Rubisco 소 서브유닛의 배열(Matsuoka et al., Plant Cell Physiol. 29:1015-1022(1988))을 참고로하여 합성한 프라이머-TP-f1
5'-GGAATTCCATGGTGCATCTCAAGAAGTAC-3' (배열번호 9)
과 TP-r1
5'-GCTCTAGACTGCATGCACCTGATCC-3' (배열번호 10)
를 사용하여 닛뽄힌슈닛뽄바레(日本稻品種日本晴)의 녹엽에서 SDS 페놀법으로 추출한 벼게놈 DNA를 주형으로서 PCR법에 의해 벼 Rubisco 소 서브유닛의 트랜짓 펩티드를 코드하는 DNA 단편을 단리하였다.
이 DNA 단편을 주형에 사용하여 합성프라이머 TP-f2
5'-GGAATTCCATGGCCCCCTCCGTGATGG-3' (배열번호 11)
와 TP-r1을 사용하여 재차 PCR을 행하였다. 그리고 PCR에서 증폭한 PCK-DNA 단편을 XbaⅠ과 SphⅠ의 부분소화에서 얻은 약 2kbp의 DNA 단편과 2번째의 PCR에서 증폭한 트랜짓 팹티드 배열 DNA 단편을 NcoⅠ과 XbaⅠ로 처리하여 얻어진 150bp의 단편(배열을 배열번호 2에 나타낸다)을 접속하여 얻어진 약 2.2kbp의 DNA 단편을 유전자구축에 사용하였다.
(4) CA 유전자
상술한 문헌(Burnell, J.N. 등, (1990) Plant Physiol. 92:33-40)에 기술되어 있는 파지클론(λLCA48)을 HindⅢ과 KpnⅠ로 처리하여 얻은 시금치 CA cDNA 영역을 포함하는 1.8kbp의 단편을 pBluescriptSK-(미국, 스트라다딘사)의 HindⅢ/KpnⅠ 부위에 삽입하였다. CA cDNA에서 엽록체로의 이행에 관여하는 트랜짓 펩티드를 코드하는 영역을 제거하기 위하여 트랜짓 팹티드 영역의 최후의 아미노산을 세린에서 메티오닌으로 치환하여 NcoⅠ 인식부위를 도입하는 부분 돌연변이를 합성올리고뉴클레오티드
5'-GGTGGCACAGATAACCATGGATCCAGTTAGCCGACGGTGGC-3' (배열번호 12)
와 Mutan-K(상품명 타카라슈죠오)를 사용하여 행하였다. 얻어진 변이도입 플라스미드를 NcoⅠ로 소화하여 트랜짓펩티드를 코드하는 영역을 제거하였다. 이 플라스미드를 NcoⅠ과 SphⅠ로 처리하여 얻어진 약 700bp의 DNA 단편을 유전자구축에 사용하였다. 사용한 배열을 배열번호 3에 나타낸다.
(5) 터미네이터 배열
터미네이터 영역은 pBⅠ121(Jefferson, R.A. (1987) Plant Mol. Biol. Reptr. 5:387-405)을 SalⅠ과 EcoRⅠ로 처리하여 얻은 NOS 터미네이터 영역의 DNA 단편 pGL2(Bilang R 등, (1991) Gene 100:247-250)를 SphⅠ과 EcoRⅠ로 처리하여 얻어진 35S 터미네이터 영역의 DNA 단편을 사용하였다.
(6) 도입용 플라스미드의 구축
입수한 프로모터 cDNA 터미네이터의 DNA 단편을 이하의 조합으로 연결하여 pBluescriptⅡSK-(미국, 스트라다딘 사)의 HindⅢ-EcoRⅠ 부위에 삽입한 플라스미드 (단독유전자 도입용 플라스미드 도 2 참조)를 구축하였다.
· PPDK 프로모터 :: PEPCcDNA :: NOS 터미네이터(pDPN)
· PPDK 프로모터 :: CAcDNA :: 35S 터미네이터(pDCS)
· PPDK 프로모터 :: PCKcDNA :: 35S 터미네이터(pDKS)
또 pDKS를 ClaⅠ로 처리한 후 말단을 평활화하여 XbaⅠ로 처리하여 얻은 DNA 단편을 pDPN를 SmaⅠ과 XbaⅠ로 처리한 부위에 삽입하여 PEPC와 PCK의 2유전자를 보유한 플라스미드 pPK를 구축하였다(도 2 참조). 이어 pDCS를 SmaⅠ로 처리한 후 HindⅢ 링커를 부가하여 HindⅢ로 처리하여 얻은 DNA 단편을 pDPN의 HindⅢ 부위에 삽입하여 플라스미드 pCP를 구축하였다. 또 pDKS를 ClaⅠ로 처리한 후 말단을 평활화하여 XbaⅠ로 처리하여 얻은 DNA 단편을 pCP를 SmaⅠ과 XbaⅠ로 처리한 부위에 삽입하여 CA, PEPC, PCK의 3유전자를 보유한 플라스미드 pCK를 구축하였다(도 2 참조). 다음에 pPK를 XbaⅠ로 처리한 후 HindⅢ에서 부분소화하여 얻은 약 7.5kbp의 DNA 단편 및 pCPK를 XbaⅠ로 처리한 후, HindⅢ에서 부분소화하여 얻은 약 9.5kbp DNA 단편을 각각 pSBll(Komari, T. 들 Plant J. (1996) 10:165-174)을 XbaⅠ와 HindⅢ로 처리한 부위에 삽입하여 슈퍼바이너리 중간 플라스미드 pSPK 및 pSCPK를 구축하였다.
이들의 벡터를 각각 대장균 LE392 주(株)에 도입하여 아그로박테륨 LBA4404/pSB4와 대장균 HB101/pPK2013과의 3계 교잡에 의해 아그로박테륨에의 도입과 상동조합(Komari T. 등, Plant J. (1996) 10:165-174)을 행하여 pSB4PK 및 pSB4CPK를 구축하였다.
(7) CA, PEPC, PCK, PPDK의 4유전자를 보유한 벡터의 구축
먼저 기술한 PCR법에 의해 얻어진 PPDK 프로모터 영역을 가진 플라스미드 벡터 pCR1000(미국 인비트로겐사)을 HindⅢ 및 EcoRⅠ로 처리하여 SacⅠ 부위를 제거한 pBluescriptⅡSK-(미국, 스트라다딘 사)의 HindⅢ, EcoRⅠ 부위간에 삽입하였다. 이것을 SacⅠ로 처리·평활말단화후 pIG221(Ohta 등 : Constructon and expression in tobacco of a beta-glucuronidse (GUS) reporter gene containing an intron within the coding sequence. Plant Cell Physiol. 31:805-813 (1990))를 BamHⅠ 및 SalⅠ로 처리·평활말단화하여 얻어지는 히마카타라제의 첫 번 인트론을 함유하는 약 200bp의 단편을 삽입하여 PPDK(catⅠ) 프로모터를 함유하는 플라스미드 pSK-Di를 작성하였다. 또 이 플라스미드를 NdeⅠ로 처리·평활말단화하여 NcoⅠ 링커를 삽입한 플라스미드 pSK-Di2를 작성하였다.
옥수수 C4 형 PPDK cDNA의 단리는 기지의 염기배열(Matsuoka, M., Ozeki, Y., Yamamoto, N., Hirano, H., Kano-Murakami, Y. and Tanaka, Y. : Primary structure of maize pyruvate, orthophosphate dikinase as deduced from cDNA sequence. J.Biol. Chem. 263:11080-11083 (1990))을 참고로 하여 작성한 합성올리고뉴클레오티드
5'-TAGCTCGATGGGTTGCACGATCATATGGAGCAAGG-3' (배열번호 13)
를 프로브로 사용하여 상법(Sambrook J. 등, 위에서 게재)에 의하여 λZAP벡터(미국, 스트라다딘 사)를 사용하여 작성한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 단리하였다. 또 기지의 배열(Sheen, J. : Molecular mechanisms underlying the differential expression of Maize Pyruvate, Orthophosphate dikinase genes. Plant Cell 3:225-245 (1991))을 참고로 하여 작성한 합성 프라이머
5'-TTTCATATGGCGCCCGTTCAATGTGCGCGTTCGCAGAGGGTGTTCCACTTCGGCAA-3' (5'측)
(배열번호 14)
5'-GTACTCCTCCACCCACTGCA-3' (3'측) (배열번호 15)
을 사용한 PCR법(Mcpherson, M.J. 등, 위에서 게재)에 의해 상기의 옥수수 PPDK cDNA를 주형으로 사용하여 증폭하여 약 250bp의 DNA 단편을 얻었다. 이 단편을 NdeⅠ, SacⅡ로 처리하여 상기의 PPDK, cDNA의 NdeⅠ, SacⅡ 부위간과 치환하였다. 이것을 NdeⅠ 및 ClaⅠ로 처리하여 얻어지는 약 2.9kbp의 DNA 단편을 PPDK, cDNA로서 유전자 구축에 사용하였다. 터미네이터영역은 플라스미드 pPGA643A(Gynheung AN, Paul R. Ebert. Amitava Mitra and Sam B. HA : binary vectors, Plant Molecular Biology Manual A3:1-19(1988))에 존재하는 gene7 터미네이터를 사용하였다. gene7 터미네이터는 pPGA643(Gynheung AN 등, 위에서 게재)을 ClaⅠ 및 KpnⅠ로 처리하여 얻어졌다. 이것을 pBluescriptⅡSK-(미국, 스트라다딘 사)의 ClaⅠ, KpnⅠ 부위간에 삽입한 플라스미드를 작성하여 KpnⅠ로 처리평활말단화하여 XhaⅠ 링커를 삽입후 ClaⅠ 및 XbaⅠ로 처리하여 얻어진 DNA 단편을 유전자구축에 사용하였다.
pSK-Di의 NdeⅠ, XbaⅠ 부위간에 PPDK cDNA 및 gene7 터미네이터를 삽입하여 PPDK 유전자를 함유하는 플라스미드 pSK-DiDT를 작성하였다.
pSK-Di2의 NcoⅠ, XbaⅠ 부위간에 앞에서 기술한 pDPN를 XbaⅠ로 처리후 NcoⅠ에서 부분소화하여 얻어지는 약 3.4kbp의 DNA 단편을 삽입하여 PEPC유전자를 함유하는 플라스미드 pSK-DiPN을 작성하였다.
pSK-Di2의 NcoⅠ, XbaⅠ 부위간에 앞에서 기술한 pDKS를 NcoⅠ 및 XbaⅠ로 처리하여 얻어지는 약 2.4kbp의 DNA 단편을 삽입하여 PEPCK 유전자를 함유하는 플라스미드 pSK-DiKS를 작성하였다.
pSK-Di2의 NcoⅠ, XbaⅠ 부위간에 앞에서 기술한 pDCS를 NcoⅠ 및 XbaⅠ로 처리하여 얻어지는 약 1kbp의 DNA 단편을 삽입하여 CA 유전자를 함유하는 플라스미드 pSK-DiCS를 작성하였다.
pSK-DiPN를 XhoⅠ부위에 SmaⅠ링커를 삽입하여 SmaⅠ로 처리하여 얻어진 약 4.5kbp의 DNA 단편을 pSK-DiCS를 PstⅠ로 처리·평활말단화한 부위에 삽입하여 플라스미드 pSK-CiPi를 작성하였다. pSK-DiDT의 XbaⅠ부위를 제거하여 XhoⅠ 부위에 XbaⅠ 링커를 삽입하여 이것을 XbaⅠ 및 NotⅠ 부위로 처리하여 얻은 8kbp의 DNA을 pSK-CIP의 XbaⅠ, NotⅠ 부위간에 삽입하여 플라스미드 pSK-CiPiDi를 작성하였다. pSK-CiPiDi의 XhoⅠ 부위에 NotⅠ 링커를 삽입하여 NotⅠ로 처리하여 얻은 약 12kbp의 DNA 단편을 얻었다. pSBⅡ(Komari T. 등, plant J. 10:165-174 (1996)을 HindⅢ 및 EcoRⅠ로 처리·평활말단화 후 NotⅠ 링커를 삽입하여 이 NotⅠ 부위에 상기의 약 12kbp의 DNA 단편을 삽입하여 플라스미드 pSBmCiPiDi를 작성하였다. pSK-DiKS의 부위에 XbaⅠ 링커 삽입후 XbaⅠ로 처리하여 얻은 약 3.3 kbp의 DNA 단편을 pSBmCiPiDi의 XbaⅠ 부위에 삽입하여 플라스미드 pSBmCiPiDi를 작성하였다.
플라스미드 pSBmCiPiDi를 보유하는 대장균 DH5α 주(株)와 pSB4를 보유하는 아그로박테륨 LBA4404 주 pRK2013을 보유하는 대장균 HB101주와의 3계교잡(3系交雜)에 의해 아그로박테륨에의 도입과 상동재조합(Komari T. 등, 위에서 게재)를 행하여 pSB4CiPiKiDi를 작성하였다.
실시예 2. 형질전환체의 작출(作出)
벼의 형질전환에는 모두 닛뽄이네 힌슈「게츠노히까리」를 사용하였다. pDPN, pDKS, pDCS를 도입한 형질전환벼의 작출은 종래기술(특개평 8-80197호 공보)에 준하여 엘렉트로포레이션법에 의해 행하였다.
pSB4PK, pSB4CPK, pSB4CiPiDiKi를 도입한 형질전환벼의 작출은 선행기술(Hiei, Y. 등, (1994) plant J. 6:271-282)에 준하여 아그로박테륨법에 의해 행하였다. 얻은 형질전환개체는 공조온실(일장시간 16시간, 낮 : 28℃, 밤 : 23℃)에서 육성하였다.
실시예 3. 효소단백질의 검출과 효소활성의 측정
형질전환 벼 및 대조벼(게츠노히까리)의 잎 약 0.1g를 1㎖의 빙냉한 추출완충액(50mM HEPES-KOH pH7.0, 10mM 염화마그네슘, 2mM 염화망간, 1mM 피루빈산나트륨 1mM 인산, 1mMEDTA, 0.1% 2-머캅토에탄올, 20% 글리세롤 1mM 불화페닐메틸술포닐 1mM 벤즈아미딘 1mM 6-아미노-n-카프론산 0.2%(M/V) 이소아스코르빈산, 2%(W/V) 폴리고랄 AT)로 마쇄(磨碎) 하였다. 마쇄액을 15000Xg으로 4℃, 20분간 원심분리하여 얻은 상청을 미리 실온에서 칼럼 완충액(50mM HEPES-KOH pH7.0, 10mM 염화마그네슘 2mM 염화망간, 1mM EDTA, 0.1% 2-머캅토에타놀, 20% 글리세롤)으로 평형화(平衡化)된 NAP5(상품명) 칼럼(스웨덴국 팔마시아 사)에 통하여 탈염하여 조추출액을 얻었다. 마쇄액의 클로로필 정량은 선행기술(Wintermans and deMots (1965) Biochem. Biophys·Acta 109 : 448-453)에 따라 행하며 조추출액의 단백질의 정량은 프로틴 어세이킷(상품명 미국 바이오라도사)을 사용하여 행하였다.
형질전환체에서 발현하고 있는 도입효소의 발현을 웨스턴 블로팅으로 검출하기 위하여 얻은 조추출액을 단백질량이 동일하게 되도록 SDS-PAGE에 제공하여 겔중의 단백질을 니트로셀룰로오스막(독일국 슈라이히야 엔드 슈엘 사)에 전기적으로 전사하여 옥수수 PEPC 단백질 혹은 우로그로아·파니코이디스 PCK 단백질 혹은 시금치 CA 단백질 혹은 옥수수 PPDK 단백질에 대한 토끼 항혈청(抗血淸) 알카리포스파타제표지 염소항(抗) 토끼 IgG(미국, 오르카논·테크닉 사 캇 페트프로닥터) AP 발색킷(상품명, 미국, 바이오라도 사)을 사용하여 각각의 도입한 효소단백질을 검출하였다.
PEPC 활성의 측정은 25mM HEPES-KOH, pH8.0, 5mM 황산마그네슘, 4mM 디티오트레이톨, 5mM 탄산수소칼륨, 0.25mM NADH, 1mM 글루코오스-6-인산, 5mM 포스페놀 피루빈산, 1 유닛 사과산 탈수소효소(독일국 베틴가 만하임 사) 조추출액 25㎕를 함유하는 1㎖의 반응액에 의해 340nm의 NADH의 흡수의 감소속도를 구함으로써 행하였다.
PCK 활성의 측정은 25mM HEPES-KOH pH8.0, 4mM 디티오트레이롤 0.2mM 옥살 초산, 1 유닛 피루빈산키나제(독일국, 베린가·만하임사), 0.2mM ATP 조추출액 50㎕를 함유하는 1㎖의 반응액에 의해 280nm의 옥살초산의 흡수의 감소속도를 구함으로서 행하였다.
CA 활성의 측정은 브로모티몰블루로 착색한 0.3㎖의 50mM HEPES-KOH 완충액 pH8.0, 조추출액 10㎕에 수냉한 0.5㎖의 포화탄산가스용액을 가하여 빙온하에서의 반응액의 정색(呈色)이 없어질 때까지 시간을 구함으로써 행하였다. 활성의 계산은 선행기술(Burnell, J.N. and Hatch, M.D. (1988) Plant Physiol. 86 : 1252-1256)에 따라 행하였다.
PPDK 활성의 측정은 25mM HEPES-KOH pH8.0, 0.10mM 디티오트레이톨, 10mM 탄산수소칼륨, 8mM 황산마그네슘, 5mM 염화암모늄, 2.5mM 인산수소칼륨, 1mM ATP, 1mM 글루코오스-6-인산, 5mM 피루빈산나트륨, 0.2mM NADN, 2유닛 사과산탈수소효소, 2유닛 PEPC(와코오쥰야쿠고오교)조 추출액 200㎕를 함유하는 1㎖의 반응액에 의해 340nm의 NADH의 흡수의 감소속도를 구함으로써 행하였다.
실시예 4.14CO2를 사용한 트레이서 실험
공조온실에서 육성한 형질전환 벼 및 대조벼(게츠노히까리)의 잎의 선단부 약 5㎝를 물기를 빼고 벤자리에 물을 스며들게한 탈지면을 감고, 손수 제작한 동화상자(同化箱子)(용적 약 120㎖ 혹은 약 50㎖)에 셋트하였다. 약 27000 룩스의 빛조사하에서 외기를 5ℓ/min의 유량으로 30분간 통기시킨 후 100∼130㎕의 60% 과염소산과 50∼70μCi의 NaH14CO3용액 (영국, 아마샴 사)을 기밀성 시린지내에서 혼합하여 발생시킨 방사성 이산화탄소 가스를 폐쇄계 내에 주입하였다.
5초간의 펄스의 후 잎을 액체 질소로 동결하여 생물활성을 정지시켜 잎을 80% 뜨거운 에탄올 중에 약 30분간 방치하여 가용성물질을 용출하였다. 또, 5초간의 펄스 후, 대기를 계내에 취입하여 10, 30, 90초 후에 각각 동화상자에서 잎을 꺼내어 액체질소에 담구어 생물활성을 정지시켜 80% 뜨거운 에탄올로 가용성 물질을 용출하였다. 얻은 추출액은 에바폴레이터에서 농축하여 후나셀SF 셀룰로오스 박층 플레이트(상품명 20㎝×20㎝, 후나코시사)를 사용한 2차원 박층(二次元薄層)크로마토그래피에 제공하였다.
전개에는 1차원 전개 용매로서 페놀-수-빙초산-0.5M EDTA(474 : 84 : 5.5 : 1.4 ; v/v)를 2차원전개 용매로서 A액(n-부타놀 : 물 ; 74 : 5 ; v/v)과 B액(프로피온산 : 물 ; 9 : 11 ; v/v)을 같은 용량 혼합한 것을 사용하였다. 전개는 실온에서 하고, 전개 종료후 플레이트를 건조하여 바이오 이미지 분석기 Bas1000시스템(후지샤신교오교)을 사용하여 오토라디오그래피 및 각 스포트의 정량을 행하여 방사성 동위원소로 통과한 물질의 비율을 조사하였다.
실시예 5
[14C]사과산을 사용한 트레이서 실험
공조온실에서 육성한 형질전환벼 및 대조벼(게초노히까리)의 잎을 물기를 빼고 10mM 인산완충액, pH6.4에 넣어 1시간 동안 27000룩스의 빛 조사를 하였다. 이어 100μl의 완충액에 1μCi의 [14C]사과산 (5μl)(영국 아마샴사)을 첨가한 용액에 잎을 넣었다. 일정시간 후에 잎조각을 꺼내어 완충액에 담구어져 있는 부분을 잘라내어 80% 비등 에타놀 중에 담구어 생물반응을 정지시켜 30분간 비등상태에 두고 가용성 물질을 용출하였다. 용출액은 증발기에서 농축하여 2차원 박층 크로마토그래피에 제공하여 방사성 동위원소를 표지한 물질을 분리하여 바이어 이미지 분석기 Bas1000 시스템을 사용하여 오토라디오그래피 및 스포트의 정량을 위하여 방사성 동위원소로 표시한 물질의 비율을 조사하였다.
실시예 6
공조온실에서 육성한 3유전자 도입 형질전환벼 및 대조벼(게초노히까리)를 1일 이상 인공기상(일장 12시간, 조도약 35000 룩스, 25℃)에서 육성하여 환경에 순화(순화)시켜 노화가 시작되지 않은 완전 전개엽(展開葉)의 광합성활성을 광합성증산측정장치(光合成蒸散測定裝置)(LI-6200, 미국 라이카사)를 사용하여 측정하였다.
실시예 7
PCK형 C4 벼의 작출 및 측정결과
각 구축 유전자에대하여 복수의 형질전환 개체를 만들어내어 웨스턴 블로팅에 의하여 도입유전자의 발현을 조사하였다. 구축유전자 pDPN이 도입된 형질전환 벼(PEPC 도입형질전환체) 19개체 중, 15개체에서 PEPC 단백질의발현이 확인되었다. 구축유전자 pDKS가 도입된 형질전환벼(PCK 도입형질전환체) 31개체중, 20개체에서 PCK 단백질의 발현이 확인되었다. 구축유전자 pDCS가 도입된 형질전환벼(CA 도입형질전환체) 41개체중 3개체에서 비교적 높은 CA 단백질의 발현이 확인되었다. 구축유전자 pSB4PK를 도입한 형절전환벼(2 유전자도입 형질전환체) 21개체 중 12개체에서 PEPC. PCK의 2종류의 단백질의 발현이 확인되었다. 구축유전자 pSB4CPK를 도입한 형질전환벼(3 유전자 도입형질전환체) 40개체 중 15개체에서 CA. PEPC. PCK의 3종류의 단백질의 발현이 확인되었다. 구축유전자 pSB4CiPiKiDi를 도입한 형질전환벼(4 유전자 도입형질전환체) 77개체 중 22개체에서 CA. PEPC. PCK. PPDK의 4종류의 단백질의 발현이 확인되었다.
이들의 형질전환벼 중 비교적 도입효소 발현량이 높은 벼의 R1 세대의 식물체를 만들어 녹엽조 추출액중의 각각의 활성을 조사하였더니, 표 1에 나타내는 것과 같은 결과를 얻었다. 이 결과 형질전환 벼의 조 추출액에서 도입한 효소의 활성이 대조벼(게츠노히까리)의 그것 보다도 높은 값으로 검출되었다. 이것은, 형질전환벼에서 발현하고 있는 도입효소는 효소활성을 가지고 있는 것을 나타내고 있다. 본 실시예에서 사용한 PCK 도입용 구축유전자는 선행기술(특개형 8-80197호 공보)과 같으며, Rubisco 소 서브유닛의 트랜짓 펩티드 부분을 코드하는 영역을 부가한 키메라 유전자이므로 PCK단백질은 트랜짓 펩티드의 작용에 의해 엽록체내에 국재(局在)한다.
표 1 형질전환벼에서의 도입효소의 활성
| 효 소 활 성(단위/mg클로로필) | ||||
| CA | PEPC | PCK | PPDK | |
| CA도입형질전환체 | 18760 | 0.458 | 0 | nd |
| PEPC도입형질전환체 | 2250 | 1.880 | 0 | nd |
| PCK도입형질전환체 | 1364 | 0.474 | 7.744 | nd |
| 2유전자도입형질전환체 | 2143 | 1.171 | 5.780 | nd |
| 3유전자도입형질전환체 | 9269 | 1.071 | 3.001 | nd |
| 4유전자도입형질전환체 | 9450 | 1.490 | 3.170 | 0.37 |
| 2171 | 0.332 | 0 | 0.29 |
nd : 측정을 하지 않음
2 유전자 도입한 형질변환벼와 3 유전자 도입한 형질전환벼의 RI 세대 및 대조벼(게츠노히까리)의 자른 잎에14CO2를 주어 5초후에 조직의 생물반응을 정지하여 표지된 C4 화합물의 비율을 조사하였더니 대조벼에 비하여 형질전환벼에 함유되는 표지된 능금산의 비율은 약 10배, 표지된 아스파라긴산의 비율은 약 2배 높았다(표 2 참조). 이것은 형질전환 벼의 녹엽조직중에서 도입한 PEPC가 기능하여 C4 광합성회로의 최초의 탄산고정의 과정이 행하여지고 있는 것을 나타내고 있다.
표 214CO2를 사용한 트레이서 실험
| 14C 취입비율(%) | ||
| 능금산 | 아스파라긴산 | |
| 대조벼(게츠노히까리) | 0.7 | 0.9 |
| 2유전자도입형질변환벼 | 9.8 | 2.0 |
| 3유전자도입형질변환벼 | 8.1 | 1.9 |
또한 2 유전자 도입한 형질변환벼, 3 유전자 도입한 형질변환벼, 4 유전자 도입한 형질전환벼의 R1 세대, 대조벼(게츠노히까리) 및 옥수수의 자른 잎에14CO2를 주어 5초간 투여 후 표지된 C4 화합물의 그 후의 움직임을 경시적으로 추적하였다. 형질전환벼에 있어서 표지된 C4 화합물은 C4식물인 옥수수에서 처럼, 시간경과에 따라 감소되지만 대조벼에서는 표지된 C4 화합물이 전혀 발견되지 않았다(도3 참조). 이는 형질전환벼에 있어서 도입된 PEPC가 탄산고정하는 것에 의해 생성된 C4 화합물은 , C4식물의 엽록조직에서 발견되는 변화와 동일하게 직접 대사되는 다른 물질로 변화되고 있음을 보여준다.
2 유전자 도입한 형질변환벼, 3 유전자 도입한 형질변환벼의 R1 세대 및 대조벼(게츠노히까리)의 자른 잎에 [14C] 사과산을 투여하고 15분후에 조직의 생물반응을 정지하여 표지된 C4 화합물의 비율을 조사하였더니 형질전환벼가 함유하는 표지된 자당의 경우 대조벼에 비해 약 3배가 높았다(표3 참조). 이는 형질전환벼의 엽록조직 중에서 도입된 PCK가 기능하여 C4 광합성회로의 C4화합물에서부터 칼빈-벤슨회로로의 이산화탄소의 주고받음이 행해지고 있는 것을 나타내고 있다.
표 3 [14C] 사과산을 사용한 트레이서 실험
| 자당에 취입되는14C의 비율(%) | |
| 대조벼(게츠노히까리) | 6.2 |
| 2유전자도입형질변환벼 | 15.7 |
| 3유전자도입형질변환벼 | 22.5 |
잎에 투여하는 이산화탄소 농도를 변화시키면서 3 유전자도입한 형질전환벼의 RI 세대 및 대조벼(게츠노히까리)의 광합성활성을 계측하여 광합성활성세포 내 이산화탄소 농도곡선(도 4 참조)를 구하였더니, 외관상의 광합성 활성이 없어진다고 가정한 때의 세포간 이산화탄소농도(도중의 직선의 X축 절편)는 형질변환벼 쪽이 대조벼 보다 낮았다. 이것은 형질전환벼의 CO2보상점은 대조벼 보다도 낮은 것을 나타내고 있다. 일반적으로 C4식물의 CO2보상점은 C3식물보다도 낮은 경향이 있기 때문에 만들어 낸 형질전환벼는 대조벼 보다 C4식물에 가까운 광합성의 특징을 가진다고 하겠다.
이상의 결과는 2유전자도입한 형질전환벼 및 2유2전자 도입한 형질전환벼에서 도입한 유전자의 발현산물인 C4 광합성 관련 효소가 효소활성을 가진 모양으로 존재하며, C4 광합성회로가 기능하여 광합성 능력에 변화가 생기고 있는 것을 시사하고 있다. 따라서, 본 발명에 의해 C3식물세포내에서 PCK형 C4 광합성회로를 기능시켜 광합성능력을 개변시키는 것이 가능하게 되었다.
[발명의 효과]
본 발명에 의하면 C3식물의 엽육세포중에서 C4 광합성 회로에 유사한 회로반응을 회전시켜 엽록체내의 이산화탄소 농도를 높이는 기능, ATP 소비에 의해 광상태를 회피하는 기능을 부여시킬 수가 있다. 또 이들의 능력이 부여된 식물은 고온내성 능력의 향상, 강광 내성능력의 향상, 저 이산화탄소 조건하에서의 광합성능력의 향상을 기대할 수 있다.
[서열목록]
서열번호 : 1
서열의 길이 : 930
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
토폴로지 : 선형
분자의 타입 : genomic DNA
기원 :
생물명 : 지 메이즈(Zea mays)
품종명 : 인브리드 B73
서열의 특징 :
성질 : (4형 PPDK 유전자 프로모터 영역의 일부)
[서열1]
CTAAAGACAT GGAGGTGGAA GGCCTGACGT AGATAGAGAA GATGCTCTTA GCTTTCATTG 60
TCTTTCTTTT GTAGTCATCT GATTTACCTC TCTCGTTTAT ACAACTGGTT TTTTAAACAC 120
TCCTTAACTT TTCAAATTGT CTCTTTCTTT ACCCTAGACT AGATAATTTT AATGGTGATT 180
TTGCTAATGT GGCGCCATGT TAGATAGAGG TAAAATGAAC TAGTTAAAAG CTCAGAGTGA 240
TAAATCAGGC TCTCAAAAAT TCATAAACTG TTTTTTAAAT ATCCAAATAT TTTTACATGG 300
AAAATAATAA AATTTAGTTT AGTATTAAAA AATTCAGTTG AATATAGTTT TGTCTTCAAA 360
AATTATGAAA CTGATCTTAA TTATTTTTCC TTAAAACCGT GCTCTATCTT TGATGTCTAG 420
TTTGAGACGA TTATATAATT TTTTTTGTGC TTACTACGAC GAGCTGAAGT ACGTAGAAAT 480
ACTAGTGGAG TCGTGCCGCG TGTGCCTGTA GCCACTCGTA CGCTACAGCC CAAGCGCTAG 540
AGCCCAAGAG GCCGGAGTGG AAGGCGTCGC GGCACTATAG CCACTCGCCG CAAGAGCCCA 600
AGAGACCGGA GCTGGAAGGA TGAGGGTCTG GGTGTTCACG AATTGCCTGG AGGCAGGAGG 660
CTCGTCGTCC GGAGCACAGG CGTGGAGAAC GTCCGGGATA AGGTGAGCAG CCGCTGCGAT 720
AGGCGCGTGT GAACCCCGTC GCGCCCCACG GATGGTATAA GAATAAAGGC ATTCCGCGTG 780
CAGGATTCAC CCGTTCGCCT CTCACCTTTT CGCTGTACTC ACTCGCCACA CACACCCCCT 840
CTCCAGCTCC GTTGGAGCTC CGGACAGCAG CAGGCGCGGG GCGGTCACGT AGTAAGCAGC 900
TCTCGGCTCC CTCTCCCCTT GCTCCATATG 930
서열번호 : 2
서열의 길이 : 153
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
토폴로지 : 선형
분자의 타입 : cDNA to mRNA
기원 :
생물명 : 오리자 사티바(Oryza sativa)
품종명 : 닛본 바레
서열의 특징 :
성질 : (루비스코 소 서브유닛 트랜짓 서열영역)
[서열2]
ATG GCC CCC TCC GTG ATG GCG TCG TCG GCC ACC ACC GTC GCT CCC TTC 48
Met Ala Pro Ser Val Met Ala Ser Ser Ala Thr Thr Val Ala Pro Phe
1 5 10 15
CAG GGG CTC AAG TCC ACC GCC GGC ATG CCC GTC GCC CGC CGC TCC GGC 96
Gln Gly Leu Lys Ser Thr Ala Gly Met Pro Val Ala Arg Arg Ser Gly
20 25 30
AAC TCC AGC TTC GGC AAC GTC AGC AAT GGC GGC AGG ATC AGG TGC ATG 144
Asn Ser Ser Phe Gly Asn Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys Met
35 40 45
CAG TCT AGA 153
Gln Ser Arg
50
서열번호 : 3
서열의 길이 : 697
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
토폴로지 : 선형
분자의 타입 : cDNA to mRNA
기원 :
생물명 : 스피나시아 클레라시(Spinacia cleracea)
품종명 : 닛본 바레
서열의 특징 :
성질 : 트랜짓 펩티드를 코드하는 영역을 제거한 카보닉안하이드라제의 mRNA서열
[서열3]
CC ATG GAG TTA GCC GAC GGT GGC ACA CCA TCC GCC AGT TAC CCG GTT 47
Met Glu Leu Ala Asp Gly Gly Thr Pro Ser Ala Ser Tyr Pro Val
5 10 15
CAG AGA ATT AAG GAA GGG TTT ATC AAA TTC AAG AAG GAG AAA TAC GAG 95
Gln Arg Ile Lys Glu Gly Phe Ile Lys Phe Lys Lys Glu Lys Tyr Glu
20 25 30
AAA AAT CCA GCA TTG TAT GGT GAG CTT TCT AAG GGC CAA GCT CCC AAG 143
Lys Asn Pro Ala Leu Tyr Gly Glu Leu Ser Lys Gly Gln Ala Pro Lys
35 40 45
TTT ATG GTG TTT GCG TGC TCA GAC TCC CGT GTG TGT CCC TCG CAC GTA 191
Phe Met Val Phe Ala Cys Ser Asp Ser Arg Val Cys Pro Ser His Val
50 55 60
CTA GAT TTC CAG CCC GGT GAG GCT TTC ATG GTT CGC AAC ATC GCC AAC 239
Leu Asp Phe Gln Pro Gly Glu Ala Phe Met Val Arg Asn Ile Ala Asn
65 70 75
ATG GTG CCA GTG TTT GAC AAG GAC AAA TAC GCT GGA GTC GGA GCA GCC 287
Met Val Pro Val Phe Asp Lys Asp Lys Tyr Ala Gly Val Gly Ala Ala
80 85 90 95
ATT GAA TAC GCA GTG TTG CAC CTT AAG GTG GAG AAC ATT GTC GTG ATT 335
Ile Glu Tyr Ala Val Leu His Leu Lys Val Glu Asn Ile Val Val Ile
100 105 110
GGA CAC AGT GCT TGT GGT GGA ATC AAG GGG CTT ATG TCT TCT CCA GAT 383
Gly His Ser Ala Cys Gly Gly Ile Lys Gly Leu Met Ser Ser Pro Asp
115 120 125
GCA GGA CCA ACC ACA ACT GAT TTT ATT GAG GAT TGG GTC AAA ATC TGC 431
Ala Gly Pro Thr Thr Thr Asp Phe Ile Glu Asp Trp Val Lys Ile Cys
130 135 140
TTG CCT GCC AAG CAC AAG GTG TTA GCC GAG CAT GGT AAT GCA ACT TTC 479
Leu Pro Ala Lys His Lys Val Leu Ala Glu His Gly Asn Ala Thr Phe
145 150 155
GCT GAA CAA TGC ACC CAT TGT GAA AAG GAA GCT GTG AAT GTA TCT CTT 527
Ala Glu Gln Cys Thr His Cys Glu Lys Glu Ala Val Asn Val Ser Leu
160 165 170 175
GGA AAC TTG TTG ACT TAC CCA TTT GTA AGA GAT GGT TTG GTG AAG AAG 575
Gly Asn Leu Leu Thr Tyr Pro Phe Val Arg Asp Gly Leu Val Lys Lys
180 185 190
ACT CTA GCT TTG CAG GGT GGT TAC TAC GAT TTT GTC AAT GGA TCA TTC 623
Thr Leu Ala Leu Gln Gly Gly Tyr Tyr Asp Phe Val Asn Gly Ser Phe
195 200 205
GAG CTA TGG GGA CTC GAA TTC GGC CTC TCT CCT TCC CAA TCT GTA 668
Glu Leu Trp Gly Leu Glu Phe Gly Leu Ser Pro Ser Gln Ser Val
210 215 220
TGAACCAACA CAACCATTTG ACTGCATGC 697
서열번호 : 4
서열의 길이 : 21
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 선형
분자의 타입 : 기타 핵산(합성 DNA)
[서열4]
CTAAAGACAT GGAGGTGGAA G 21
서열번호 : 5
서열의 길이 : 19
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 선형
분자의 타입 : 기타 핵산(합성 DNA)
[서열5]
GTAGCTCGAT GGGTGCACG 19
서열번호 : 6
서열의 길이 : 35
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 선형
분자의 타입 : 기타 핵산(합성 DNA)
[서열6]
GCCATGGCGC GGCGGGAAGC TAAGCACGGA AGCGA 35
서열번호 : 7
서열의 길이 : 39
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 선형
분자의 타입 : 기타 핵산(합성DNA)
[서열7]
GCTCTAGATC TCTGGCACGT GAATATGGCC CCAACCTCG 39
서열번호 : 8
서열의 길이 : 39
서열의 타입 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
토폴로지 : 선형
분자의 타입 : 기타 핵산(합성 DNA)
[서열8]
CAGTGCATGC CGCCGAACAG GCATACAGAT TTACACCAG 39
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분자의 타입 : 기타 핵산(합성 DNA)
[서열9]
GGAATTCCAT GGTGCATCTC AAGAAGTAC 29
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GCTCTAGACT GCATGCACCT GATCC 25
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GGAATTCCAT GGCCCCCTCC GTGATGG 27
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[서열12]
GGTGGCACAG ATAACCATGG ATCCAGTTAG CCGACGGTGG C 41
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[서열13]
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[서열14]
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서열의 타입 : 핵산
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분자의 타입 : 기타 핵산(합성 DNA)
[서열15]
GTACTCCTCC ACCCACTGCA 20
고등식물의 광합성경로에는 C3형, C4형 및 CAM형의 가지의 타입이 존재한다. C4형 광합성을 하는 식물(C4식물)의 잎조직은 엽육(葉肉) 세포와 유관속주변(維管束周邊)의 유관속초세포로 구성되어 있으며, 크란츠형 잎구조라 부르는 특수한 잎조직구조를 하고 있다. C4식물은 엽육세포의 세포질에 국제(局在)하는 포스포에놀피루빈산 카르복실라제(이하 PEPC라 하는 경우가 있다)에 의해 대기 중의 이산화탄소를 C4 화합물의 형으로 고정하여 유관속초세포에서 탈탄산효소의 작용에 의해 이산화탄소를 방출하여 진정한 탄산고정 효소인 리불로스-1,5-이인산카르복실라제/옥시게나제(이하 Rubisco라 하는 경우가 있다) 근방의 이산화탄소 농도를 증가시킨다. 또 유관속초세포내에서 탈탄산된 대사산물은 엽육세포에 수송되어 거기에 국제(局在)하는 피루빈산인산디키나제(이하 PPDK라 하는 경우가 있다)의 작용에 의해 ATP를 소비하여 PEPC의 기질인 포스포에놀피루빈산(이하 PEP라 하는 경우가 있다)으로 변환된다. 따라서 C4식물녹엽의 2종류의 세포는 기능적으로 분화되어 있으며 엽육세포는 최초의 탄산고정에 의한 C4 화합물의 생성과 PEPC의 기질의 재생, 유관속초세포는 C4 화합물에서의 탈탄산과 칼빈-벤슨회로(Calvin-Benson cycle)에 의한 진정한 탄소고정을 행하고 있다.
이들의 PEPC에 의한 탄산고정, 탈탄산효소에 의한 Rubisco 근방에서의 이산화탄소의 방출, ATP를 소비한 PEPC에 기질의 재생의 3개의 과정은 C4 광합성 회로라 부르는 회로반응을 형성하고 있다. 이 회로반응은 C4식물에 탄산농축기능, 강광조건하(强光條件下)에서의 ATP 과잉생산에 의한 광화학계의 효율저하의 회피(광상해회피)기능 물스트레스 내성기능 등 통상의 광합성(C3형 광합성)을 하는 식물(C3식물)에는 없는 기능을 가지고 있으며 그 때문에 C4식물에서는 C3식물에서 관찰되는 외관의 광호흡이 보이지 않으며 C3식물에 비하여 건조조건, 강광조건(强光條件), 고온조건에서의 광합성 능력의 저하량이 적다. 따라서, C4식물은 C3식물보다도 광합성 능력이 우수하다고 하겠다.
C3식물에 C4 광합성 회로를 부여하는 시도로서 교배육종(交配育種)에 의한 도입이 생각되나, C4 광합성회로와 통상의 C3 광합성회로를 가진 종(種)은 현재의 교잡기술에서는 교배가 곤란한 속과(屬科)로 분류되는 것이 대부분이다. 같은 속내의 C3식물과 C4식물을 교배하여 C4 광합성의 형질을 도입하는 시도가 하마아가자속 식물을 사용하여 행하였으나 C4 광합성회로의 형질을 도입하는데는 이르지 못했다(오오수기 코구리츠노교 기지츠(1995) 50권 PP. 30∼36).
한편 Hudspeth 등의 문헌(Hudspeth et al., Plant Physiol., (1992) 98 : 458∼464)에는 담배 클로로필 a/b 결합 단백질 프로모터(cab 프로모터)의 하류에 PEPC 유전자를 연결하여 담배에 도입하여 녹엽의 PEPC 활성이 2배로 상승하며 잎의 사과산 함량이 증가한 점이 보고되어 있으며, 또 Kogami 등의 문헌(Kogamietal., Transgenic Research(1994) 3 : 287∼296)에는 카리플라워 모자이크바이러스 35S, 프로모터의 하류에 PEPC 유전자를 연결하여 담배에 도입한 경우 잎의 PEPC 활성이 2배로 상승한 취지가 보고되어 있다.
어느 문헌도 PEPC를 단독으로 C3식물인 담배에 도입하여 C4 화합물인 사과산의 축적을 확인하고 있으나 광합성 능력의 변화는 관찰되어 있지 않다. 또, C3식물은 C4 화합물을 식물체내에서 탈탄산하여 카루빈 회로에 공급하는 능력이 부족하다. 따라서 C3식물에 PEPC 유전자를 단독으로 도입한 것만으로는 C4 광합성회로에 볼 수 있는 탄산농축기능, 광상해회피기능(光傷害回避機能)등을 재현할 수는 없고 C3식물의 광합성 능력의 향상으로 되지 않는다.
또 일본국 특개평 8-80197호 공보에 있어서는 엽록체에의 이행에 필요한 트랜짓 펩티드를 부가한 포스포에놀피루빈산카르복시키나제(이하, PCK라고 하는 경우가 있다) 유전자를 연결하여 C3식물인 벼에 도입하여 녹엽 조추출액중(粗抽出液中)의 효소활성의 검출과 PCK 단백질의 엽록체에의 이행을 확인하고 있다. 이것으로부터 PCK 활성은 엽록체내에 국제(局在)시키는 것이 가능하다는 것을 시사한다. 그러나 형질전환식물에서의 C4 광합성회로의 회전, 광합성활성의 변화에 관하여는 언급하지 않았다.
또 이찌가와 등의 문헌(일본 작물학회 기사 63권, 별 2호(1994) P. 247)에서는 PPDK를 C3식물인 아라비돕시스 및 토마토에 도입하여 본 효소 단백질이 축적하는 것을 확신하고 있으나 형질전환식물에서의 C4 광합성회로의 회전, 광합성활성의 변화에 대하여는 언급하지 않았다. 또 특공평 6-12990호 공보에서 카보닉안하이드라제(이하 CA라고 하는 경우가 있다) 단백질을 취입시킨 리고페르시콘 에스큘렌텀(Lycopersicon esculentum)의 자엽(子葉) 원형질체의 광합성효율의 변화가 보고되어 있으나 Majeau 등의 문헌(Plant Mol. Biol. (1994) 25 : 337∼385)에는 유전자 도입에 의해 실제의 식물체중에서 CA를 과잉발현시켜도 광합성 활성에 아무런 변화가 보이지 않았다고 하는 보고도 있다.
이와같이 C4 광합성회로에 관여하는 효소의 유전자를 유전자 공학적 수법에 의해 C3식물에 도입하는 시도는 CA, PEPC, PCK PPDK를 단독으로 도입한 예가 있으며 어떤 경우도 도입한 유전자의 발현 혹은 효소의 활성이 확인되어 있으나 형질전환식물에서의 C4 광합성회로의 회전 광합성 활성의 현저한 변화는 보고되어 있지 않다.
Claims (7)
1. 포스포에놀피루빈산 카르복실라제(PEPC)를 코드하는 유전자와, 트랜짓 펩티드를 코드하는 유전자가 연결된 포스페놀피루빈산 카르복시키나제(PCK)를 코드하는 유전자를 C3식물에 도입함으로써 C3식물에 C4 광합성회로를 부여하는 C3식물의 형질전환법.
제1항에 있어서, 카보닉안하이드라제(CA)를 코드하는 유전자를 추가로 도입하는 것을 특징으로 하는 형질전환법.
제1항에 있어서, 피루빈산인산디키나제(PPDK)를 코드하는 유전자를 추가로 도입하는 것을 특징으로 하는 형질전환법.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 프로모터 서열이 광합성기관 특이적 프로모터 서열인 형질전환법.
제1항에서 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자의 2개이상 또는 전부를 동일의 유전자 도입용 구축유전자상에 연결하여 이것을 C3식물에 도입하는 것을 특징으로 하는 형질전환법.
포스포에놀피루빈산 카르복실라제(PEPC)를 코드하는 유전자와, 트랜짓 펩티드를 코드하는 유전자가 연결된 포스포에놀피루빈산 카르복시키나제(PCK)를 코드하는 유전자가 연결된 키메라 유전자.
제1항에서 제5항까지의 어느 한항에 기재된 형질전환법에 의해 형질전환되어 C4 광합성회로가 부여된 형질전환식물.
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