JP3501814B2 - Ｐｃｋ型ｃ４回路 - Google Patents

Ｐｃｋ型ｃ４回路

Info

Publication number
JP3501814B2
JP3501814B2 JP53414598A JP53414598A JP3501814B2 JP 3501814 B2 JP3501814 B2 JP 3501814B2 JP 53414598 A JP53414598 A JP 53414598A JP 53414598 A JP53414598 A JP 53414598A JP 3501814 B2 JP3501814 B2 JP 3501814B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
plant
photosynthetic
sequence
plants
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP53414598A
Other languages
English (en)
Inventor
雅雄 新井
庄一 鈴木
宣彦 村井
茂裕 山田
象三 太田
バーネル，ジェームス・エヌ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Tobacco Inc
Original Assignee
Japan Tobacco Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Tobacco Inc filed Critical Japan Tobacco Inc
Application granted granted Critical
Publication of JP3501814B2 publication Critical patent/JP3501814B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/8269—Photosynthesis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の属する分野 本発明は、C4光合成回路に寄与する複数の酵素をC3植
物に導入することによりC4回路を付与するC3植物の形質
転換法に関するものである。
従来の技術 高等植物の光合成経路にはC3型、C4型及びCAM型の３
つのタイプが存在する。C4型光合成をする植物（C4植
物）の葉組織は、葉肉細胞と維管束周辺の維管束鞘細胞
から構成されており、クランツ型葉構造と呼ばれる特殊
な葉組織構造をしている。C4植物は、葉肉細胞の細胞質
に局在するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
（以下、PEPCとする場合がある。）により大気中の二酸
化炭素をC4化合物の形で固定し、維管束鞘細胞で脱炭酸
酵素の作用により二酸化炭素を放出して真の炭酸固定酵
素であるリブロース−1,5−二リン酸カルボキシラーゼ
／オキシゲナーゼ（以下、Rubiscoとする場合があ
る。）近傍の二酸化炭素濃度を高めている。また、維管
束鞘細胞内で脱炭酸された代謝産物は葉肉細胞に輸送さ
れ、そこに局在するピルビン酸リン酸ジキナーゼ（以
下、PPDKとする場合がある。）の作用によりATPを消費
してPEPCの基質であるホスホエノールピルビン酸（以
下、PEPとする場合がある。）に変換される。したがっ
て、C4植物緑葉の２種類の細胞は機能的に分化してお
り、葉肉細胞は最初の炭酸固定によるC4化合物の生成と
PEPCの基質の再生、維管束鞘細胞はC4化合物からの脱炭
酸とカルビン−ベンソン回路による真の炭酸固定を行っ
ている。
これらのPEPCによる炭酸固定、脱炭酸酵素によるRubi
sco近傍での二酸化炭素の放出、ATPを消費したPEPCの基
質の再生の３つの過程は、C4光合成回路と呼ばれる回路
反応を形成している。この回路反応は、C4植物に炭酸濃
縮機能、強光条件下におけるATP過剰生産による光化学
系の効率低下の回避（光傷害回避）機能、水ストレス耐
性機能という通常の光合成（C3型光合成）を行う植物
（C3植物）にはない機能をもたらしており、そのために
C4植物ではC3植物において観察される見かけの光呼吸が
見られず、C3植物に比べ乾燥条件、強光条件、高温条件
における光合成能力の低下量が少ない。したがって、C4
植物はC3植物よりも光合成能力が優れているといえる。
C3植物にC4光合成回路を付与する試みとして、交配育
種による導入が考えられるが、C4光合成回路と通常のC3
光合成回路を持つ種は、現在の交雑技術では交配の困難
な属科のレベルで分類されるものがほとんどである。同
じ属内のC3植物とC4植物を交配してC4光合成の形質を導
入する試みがハマアカザ属植物を用いて行われたが、C4
光合成回路の形質を導入するには至らなかった（大杉
立農業技術（1995）50巻pp.30−36）。
一方、Hudspeth等の文献（Hudspeth et al.,Plant Ph
ysiol.,（1992）98:458−464.）には、タバコクロロフ
ィルa/b結合タンパク質プロモーター（cabプロモータ
ー）の下流にPEPC遺伝子をつないでタバコに導入し、緑
葉のPEPC活性が２倍に上昇し、葉のリンゴ酸含量が増加
した点が報告されており、またKogami等の文献（Kogami
et al.,Transgenic Research（1994）3:287−296）に
は、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターの
下流にPEPC遺伝子をつないでタバコに導入した場合、葉
のPEPC活性が２倍に上昇した旨が報告されている。
いずれの文献もPEPCを単独でC3植物であるタバコに導
入し、C4化合物であるリンゴ酸の蓄積を確認している
が、光合成能力の変化は観察されていない。また、C3植
物は、C4化合物を植物体内で脱炭酸してカルビン回路へ
供給する能力を欠いている。したがって、C3植物にPEPC
遺伝子を単独で導入しただけでは、C4光合成回路にみら
れる炭酸濃縮機能、光傷害回避機能等を再現することは
できず、C3植物の光合成能力の向上とはならない。
また、特開平８−80197号公報においては、葉緑体へ
の移行に必要なトランジットペプチドを付加したホスホ
エノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（以下、PCKと
いう場合がある）遺伝子をつないでC3植物であるイネに
導入し、緑葉粗抽出液中の酵素活性の検出とPCKタンパ
ク質の葉緑体への移行を確認している。このことから、
PCK活性を葉緑体内に局在させることが可能であること
が示唆される。しかしながら、形質転換植物におけるC4
光合成回路の回転、光合成活性の変化に関しては言及し
ていない。
さらに、市川等の文献（日本作物学会記事 63巻、別
２号（1994）p.247.）においては、PPDKをC3植物である
アラビドプシス及びトマトに導入し、本酵素タンパク質
が蓄積することを確認しているが、形質転換植物におけ
るC4光合成回路の回転、光合成活性の変化については言
及していない。また、特公平６−12990号公報におい
て、カーボニックアンヒドラーゼ（以下、CAとする場合
がある。）タンパク質を取り込ませたリコペリシコン
エクスレンタム（Lycopersicon esculentum）の子葉プ
ロトプラストの光合成効率の変化が報告されているが、
Majeau等の文献（Plant Mol.Biol.（1994）25:337−38
5.）には、遺伝子導入により実際の植物体中でCAを過剰
発現させても光合成活性に何ら変化が見られなかったと
いう報告もある。
このように、C4光合成回路に関する酵素の遺伝子を遺
伝子工学的手法によりC3植物に導入する試みは、CA、PE
PC、PCK,PPDKを単独で導入した例があり、いずれの場合
も導入した遺伝子の発現、もしくは酵素の活性が確認さ
れているが、形質転換植物におけるC4光合成回路の回
転、光合成活性の顕著な変化は報告されていない。
発明の概要 本発明の目的は、C3植物の光合成能力を向上させるた
めに、C3植物にC4光合成回路に寄与する複数の酵素を導
入することにより、C3植物にC4光合成回路を付与するC3
植物の形質転換法を提供することである。
また、本発明は、この形質転換法によりC4回路が付与
された形質転換植物を提供することも目的とする。
さらにまた、本発明は、この形質転換のためのベクタ
ーを提供することも目的とするものである。
図面の簡単な説明 図１はPCK型C4光合成回路を示す模式図である。
図２は形質転換に用いた構築遺伝子を示す模式図であ
る。
図３は標識された炭素化合物の経時変化を示すグラフ
である。
図４は形質転換イネの光合成活性を示すグラフであ
る。
発明の詳細な説明 本発明者等は、鋭意研究の結果、PEPCをコードする遺
伝子と、トランジットペプチドをコードする遺伝子が連
結されたPCKをコードする遺伝子とをC3植物に導入する
ことにより上記課題を解決したものである。
本発明者等は、従来技術ではC4光合成に関与する遺伝
子を細胞質内で単独で発現させているので、導入した酵
素の活性をC3植物に付与することは可能だが、C4光合成
回路の回転、光合成能力の向上が達成できないのではな
いかと考えた。
そこで、本発明では導入する酵素の細胞内局在を限定
し、細胞質をC4植物の葉肉細胞に見立て、そして、葉緑
体をC4植物の維管束鞘細胞に見立てて、C4光合成回路に
必要な複数の酵素を緑葉葉肉細胞で同時に発現させるよ
うにした。そうすることにより、C3植物に単なる酵素活
性を付与するのではなく、C3植物の葉肉細胞中でC4植物
のC4光合成回路に類似した回路反応を回転させ、葉緑体
内の二酸化炭素濃度を高める機能、ATP消費により光傷
害を回避する機能を付与させることができる。またこれ
らの能力が付与された植物は、光合成能力が向上される
ことにより、乾物生産性の向上、乾燥耐性能力の向上、
高温耐性能力の構造、強光耐性能力の向上、低二酸化炭
素条件下での光合成能力の向上が期待できる。
本発明の光合成回路の付与方法においては、C3植物
（イネ）の緑葉の葉肉細胞内において、C4植物の最初の
炭酸固定酵素であるPEPCを細胞質で作用させ、C4化合物
の脱炭酸酵素を葉緑体内で作用させ、さらにPEPを再生
するための酵素を細胞質または葉緑体内のいずれかで同
時に発現させる。
この目的で用いる脱炭酸酵素としては、PCKがある。P
CKはATPを消費してオキザロ酢酸を脱炭酸し、PEPを生成
する酵素なので、PCKを脱炭酸酵素として用いた場合に
は、脱炭酸、ATP消費、PEP再生が１つの酵素で行える。
この脱炭酸酵素が葉緑体内でその作用を発揮するように
するためには、この酵素をコードする遺伝子を、トラン
ジットペプチドをコードする遺伝子と連結して使用す
る。トランジットペプチドは、細胞質内で発現した脱炭
酸酵素を葉緑体内に運搬し、脱炭酸酵素が葉緑体内で作
用することを可能にする。
このような形質転換により、C3植物の緑葉葉肉細胞に
おいて、細胞質をC4植物の葉肉細胞に、葉緑体をC4植物
の維管束鞘細胞に見立てて、C4植物の組織分化と類似し
た形態の炭酸固定経路を作り出す（図１）。このことに
よりC3植物に炭酸濃縮機能と光傷害回避機能を付与す
る。
PEPCと脱炭酸酵素及びPEPを再生する酵素のみで目的
とするC4光合成回路は形成されるが、これに加えて、PE
PCの直接の基質である炭酸水素イオンを細胞質に供給す
るために、CAを細胞質で同時に発現させ、C4光合成回路
の流れをより円滑にしてもよい。PEPC、PCK、CAに加え
て、PEPCの基質であるPEPの供給量を増やすために、ピ
ルビン酸からPEPを生成する酵素のPPDKを同時に発現さ
せ、C4光合成回路の流れをさらに円滑にすることも可能
である。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、PEPCをコードする遺伝子と、トランジット
ペプチドをコードする遺伝子が連結されたPCKをコード
する遺伝子とをC3植物に導入することによりC3植物にC4
光合成回路を付与するC3植物の形質転換法である。
この発明に用いられるPEPCをコードする遺伝子は細
菌、原生動物、植物に由来するものが知られている。例
えば、細菌由来のものとしては、コリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌由来のもの（特公平７−83714）等が挙げ
られる。
しかし、好ましいPEPCは植物由来のものであり、例え
ば、トウモロコシ由来のもの（特公平６−30587号公
報）、アマランサス由来のもの（Rydzik,E.and Berry,
J.O.,Plant Physiol.,（1995）110:713）、フラベリア
・トリネルビア由来のもの（Poestch,W.,et al.,FEBS L
ett.,（1991）292:133−136）、タバコ由来のもの（Koi
zumi,N.et al.,Plant Mol.Biol.,（1991）17:535−53
9）、ダイズ由来のもの（特開平６−319567号公報）、
アブラナ由来のもの（特開平６−90766号公報）、ジャ
ガイモ由来のもの（Merkelbach,S.et al.,Plant Mol.Bi
ol.,（1993）23:881−888）、アルファルファ由来のも
の（Pathariana,S.M.et al.,Plant Mol.Biol.,（1992）
20:437−450）、メセムブリアンテムム・クリスタリヌ
ム由来のもの（Cushman,J.C.and Bohnart,H.J.,Nuc.Aci
d Res.,（1989）6743−6744）等を用いることができ、
中でもトウモロコシ由来のものが特に好ましい。
また、本発明に用いられるPCKをコードする遺伝子と
してはATP依存性のPCKをコードする植物及び細菌由来の
ものが好ましく、植物由来のものとしては、例えばウロ
クロア・パニコイデス由来のもの（特開平８−80197号
公報）、キュウリ由来のもの（Kim,D.−J.and Smith,S.
M.,Plant Mol.Biol.,（1994）26:423−434）等が挙げら
れ、細菌由来のものとしては大腸菌由来のもの（Medin
a,V.et al.,J.Bacteriol.,（1990）172:7151−7156）、
リゾビウム族菌由来のもの（Osteras,M.et al.,J.Bacte
riol.,（1995）177:1452−1460）等が挙げられるが、植
物由来のものが好ましく、特に好ましくは、ウロクロア
・パニコイデス由来のものである。
また、PCKは、上述したように葉緑体内でその作用を
発揮させる必要がある。したがって、このPCKをコード
する遺伝子配列には、トランジット配列を連結して用い
ることが必要である。
ここで、連結するトランジット配列としては、数多く
の植物の葉緑体局在型タンパク質由来のものが報告され
ている（Keegstra,K.et al.,Annu.Rev.Plant Mol.Bio
l.,（1989）40:471−501）が、本発明においては、イネ
由来の配列が好ましく、特に好ましくは、後述する実施
例の方法により得られる配列番号２に表されるイネのル
ビスコ小サブユニットの配列である。トランジット配列
は、PCKをコードする遺伝子の上流に、オープンリーデ
ィングフレームをPCK遺伝子と一致させて連結させる。
好ましくは、トランジット配列はPCKの構造遺伝子の上
流に直接連結させる。
本発明においては、さらに上述したようにPEPCの直接
の基質である炭酸水素イオンを細胞質に供給するため
に、CAをコードする遺伝子をC3植物に導入してもよい。
ここで用いられるCAをコードする遺伝子は植物及び植
物由来のものが数多く知られているが、高等植物由来の
CAをコードする遺伝子と他の生物由来のものとでは塩基
配列の類似性が低い。また、高等植物のCAは無機リン酸
により酵素活性が制御される（Sultemeyer,D.et al.,Ph
ysiol.Plant.,（1993）88:179−190）。したがって、用
いる遺伝子としては高等植物由来のものが好ましく、高
等植物由来のものとしては、ホウレンソウ由来のもの
（Burnell et al.,Plant Physiol.（1990）92:37−4
0）、エンドウ由来のもの（Roeske,C.A.and Ogren,W.
L.,Nuc.Acid Res.,（1990）18:3413）、シロイヌナズナ
由来のもの（Raines,C.A.et al.,Plant Mol.Biol.,（19
92）20:1143−1148）、イネ由来のもの（WO 95/1197
9）、トウモロコシ由来のもの（WO 95/11979）等が挙
げられるが、好ましくはホウレンソウ由来のものであ
る。ホウレンソウCAは葉緑体に局在する酵素であるの
で、本酵素をコードする遺伝子にはトランジットペプチ
ド配列が付加されている。そこで、遺伝子構築には、後
述する実施例１で述べるように部分突然変異導入により
トランジットペプチドをコードする領域を除去した配列
番号３に記した遺伝子を用いる。
また、本発明に用いられるPPDKをコードする遺伝子と
しては、トウモロコシC4型PPDK遺伝子（Matsuoka,M.et
al.,J.Biol.Chem.,（19883）263:11080−11083）、イネ
由来のもの（特開平７−184657）、フラベリア・プリン
グレイ由来のもの（Rosche,E.et al.,Plant Mol.Biol.,
（1994）26:763−769）、メセムブリアンテムム・クリ
スタリヌム由来のもの（Fisslthaler,B.et al.,Planta,
（1995）196:492−500）等が挙げられ、本発明において
は、トウモロコシC4型PPDK遺伝子が好ましい。
本発明において、PPDK遺伝子は葉緑体内で発現させて
も、細胞質内で発現させてもよい。葉緑体内で発現させ
ることが望まれる場合は、PPDK遺伝子にトランジットペ
プチドをコードする配列を連結して用いる。
上述した各酵素をコードする遺伝子に用いられるプロ
モータ配列としては、特に限定されるものではないが、
光合成器官特異的プロモーター配列が好ましい。光合成
器官特異的プロモーター配列としては、例えばトウモロ
コシC4型PPDKプロモーター配列（Glackin et al.,（199
0）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3004−3008）、トウモ
ロコシC4型PEPCプロモーター配列（Hudspeth,R.L.and G
rula,J.W.,Plant Mol.Biol.,（1989）12:579−589）、
イネRubisco小サブユニットプロモーター配列（Kyozuk
a,J.et al.,Plant Physiol.,（1993）102:991−100
0）、イネ集光クロロフィルa/b結合タンパク質プロモー
ター配列（Sakamoto,M.et al.,Plant Cell Physiol.,
（1991）32:385−393）等が挙げらる。本発明において
は、トウモロコシC4型PPDKプロモーター配列が好まし
い。後述する実施例においては、配列番号１に表される
配列を用いている。
本発明においては、上記C4回路に関与する各酵素をコ
ードする遺伝子を別個に遺伝子導入用構築遺伝子として
C3植物に導入、形質転換してもよいが、好ましくは各遺
伝子を同一の遺伝子導入用構築遺伝子上に連結し、これ
をC3植物に導入、形質転換することが好ましい。その
際、遺伝子の順番には特別の制限はない。
必要な遺伝子を別個に又は一緒に連結して含む遺伝子
導入用構築遺伝子で、C3植物細胞を形質転換するには、
選択されたC3植物細胞から常法にしたがってその細胞内
に上記構築遺伝子を導入すればよい。導入の方法として
は、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェク
ション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子
銃を用いる方法等の常法が挙げられるが、中でもアグロ
バクテリウム法を用いて各遺伝子をC3植物に導入、形質
転換することが好ましい。このアグロバクテリウム法
は、この分野において周知であり、これにより双子葉植
物（例えば特開平４−330234号公報）でも単子葉植物
（WO 94/00977）でも形質転換することができる。形質
転換に成功した植物は、後に記載する方法により選別す
ることができる。
形質転換された植物の遺伝形質は、一般的育種方法で
固定して、導入された遺伝子を子孫植物に伝達すること
が可能である。
本発明において形質転換されるC3植物としては、この
技術はあらゆるC3植物に適応が可能であるが、特にイ
ネ、コムギ、オオムギ、ダイズ、バレイショ、タバコ、
アブラナ等の光合成能力が向上することにより乾物生産
性の向上が期待される作物にとって有用である。本発明
においては、単子葉植物に適用することが好ましく、特
に好ましくはイネに適用することである。
なお、本発明でいうC4光合成回路とは、上述したよう
にPEPCによる炭酸固定、脱炭酸酵素によるRubisco近傍
での二酸化炭素の放出、ATPを消費したPEPCの基質の再
生の３つの過程により形成されている。
このC4光合成回路が形質転換されたC3植物内で機能し
ているか否かの判断方法は、後述する実施例で詳述する
が、要約すると以下の方法である。
作出した形質転換体及び対照の切り葉に放射性同位
元素で標識した二酸化炭素（14CO2）を短時間取り込ま
せ、標識される炭素化合物の割合を比較し、形質転換植
物体内でPEPCが機能してC4光合成回路の初期炭酸固定産
物であるC4化合物が生成されるかの調査。また、標識さ
れた炭素化合物の経時的変化を比較し、導入したC4光合
成経路が形質転換植物体内で機能しているかの調査。
作出した形質転換体及び対照の切り葉に放射性同位
元素で標識したリンゴ酸（［14C］リンゴ酸）を取り込
ませ、一定時間後に標識されるショ糖の割合を比較し、
形質転換植物体内でPCKが機能してC4化合物の脱炭酸が
行れているかの調査。
作出した形質転換体の光合成活性を測定し、光合成
能力に変化が見られるかの調査。
実施例 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する
が、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
A.PCK型C4光合成回路 実施例１ 導入遺伝子の構築 （１）プロモーター配列 トウモロコシC4型PPDKプロモーター領域のDNA断片は
既知の塩基配列（Glackin,C.A.and Grula,J.W.（1990）
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3004−3008）をもとに作製
した合成プライマー と、トウモロコシ インブレッドB73緑葉よりSDS−フェ
ノール法により全核酸を抽出し、塩化セシウム−エチジ
ウムブロマイド超遠心法により精製したトウモロコシゲ
ノムDNAを鋳型に用いたPCR法（Mcpherson,M.J.,Quirke,
P.and Taylor,GR.ed.:PCR.A practical approach.Oxfor
d Express Press,Oxford NY（1991））により得た。こ
のDNA断片をプラスミドベクターpCR1000（アメリカ国、
インビトロゲン社）のクローニングサイトに挿入した。
得られたプラスミドをSac Iで消化し、末端を平滑化し
た後Nco Iリンカーを付加し、Hind IIIで消化して得ら
れた約950bpのPPDKプロモーター領域DNA断片を遺伝子構
築に用いた。用いたDNA配列を配列番号１に示す。
（２）PEPC遺伝子 トウモロコシC4型PEPCのcDNAは既知の塩基配列（Huds
peth,R.L and Grula,J.W.（1989）Plant Mol.Biol.12:5
79−589）をもとにして作製した合成オリゴヌクレオチ
ド をプローブに用いて常法（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.an
d Maniatis,T.ed.:Molecular Cloning:A Laboratory Ma
nual,2nd ed.,Cold Spring Horbor Laboratory Press,C
old Spring Horbor NY（1989））により、トウモロコシ
ハイブリッド品種ハーベストクイーンの発芽後約２週
間の芽生え緑葉よりグアニジン−塩酸法により調製した
mRNAとλZAPベクター（アメリカ国、ストラタジーン
社）を用いて添付の説明書にしたがって作成したcDNAラ
イブラリーより２万個のクローンをスクリーニングして
単離した。得られたクローンをXho Iで消化した後Nco I
で部分消化して得られた約3kbpのDNA断片を遺伝子構築
に用いた。
（３）PCK遺伝子 ウロクロア・パニコイデスPCKのcDNAは、既報（特開
平８−80197）で述べたように、イネRubisco小サブユニ
ットのトランジットペプチド部分をコードする領域を付
加した構築遺伝子を用いた。すなわち、λPCK170204お
よびλPCK100101をそれぞれの挿入物中に存在するKpn I
部位で接続し、得られたDNA断片を鋳型として合成プラ
イマーPCK−f2 を用いてPCRを行った。
これとは別に、イネのRubisco小サブユニットの配列
（Matsuoka et al.,Plant Cell Physiol.29:1015−1022
（1988））をもとに合成したプライマーTP−f1 を用い、日本稲品種日本晴の緑葉よりSDS−フェノール
法で抽出したイネゲノムDNAを鋳型としてPCR法によりイ
ネRubisco小サブユニットのトランジットペプチドをコ
ードするDNA断片を単離した。
このDNA断片を鋳型に用い、合成プライマーTP−f2 とTP−r1を用いて再度PCRを行った。そして、PCRで増幅
したPCKcDNA断片をXba IとSph Iの部分消化で得られた
約2kbpのDNA断片と２度目のPCRで増幅したトランジット
ペプチド配列DNA断片をNco IとXba Iで消化して得られ
た約150bpの断片（配列を配列番号２に示す。）を接続
し、得られた約2.2kbpのDNA断片を遺伝子構築に用い
た。
（４）CA遺伝子 既報（Burnell,J.N.ら（1990）Plant Physiol.92:33
−40）で述べられているλファージクローン（λLCA4
8）をHind IIIとKpn Iで消化して得られたホウレンソウ
CAcDNA領域を含む1.8kbpの断片をpBluescriptSK−（米
国、ストラテジーン社）のHind III/Kpn I部位に挿入し
た。CA cDNAから葉緑体への移行に関与するトランジッ
トペプチドをコードする領域を除去するために、トラン
ジットペプチド領域の最後のアミノ酸をセリンからメチ
オニンに改変しNco I認識部位を導入する部分突然変異
を合成オリゴヌクレオチド とMutan−Ｋ（商品名、宝酒造）を用いて行った。得ら
れた変異導入プラスミドをNco Iで消化してトランジッ
トペプチドをコードする領域を除去した。このプラスミ
ドをNco IとSph Iで消化して得られた約700bpのDNA断片
を遺伝子構築に用いた。用いた配列を配列番号３に示
す。
（５）ターミネーター配列 ターミネーター領域は、pBI121（Jefferson,R.A.（19
87）Plant Mol.Biol.Reptr.5:387−405）をSal IとEcoR
Iで消化して得られたNOSターミネーター領域のDNA断
片、pGL2（Bilang,R.ら（1991）Gene 100:247−250）を
Sph IとEcoR Iで消化して得られた35Sターミネーター領
域のDNA断片を用いた。
（６）導入用プラスミドの構築 入手したプロモーター、cDNA、ターミネーターのDNA
断片を以下の組合せで連結し、pBluescript II SK−
（アメリカ国、ストラタジーン社）のHind III−EcoR I
部位に挿入したプラスミド（単独遺伝子導入用プラスミ
ド、図２参照）を構築した。
・PPDKプロモーター::PEPCcDNA::NOSターミネーター（p
DPN） ・PPDKプロモーター::CAcDNA::35Sターミネーター（pDC
S） ・PPDKプロモーター::PCKcDNA::35Sターミネーター（pD
KS） さらに、pDKSをCla Iで消化した後末端を平滑化し、X
ba Iで消化して得たDNA断片を、pDPNをSma IとXba Iで
消化した部位に挿入してPEPCとPCKの２遺伝子を保持し
たプラスミドpPKを構築した（図２参照）。次いで、pDC
SをSma Iで消化した後Hind IIIリンカーを付加し、Hind
IIIで消化して得たDNA断片をpDPNのHind III部位に挿
入しプラスミドpCPを構築した。さらに、pDSKをCla Iで
消化した後末端を平滑化し、Xba Iで消化して得たDNA断
片を、pCPをSma IとXba Iで消化した部位に挿入してC
A、PEPC、PCKの３遺伝子を保持したプラスミドpCPKを構
築した（図２参照）。次に、pPKをXba Iで消化した後、
Hind IIIで部分消化して得た約7.5kbpのDNA断片、及びp
CPKをXba Iで消化した後、Hind IIIで部分消化して得た
約9.5kbpのDNA断片をそれぞれpSB11（Komari,T.らPlant
J.（1996）10:165−174）をXba IとHind IIIで消化し
た部位に挿入し、スーパーバイナリー中間プラスミドpS
PK及びpSCPKを構築した。
これらのベクターをそれぞれ大腸菌LE392株に導入
し、アグロバクテリウムLBA4404/pSB4と大腸菌HB101/pR
K2013との３系交雑によりアグロバクテリウムへの導入
と相同組換え（Komari,T.らPlant J.（1996）10:165−1
74）を行い、pSB4PK及びpSB4CPKを構築した。
（７）CA、PEPC、PCK、PPDKの４遺伝子を保持したベク
ターの構築先に述べた、PCR法により得られたPPDKプロ
モーター領域を持つプラスミドベクターpCR1000（アメ
リカ国、インビトロゲン社）をHind IIIおよびEcoR Iで
消化し、Sac I部位を除去したpBluescript II SK−（ア
メリカ国、ストラタジーン社）のHind III、EcoR I部位
間に挿入した。これをSac Iで消化、平滑末端化後、pIG
221（Ohtaら:Construction and expression in tobacco
of a beta−glucuronidase（GUS）reporter gene cont
aining an intron within the coding sequence.Plant
Cell Physiol.31:805−813（1990））をBamH IおよびSa
l Iで消化、平滑末端化として得られるヒマカタラーゼ
の第１イントロンを含む約200bpの断片を挿入し、PPDK
（cat I）プロモーターを含むプラスミドpSK−Diを作成
した。また、このプラスミドをNde Iで消化、平滑末端
化し、Nco Iリンカーを挿入したプラスミドpSK−Di2を
作成した。
トウモロコシC4型PPDK cDNAの単離は、既知の塩基配
列（Matsuoka,M.,Ozeki,Y.,Yamamoto,N.,Hirano,H.,Kan
o−Murakami,Y.and Tanaka,Y.:Primary structure of m
aize pyruvate,orthophosphate dikinase as deduced f
rom cDNA sequence.J.Biol.Chem.263:11080−11083（19
90））をもとに作成した合成オリゴヌクレオチド をプローブに用いて、常法（Sambrook,J.ら、上掲）に
よってλZAPベクター（アメリカ国、ストラタジーン
社）を使用して作成したcDNAライブラリーをスクリーニ
ングして単離した。さらに、既知の配列（Sheen,J.:Mol
ecular mechanisms underlying the differential expr
ession of Maize Pyruvate,Orthophosphate dikinase g
enes.Plant Cell 3:225−245（1991））をもとに作成し
た合成プライマー を用いたPCR法（Mcpherson,M.J.ら、上掲）により上記
のトウモロコシPPDK cDNAを鋳型に用いて増幅し、約250
bpのDNA断片を得た。この断片をNde I、Sac IIで消化
し、上記のPPDK cDNAのNde I、Sac II部位間と置換し
た。これを、Nde IおよびCla Iで消化して得られる約2.
9kbpのDNA断片をPPDK cDNAとして遺伝子構築に用いた。
ターミネーター領域は、プラスミドpPGA643A（Gynheu
ng AN,Paul R.Ebert,Amitava Mitra and Sam B.HA:bina
ry vectors,Plant Molecular Biology Manual A3:1−19
（1988））に存在するgene7ターミネーターを用いた。g
ene7ターミネーターは、pPGA643（Gynheung ANら、上
掲）をCla IおよびKpn Iで消化して得られた。これをpB
luescript II SK−（アメリカ国、ストラタジーン社）
のCla I、Kpn I部位間に挿入したプラスミドを作成し、
Kpn Iで消化、平滑末端化し、Xba Iリンカーを挿入後、
Cla IおよびXba Iで消化して得られたDNA断片を遺伝子
構築に用いた。
pSK−DiのNde I、Xba I部位間に、PPDK cDNAおよびge
ne7ターミネーターを挿入し、PPDK遺伝子を含むプラス
ミドpSK−DiDTを作成した。
pSK−Di2のNco I、Xba I部位間に、先に述べたpDPNを
Xba Iで消化後、Nco Iで部分消化して得られる約3.4kbp
のDNA断片を挿入し、PEPC遺伝子を含むプラスミドpSK−
DiPNを作成した。
pSK−Di2のNco I、Xba I部位間に、先に述べたpDKSを
Nco IおよびXba Iで消化して得られる約2.4kbpのDNA断
片を挿入し、PEPCK遺伝子を含むプラスミドpSK−DiKSを
作成した。
pSK−Di2のNco I、Xba I部位間に、先に述べたpDCSを
Nco IおよびXba Iで消化して得られる約1kbpのDNA断片
を挿入し、CA遺伝子を含むプラスミドpSK−DiCSを作成
した。
pSK−DiPNをXho I部位にSma Iリンカーを挿入し、Sma
Iで消化して得られた約4.5kbpのDNA断片を、pSK−DiCS
をPst Iで消化、平滑末端化した部位に挿入し、プラス
ミドpSK−CiPiを作成した。pSK−DiDTのXba I部位を除
去し、Xho I部位にXba Iリンカーを挿入し、これをXba
IおよびNot Iで消化して得られた約4.8kbpのDNA断片
を、pSK−CiPiのXba I、Not I部位間に挿入し、プラス
ミドpSK−CiPiDiを作成した。pSK−CiPiDiのXho I部位
にNot Iリンカーを挿入し、Not Iで消化して得られた約
12kbpのDNA断片を得た。pSB11（Komari T.ら,Plant I.1
0:165−174（1996））をHind IIIおよびEcoR Iで消化、
平滑末端化後、Not Iリンカーを挿入し、このNot I部位
に上記の約12kbpのDNA断片を挿入し、プラスミドpSBmCi
PiDiを作成した。pSK−DiKSのXho I部位にXba Iリンカ
ーを挿入後、Xba Iで消化して得られた約3.3kbpのDNA断
片を、pSBmCiPiDiのXba I部位に挿入し、プラスミドpSB
mCiPiKiDiを作成した。
プラスミドpSBmCiPiKiDiを保有する大腸菌DH5α株
と、pSB4を保有するアグロバクテリウムLBA4404株、pRK
2013を保有する大腸菌HB101株との３系交雑により、ア
グロバクテリウムへの導入と相同組換え（Komari T.
ら、上掲）を行い、pSB4CiPiKiDiを作成した。
実施例２ 形質転換体の作出 イネの形質転換にはすべて日本稲品種「月の光」を用
いた。
pDPN、pDKS、pDCSを導入した形質転換イネの作出は既
報（特開平８−80197号公報）に準じてエレクトロポレ
ーション法により行った。
pSB4PK、pSB4CPK、pSB4CiPiDiKiを導入した形質転換
イネの作出は既報（Hiei,Y.ら（1994）Plant J.6:271−
282）に準じてアグロバクテリウム法により行った。
得られた形質転換個体は空調温室（16時間日長、昼:2
8℃、夜:23℃）にて育成した。
実施例３ 酵素タンパク質の検出と酵素活性の測定 形質転換イネ及び対照イネ（月の光）の葉約0.1gを1m
lの氷冷した抽出緩衝液（50mM HEPES−KOH pH7.0、10mM
塩化マグネシウム、2mM塩化マンガン、1mMピルピン酸ナ
トリウム、1mMリン酸、1mM EDTA、0.1％ 2−メルカプト
エタノール、20％グリセロール、1mMフッ化フェニルメ
チルスルホニル、1mMベンズアミジン、1mM 6−アミノ−
ｎ−カプロン酸、0.2％（W/V）イソアスコルビン酸、２
％（W/V）ポリクラールAT）で磨砕した。磨砕液を15000
×ｇで４℃、20分間遠心分離し、得られた上清を予め室
温でカラム緩衝液（50mM HEPES−KOH pH7.0、10mM塩化
マグネシウム、2mM塩化マンガン、1mM EDTA、0.1％ 2−
メルカプトエタノール、20％グリセロール）で平衡化し
ておいたNAP5（商品名）カラム（スウェーデン国、ファ
ルマシア社）に通して脱塩し、粗抽出液を得た。磨砕液
のクロロフィルの定量は既報（Wintermans and deMots
（1965）Biochem.Biophys.Acta 109:448−453）にした
がって行い、粗抽出液のタンパク質の定量はプロテイン
アッセイキット（商品名、アメリカ国、バイオラド社）
を用いて行った。
形質転換体において発現している導入酵素の発現をウ
エスタンブロッティングで検出するために、得られた粗
抽出液をタンパク質量が等しくなるようにSDS−PAGEに
供し、ゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜（ドイ
ツ国、シュライヒャー アンド シュエル社）に電気的
に転写し、トウモロコシPEPCタンパク質もしくはウロク
ロア・パニコイデスPCKタンパク質もしくはホウレンソ
ウCAタンパク質もしくはトウモロコシPPDKタンパク質に
対するウサギ抗血清、アルカリフォスファターゼ標識ヤ
ギ抗ウサギIgG（アメリカ国、オルガノン・テクニカ社
カッペルプロダクト）、AP発色キット（商品名、アメ
リカ国、バイオラド社）を用いてそれぞれの導入した酵
素タンパク質を検出した。
PEPC活性の測定は、25mM HEPES−KOH pH8.0、5mM硫酸
マグネシウム、4mMジチオスレイトール、5mM炭酸水素カ
リウム、0.25mM NADH、1mMグルコース−６−リン酸、5m
Mホスホエノールピルビン酸、１ユニットリンゴ酸脱水
素酵素（ドイツ国、ベーリンガーマンハイム社）、粗抽
出液25μｌを含む1mlの反応液により340nmのNADHの吸収
の減少速度を求めることにより行った。
PCK活性の測定は、25mM HEPES−KOH pH8.0、4mMジチ
オスレイトール、0.2mMオキザロ酢酸、１ユニットピル
ビン酸キナーゼ（ドイツ国、ベーリンガーマンハイム
社）、0.2mM ATP、粗抽出液50μｌを含む1mlの反応液に
より280nmのオキザロ酢酸の吸収の減少速度を求めるこ
とにより行った。
CA活性の測定は、ブロモチモールブルーで着色した0.
3mlの50mM HEPES−KOH緩衝液pH8.0、粗抽出液10μｌに
氷冷した0.5mlの飽和炭酸ガス溶液を加え、氷温下での
反応液の呈色が消えるまで時間を求めることにより行っ
た。活性の計算は既報（Burnell,J.N.and Hatch,M.D.
（1988）Plant Physiol.86:1252−1256）にしたがって
行った。
PPDK活性の測定は、25mM HEPES−KOH pH8.0、10mMジ
チオスレイトール、10mM炭酸水素カリウム、8mM硫酸マ
グネシウム、5mM塩化アンモニウム、2.5mMリン酸水素一
カリウム、1mM ATP、1mMグルコース−６−リン酸、5mM
ピルビン酸ナトリウム、0.2mM NADH、２ユニットリンゴ
酸脱水素酵素、２ユニットPEPC（和光純薬工業）、粗抽
出液200μｌを含む1mlの反応液により340nmのNADHの吸
収の減少速度を求めることにより行った。
実施例４ 14CO2を用いたトレーサー実験 空調温室で育成した形質転換イネ及び対照イネ（月の
光）の葉の先端部約5cmを水切りし、切り口に水をしみ
こませた脱脂綿を巻き、自作の同化箱（容積約120mlも
しくは約50ml）にセットした。約27000ルクスの光照射
下で外気を約51/minの流量で30分間通気させた後、100
〜130μｌの60％過塩素酸と50〜70μCiのNaH14CO3溶液
（イギリス国、アマシャム社）をガスタイトシリンジ内
で混合して発生させた放射性二酸化炭素ガスを閉鎖系内
に注入した。５秒間のパルスの後、葉を液体窒素で凍結
して生物活性を停止させ、葉を80％熱エタノール中に約
30分間放置して可溶性物質を溶出した。また、５秒間の
パルスの後、大気を系内に取り込んで10、30、90秒後に
各々同化箱から葉を取り出して液体窒素に浸けて生物活
性を停止させ、80％熱エタノールで可溶性物質を溶出し
た。得られた抽出液はエバポレーターで濃縮し、フナセ
ルSFセルロース薄層プレート（商品名、20cm×20cm、フ
ナコシ社）を用いた二次元薄層クロマトグラフィーに供
した。
展開には、一次元展開溶媒としてフェノール−水−氷
酢酸−0.5M EDTA（474:84:5.5:1.14;V/V）を、二次元展
開溶媒としてＡ液（ｎ−ブタノール：水;74:5;V/V）と
Ｂ液（プロピオン酸：水;9:11;V/V）を等容量混合した
ものを用いた。展開は室温で行い、展開終了後プレート
を乾燥して、バイオイメージアナライザーBas1000シス
テム（フジ写真工業）を用いてオートラジオグラフィー
及び各スポットの定量を行ない、放射性同位元素で標識
された物質の割合を調査した。
実施例５ ［14C］リンゴ酸を用いたトレーサー実験 空調温室で育成した形質転換イネ及び対照イネ（月の
光）の葉を水切りし、10mMリン酸緩衝液pH6.4に差して
１時間27000ルクスの光照射をした。次いで、100μｌの
緩衝液に１μCiの［14C］リンゴ酸（５μｌ）（イギリ
ス国、アマシャム社）を添加した溶液に葉を差した。一
定時間後に葉片を取り出して緩衝液に浸かっていた部分
を切除して80％沸騰エタノール中に浸けて生物反応を停
止させ、30分間沸騰状態に置き可溶性物質を溶出した。
溶出液はエバポレーターで濃縮し、二次元薄層クロマト
グラフィーに供して放射性同位元素で標識された物質を
分離し、バイオイメージアナライザーBas1000システム
を用いてオートラジオグラフィー及び各スポットの定量
を行ない、放射性同位元素で標識された物質の割合を調
査した。
実施例６ 光合成活性の測定 空調温室で育成した３遺伝子導入形質転換イネ及び対
照イネ（月の光）を１日以上人工気象器（12時間日長、
照度約35000ルクス、25℃）で育成して環境に馴化さ
せ、老化が始まっていない完全展開葉の光合成活性を光
合成蒸散測定装置（LI−6200、アメリカ国、ライカー
社）を用いて測定した。
実施例７ PCK型C4イネの作出および測定結果 各構築遺伝子について複数の形質転換個体を作出し、
ウエスタンブロッティングによって導入遺伝子の発現を
調査した。構築遺伝子pDPNが導入された形質転換イネ
（PEPC導入形質転換体）19個体のうち、15個体において
PEPCタンパク質の発現が確認された。構築遺伝子pDKSが
導入された形質転換イネ（PCK導入形質転換体）31個体
のうち、20個体においてPCKタンパク質の発現が確認さ
れた。構築遺伝子pDCSが導入された形質転換イネ（CA導
入形質転換体）41個体のうち、３個体において比較的高
いCAタンパク質の発現が確認された。構築遺伝子pSB4PK
を導入した形質転換イネ（２遺伝子導入形質転換体）21
個体のうち、12個体においてPEPCとPCKの２種類のタン
パク質の発現が確認された。構築遺伝子pSB4CPKを導入
した形質転換イネ（３遺伝子導入形質転換体）40個体の
うち、15個体においてCA、PEPC、PCKの３種類のタンパ
ク質の発現が確認された。構築遺伝子pSB4CiPiKiDiを導
入した形質転換イネ（４遺伝子導入形質転換体）72個体
のうち、22個体においてCA、PEPC、PCK、PPDKの４種類
のタンパク質の発現が確認された。
これらの形質転換イネのうち、比較的導入酵素発現量
の高いものに関して、R1世代の植物体を作出し、緑葉粗
抽出液中のそれぞれの酵素の活性を調査したところ、表
１に示すような結果を得た。この結果から明らかなよう
に、形質転換イネの粗抽出液において導入した酵素の活
性が対照イネ（月の光）のそれよりも高い値で検出され
た。このことは、形質転換イネにおいて発現している導
入酵素は酵素活性を有していることを示している。本実
施例で用いたPCK導入用構築遺伝子は既報（特開平８−8
0197号公報）と同じイネRubisco小サブユニットのトラ
ンジットペプチド部分をコードする領域を付加したキメ
ラ遺伝子であるので、PCKタンパク質は、トランジット
ペプチドの作用により葉緑体内に局在する。
２遺伝子導入した形質転換イネと３遺伝子導入した形
質転換イネのR1世代及び対照イネ（月の光）の切り葉に
14CO2を与え、５秒後に組織の生物反応を停止して標識
されるC4化合物の割合を調査したところ、対照イネに比
べ形質転換イネに含まれる標識されたリンゴ酸の割合は
約10倍、標識されたアスパラギン酸の割合は約２倍高か
った（表２参照）。このことは、形質転換イネの緑葉組
織中において導入したPEPCが機能し、C4光合成回路の最
初の炭酸固定の過程が行われていることを示している。
また、２遺伝子導入した形質転換イネ、３遺伝子導入
した形質転換イネ、４遺伝子導入した形質転換イネのそ
れぞれのR1世代、対照イネ（月の光）及びトウモロコシ
の切り葉に５秒間14CO2を与えた後の標識されたC4化合
物のその後の挙動を経時的に追った。形質転換イネにお
いて標識されたC4化合物は、C4植物であるトウモロコシ
と同じように、経時的に減少していくが、対照イネにお
いては標識されたC4化合物の変化は殆ど見られなかった
（図３参照）。このことは、形質転換イネにおいて、導
入したPEPCが炭酸固定することによって生成されたC4化
合物は、C4植物の緑葉組織で見られる変化と同じよう
に、直ちに代謝されて他の物質へと変化していることを
示している。
２遺伝子導入した形質転換イネと３遺伝子導入した形
質転換イネのそれぞれのR1世代及び対照イネ（月の光）
の切り葉に［14C］リンゴ酸を与え、15分後に組織の生
物反応を停止して標識される物質の割合を調査したとこ
ろ、形質転換イネに含まれる標識されたショ糖の割合は
対照イネに比べ約３倍高かった（表３参照）。このこと
は、形質転換イネの緑葉組織中において、導入したPCK
が機能し、C4光合成回路におけるC4化合物からカルビン
−ベンソン回路への二酸化炭素の授受が行われているこ
とを示している。
３遺伝子導入した形質転換イネのR1世代及び対照イネ
（月の光）の光合成活性を葉に与える二酸化炭素濃度を
変えて計測し、光合成活性−細胞内二酸化炭素濃度曲線
（図４参照）を求めたところ、見かけの光合成活性が無
くなると仮定した際の細胞間二酸化炭素濃度（図中の直
線のｘ軸切片）は形質転換イネの値のほうが対照イネよ
りも低かった。このことは、形質転換イネのCO2補償点
は対照イネよりも低いことを示している。一般的にC4植
物のCO2補償点はC3植物よりも低い傾向にあることか
ら、作出した形質転換イネは対照イネよりもC4植物に近
い光合成の特質を持つといえる。
以上の結果は、２遺伝子導入した形質転換イネ及び３
遺伝子導入した形質転換イネにおいて、導入した遺伝子
の発現産物であるC4光合成関連酵素が酵素活性を有した
かたちで存在し、しかも、C4光合成回路が機能し、光合
成能力に変化が生じていることを示唆している。よっ
て、本発明によりC3植物細胞内でPCK型C4光合成回路を
機能させ光合成能力を改変させることが可能となった。
発明の効果 本発明によれば、C3植物の葉肉細胞中でC4植物のC4光
合成回路に類似した回路反応を回転させ、葉緑体内の二
酸化炭素濃度を高める機能、ATP消費により光傷害を回
避する機能を付与させることができる。またこれらの能
力が付与された植物は、光合成能力が向上されることに
より、乾物生産性の向上、乾燥耐性能力の向上、高温耐
性能力の向上、強光耐性能力の向上、低二酸化炭素条件
下での光合成能力の向上が期待できる。
配列表 配列番号:1 配列の長さ:930 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 起源： 生物名：チア メイス（Zea mays） 品種名：インブレッドB73 配列の特徴： 性質:C4型PPDK遺伝子プロモーター領域の一部 配列 配列番号:2 配列の長さ:153 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 起源： 生物名：オリザ サティバ（Oryza sativa） 品種名：日本晴 配列の特徴： 性質：ルビスコ小サブユニットトランジット配列領域 配列 配列番号:3 配列の長さ:697 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 起源： 生物名：スピナチア オレラセア（Spinacia olerace
a） 配列の特徴： 性質：トランジットペプチドをコードする領域を除去
したカーボニックアンヒドラーゼのmRNA 配列 配列番号:4 配列の長さ:21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:5 配列の長さ:19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:6 配列の長さ:35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:7 配列の長さ:39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:8 配列の長さ:39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:9 配列の長さ:29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:10 配列の長さ:25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:11 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:12 配列の長さ:41 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:13 配列の長さ:35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:14 配列の長さ:56 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:15 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列
フロントページの続き (72)発明者 山田 茂裕 静岡県磐田郡豊田町東原700番地 日本 たばこ産業株式会社遺伝育種研究所内 (72)発明者 太田 象三 静岡県磐田郡豊田町東原700番地 日本 たばこ産業株式会社遺伝育種研究所内 (72)発明者 バーネル，ジェームス・エヌ オーストラリア国クイーンズランド州 4814，アナンデイル，ウッドハウス・コ ート 14 (56)参考文献 特開 平８−80197（ＪＰ，Ａ) 特公 平６−12990（ＪＰ，Ｂ２) Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ（1994）Ｖｏｌ．３，ｐ．287−296 日本作物学会記事（1994）Ｖｏｌ. 63，別冊Ｎｏ．２，ｐ．247−248 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A01H 5/00 ＰｕｂＭｅｄ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
    ゼ（PEPC）をコードする遺伝子と、トランジットペプチ
    ドをコードする遺伝子が連結されたホスホエノールピル
    ビン酸カルボキシキナーゼ（PCK）をコードする遺伝子
    とをC3植物に導入することによりC3植物にC4光合成回路
    を付与するC3植物の形質転換法。
  2. 【請求項２】カーボニックアンヒドラーゼ（CA）をコー
    ドする遺伝子をさらに導入することを特徴とする請求項
    １記載の形質転換法。
  3. 【請求項３】ピルビン酸リン酸ジキナーゼ（PPDK）をコ
    ードする遺伝子をさらに導入することを特徴とする請求
    項１記載の形質転換法。
  4. 【請求項４】プロモーター配列が光合成器官特異的プロ
    モーター配列である請求項１ないし３のいずれか１項に
    記載の形質転換法。
  5. 【請求項５】前記遺伝子の二つ以上または全部を同一の
    遺伝子導入用構築遺伝子上に連結し、これをC3植物に導
    入することを特徴とする請求項１から３までのいずれか
    に記載の形質転換法。
  6. 【請求項６】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
    ゼ（PEPC）をコードする遺伝子と、トランジットペプチ
    ドをコードする遺伝子が連結されたホスホエノールピル
    ビン酸カルボキシキナーゼ（PCK）をコードする遺伝子
    とが連結されたキメラ遺伝子。
  7. 【請求項７】請求項１から５までのいずれかの請求項に
    記載された形質転換法により形質転換され、C4光合成回
    路が付与された形質転換植物。
JP53414598A 1997-02-10 1998-02-10 Ｐｃｋ型ｃ４回路 Expired - Fee Related JP3501814B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2665897 1997-02-10
JP9-26658 1997-02-10
PCT/JP1998/000537 WO1998035030A1 (fr) 1997-02-10 1998-02-10 Cycle c4 de type pck

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP3501814B2 true JP3501814B2 (ja) 2004-03-02

Family

ID=12199531

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP53414598A Expired - Fee Related JP3501814B2 (ja) 1997-02-10 1998-02-10 Ｐｃｋ型ｃ４回路

Country Status (14)

Country Link
US (2) US6610913B1 (ja)
EP (1) EP0916725B1 (ja)
JP (1) JP3501814B2 (ja)
KR (1) KR100769755B1 (ja)
CN (1) CN1107723C (ja)
AR (1) AR011652A1 (ja)
AT (1) ATE360064T1 (ja)
AU (1) AU729520B2 (ja)
CA (1) CA2250827C (ja)
DE (1) DE69837588T2 (ja)
ID (1) ID21006A (ja)
NZ (1) NZ332271A (ja)
RU (1) RU2159813C2 (ja)
WO (1) WO1998035030A1 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2823064B1 (fr) * 2001-04-04 2004-05-28 Biogemma Fr Procede d'obtention de plantes c4 a metabolisme carbone modifie
EP1367127A1 (en) * 2002-05-27 2003-12-03 Bayer CropScience AG A method for production of plants with suppressed photorespiration and improved CO2 fixation
US7642347B2 (en) * 2006-06-23 2010-01-05 Monsanto Technology Llc Chimeric regulatory elements for gene expression in leaf mesophyll and bundle sheath cells
BRPI0718977A2 (pt) 2006-11-24 2014-02-04 Cropdesign Nv Método para aumentar rendimento de sementes em plantas em relação às plantas de controle, construção, uso da mesma, planta, parte de planta ou célula de planta, método para a produção de uma planta transgênica tendo redimento aumentado de sementes em relação às plantas de controle, planta transgênica, partes colhíveis de uma planta, produtos, e, uso de um ácido nucleico
EP2503000A1 (en) * 2007-07-31 2012-09-26 BASF Plant Science GmbH Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same
DE202008005083U1 (de) * 2008-01-22 2008-06-26 Wezag Gmbh Werkzeugfabrik Presszange
GB0903346D0 (en) * 2009-02-27 2009-04-08 Cambridge Advanced Tech Transgenic Plants
US20140298544A1 (en) * 2011-10-28 2014-10-02 Pioneer Hi Bred International Inc Engineered PEP carboxylase variants for improved plant productivity
EA201591294A1 (ru) * 2013-02-22 2016-01-29 Технише Университет Делфт Рекомбинантный микроорганизм для применения в способе с повышенным выходом продукта
WO2014201156A1 (en) * 2013-06-11 2014-12-18 Florida State University Research Foundation, Inc. Materials and methods for controlling bundle sheath cell fate and function in plants
CN103805616A (zh) * 2014-02-25 2014-05-21 河南省农业科学院小麦研究所 玉米c4型磷酸丙酮酸双激酶（ppdk）基因及其在小麦中的应用
CN108440672B (zh) * 2018-03-13 2020-12-04 华南农业大学 一条光呼吸代谢改造支路及其在c3植物中的应用
KR102381872B1 (ko) 2020-10-19 2022-04-12 주식회사 수앤그린테크 벼 재배용 화분장치

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0783714B2 (ja) 1983-08-29 1995-09-13 味の素株式会社 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法
JPH0612990B2 (ja) 1984-08-09 1994-02-23 株式会社アドバンス 生細胞のｃｏ２固定能力を増大する方法
JPH0630587B2 (ja) 1985-08-23 1994-04-27 住友化学工業株式会社 クロ−ン化されたトウモロコシのｐｐｃ遺伝子
JPH04222527A (ja) 1990-12-19 1992-08-12 Japan Tobacco Inc トマトの形質転換方法
JP3002735B2 (ja) 1991-09-27 2000-01-24 農林水産省食品総合研究所長 大豆のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
EP0604662B1 (en) 1992-07-07 2008-06-18 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
JPH0690766A (ja) 1992-09-09 1994-04-05 Mitsui Giyousai Shokubutsu Bio Kenkyusho:Kk アブラナのホスホエノールピルビン酸 カルボキシラーゼ遺伝子
CA2148499C (en) 1993-09-03 2006-07-11 Hideaki Saito Method for transforming monocotyledons using scutella of immature embryos
AU8003494A (en) 1993-10-29 1995-05-22 Japan Tobacco Inc. Dna coding for carbonic anhydrase
EP0690128A4 (en) 1993-12-03 2004-03-03 Japan Tobacco Inc POLYPEPTIDE HAVING COLD RESISTANCE INDUCING PYRUVATE-PHOSPHATE-DIKINASE ACTIVITY, DNA ENCODING THE POLYPEPTIDE, AND RECOMBINANT VECTOR AND TRANSFORMED PLANT CONTAINING BOTH OF THE SAME
JPH07184657A (ja) 1993-12-28 1995-07-25 Japan Turf Glass:Kk イネにおけるｃ４光合成関連遺伝子およびそのプロモーター
JP3521161B2 (ja) * 1994-07-09 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｄｎａ、それを含む組換えベクター及び形質転換植物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４）Ｖｏｌ．３，ｐ．２８７−２９６
日本作物学会記事（１９９４）Ｖｏｌ．６３，別冊Ｎｏ．２，ｐ．２４７−２４８

Also Published As

Publication number Publication date
AR011652A1 (es) 2000-08-30
DE69837588D1 (de) 2007-05-31
US6610913B1 (en) 2003-08-26
KR100769755B1 (ko) 2008-01-22
ATE360064T1 (de) 2007-05-15
RU2159813C2 (ru) 2000-11-27
NZ332271A (en) 2000-04-28
DE69837588T2 (de) 2008-01-03
CN1220698A (zh) 1999-06-23
EP0916725B1 (en) 2007-04-18
CA2250827C (en) 2005-10-18
WO1998035030A1 (fr) 1998-08-13
CA2250827A1 (en) 1998-08-13
AU5781798A (en) 1998-08-26
AU729520B2 (en) 2001-02-01
CN1107723C (zh) 2003-05-07
EP0916725A1 (en) 1999-05-19
EP0916725A4 (en) 2004-06-09
ID21006A (id) 1999-04-08
US20030221219A1 (en) 2003-11-27
KR20000064878A (ko) 2000-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7390937B2 (en) Plants with enhanced levels of nitrogen utilization proteins in their root epidermis and uses thereof
JP4427103B2 (ja) 窒素同化の増加を示すトランスジェニック植物
Jeanneau et al. Improvement of drought tolerance in maize: towards the functional validation of the Zm-Asr1 gene and increase of water use efficiency by over-expressing C4–PEPC
US20150218578A1 (en) Methods of increasing tolerance to heat stress and amino acid content of plants
JP3501814B2 (ja) Ｐｃｋ型ｃ４回路
WO2006036864A2 (en) Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof
JP6163514B2 (ja) 増強された成長特性を有するトランスジェニック植物
JP6117837B2 (ja) 植物性グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ遺伝子、およびそれを運搬するトランスジェニック植物
US7777099B2 (en) Genetic method
MX2007014611A (es) Regulacion post-transcripcional de la expresion del gen.
US20150203864A1 (en) Myb55 promoter and use thereof
AU2012245969B2 (en) An expression construct and process for enhancing the carbon, nitrogen, biomass and yield of plants
JPH11341928A (ja) リンゴ酸酵素を用いたｃ３植物へのｃ４光合成回路の付与
WO2004092380A1 (ja) イネニコチアナミンシンターゼ遺伝子プロモーター、およびその利用
MXPA98008409A (en) C4 cycle of pck type

Legal Events

Date Code Title Description
A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20031203

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081212

Year of fee payment: 5

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees