KR20000016035A - 알부민을 측정하는 동안 헤모글로빈 오류를 제거하는 방법 - Google Patents

알부민을 측정하는 동안 헤모글로빈 오류를 제거하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2개 이상의 파장을 광학적으로 측정하여 유리 헤모글로빈을 포함하는 샘플내에서 알부민을 검정하기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법에 따라 a) 검정하는 동안 알부민에 대해 적절하게 강한 측정 신호가 제 1 시험 파장에 제공되고, b) 제 2 시험 파장에서 (ⅰ) 알부민 측정 신호가 없거나 또는 제 1 파장에 대한 것보다 알부민 측정 신호가 상대적으로 더 작고, 그리고 c) 상기 알부민 검정을 위해 사용되는 검정 시약과 상기 헤모글로빈의 반응에 의해 야기된 제 1 및 제 2 시험 파장에 비교적 큰 시간 의존성 간섭 신호가 존재하도록 한다.

Description

알부민을 측정하는 동안 헤모글로빈 오류를 제거하는 방법
혈청과 혈장 내의 알부민 검정(예를 들어, 브로모크레솔 그린(bromocresol green) 처리법을 사용하는)은 헤모글로빈(Hb)에 의해 그리고 다르게 상승된 알부민 함량이 나타내는 헤모글로빈과 유사한 화합물의 함량에 의해 간섭을 받는다. 이러한 원인은 염색물과 헤모글로빈의 반응 때문이며, Hb은 알부민에 의해 정량적으로 측정된다(Doumas 등의 Clin. Chim. Acta 31, 87-96(1971)).
유럽 특허 0,268,025B1는 통상적인 2 지점 측정에 의해 알부민 검정시에 Hb간섭을 보정하는 것이 불가능한 것으로 지적하고 있다. 그러나, 상기 특허에서는 용혈의 정도와 측정 오류사이의 관계로부터 보정 요소를 결정하고 그리고 주어진 샘플의 이종 알부민 결과를 계산하여 보정하도록 (용혈 정도의 분리 측정에 이어서) 상기 요소를 사용하는 것을 제안하고 있다.
Jay 및 Provasek(Clin. Chem. 39/9, 1804-1810, 1993)는 이들의 실험에서 각각의 탐색가능한 용혈 샘플에 대해 이들 샘플의 Hb 함량을 분리하여 측정하고 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 이들은 분석물 측정의 (이종(異種))결과를 계산함에 의해 보정한다. 이어서 보정의 정도는 분석 결과에 따라 알 수 있다.
알부민에 의한 Hb 간섭을 보정하는 다른 방법은 독일 공개공보 4,427,492A1에 기술되어 있다. 여기서는 이것은 주반응 전의 반응으로부터 유도될수있기 때문에, 용혈의 정도의 분리 측정이 제거된다. 소위 비율(rate)플러스방법을 사용할 때, 주 반응으로부터의 시험 결과는 용혈의 정도와 간섭사이의 조사된 관계를 사용하여 계산됨에 의해 보정된다.
알부민 검정시에 Hb 간섭을 제거하기 위한 이전에 기술된 방법은 일반적으로 Hb 함량에 대응되는 양에 의해 분석 결과를 수학적으로 보정하는 것을 필요로 한다. 이 Hb 함량 또는 용혈의 정도는 분리 측정(예를들어 다중 파장 분석에 의해 또는 독립적인 방법에 의해)에 의해 그렇지 않으면 예비 반응에 의해 조사되며, 항상 2종 시약 검정이 필요하다.
그러나, 현재 알부민은 종종 단일 시약을 사용하는 한점 측정으로서 검정되며, 색 반응은 샘플 및 시약(예를들어, 뵈링거 만하임 게엠베하에서 시판되는 알부민 시약)을 혼합함에 의해 출발된다. 이러한 검정은 조작이 용이하다는 점 이외에도, 또한 비용이 저렴하다는 장점을 제공한다. 그러나, Hb 간섭을 제거하는 방법은 복잡하며, 이것은 단일 시약을 사용하고 Hb 함량을 분리 측정하거나 또는 2 종 시약 검정을 실행하여 Hb 함량의 분리 측정을 피할수 있도록 한다. 모든 각각의 실례에 있어서, 수득된 분석 결과는 계산에 의해 보정되어야만 한다.
나아가, 헤모글로빈의 포함하는 혈장 또는 혈청의 샘플을 시험할 때, 주반응(시험 시약과 알루미늄)은 간섭 반응(시험 시약과 헤모글로빈)과 겹쳐지고 간섭 반응에 의해 야기된 헤모글로빈 흡광 신호가 감소된다. 결국 주반응과 간섭 반응으로부터의 흡광 스팩트럼들은 특정 알부민 검정 시약의 작용과는 다르다.
주반응 시험 결과에서의 간섭 반응의 작용은 시험 파장의 조합 및 도한 반응 시간에 따라 좌우된다는 사실을 발견할 수 있다.
이에따라 알부민을 검정할 때 헤모글로빈의 간섭을 제거하는 것은 매우 복잡한데, 이종 신호가 평면 구조의 중크롬산 측정 또는 견본 샘플의 값을 간단하게 측정함에의해 제거될수도 있는 전형적인 간섭 신호가 아니기 때문이다. 이 보다는 천연, 가교된, 중합된 또는 제조합되어 제조된 헤모글로빈인 간섭 물질이 시약과 직접 반응한다. 이에따라 시험 파장에 있어서 이 간섭 반응은 주반응으로부터 적정하게 명확하게 구별되어야만 한다.
이러한 문제는 중크롬산염 검정의 1 차 시험 파장 및 제 2 시험 파장인 시험 파장의 조합을 변경시킴에 의해 해결하여왔다. 그러나 현재는 파장의 조합을 변경시킴에 의해 샘플내의 유리 헤모글로빈에 의해 야기된 검정 오류는 실질적으로 억제될수있다는 것을 발견한다(도 1, 3, 4, 5, 7, 8, 10 및 11). 일반적으로 검정 시약의 최대 흡광도의 외면에 있을수 있는 파장의 조합에 있어서, 헤모글로빈을 포함하는 샘플로부터의 측정 신호는 시간 의존 방식으로 변경될수 있어서, 헤모글로빈으로부터 자유로운 샘플로부터의 측정 신호는 본질적으로 일정할 것이다.
그러나, 이러한 작용은 600nm의 주파장 및 700nm의 부(side)파장에 대해 알부민을 검정하는데 통상적으로 사용되는 파장 조합에서는 관측되지 않는다. 이러한 경우에 큰 검정 오류는 헤모글로빈을 포함하는 샘플에서 발견할 수 있을 것이다(도 2, 6 및 9).
본 발명의 목적은 2개 이상의 파장을 광학적으로 측정하여 유리 헤모글로빈을 포함하는 샘플내에서 알부민을 검정하기 위한 방법을 제공하는 것으로서,
a) 검정하는 동안 알부민에 대해 적절하게 강한 측정 신호가 제 1 시험 파장에 제공되고,
b) 제 2 시험 파장에서 (ⅰ) 알부민 측정 신호가 없거나 또는 제 1 파장에 대한 것보다 알부민 측정 신호가 상대적으로 더 작고, 그리고
c) 상기 알부민 검정을 위해 사용되는 검정 시약과 상기 헤모글로빈의 반응에 의해 야기된 제 1 및 제 2 시험 파장에 비교적 큰 시간 의존성 간섭 신호가 존재하도록 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법은 시험 파장의 조합을 사용하여 제 1 시험 파장이 측정을 위해 충분히 높은 알부민 측정 신호가 결과되도록 한다. 최대 흡광도의 외부에 제공되는 것이 바람직하더라도, 제 1 시험 파장은 검정 시약의 최대 흡광을 필요로 하지 않는다는 것이 중요하다. 제 2 시험 파장은 제 1 파장의 시험 파장 보다 실질적으로 작은 알부민 측정 신호를 나타낸다. 바람직하게는 제 1 시험 파장의 측정 신호는 적어도 20mE이고 보다 바람직하게는 제 2 시험파장 보다 큰 적어도 50mE이다.
나아가, 상대적으로 동일한 간섭 신호는 제 1 및 제 2 시험 파장에 있는 것으로 가정한다. 단일 지점 측정이 수행될 때 바람직하게는 검정 시약과 헤모글로빈이 반응함에 의해 야기된 간섭 신호가 제 1 및 제 2 시험 파장에서 동일하거나 또는 대략적으로 동일하도록 하는 방식으로 측정 점이 선택될 것이다.
다중점 측정, 예를들어 2중 점 측정(견본 샘플 값 및 분석 값을 측정하는 2종 시약 검정)을 고려할 때, 개별적 시약의 피펫팅(pipetting)된 용적으로부터 희석 인자를 고려하면서, 동일하거나 또는 대략적으로 동일하게 큰 간섭 신호가 측정 시간, 예를들어 제 1 및 제 2 측정 시간에서 수득될수 있도록하는 방식으로 측정 지점이 선택된다. 동력학적 측정이 또한 가능하지만, 바람직하게는 다중 지점 검정은 말단(terminal) 지점으로서 측정된다.
본 발명의 방법에 있어서, 알부민 함량은 염색 반응을 사용하여 광학적으로 측정된다. 바람직하게는 알부민 함량은 브로모크레졸 그린(green) 또는 브로모크레졸 퍼플(purple) 방법을 사용하여 결정될 것이다.
브로모크레졸 그린 방법 및 숙신산염 완충액을 사용하여 알부민을 검정하도록 시험 파장의 3개의 바람직한 시험 파장의 조합을 조사하도록 시험을 수행한다. 바람직한 제 1 실시예에서, 500 내지 600nm, 보다 바람직하게는 560 내지 580nm, 특히 570±5nm 및 특히 570nm의 제 1 시험 파장에서 그리고 540 내지 552nm, 특히 546±5nm 및 특히 약 546nm의 제 2 시험 파장에서 검정을 수행한다.
본 발명의 제 2의 바람직한 실시예에서, 640 내지 680nm, 바람직하게는 660±5nm 및 특히 660nm의 제 1 시험 파장과 470 내지 490nm, 특히 480±5nm 및 특히 약 480nm의 제 2 시험 파장을 사용한다.
본 발명의 제 3의 바람직한 실시예에서, 620 내지 640nm, 바람직하게는 630±5nm 및 특히 630nm의 제 1 시험 파장과 590 내지 610nm, 바람직하게는 600±5nm 및 특히 약 600nm의 제 2 시험 파장을 사용한다.
바람직하게는 시트르산염 완충액을 사용하는 브로모크레졸 그린 방식은 560 내지 580nm, 특히 570±5nm 및 특히 570nm의 제 1 시험 파장과 490 내지 520nm, 특히 505±5nm 및 특히 약 505nm의 제 2 시험 파장을 사용한다.
다른 검정 시약 및/또는 다른 완충액을 사용할 때, 당해업자는 파장의 추가의 적절한 조합을 확인하도록 간단한 검정 수단에 의해, 예를들어 다이어오드 검정 스펙트럼 및 시간 의존성 흡광 측정을 분석함에 의해 검정을 수행할수 있을 것이다.
놀랍게도, 파장의 조합을 사용할 때 헤모글로빈을 포함하는 샘플을 측정할 때, 샘플내의 적어도 실질적으로 오염되지 않은 알부민 농도 값이 수득될것이며, 상기 값은 계산에 의해 더 이상 연속적인 보정을 요구하지 않는다. 본 발명의 방법을 사용하여 100±10% 및 바람직하게는 100±5%의 범위에서 알부민이 회수되며, 특히 알부민 값은 약 3.5g/dl의 낮은 의학적 결정 범위에서 얻어지도록 한다.
본 발명의 방법의 광학적 반응 시간은 반응을 도시한 흡광/시간 좌표로부터 간단한 예비 시험에 의해 조사될수있으며, 일반적으로 범위는 0.2 분 내지 10분이다. 용혈 헤모글로빈을 포함하는 샘플에 대해 숙신산염 완충액에서 브로모크레졸 그린 방법을 사용하여 알부민을 검정함에 있어서, 파장 조합(a)에서 시험할 때, 측정 신호는 1-10분의 측정 시간에 걸쳐 실질적으로 일정하게 유지되어, 이 시간에서 임의의 시간에서 사용될수도 있거나 또는 필요에 따라 계속될수도 있다.
한점 측정은 바람직하게는 3-10분, 특히 5-7분 및 특히 약 6분의 반응 시간후에 파장 조합(a)에 대해 단일 시약을 사용하여 혈액 대체물로서, 가교 결합된 헤모글로빈, 예를들어 디아스피린 가교결합된(DCL) 헤모글로빈을 포함하는 샘플상에서 수행된다. 한편으로는 파장 조합(b)와 관련하여, 바람직하게는 반응 출발후에 1-4분, 바람직하게는 2-3분 및 특히 약 2.5분의 반응시간후에 측정이 수행된다.
혈액 대체물로서 재조합되어 제조된 헤모글로빈을 포함하는 샘플과 관련하여, 단일 시약을 사용하는 단일 지점 측정은 1-3분, 특히 1-2분 및 더 바람직하게는 1.5분의 반응 시간후에 파장 조합(a)을 사용하여 수행하는 것이 바람직하다. 파장 조합(b)과 관련하여, 단일 지점 측정은 바람직하게는 1-4분의 반응 시간후에 취해진다.
브로모크레졸 그린 방법 및 DCL 헤모글로빈을 포함하는 샘플의 시트르산염 완충액을 사용하여 알부민을 측정할 때, 분석 값 검정은 바람직하게는 20 내지 90초후에 특히 30 내지 60초후에 단일 시약을 사용하여 수행되고 2종 시약 검정을 사용할때는 바람직하게는 시약2(출발 시약)을 부가한후 0.2 내지 5분이다.
또한, 시험 파장의 2개의 바람직한 조합은 브로모크레졸 퍼플 방법을 사용하여 알부민을 검정하도록 조사하였고 이들은 실질적으로 샘플내에서 유리 헤모글로빈에 의해 야기된 간섭을 제거한다. 제 1의 바람직한 실시예에서, 560 내지 580nm, 바람직하게는 570±5nm 및 특히 약 570nm의 제 1 시험 파장에서 그리고 490 내지 520, 바람직하게는 505±5nm 및 특히 약 505nm의 제 2 시험 파장에서 검정을 수행한다.
본 발명의 제 2의 바람직한 실시예는 560 내지 580nm, 바람직하게는 570±5nm 및 특히 약 570nm의 제 1 시험 파장과 그리고 490 내지 520, 바람직하게는 505±5nm 및 특히 약 505nm의 제 2 시험 파장을 사용한다.
가교 결합된 헤모글로빈, 예를들어 혈액 대체물로서 DCL 헤모글로빈을 포함하는 샘플과 관련하여, 2종 시약 검정에서 분석값의 측정은 시약2(출발 시약)을 부가한후 바람직하게는 0.2 내지 8분에 걸쳐, 특히 약 5분동안 수행된다. 견본 샘플의 측정은 샘플에 시약1을 부가한후 바람직하게는 1 내지 4분에 걸쳐, 특히 약 2.5분동안 제 1 파장 조합(570/546nm)에서 수행된다. 제 2 파장 조합에서는, 견본 샘플의 측정은 바람직하게는 샘플에 시약 1을 부가한후 바람직하게는 0.2 내지 4분, 특히 0.2 내지 1분 걸쳐, 특히 약 0.5분동안 수행된다.
그러나, 본 발명의 방법의 중요한 특징은 주파장 및 시험 파장의 신규한 조합이다. 또한 다른 종류의 Hb에 대해서 다른 광학 측정 시간에서의 측정이 측정의 정확성을 더 상승시키도록 사용될수도 있다.
이 방식에서, 제 1 시간동안 헤모글로빈의 함량 또는 용혈 정도를 추가로 측정할 필요없이 그리고 헤모글로빈에 의해 영향을 받는 분석 결과에 대해 계속적인 보정 계산을 수행하지 않고서, 1 지점 측정의 형태인 단일 측정 단계에서 알부민의 정확한 함량을 측정하는 것이 가능하다. 본 발명은 또한 단일 시약을 사용하여 정확한 알부민 값을 측정하는 것이 가능한 결정적인 장점을 더 제공한다. 이 특징은 조작 및 가격과 관련된 실질적인 장점을 갖도록 한다.
나아가, 강제적인 것은 아니지만 2 종 시약 검정이 사용될수 있다. 그러나 또한 2 종 시약 검정은 필요에 따라 헤모글로빈에 의해 야기된 이종 알부민 값을 계산하여 연속적으로 보정하여 용혈 정도의 측정을 제거하도록 본 발명의 범위내에서 장점을 제공한다.
통상적으로 혈장 및 혈청 샘플은 헤모글로빈을 포함하는 샘플로서 사용된다. 이와 관련하여 본 발명의 용어 "유리 헤모글로빈"은 용혈 샘플 및 혈액 대체물로서 헤모글로빈과 유사한 화합물을 부가한 샘플에 관한것으로서, 이 화합물로는 예를들어 인간 또는 소의 헤모글로빈의 변형되고 중합된 및/또는 가교결합된 유도체, 예를들어 디아스피린 가교결합된(DCL) 헤모글로빈 또는 또한 제조합되어 제조된 헤모글로빈을 들 수 있다.
나아가, 본 발명의 방법은 자동 분석을 수행하는 것을 더 용이하게 한다. 적절히 자동화된 분석 장치의 실례는 뵈링거 만하임/히타치 717 분석기이다.
본 발명의 예시 및 실례에 의해 다음과 같이 명백히 나타내었다.
도 1 은 가교결합된 헤모글로빈(DCL-Hb)이 있을 때 546/570nm 시험 파장(숙신산염 완충액)의 조합에서 단일 시약을 사용하여 본 발명의 방법으로 알부민을 검정한 시간 의존성 측정 신호의 좌표를 도시한 것이다.
도 2 는 가교결합된 헤모글로빈(DCL-Hb)이 있을 때 700/600nm의 시험 파장(숙신산염 완충액)의 조합에서 단일 시약을 사용하여 당해 기술 분야의 방법으로 알부민을 검정한 시간 의존성 측정 신호의 좌표를 도시한 것이다.
도 3 은 제조합되어 제조된 헤모글로빈이 있을 때 546/570nm의 시험 파장(숙신산염 완충액)의 조합에서 단일 시약을 사용하여 본 발명의 방법으로 알부민을 검정한 시간 의존성 측정 신호의 좌표를 도시한 것이다.
도 4 는 용혈 헤모글로빈이 있을 때 546/570nm의 시험 파장(숙신산염 완충액)의 조합에서 단일 시약을 사용하여 본 발명의 방법으로 알부민을 검정한 시간 의존성 측정 신호의 좌표를 도시한 것이다.
도 5 는 DCL 헤모글로빈이 있을 때 480/660nm의 시험 파장(숙신산염 완충액)의 조합에서 단일 시약을 사용하여 본 발명의 방법으로 알부민을 검정한 시간 의존성 측정 신호의 좌표를 도시한 것이다.
도 6 은 DCL 헤모글로빈이 있을 때 700/600nm의 시험 파장(시트르산염 완충액)의 조합에서 단일 시약을 사용하여 당해 기술 분야의 방법으로 알부민을 검정한 시간 의존성 측정 신호의 좌표를 도시한 것이다.
도 7 은 DCL 헤모글로빈이 있을 때 505/570nm의 시험 파장(시트르산염 완충액)의 조합에서 단일 시약을 사용하여 본 발명의 방법으로 알부민을 검정한 시간 의존성 측정 신호의 좌표를 도시한 것이다.
도 8 은 DCL 헤모글로빈이 있을 때 505/570nm의 시험 파장(시트르산염 완충액)의 조합에서 2종 시약을 사용하여 본 발명의 방법으로 알부민을 검정한 시간 의존성 측정 신호의 좌표를 도시한 것이다.
도 9 는 DCL 헤모글로빈이 있을 때 700/600nm의 시험 파장의 조합에서 2종 시약 검정을 하는 브로코크레졸 퍼플 방법을 사용하여 당해 기술 분야의 방법으로 알부민을 검정한 시간 의존성 측정 신호의 좌표를 도시한 것이다.
도 10 은 DCL 헤모글로빈이 있을 때 505/570nm의 시험 파장의 조합에서 2종 시약 검정을 하는 브로코크레졸 퍼플 방법을 사용하여 본 발명의 방법으로 알부민을 검정한 시간 의존성 측정 신호의 좌표를 도시한 것이다.
도 11 은 DCL 헤모글로빈이 있을 때 2종 시약 검정을 하는 브로코크레졸 퍼플 방법을 사용하여 본 발명의 방법으로 알부민을 검정한 시간 의존성 측정 신호의 좌표를 도시한 것이다.
도 12 는 단일 시약(숙신산염 완충액)을 사용하여 알부민을 검정하기 위한 다이어오드 검정 스팩트럼을 도시한 것이다.
도 13 은 단일 시약(시트르산염 완충액)을 사용하여 알부민을 검정하기 위한 다이어오드 검정 스팩트럼을 도시한 것이다.
실례 1
알부민은 숙신산염 완충액에서 브로모 그린 방법(Doumas등의 Clin. Chim. Acta 31, 1971, 87-96)에 따라 단일 시약을 사용하여 검정된다. 이 시약은 숙신산염 완충액 75mmol/ltr, pH 4.2, 0.15mmol/ltr 브로코크레졸 그린이다.
다음과 같이 검정을 수행하였다.
350㎕시약을 3㎕의 샘플에 부가하였고 시간 의존성 측정 신호(mE)를 측정하였다.
700/600nm의 시험 파장의 조합(종래 기술) 및 546/570nm의 시험 파장 조합(본 발명)을 사용하여 뵈링거 히타치717 분석기로 검정을 실행하였다.
헤모글로빈을 사용하지 않고, 가교 결합된 1000mg/의 헤모글로빈, 및 헤모글로빈(DCL-Hb) 형태의 2000mg/dl의 헤모글로빈을 갖는 샘플에 대한 시간 의존성 측정 신호는 도 1에서는 546/570nm의 시험 파장 조합 및 도 2에서는 700/600nm의 시험 파장 조합에 대해 도시하였다.
546/570nm의 시험 파장 조합과 관련하여, 측정 신호의 강하가 발견되었고 헤모글로빈을 포함하는 샘플에 대해 반응 시간이 증가되어 헤모글로빈으로부터 자유로운 샘플에 대한 측정 신호는 본질적으로 일정하게 유지되는 것으로 관측될 것이다. 측정 신호가 Hb으로부터 자유로운 샘플의 신호와 대응되는 바람직한 반응 시간은 약 5-7분이다. 도 2에서 700/600nm의 시험 파장의 조합을 사용할 때, Hb으로부터 자유로운 샘플로부터의 신호 및 Hb를 포함하는 샘플로부터의 신호 양쪽은 본질적으로 일정하게 유지된다는 것을 알 수 있다.
표 1에는 다른 헤모글로빈 함량을 갖는 샘플에서 알부민 함량의 회수율을 퍼센테이지로 기입하였다. 종래 기술의 700/600nm의 시험 파장의 조합과 관련하여(80초의 반응 시간후에 측정), 이종으로 표시한 검정값은 헤모글로빈 함량 손실로서 나타내었다. 한편으로는, 본 발명의 546/570nm의 시험 파장의 조합과 관련하여(340초의 반응 시간이후의 측정) 그리고 본 발명의 480/660nm의 시험 파장의 조합과 관련하여, 샘플의 헤모글로빈 양과는 독립적으로 100±2%의 회수율이 관측되었다.
도 3에는 546/570nm의 시험 파장의 조합에 대해 Hb이 없는 샘플, 또한 1000 또는 2000mg/dl의 제조합하여 제조된 헤모글로빈을 갖는 샘플에 대해 시간 의존성 측정 신호를 예시하였다. 바람직한 반응 시간은 1-2분이다.
도 4는 Hb가 없는 샘플에 대해 그리고 1000mg/dl이 제공된 샘플에 대해 시간 의존성 측정 신호를 예시하고 있다.
도 5에는 480/660nm의 본 발명의 시험 파장의 조합으로 Hb가 없는 샘플 뿐만아니라 1000mg/dl 또는 2000mg/dl의 Hb를 갖는 샘플에 대한 시간 의존성 측정 신호를 예시하였다. DCL-Hb를 포함하는 샘플로부터의 측정 신호가 Hb으로부터 자유로운 샘플로부터의 신호에 대응되는 바람직한 반응 시간은 약 1-3분이다.
용혈 헤모글로빈 또는 제조합되어 제조된 헤모글로빈을 포함하는 샘플과 관련하여, 또한 간섭의 우수한 제거 효과는 480/660의 본 발명의 시험 파장의 조합을 사용하여 달성될 것이다.
실례 2
시트르산염 완충액(95mmols/l, pH 4.1, 0.11mmoles/l 브로모크레졸 그린, 세정제)에서 브로로크레졸 그린 방법에 따라 단일 시약을 사용하여 검정하였다.
이 검정은 실례 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 700/600nm 및 505/570nm의 시험 파장의 조합(각각 종래기술 및 본 발명)을 사용하여 그리고 반응 출발후에 80초의, 40-60초의 바람직하게는 50초의 측정 시간(종래 기술)을 사용하여 검정을 실행하였다.
700/600nm의 시험 파장의 조합에 있어서, 헤모글로빈이 없는 샘플, DCL 헤모글로빈 형태의 1000mg/dl의 헤모글로빈 및 2000mg/dl의 헤모글로빈을 갖는 샘플에 대한 시간 의존성 측정 신호는 도 6에 도시되어 있으며 도 7에는 505/570nm의 시험 파장에 대해 도시하였다.
이들 도면에서, 본 발명의 505/570nm의 시험 파장의 조합을 사용할 때, 반응 시간이 증가하면서, 측정 신호는 헤모글로빈을 포함하는 샘플에서 감소되어 헤모글로빈이 없는 샘플의 측정 신호가 본질적으로 일정하게 유지되는 것을 알 수 있다. 측정 신호가 Hb으로부터 자유로운 샘플의 신호에 대응하는 바람직한 대응 시간은 약 20-90초이다.
표 2에는 다른 함량의 헤모글로빈을 갖춘 샘플에서 알부민 함량의 퍼센테이지 회수율을 도시하였다. 본 발명의 505/570nm의 시험 파장의 조합과 관련하여(60초의 반응 시간후에 취해진 측정), 샘플의 헤모글로빈 함량에 독립적으로 100±5%의 회수율이 달성되어, 700/600nm의 종래기술의 시험 파장의 조합과 관련하여, 헤모글로빈 함량이 증가되면서 강한 이종의 검정값이 관측되었다.
용혈 헤모글로빈 또는 제조합되어 제조된 헤모글로빈을 포함하는 샘플에서, 또한 우수한 간섭 억제는 본 발명의 시험 파장의 조합을 사용할 때 달성될 것이다.
실례 3
알부민은 2개의 시약 검정을 사용하여 시트르산염 완충액에서 브로모크레졸 그린 방법에 의해 검정하였다. 이 시약은 다음과 같다.
시약 1 : 95 mmole/l 시트르산염 완충액, pH 4.1, 세정제,
시약 2 : 95 mmole/l 시트르산염 완충액, pH 4.1, 0.66 mmole/l 브로모크레졸 그린, 세정제.
검정은 다음과 같이 사용하였다. 250㎕의 시약 1을 3㎕의 샘플에 부가하였고 4.5분 후에, 견본 샘플 값 E1을 측정하였다. 이어서 50㎕의 시약 2를 부가하였고 0.5분후에 분석 측정 값 E2를 취하였다. 또한 전체 시간동안 시간 의존 측정 신호를 기록하였다. 본 발명의 505/507nm의 시험 파장의 조합을 사용하여 뵈링거 히타치 717 분석기를 검정을 수행하였다. 종래 기술의 700/600nm의 시험 파장의 조합에서 실례 2에서 인용된 시약을 사용하였다.
도 8은 본 발명의 505/570nm의 시험 파장의 조합에 대해 헤모글로빈이 없는 샘플, DCL 헤모글로빈 형태의 1000mg/dl의 헤모글로빈 및 2000mg/dl의 헤모글로빈이 있는 샘플에 대한 시간 의존성 측정 신호를 도시하였다.
측정 신호의 감소는 505/570nm의 시험 파장의 조합에서 헤모글로빈을 포함하는 샘플에서 발견된다는 것을 관측할수 있다. 바람직한 측정 시간은 헤모글로빈에 의해 야기된 이종 신호가 동일하게 크게 되도록 하는 방식으로 선택되고, 피펫팅 용적으로 인한 희석 인자를 고려한다. 이에따라 바람직하게는 E1(견본 샘플값)은 시약 1을 샘플에 부가한후 약 4.5분 동안 측정하였고 E2(분석값)는 시약 2를 부가한후 약 0.5분간 측정하였다.
표 3에는 다른 헤모글로빈 함량을 갖는 샘플에서의 알부민 함량의 퍼센테이지 회수율을 도시하였다. 505/570nm의 본발명의 시험 파장의 조합에서 헤모글로빈 함량과 독립적으로 100±2%의 회수율이 달성되며, 700/600nm의 종래 기술의 시험 파장의 조합에서는 강한 이종 측정 값이 관측되었다.
용혈 헤모글로빈 또는 제조합되어 제조된 헤모글로빈을 포함하는 샘플에서, 또한 우수한 간섭 억제는 본 발명의 파장 조합을 사용하여 달성될 수 있다.
실례 4
알부민은 2종 시약 시험 및 2 지점 측정을 사용하여 브로모크레졸 퍼플 방법에 의해 검정하였다. 다음 시약을 사용하였다.
시약 1 : 100mmol/l 아세트산염 완충액, pH 5.3, 세정제,
시약 2 : 100mmol/l 아세트산염 완충액, pH 5.3, 세정제, 526mmol
브로모크레졸 퍼플
검정을 다음과 같이 수행하였다.
250㎕의 시약 1을 3㎕의 샘플에 부가하였고 약 2.5분후에, 견본 샘플값 E1을 측정하였다. 이어서, 150㎕의 시약 2를 부가하였고 약 5분후에, 견본 샘플값 E2을 측정하였다. 나아가 시간 의존성 측정 신호를 모든 시간 동안 측정하였다.
700/600nm의 종래 기술의 시험 파장 조합과 505/570 또는 546/570의 본 발명의 조합을 사용하여 뵈링거 만하임 히타치 717 분석기를 수행하였다.
헤모글로빈이 없는 샘플, DCL 헤모글로빈 형태의 1000mg/dl의 헤모글로빈 및 2000mg/dl의 헤모글로빈을 갖는 샘플에 대해 시간 의존성 측정 신호를 도 9에서의 700/600nm의 시험 파장의 조합, 도 10에서의 505/570nm의 시험 파장의 조합 및 도 11에서의 546/570nm의 시험 파장의 조합에 대해 도시하였다.
700/600nm의 시험 파장의 조합과 관련하여, 헤모글로빈에 의해 야기된 신호 강도의 상승은 시약 2를 부가하기 전보다는 부가한 후가 더 크다는 것을 알 수 있다. 이 특징은 헤모글로빈 자체는 브로모크레졸과 반응하여 침전되고 이 결과에 따라 알부민 검정이 간섭을 받게 된다는 것을 지시한다. 그러나, 헤모글로빈을 포함하는 샘플로부터의 측정 신호 뿐만아니라 헤모글로빈이 없는 샘플로부터의 측정 신호는 시약 2을 부가한 후나 전 모두 거의 일정하게 유지되었다.
한편 헤모글로빈을 포함하는 샘플로부터의 측정 신호의 강하는 505/570nm의 본 발명의 시험 파장의 조합에서 관측될수 있으며 헤모글로빈이 부족한 샘플로부터의 신호는 실질적으로 일정하게 유지되었다. 이에따라 바람직한 반응 시간은 간섭을 벗어나도록 희석 인자를 고려하여, 시약 2를 부가하기 전에 헤모글로빈에 의해 야기된 간섭 신호가 시약 2를 부가한후의 헤모글로빈에 의해 야기된 간섭 신호 만큼 크거나 또는 대략적 동일하도록 하는 방식으로 선택되어야만 한다. 이에따라 실례 4에서의 E1는 시약 1을 샘플에 부가한후 약 2.5분(505/570nm) 또는 0.5분(546/570nm)동안 측정하였고 E2는 시약 2를 부가한후 약 5분 동안 상기 파장의 조합에서 측정하였다.
표 4에서는 다른 알부민 함량을 갖는 샘플내의 알부민 함량의 퍼센테이지 회수율을 도시하고 있다. 본 발명의 505/570nm 및 546/570nm의 시험 파장의 조합과 관련하여, 상기 샘플의 헤모글로빈의 함량과 독립적으로 100±4%의 회수율이 달성되지만, 종래 기술의 경우에는 헤모글로빈 함량이 증가되면서 강한 이종 측정 값은 700/600nm의 시험 파장의 조합을 사용하여 알 수 있다.
또한 우수한 간섭 억제는 본 발명의 시험 파장의 조합을 사용할 때 용혈 헤모글로빈 또는 제조합되어 제조된 헤모글로빈을 포함하는 샘플로 달성하였다.
실례 5
도 12 및 13은 숙신산염 또는 시트르산염 완충액에서 단일 시약을 사용하는 브로모크레졸 그린 방법에 의한 알부민 검정에서 사용되는 다이어오드 어레이의 파장 의존성 스펙트럼등을 도시하고 있다. 샘플1은 0.9%의 NaCl로 제어된다. 샘플 2는 혈청+NaCl이고 샘플 3은 혈청+DCL 헤모글로빈이다. 각 경우에 반응 시간은 90초이다.
도 12는 실례 1에 인용된 546/570 또는 480/660nm의 시험 파장의 조합이외에도 또한 600/630nm의 시험 파장의 조합이 적절하다는 것을 도시하였다.
도표 1
도표 2
도표 3
도표 4
본 발명은 유리(free) 헤모글로빈을 포함하는 샘플 내의 알부민을 분석하기 위하여 광학 측정법을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Claims (29)

  1. 2개 이상의 파장에서 광학 측정을 실행하여 유리 헤모글로빈을 포함하는 샘플내에서 알부민을 검정하기 위한 방법으로서,
    a) 측정할수 있도록 충분히 강한 알부민 측정 신호가 제 1 시험 파장에 제공하도록 하고,
    b) 제 2 시험 파장에 (ⅰ) 알부민 측정 신호가 제공되지 않거나 또는 제 1 파장에 대한 것보다 알부민 측정 신호가 상대적으로 더 작게 제공되고, 그리고
    c) 상기 알부민 검정을 위해 사용되는 검정 시약과 상기 헤모글로빈의 반응에 의해 야기된 상대적으로 강한 간섭 신호가 제 1 및 제 2 시험 파장에서 존재하도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 단일 지점 측정 형태로 상기 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 검정 시약과 상기 헤모글로빈의 반응에 의해 야기된 간섭 신호가 상기 제 1 및 제 2 시험 파장에서 동일하거나 또는 거의 동일하도록 측정 시간이 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 2 지점 또는 다중 지점 측정의 형태로 상기 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 희석 인자를 고려하여, 상기 헤모글로빈에 의해 야기된 간섭 신호가 상기 측정 시간에서 동일하거나 또는 거의 동일하도록 하는 방식으로 측정 시간이 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한항에 있어서, 숙신산염 완충액에서 브로모크레졸 그린 방법을 사용하여 상기 알부민 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, a) 560-580nm의 제 1 시험 파장과 540-552nm의 제 2 시험 파장에서,
    b) 640-680nm의 제 1 시험 파장과 470-490nm의 제 2 시험 파장에서, 또는
    c) 620-640nm의 제 1 시험 파장과 590-610nm의 제 2 시험 파장에서 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, a) 570±5nm의 제 1 시험 파장과 546±5nm의 제 2 시험 파장에서,
    b) 660±5nm의 제 1 시험 파장과 480±5nm의 제 2 시험 파장에서, 또는
    c) 630±5nm의 제 1 시험 파장과 600±5nm의 제 2 시험 파장에서 상기 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, a) 570nm의 제 1 시험 파장과 546nm의 제 2 시험 파장에서,
    b) 660nm의 제 1 시험 파장과 480nm의 제 2 시험 파장에서, 또는
    c) 630nm의 제 1 시험 파장과 600nm의 제 2 시험 파장에서 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한항에 있어서, 상기 알부민 검정이 시트르산염 완충액에서 브로모크레졸 그린 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 560 내지 580nm의 제 1 시험 파장과 490 내지 520nm의 제 2 시험 파장에서 상기 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 570±5nm의 제 1 파장과 505±5nm의 제 2 파장에서 상기 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 570nm의 제 1 시험 파장과 505nm의 제 2 시험 파장에서 상기 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한항에 있어서, 브로모크레졸 퍼플 방법에 의해 상기 알부민 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, (a) 560 내지 580nm의 제 1 시험 파장과 490 내지 520nm의 제 2 시험 파장에서 또는 (b) 560 내지 580nm의 제 1 시험 파장과 540 내지 552nm의 제 2 시험 파장에서 상기 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, (a) 570±5nm의 제 1 시험 파장과 505±5nm의 제 2 시험 파장에서 또는 (b) 570±5nm의 제 1 시험 파장과 546±5nm의 제 2 시험 파장에서 상기 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, (a) 570nm의 제 1 시험 파장과 505nm의 제 2 시험 파장에서 또는 (b) 570nm의 제 1 시험 파장과 546nm의 제 2 시험 파장에서 상기 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항중 어느 한항에 있어서, 0.5 내지 10 분의 반응 시간후에 측정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항중 어느 한항에 있어서, 용혈 헤모글로빈을 포함하는 샘플을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 18 항중 어느 한항에 있어서, 가교결합된 헤모글로빈을 포함하는 샘플을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 18 항중 어느 한항에 있어서, 제조합되어 제조된 헤모글로빈을 포함하는 샘플을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 6 항 내지 제 9 항 및 제 20 항중 어느 한항에 있어서, 5 내지 7분의 반응 시간후에 파장 조합(a)을 사용하거나 또는 2 내지 3분의 반응 시간후에 파장 조합(b)를 사용하여 단일 지점 측정으로 상기 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 6 항 내지 제 9 항 및 제 21 항중 어느 한항에 있어서, 1 내지 2분의 반응 시간후에 파장 조합(a)을 사용하거나 또는 1 내지 3분의 반응 시간후에 파장 조합(b)를 사용하여 단일 지점 측정으로 상기 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 10 항 내지 제 13 항 및 제 19 항 내지 제 21 항중 어느 한항에 있어서, 20 내지 90초의 반응 시간후에 단일 지점 측정으로서 상기 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 10 항 내지 제 13 항 및 제 19 항 내지 제 21 항중 어느 한항에 있어서, 2 지점 측정으로서 2종 시약을 사용하여 상기 검정을 수행하고, 제 2 시약을 부가한후 0.2 내지 5 분에 걸쳐 분석값을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 14 항 내지 제 17 항 및 제 19 항 내지 제 21 항중 어느 한항에 있어서, 2 지점 측정으로서 2종 시약을 사용하여 상기 검정을 수행하고, 제 2 시약을 부가한후 0.2 내지 8 분에 걸쳐 분석값을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항중 어느 한항에 있어서, 상기 검정을 수행한후 시험 결과을 계산하여 보정을 하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항중 어느 한항에 있어서, 혈청 또는 혈장의 샘플상에서 상기 검정을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항중 어느 한항에 있어서, 상기 방법이 자동화된 분석기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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