JPH0635982B2 - 抗原−抗体反応の高感度測定法 - Google Patents
抗原−抗体反応の高感度測定法Info
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- JPH0635982B2 JPH0635982B2 JP62001367A JP136787A JPH0635982B2 JP H0635982 B2 JPH0635982 B2 JP H0635982B2 JP 62001367 A JP62001367 A JP 62001367A JP 136787 A JP136787 A JP 136787A JP H0635982 B2 JPH0635982 B2 JP H0635982B2
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- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 (イ)産業上の利用分野 本発明は，抗原−抗体反応の測定法に関する。さらに詳
しくは，本発明は微細粒径の不溶性担体に抗体（又は抗
原）を担持させ，これに抗原（又は抗体）を反応させ
て，この抗原−抗体複合物に光を照射し，特定の波長に
おける吸光度を測定することにより抗原（又は抗体）を
定量する方法に関する。
しくは，本発明は微細粒径の不溶性担体に抗体（又は抗
原）を担持させ，これに抗原（又は抗体）を反応させ
て，この抗原−抗体複合物に光を照射し，特定の波長に
おける吸光度を測定することにより抗原（又は抗体）を
定量する方法に関する。
(ロ)従来の技術 近年，医療分野においては，病気の診断のために抗原あ
るいは抗体の濃度を定量的に検知することが重要な課題
となってきており，特に通常試料（血液など）中に微量
しか存在しない成分例えば急性相反応物質であるCRP(Re
active proteinc)や腫瘍マーカであるAFP(α-Fetoprote
in)などについて定量的に測定できる高感度定量法の開
発が課題となってきている。
るいは抗体の濃度を定量的に検知することが重要な課題
となってきており，特に通常試料（血液など）中に微量
しか存在しない成分例えば急性相反応物質であるCRP(Re
active proteinc)や腫瘍マーカであるAFP(α-Fetoprote
in)などについて定量的に測定できる高感度定量法の開
発が課題となってきている。
従来，第３図に示すように抗体（又は抗原）を担持させ
たラテックスを溶媒中に分散させ，これと抗原（又は抗
体）を反応させ，第４図に示すように，ラテックスの凝
集反応に伴なう濁度（吸光度）増加を波長600〜2400nm
で測定して，抗原（又は抗体）を定量する方法が特許公
開公報（昭58-11575）に示され，実用化されている。
たラテックスを溶媒中に分散させ，これと抗原（又は抗
体）を反応させ，第４図に示すように，ラテックスの凝
集反応に伴なう濁度（吸光度）増加を波長600〜2400nm
で測定して，抗原（又は抗体）を定量する方法が特許公
開公報（昭58-11575）に示され，実用化されている。
また最近第５図に示すように凝集したラテックス粒子を
含む溶液をシースフロー中で１個１個の凝集塊に分けレ
ーザ光源による光散乱検出法により凝集の度合を解析し
て抗原（又は抗体）を定量する方法が開発されている。
含む溶液をシースフロー中で１個１個の凝集塊に分けレ
ーザ光源による光散乱検出法により凝集の度合を解析し
て抗原（又は抗体）を定量する方法が開発されている。
(ハ)発明が解決しようとする問題点 しかしながら，上記の方法はつぎのような問題点があ
る。
る。
前者では，ラテックス溶液自身の吸光度に比べて，ラ
テックス凝集による吸光度の変化が小さく，測定波長の
選択により吸光度変化を大きくしようとしてもラテック
ス溶液自身の吸光度も大きくなってしまうため，S/Nに
改善にはならず，そのため第２図に示すように，同一の
反応液について，抗原−抗体反応開始後の一定時間後
と，それから一定時間経過後の２点について吸光度の変
化分だけを測定する２点法の採用が必要となり，十分な
反応時間後の吸光度から試薬であるラテックス溶液のみ
の吸光度を差引く，いわゆるエンドポイント法（１点
法）の採用がむつかしく，試薬あるいは試料の分注から
測定まで自動的にコントロールされる自動分析装置が必
要となる。吸光度は粒子の大きさと，数によって決る
ためラテックス凝集の度合と吸光度の変化とは１対１に
対応せず，例えば第６図に示すように抗原の濃度の増加
と共にラテックスの凝集が起っているにもかかわらず，
ある濃度以上では吸光度が減少しはじめるという反転現
象が生ずる場合がある。２点法においてはラテックス
濃度を減少させると凝集スピードが低下し，感度が悪く
なるので高価なラテックス試薬を多量に必要とする。な
どの問題があった。
テックス凝集による吸光度の変化が小さく，測定波長の
選択により吸光度変化を大きくしようとしてもラテック
ス溶液自身の吸光度も大きくなってしまうため，S/Nに
改善にはならず，そのため第２図に示すように，同一の
反応液について，抗原−抗体反応開始後の一定時間後
と，それから一定時間経過後の２点について吸光度の変
化分だけを測定する２点法の採用が必要となり，十分な
反応時間後の吸光度から試薬であるラテックス溶液のみ
の吸光度を差引く，いわゆるエンドポイント法（１点
法）の採用がむつかしく，試薬あるいは試料の分注から
測定まで自動的にコントロールされる自動分析装置が必
要となる。吸光度は粒子の大きさと，数によって決る
ためラテックス凝集の度合と吸光度の変化とは１対１に
対応せず，例えば第６図に示すように抗原の濃度の増加
と共にラテックスの凝集が起っているにもかかわらず，
ある濃度以上では吸光度が減少しはじめるという反転現
象が生ずる場合がある。２点法においてはラテックス
濃度を減少させると凝集スピードが低下し，感度が悪く
なるので高価なラテックス試薬を多量に必要とする。な
どの問題があった。
また後者ではラテックスの凝集と測定結果が１対１に対
応し，またエンドポイント法の採用が可能であり，反応
時間を長くするほど凝集が進み，高感度となり，かつラ
テックス濃度を減少させても感度は変らないなど前者の
欠点が改善されているが，シースフロー構造とすること
が必要でかつ１個の粒子による散乱光を検出するためレ
ーザ光源が必要で，専用装置とならざるを得ないという
問題点があった。
応し，またエンドポイント法の採用が可能であり，反応
時間を長くするほど凝集が進み，高感度となり，かつラ
テックス濃度を減少させても感度は変らないなど前者の
欠点が改善されているが，シースフロー構造とすること
が必要でかつ１個の粒子による散乱光を検出するためレ
ーザ光源が必要で，専用装置とならざるを得ないという
問題点があった。
この発明は，かかる状況に鑑みなされたものであり，波
長λ1，λ2における吸光度Ａλ1，Ａλ2の比Ａλ1／Ａ
λ2をとることにより，高感度で経済的な抗原（又は抗
体）の濃度を測定する方法を提供しようとするものであ
る。
長λ1，λ2における吸光度Ａλ1，Ａλ2の比Ａλ1／Ａ
λ2をとることにより，高感度で経済的な抗原（又は抗
体）の濃度を測定する方法を提供しようとするものであ
る。
(ニ)問題を解決するための手段 かくしてこの発明によれば抗原−抗体複合物を含有する
被検液に光を照射して２つの波長λ1，λ2における吸光
度Ａλ1，Ａλ2の比Ａλ1／Ａλ2を求め，これが被検液
中に懸濁する粒子の平均粒径の函数になることを利用し
て，ラテックス凝集による平均粒径の増加を測定するこ
とにより，抗原（又は抗体）の濃度を求めることを特徴
とする抗原−抗体反応の測定法が提供される。
被検液に光を照射して２つの波長λ1，λ2における吸光
度Ａλ1，Ａλ2の比Ａλ1／Ａλ2を求め，これが被検液
中に懸濁する粒子の平均粒径の函数になることを利用し
て，ラテックス凝集による平均粒径の増加を測定するこ
とにより，抗原（又は抗体）の濃度を求めることを特徴
とする抗原−抗体反応の測定法が提供される。
この方法の最も特徴とする点は，異なる２波長の吸光度
比Ａλ1／Ａλ2が懸濁する粒子の濃度に関係せず，平均
粒径の函数となることであり，測定に利用する２波長の
組合わせを変えることにより，従来の測定法では得られ
なかった高感度でかつ経済的な測定法を提供することが
可能となる。
比Ａλ1／Ａλ2が懸濁する粒子の濃度に関係せず，平均
粒径の函数となることであり，測定に利用する２波長の
組合わせを変えることにより，従来の測定法では得られ
なかった高感度でかつ経済的な測定法を提供することが
可能となる。
２波長の吸光度の比は懸濁液の濃度に関係なく，粒子の
屈折率と，測定波長に対する粒子の相対的な大きさによ
るので，２波長の比をとる方法はラテックス濃度によ
り，あまり影響されないので，エンドポイント法の採用
が可能となる。
屈折率と，測定波長に対する粒子の相対的な大きさによ
るので，２波長の比をとる方法はラテックス濃度によ
り，あまり影響されないので，エンドポイント法の採用
が可能となる。
各種粒径のポリスチレンラテックスについて，数段階の
濃度の懸濁液について，340nm〜1000nmの吸光度を測定
し1000nmの吸光度A1000に対する他の波長の吸光度Aλの
比Aλ／Ａ1000を求めた結果を第１図に示す。第１図のA
λ／Ａ1000の値は数段階の濃度の懸濁液についての平均
値である。各波長での吸光度はラテックス濃度と共に増
加したが，その比Aλ／Ａ1000はほぼ一定であった。
濃度の懸濁液について，340nm〜1000nmの吸光度を測定
し1000nmの吸光度A1000に対する他の波長の吸光度Aλの
比Aλ／Ａ1000を求めた結果を第１図に示す。第１図のA
λ／Ａ1000の値は数段階の濃度の懸濁液についての平均
値である。各波長での吸光度はラテックス濃度と共に増
加したが，その比Aλ／Ａ1000はほぼ一定であった。
第１図の結果より，１例として粒径とA340/A1000,A500/
A1000,A600/A1000との関係を求めた結果を第２図に示
す。第２図より粒径の増加と共にA340/A1000,A500/A
1000,A600/A1000の値が減少し、かつ２波長の差が大き
いほどその変化は大きくなることが判る。すなわち使用
する２波長の差を大きくするほど低濃度の抗原（又は抗
体）に対して高感度な測定ができることが判る。
A1000,A600/A1000との関係を求めた結果を第２図に示
す。第２図より粒径の増加と共にA340/A1000,A500/A
1000,A600/A1000の値が減少し、かつ２波長の差が大き
いほどその変化は大きくなることが判る。すなわち使用
する２波長の差を大きくするほど低濃度の抗原（又は抗
体）に対して高感度な測定ができることが判る。
従来の１波長での吸光度の変化を測定する方法の場合高
感度にするためには，ラテックス濃度を増加させるか，
測定に使用するセルの光路長を大きくする必要がある
が，このような方法により，高感度化をはかろうと思う
と測定のベースとなる試薬自身の吸光度が大きくなり，
通常の分光光度計の測定可能な吸光度範囲を越えてしま
うことになる。特に感度のよい短波長側ではこの傾向が
強いため，高感度化と矛盾することになる。また第７図
に示すように抗原（又は抗体）の濃度が大きくなってラ
テックスが凝集して平均粒径が大きくなって数が減ると
短波長側では逆に吸光度が減少するという現象が起る。
この現象は１波長での吸光度が，波長λとある抗原（又
は抗体）濃度Ｃにおける粒子の平均粒径dcの比dc/λの
函数ｆ(dc/λ）と光路中の粒子数Ncの積として Aλc＝Nc・ｆ(dc/λ） で表わされ，ｆ(dc/λ）は初めdc/λが大きくなるにつ
れて大きくなるが，ある値以上では逆に減少しはじめる
というMieの光散乱の理論を用いて説明できる。
感度にするためには，ラテックス濃度を増加させるか，
測定に使用するセルの光路長を大きくする必要がある
が，このような方法により，高感度化をはかろうと思う
と測定のベースとなる試薬自身の吸光度が大きくなり，
通常の分光光度計の測定可能な吸光度範囲を越えてしま
うことになる。特に感度のよい短波長側ではこの傾向が
強いため，高感度化と矛盾することになる。また第７図
に示すように抗原（又は抗体）の濃度が大きくなってラ
テックスが凝集して平均粒径が大きくなって数が減ると
短波長側では逆に吸光度が減少するという現象が起る。
この現象は１波長での吸光度が，波長λとある抗原（又
は抗体）濃度Ｃにおける粒子の平均粒径dcの比dc/λの
函数ｆ(dc/λ）と光路中の粒子数Ncの積として Aλc＝Nc・ｆ(dc/λ） で表わされ，ｆ(dc/λ）は初めdc/λが大きくなるにつ
れて大きくなるが，ある値以上では逆に減少しはじめる
というMieの光散乱の理論を用いて説明できる。
一方抗原（又は抗体）の濃度Ｃにおける異なって２つの
波長λ1，λ2での吸光度Ａλ1，Ａλ2の比は となり，光路中の粒子数Ncと関係なく，２つの波長
λ1，λ2と平均粒径dcによって決ることになる。このこ
とはラテックス濃度を薄くしたり，セルの光路長を短か
くしたりしてもラテックス凝集反応が同じように起った
場合には，Ａλ1C／Ａλ2Cの値の変化のしかたは変らな
いことを意味し，ラテックス濃度を薄くしたり，セルの
光路長を短かくしたりして各々の吸光度Ａλ1C，Ａλ2C
を小さくして通常の分光光度計の吸光度測定可能範囲内
に入れて，選択する２つの波長の差を大きくすることに
より，Ａλ1C／Ａλ2Cの変化率を大きくして高感度化を
はかることが可能なことを示す。
波長λ1，λ2での吸光度Ａλ1，Ａλ2の比は となり，光路中の粒子数Ncと関係なく，２つの波長
λ1，λ2と平均粒径dcによって決ることになる。このこ
とはラテックス濃度を薄くしたり，セルの光路長を短か
くしたりしてもラテックス凝集反応が同じように起った
場合には，Ａλ1C／Ａλ2Cの値の変化のしかたは変らな
いことを意味し，ラテックス濃度を薄くしたり，セルの
光路長を短かくしたりして各々の吸光度Ａλ1C，Ａλ2C
を小さくして通常の分光光度計の吸光度測定可能範囲内
に入れて，選択する２つの波長の差を大きくすることに
より，Ａλ1C／Ａλ2Cの変化率を大きくして高感度化を
はかることが可能なことを示す。
(ホ)作用 この発明によれば，抗体（又は抗原）を担持したラテッ
クス試薬と血清などの試料を反応させて，試料中の抗原
（又は抗体）の濃度を測定するラテックス凝集反応によ
る抗原−抗体反応測定法において，２つの波長λ1，λ2
における吸光度Ａλ1，Ａλ2の比Ａλ1／Ａλ2を測定す
る方法を採用し，使用ラテックスの粒を小さくし，かつ
ラテックス濃度を薄くしたり，セレの光路長を短かくし
たりして，測定に用いる２つの波長の差を大きくするこ
とにより，高感度な測定が可能になる。
クス試薬と血清などの試料を反応させて，試料中の抗原
（又は抗体）の濃度を測定するラテックス凝集反応によ
る抗原−抗体反応測定法において，２つの波長λ1，λ2
における吸光度Ａλ1，Ａλ2の比Ａλ1／Ａλ2を測定す
る方法を採用し，使用ラテックスの粒を小さくし，かつ
ラテックス濃度を薄くしたり，セレの光路長を短かくし
たりして，測定に用いる２つの波長の差を大きくするこ
とにより，高感度な測定が可能になる。
また，吸光度比をとることにより，ラテックス濃度を薄
くしても感度低下がなく，反応時間を十分長くすること
により，むしろより高感度になるので，高価なラテック
ス試薬を節約できるという効果もある。
くしても感度低下がなく，反応時間を十分長くすること
により，むしろより高感度になるので，高価なラテック
ス試薬を節約できるという効果もある。
以下実施例によりこの発明を詳細に説明するがこれによ
り，この発明が限定されるものではない。
り，この発明が限定されるものではない。
(ヘ)実施例 第１表はCRP抗体を粒径約0.2μｍのラテックスに担持し
た試薬について，その濃度を変えてCRP濃度既知の血清
と37℃で30分および90分反応させた時点での吸光度
A340,A500,A600,A1000と吸光度比A340/A1000,A500/A
1000,A600/A1000を示す。
た試薬について，その濃度を変えてCRP濃度既知の血清
と37℃で30分および90分反応させた時点での吸光度
A340,A500,A600,A1000と吸光度比A340/A1000,A500/A
1000,A600/A1000を示す。
第１表の結果よりCRP濃度と従来の１波長の吸光度測定
法に相当するAλの関係を，ラテックス希釈比1/2の場合
について第８図に示す。短波長側では吸光度が大きくな
りすぎて，測定不能となると同時に，第７図に示したよ
うな現象が生じていることが判る。
法に相当するAλの関係を，ラテックス希釈比1/2の場合
について第８図に示す。短波長側では吸光度が大きくな
りすぎて，測定不能となると同時に，第７図に示したよ
うな現象が生じていることが判る。
また第１表の結果より，ラテックス希釈比を変えた場合
のCRP濃度と600nmにおける吸光度A600の関係を第９図に
示す。１波長の吸光度により抗原（又は抗体）の濃度を
測定する方法の場合，ラテックス濃度を薄くすると感度
が低下することが 判る。
のCRP濃度と600nmにおける吸光度A600の関係を第９図に
示す。１波長の吸光度により抗原（又は抗体）の濃度を
測定する方法の場合，ラテックス濃度を薄くすると感度
が低下することが 判る。
つぎに２つの波長λ1，λ2における吸光度Ａλ1，Ａλ2
の比Ａλ1／Ａλ2により抗原（又は抗体）の濃度を測定
する方法の場合の波長λ1，λ2の選択について考える。
の比Ａλ1／Ａλ2により抗原（又は抗体）の濃度を測定
する方法の場合の波長λ1，λ2の選択について考える。
第１表の結果より，ラテックス希釈比1/4の場合のCRP濃
度とA340/A1000,A500/A1000,A600/A1000の関係を第10図
に示す。２つの波長の差が大きいほど高感度となること
が判る。
度とA340/A1000,A500/A1000,A600/A1000の関係を第10図
に示す。２つの波長の差が大きいほど高感度となること
が判る。
以上の結果より本発明がラテックス凝集反応を高感度に
的確にとらえることができる簡便でかつ経済的な方法で
あることが判る。
的確にとらえることができる簡便でかつ経済的な方法で
あることが判る。
(ト)発明の効果 本発明により専用の自動吸光度変化測定装置やシースフ
ローとレーザ光散乱を用いた特殊な装置を用いなくと
も，汎用の分光光度計により，ラテックス凝集を利用し
た抗原−抗体反応における抗原（又は抗体）の濃度を高
感度で精度よく測定することが可能となる。
ローとレーザ光散乱を用いた特殊な装置を用いなくと
も，汎用の分光光度計により，ラテックス凝集を利用し
た抗原−抗体反応における抗原（又は抗体）の濃度を高
感度で精度よく測定することが可能となる。
さらに本発明により感度の低下をきたすことなく，従来
の高価なラテックス試薬を希釈して使用することが可能
となるので，試薬代を節約できる。
の高価なラテックス試薬を希釈して使用することが可能
となるので，試薬代を節約できる。
第１図は各種粒径のラテックス溶液の波長1000nmの吸光
度に対する他の波長での吸光度の比Aλ／Ａ1000を示す
図，第２図はラテックス粒径とA340/A1000,A500/A1000,
A600/A1000の関係を示す図，第３図はラテックス凝集を
利用した抗原−抗体反応を示す図であり，第４図は吸光
度測定による従来のラテックス凝集反応を利用した抗原
−抗体反応の測定法，第５図はシースフローとレーザ光
散乱光法による従来のラテックス凝集反応を利用した抗
原−抗体反応の測定法，第６図は抗原濃度と吸光度ある
いは凝集ラテックスの平均粒径の関係の１例を示す図，
第７図，第８図，第９図はラテックス凝集反応を利用し
てCRP濃度を測定する場合のCRP濃度と各波長での吸光度
の関係を示す図，第10図はCRP濃度と２波長の吸光度比
の関係を示す図である。
度に対する他の波長での吸光度の比Aλ／Ａ1000を示す
図，第２図はラテックス粒径とA340/A1000,A500/A1000,
A600/A1000の関係を示す図，第３図はラテックス凝集を
利用した抗原−抗体反応を示す図であり，第４図は吸光
度測定による従来のラテックス凝集反応を利用した抗原
−抗体反応の測定法，第５図はシースフローとレーザ光
散乱光法による従来のラテックス凝集反応を利用した抗
原−抗体反応の測定法，第６図は抗原濃度と吸光度ある
いは凝集ラテックスの平均粒径の関係の１例を示す図，
第７図，第８図，第９図はラテックス凝集反応を利用し
てCRP濃度を測定する場合のCRP濃度と各波長での吸光度
の関係を示す図，第10図はCRP濃度と２波長の吸光度比
の関係を示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】微細粒径の不溶性担体に抗体又は抗原を支
持したものを溶媒中に分散させ、これと抗原又は抗体を
反応させて生成する抗原−抗体複合物に光を照射し２つ
の波長λ１，λ２における吸光度Ａλ１，Ａλ２の比Ａ
λ１／Ａλ２を測定し、その値より抗原又は抗体の濃度
を測定する方法において、測定に用いる２つの波長（λ
１，λ２）の差を大きくしてＡλ１／Ａλ２の値を大き
く変化させることを特徴とする抗原−抗体反応の高感度
測定法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62001367A JPH0635982B2 (ja) | 1987-01-07 | 1987-01-07 | 抗原−抗体反応の高感度測定法 |
| US07/124,997 US5093271A (en) | 1986-11-28 | 1987-11-24 | Method for the quantitative determination of antigens and antibodies by ratio of absorbances at different wavelengths |
| DE87402674T DE3787706T2 (de) | 1986-11-28 | 1987-11-26 | Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Antigene und Antikörper. |
| EP87402674A EP0269526B1 (en) | 1986-11-28 | 1987-11-26 | Method of quantitative determination of antigens and antibodies |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62001367A JPH0635982B2 (ja) | 1987-01-07 | 1987-01-07 | 抗原−抗体反応の高感度測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63169564A JPS63169564A (ja) | 1988-07-13 |
| JPH0635982B2 true JPH0635982B2 (ja) | 1994-05-11 |
Family
ID=11499525
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62001367A Expired - Fee Related JPH0635982B2 (ja) | 1986-11-28 | 1987-01-07 | 抗原−抗体反応の高感度測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0635982B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL330221A1 (en) * | 1996-05-31 | 1999-05-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method of eliminating disturbances caused by haemoglobing during determination of albumin |
-
1987
- 1987-01-07 JP JP62001367A patent/JPH0635982B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63169564A (ja) | 1988-07-13 |
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