JPS63169564A - 抗原−抗体反応の高感度測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ）産業上の利用分野 本発明は、抗原−抗体反応の測定法に関する。さらに詳
しくは１本発明は微細粒径の不溶性担体に抗体（又は抗
原）を担持させ、これに抗原（又は抗体）を反応させて
、この抗原−抗体複合物に光を照射し、特定の波長にお
ける吸光度を測定することにより抗原（又は抗体）を定
量する方法に関する。

（ロ）従来の技術 近年、医療分野においては、病気の診断のために抗原あ
るいは抗体の濃度全定量的に検知すること゛が重要な課
題となってきており、特に通常試料（血液など）中に微
量しか存在しない成分例えば息性相反応物質であるＣＲ
Ｐ　（Ｒｅａｃｔ　１ｖｅｐｒｏｔｅｉｎ（）や腫瘍マ
ーカであるＡＦＰ　（α−Ｆｅｔ。

ｐｒｏｔｅｉｎ　　）などについて定量的に測定できる
高感度定量法の開発が課題となってきている。

従来、第３図に示すように抗体（又は抗原）を担持させ
たラテックスを溶媒中に分散させ、これと抗原（又は抗
体）を反応させ、第４図に示すように、ラテックスの凝
集反応に伴なう濁度（ｇ＆光度）増ｍ’を波長６００〜
２４００ｒ１ｍで測定して、抗原（又は抗体）を定量す
る方法が特許公開公報（昭５８−１１５７５）に示され
、実用化されている。

また最近第５図に示すように凝集し几ラテックス粒子を
含む溶液をシースフロー中で１個１個の凝集塊に分はレ
ーザ光源による光散乱検出法により凝集の度合を解析し
て抗原（又は抗体）１一定量する方法が開発されている
。

ｅｌ　　発明が解決しようとする問題点しかしながら、
上記の方法はつぎのような問題点がある。

前者では、■ラテックス溶液自身の吸光度に比べて、′
ｙテックス凝集による吸光度の変化が小さく９ｍ定波長
の選択によりｇ＆光度変化を大きくしようとしてもラテ
ックス溶液自身の吸光度も大きくなってしまうため、　
Ｓ／Ｎの改善にはならず、そのため第２図に示すように
、同一の反応液について、抗原−抗体反応開始後の一定
時間後と、それから一定時間経過後の２点について吸光
度の変化分だけを測定する２点法の採用が必要となり、
十分な反応時間後の吸光度から試薬であるラテックス溶
液のみの吸光度を差引く、いわゆるエンドポイント法（
１点法）の採用がむつかしく、試薬あるいは試料の分注
から測定まで自動的にコントロールされる自動分析装置
が必要となる。■吸光度は粒子の大きさと、′ｔ＆によ
って決るためラテックス凝集の度合と吸光度の変化とは
１対１に対応せず９例えば第６図に示すように抗原の濃
度の増加と共にラテックスの凝集が起っているにもかか
わらず、ある濃度以上では吸光度が減少しはじめるとい
う反転現象が生ずる場合がある。■２点法においてはラ
テックス濃度を減少させると凝集スピードが低下し、感
度が悪くなるので高価なラテックス試薬を多量に必要と
する。などの問題があったＯ ま友後者ではラテックスの凝集と測定結果が１対１に対
応し、またエンドポイント法の採用が可能であり９反応
時間を長くするほど凝集が進み。

高感度となり、かつラテックス濃度を減少させても感度
は変らないなど前者の欠点が改善されているが、シース
フロー構造とすることが必要でかつ１個の粒子による散
乱光を検出するためレーザ光源が必要で、専用装置とな
らざるを得ないという問題点があった。

この発明は、かかる状況に鑑みなされ次ものであり、波
長λ１、λ２における吸光度Ａλ１．Ａλ２の比Ａλ＋
／Ａλ２全とることにより、高感度で経済的な抗原（又
は抗体）の濃度を測定する方法を提供しようとするもの
である。

に）問題を解決するための手段 かくしてこの発明によれば抗原−抗体複合物を含有する
被検液に光を照射して２つの波長λ１゜λ２における吸
光度Ａλ１．Ａλ２の比Ａλｌ／Ａλ２を求め。

これが被検液中に懸濁する粒子の平均粒径の函数になる
こと全利用して、ラテックス凝集による平均粒径の増加
を測定することにより、抗原（又は抗体）の濃度全訳め
ることを特徴とする抗原−抗体反応の測定法が提供され
る。

この方法の最も特徴とする点は、異なる２波長の吸光度
比Ａλ１／Ａλ２が懸濁する粒子の濃度に関係せず、平
均粒径の函数となることであり、測定に利用する２波長
の組合わせを変えることにより。

従来の測定法では得られなかった高感度でかつ経済的な
測定法を提供することが可能となる。

２波長の吸光度の比は懸濁液の濃度に関係なく。

粒子の屈折率と、測定波長に対する粒子の相対的な大き
さによるので、２波長の比をとる方法はラテックス濃度
により、あまり影響されないので。

エンドポイント法の採用が可能となる。

各種粒径のポリスチレンラテックスについて。

数段階の濃度の懸濁液について＊　３４０ｎｍ〜１１０
００ｎの吸光度を測定し１１０００ｎの吸光度Ａ　１０
００に対する他の波長の吸光度Ａλの比ＡｖＡ１００Ｏ
’ｒ：求めた結果を第１図に示す。第１図のＡ２／　Ａ
ｔｏｏｏの値は数段階の濃度の懸濁液についての平均値
である。各波長での吸光度はラテックス濃度と共に増加
したが、その比Ａ、ｊ／Ａｓｏｏｏはほぼ一定であった
。

第１図の結果より、１例として粒径とＡ３４０／Ａ１０
０Ｏ。

Ａｓｏｏ／Ａｔｏｏｏ・Ａ６ｏｉＡｔｏｏｏとの関係全
訳めた結果を第２図に示す、第２図より粒径の増加と共
にＡ３４Ｑ／Ａ１００Ｏ。

Ａｓｏｏ／Ａｔｏｏｏ、　／’＋６０ｏ／Ａ１０００の
値が減少し、かつ２波長の差が大きいほどその変化は大
きくなることが判る。

すなわち使用する２波長の差を大きくするほど低濃度の
抗原（又は抗体）に対して高感度な測定ができることが
判る。

従来の１波長での吸光度の変化全測定する方法の場合高
感度にするためには、ラテックス濃度ケ増加させるか、
測定に使用するセルの光路長音大きくする必要があるが
、このような方法により。

高感度化金はかろうと思うと測定のベースとなる試薬自
身の吸光度が大きくなり２通常の分光光度計の測定可能
な吸光度範囲を越えてしまうことになる。特に感度のよ
い短波長側ではこの傾向が強いため、高感度化と矛盾す
ることになる。また第７図に示すように抗原（又は抗体
うの濃度が大きくなってラテックスが凝集して平均粒径
が大きくなって数が減ると短波長側では逆に吸光度が減
少するという現象が起る。この現象に１波長での吸光度
が、波長λとある抗原（又は抗体）濃度Ｃにおける粒子
の平均粒径ｄｃの比”ｌｘの函数ｆ（６η）と光路中の
粒子数Ｎｃの積として Ａλ（＝　Ｎｃ−Ｅ　（”／２　） で表わされ、ｆ（ｄＣ−／Ａ）は初め４ガが大きくなる
につれて大きくなるが、ある値以上では逆に減少しはじ
めるというＭｉｅの光散乱の理論を用いて説明できる。

一方抗原（又は抗体）の濃度Ｃにおける異な−コて２つ
の波長λ１、λ２での吸光度ＡλＩＣ，Ａλ２ｃの比は
となり、光路中の粒子数Ｎｃと関係なく、２つの波長λ
１、λ２と平均粒径ｄ。Ｋよって決ることになる。

このことはラテックス濃度を薄くし九り、セ、ルの光路
長を短かくしたりしてもラテックス凝集反応が同じよう
に起った場合には、ＡλＩ　Ｃ／Ａλ２ｏの値の変化の
しかたは変らないこと全意味し、ラテックス濃度を薄く
したり、セルの光路長？短か＜　Ｌｌｔりして各々の吸
光度Ａ２１ｃ　＋　Ａλ２Ｃｋ小さくして通常の分光光
度計の吸光度測定可能範囲内に入れて。

選択する２つの波長の差を大きくすることにより。

ＡλＩＣ／Ａλ２ｃの変化率を大きくして高感度化をは
かることが可能なことを示す。

（ホ）作　用 この発明によれば、抗体（又は抗原）を担持したラテッ
クス試薬と血清などの試料を反応させて、試料中の抗原
（又は抗体）の濃度全測定するラテックス凝集反応によ
る抗原−抗体反応測定法において、２つの波長λ１．λ
２における吸光度Ａλｌ＋Ａλ２の比Ａλｔ／Ａλ２全
測定する方法を採用し。

使用ラテックスの粒を小さくシ、かつラテックス濃度？
薄くしたり、七しの光路長を短かくしたジして、測定に
用いる２つの波長の差を大きくすることにより、高感度
な測定が可能になる〜マ友、吸光度比をとることにより
、ラテックス濃度を薄くしても感度低下がなく１反応時
間を十分長くすることにより、むしろより高感度になる
ので、高価なラテックス試薬を節約できるという効果も
ある。

以下実施例によりこの発明の詳細な説明するがこれにエ
フ、この発明が限定されるものではない。

（へ）実施例 第１表はＣＲＰ抗体を粒径約０２μｍのラテックスに担
持した試薬について、その濃度を変えてＣＲＰ濃度既知
の血清と３７℃で３０分および９０分反応させた時点で
の吸光度Ａ３４０　＋　Ａ３００　＋　Ａ６０Ｑ　＋　
Ａ１００Ｏと吸光度比Ａ３４Ｑ／Ａ１００Ｏ＋　Ａｓｏ
ｏ／Ａｔｏｏｏ　＋　Ａ６００／Ａ１００Ｏを示す０第
１表の結果よｔ）ＣＲＰ濃度と従来の１波長の吸光度測
定法に相当するＡλの関係金、ラテックス希釈比りの場
合について第８図に示す。短波長側では吸光度が大きく
なりすぎて、測定不能となると同時に、第７図に示した
ような現象が生じていることが判る。

普だ第１表の結果より、ラテックス希釈比を変えた場合
のＣＲＰ濃度と６００　ｎｍにおける吸光度Ａ　６００
の関係を第９図に示す。１波長の吸光度により抗原（又
は抗体）の濃度を測定する方法の場合、′ＩＰテックス
濃［！−薄くすると感度が低下することが判る。

つき゛に２つの波長λ１．λ２における吸光度Ａλｌ。

Ａλ２■比Ａλ１／Ａλ２によジ抗原（又は抗体）の濃
度をθ１ｊ定する方法の場合の波長λ１、λ２の選択に
ついて考える。

第１表の結果よジ、ラテックス希釈比にの場合のＣＲＰ
濃度とＡ３４０／Ａ１００Ｏ・Ａ３ｏ／Ａｘｏｏｏ・Ａ
６００　／Ａ１００Ｏの関係金弟１０図に示す。２つの
波長の差が大きいほど高感度となることが判る。

以上の結果より本発明がラテックス凝集反応金高感度に
的確にとらえることができる簡便でかつ経済的な方法で
あることが判る。

（ト）発明の効果 本発明により専用の自動吸光度変化測定装置やシースフ
ローとレーザ光散乱を用いた特殊な装置音用いなくとも
、汎用の分光光度針により。

ラテックス凝集全利用した抗原−抗体反応における抗原
（又は抗体ンの濃度を高感度で精度よく測定することが
可能となる。

さらに本発明により感度の低下？きたすことなぐ、従来
の高価なラテックス試薬を希釈して使用することが可能
となるので、試薬代金節約できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は各種粒径のラテックス溶液の波長１１０００ｎ
の吸光度に対する他の波長での吸光度の比−１０００を
示す図、第２図はラテックス粒径とＡ３４ｏ／Ａｘｏｏ
ｏ　。 Ａ３００／Ａ１００Ｏ＋　Ａ３ｏ／Ａｘｏｏｏ　１７）
関係全示す図、第３図はラテックス凝集を利用し之抗原
−抗体筐応全示す図でらり、第４図は吸光１度測定によ
る従来のラテックス凝集反応を利用し定抗原−抗体反応
の澗定法、第５図はシースフローとレーザ光散乱光法に
よる従来のラテックス凝集反応を利用し之抗原−抗体反
応の測定法、第６図は抗原濃度と吸光度あるいは凝集ラ
テックスの平均粒径の関係の１例を示す図、第７図、第
８図、第９図はラテックス凝集反応全利用してＣＲＰ濃
度全測定する場合のＣＲＰ濃度と各波長での吸光度の関
係を示″ｒ図、第１０因はＣＲＰ濃度と２波長の吸光ご
比の関係？示す図である。 特許出願人　株式会社　島　津　製作所、−、ｔ＋−、
、：ｑ代理人弁理士　武石端彦己１？：５ 茅１　区 牛２凹 坑厚濠戻 Ａ入 Ｃ’＋２３４　　　５　６　７　　８　　　’？　　　
１０（ＪＰ　（，７／＃） 第１０図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微細粒径の不溶性担体に抗体（又は抗原）を支持し
   たものを溶媒中に分散させ、これと抗原（又は抗体）を
   反応させて生成する抗原−抗体複合物に光を照射し２つ
   の波長λ＿１、λ＿２における吸光度Ａλ＿１／Ａλ＿
   ２の比Ａλ＿１／Ａλ＿２を測定し、その値の変化の度
   合により抗原（又は抗体）の濃度を測定する方法におい
   て、測定に用いる２つの波長（λ＿１、λ＿２）の差を
   大きくすることによりＡλ＿１／Ａλ＿２の変化率を大
   きくすることを特徴とする抗原−抗体反応の高感度測定
   法。 ２、使用するセルの光路長を短かくするか、あるいは担
   体の濃度を下げることにより短波長の吸光度の測定がで
   きるようにし、測定に用いる２つの波長（λ＿１、λ＿
   ２）の差を大きくすることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の抗原−抗体反応の高感度測定法。