JPH0635981B2 - 抗原−抗体反応の高感度測定法 - Google Patents
抗原−抗体反応の高感度測定法Info
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- JPH0635981B2 JPH0635981B2 JP62001366A JP136687A JPH0635981B2 JP H0635981 B2 JPH0635981 B2 JP H0635981B2 JP 62001366 A JP62001366 A JP 62001366A JP 136687 A JP136687 A JP 136687A JP H0635981 B2 JPH0635981 B2 JP H0635981B2
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- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 (イ)産業上の利用分野 本発明は，抗原−抗体反応の測定法に関する。さらに詳
しくは，本発明は微細粒径の不溶性担体に抗体（又は抗
原）を担持させ，これに抗原（又は抗体）を反応させ
て，この抗原−抗体複合物に光を照射し特定の波長にお
ける吸光度を測定することにより抗原（又は抗体）を定
量する方法に関する。
しくは，本発明は微細粒径の不溶性担体に抗体（又は抗
原）を担持させ，これに抗原（又は抗体）を反応させ
て，この抗原−抗体複合物に光を照射し特定の波長にお
ける吸光度を測定することにより抗原（又は抗体）を定
量する方法に関する。
(ロ)従来の技術 近年，医療分野においては，病気の診断のために抗原あ
るいは抗体の濃度を定量的に検知することが重要な課題
となってきており，特に通常試料（血液など）中に微量
しか存在しない成分，例えば急性相反応物質であるCRP
(Reactiveprotein)や腫瘍マーカであるAFP(α-Fetoprot
ein)などについて定量的に測定できる高感度定量法の開
発が課題となってきている。
るいは抗体の濃度を定量的に検知することが重要な課題
となってきており，特に通常試料（血液など）中に微量
しか存在しない成分，例えば急性相反応物質であるCRP
(Reactiveprotein)や腫瘍マーカであるAFP(α-Fetoprot
ein)などについて定量的に測定できる高感度定量法の開
発が課題となってきている。
従来，第３図に示すように抗体（又は抗原）を担持させ
たラテックスを溶媒中に分散させ，これと抗原（又は抗
体）を反応させ，第４図に示すように，ラテックスの凝
集反応に伴なう濁度（吸光度）増加を波長600〜2400nm
で測定して抗原（又は抗体）を定量する方法が特許公開
公報（昭58-11575）に示され，実用化されている。
たラテックスを溶媒中に分散させ，これと抗原（又は抗
体）を反応させ，第４図に示すように，ラテックスの凝
集反応に伴なう濁度（吸光度）増加を波長600〜2400nm
で測定して抗原（又は抗体）を定量する方法が特許公開
公報（昭58-11575）に示され，実用化されている。
また最近第５図に示すように凝集したラテックス粒子を
含む溶液をシースフロー中で１個１個の凝集塊に分けレ
ーザ光源による光散乱検出法により凝集の度合を解析し
て抗原（又は抗体）を定量する方法が開発されている。
含む溶液をシースフロー中で１個１個の凝集塊に分けレ
ーザ光源による光散乱検出法により凝集の度合を解析し
て抗原（又は抗体）を定量する方法が開発されている。
(ハ)発明が解決しようとする問題点 しかしながら，上記の方法はつぎのような問題点があ
る。前者では，ラテックス溶液自身の吸光度に比べ
て，ラテックス凝集による吸光度の変化が小さく，測定
波長の選択により吸光度変化を大きくしようとしてもラ
テックス溶液自身の吸光度も大きくなってしまうためS/
Nに改善にはならず，そのため第２図に示すように，同
一の反応液について，抗原−抗体反応開始後の一定時間
後と，それから一定時間経過後の２点について，吸光度
の変化分だけを測定する２点法の採用が必要となり，十
分な反応時間後の吸光度から試薬であるラテックス溶液
のみの吸光度を差引く，いわゆるエンドポイント法（１
点法）の採用がむつかしく，試薬あるいは試料の分注か
ら測定まで自動的にコントロールされる自動分析装置が
必要となる。吸光度は粒子の大きさと数によって決る
ためラテックス凝集の度合と吸光度の変化とは１対１に
対応せず，例えば第６図に示すように抗原の濃度の増加
と共にラテックスの凝集が起っているにもかかわらず，
ある濃度以上では吸光度が減少しはじめるという反転現
象が生ずる場合がある。２点法においてはラテックス
濃度を減少させると凝集スピードが低下し，感度が悪く
なるので高価なラテックス試薬を多量に必要とする。な
どの問題があった。
る。前者では，ラテックス溶液自身の吸光度に比べ
て，ラテックス凝集による吸光度の変化が小さく，測定
波長の選択により吸光度変化を大きくしようとしてもラ
テックス溶液自身の吸光度も大きくなってしまうためS/
Nに改善にはならず，そのため第２図に示すように，同
一の反応液について，抗原−抗体反応開始後の一定時間
後と，それから一定時間経過後の２点について，吸光度
の変化分だけを測定する２点法の採用が必要となり，十
分な反応時間後の吸光度から試薬であるラテックス溶液
のみの吸光度を差引く，いわゆるエンドポイント法（１
点法）の採用がむつかしく，試薬あるいは試料の分注か
ら測定まで自動的にコントロールされる自動分析装置が
必要となる。吸光度は粒子の大きさと数によって決る
ためラテックス凝集の度合と吸光度の変化とは１対１に
対応せず，例えば第６図に示すように抗原の濃度の増加
と共にラテックスの凝集が起っているにもかかわらず，
ある濃度以上では吸光度が減少しはじめるという反転現
象が生ずる場合がある。２点法においてはラテックス
濃度を減少させると凝集スピードが低下し，感度が悪く
なるので高価なラテックス試薬を多量に必要とする。な
どの問題があった。
また後者ではラテックスの凝集と測定結果が１対１に対
応し，またエンドポイント法の採用が可能であり反応時
間を長くするなど凝集が進み，高感度となり，かるラテ
ックス濃度を減少させても感度は変らないなど前者の欠
点が改善されているが，シースフロー構造とすることが
必要で，かつ１個の粒子による散乱光を検出するためレ
ーザ光源が必要で，専用装置とならざるを得ないという
問題点があった。
応し，またエンドポイント法の採用が可能であり反応時
間を長くするなど凝集が進み，高感度となり，かるラテ
ックス濃度を減少させても感度は変らないなど前者の欠
点が改善されているが，シースフロー構造とすることが
必要で，かつ１個の粒子による散乱光を検出するためレ
ーザ光源が必要で，専用装置とならざるを得ないという
問題点があった。
この発明は，かかる状況に鑑みなされたものであり，波
長λ1，λ2における吸光度Ａλ1，Ａλ2の比Ａλ1／Ａ
λ2をとることにより，高感度で経済的な抗原（又は抗
体）の濃度を測定する方法を提供しようとするものであ
る。
長λ1，λ2における吸光度Ａλ1，Ａλ2の比Ａλ1／Ａ
λ2をとることにより，高感度で経済的な抗原（又は抗
体）の濃度を測定する方法を提供しようとするものであ
る。
(ニ)問題を解決するための手段 かくしてこの発明によれば抗原−抗体複合物を含有する
被検液に光を照射して２つの波長λ1，λ2における吸光
度Ａλ1，Ａλ2の比Ａλ1／Ａλ2を求め，これが被検液
中に懸濁する粒子の平均粒径の函数になることを利用し
てラテックス凝集による平均粒径の増加を測定すること
により，抗原（又は抗体）の濃度を求めることを特徴と
する抗原−抗体反応の測定法が提供される。
被検液に光を照射して２つの波長λ1，λ2における吸光
度Ａλ1，Ａλ2の比Ａλ1／Ａλ2を求め，これが被検液
中に懸濁する粒子の平均粒径の函数になることを利用し
てラテックス凝集による平均粒径の増加を測定すること
により，抗原（又は抗体）の濃度を求めることを特徴と
する抗原−抗体反応の測定法が提供される。
この方法の最も特徴とする点は，異なる２波長の吸光度
比Ａλ1／Ａλ2が懸濁する粒子の濃度に関係せず，平均
粒径の函数となることであり，これにより，使用する抗
体（又は抗原）を担持したラテックスの粒径や濃度を変
えることにより，従来の測定法では得られなかった高感
度でかつ経済的な測定法を提供することが可能となる。
比Ａλ1／Ａλ2が懸濁する粒子の濃度に関係せず，平均
粒径の函数となることであり，これにより，使用する抗
体（又は抗原）を担持したラテックスの粒径や濃度を変
えることにより，従来の測定法では得られなかった高感
度でかつ経済的な測定法を提供することが可能となる。
２波長の吸光度の比は懸濁液の濃度に関係なく，粒子の
屈折率と，測定波長に対する粒子の相対的な大きさによ
るので，２波長の比をとる方法はラテックス濃度によ
り，あまり影響されないので，エンドポイント法の採用
が可能となる。
屈折率と，測定波長に対する粒子の相対的な大きさによ
るので，２波長の比をとる方法はラテックス濃度によ
り，あまり影響されないので，エンドポイント法の採用
が可能となる。
各種粒径のポリスチレンラテックスについて数段階の濃
度の懸濁液について，340nm〜1000nmの吸光度を測定し1
000nmの吸光度A1000に対する他の波長の吸光度Aλの比A
λ／Ａ1000を求めた結果を第１図に示す。第１図のAλ
／Ａ1000の値は数段階の濃度の懸濁液についての平均値
である。各波長での吸光度はラテックス濃度と共に増加
したがその比Aλ／Ａ1000はほぼ一定であった。
度の懸濁液について，340nm〜1000nmの吸光度を測定し1
000nmの吸光度A1000に対する他の波長の吸光度Aλの比A
λ／Ａ1000を求めた結果を第１図に示す。第１図のAλ
／Ａ1000の値は数段階の濃度の懸濁液についての平均値
である。各波長での吸光度はラテックス濃度と共に増加
したがその比Aλ／Ａ1000はほぼ一定であった。
第１図の結果より，抗体（又は抗原）を担持するラテッ
クスの粒径を小さくしておく方が，ラテックスが凝集し
て平均粒径が大きくなったときのAλ／Ａ1000の値の変
化が大きくなることが判る。すなわち使用するラテック
スの粒径を小さくしておく方が低濃度の抗原（又は抗
体）に対して高感度な測定ができ，かつ変化を測定でき
る粒径の範囲が広くなるので測定できる抗原（又は抗
体）の濃度範囲も広くなることが判る。
クスの粒径を小さくしておく方が，ラテックスが凝集し
て平均粒径が大きくなったときのAλ／Ａ1000の値の変
化が大きくなることが判る。すなわち使用するラテック
スの粒径を小さくしておく方が低濃度の抗原（又は抗
体）に対して高感度な測定ができ，かつ変化を測定でき
る粒径の範囲が広くなるので測定できる抗原（又は抗
体）の濃度範囲も広くなることが判る。
また第１図の結果より，１例として粒径とA340/A1000,A
500/A1000,A600/A1000との関係を求めた結果を第２図に
示す。第２図より粒径の増加と共にA340/A1000,A500/A
1000,A600/A1000の値が減少することが判る。すなわ
ち、粒径を小さくしておく方が高感度に測定できること
になる。
500/A1000,A600/A1000との関係を求めた結果を第２図に
示す。第２図より粒径の増加と共にA340/A1000,A500/A
1000,A600/A1000の値が減少することが判る。すなわ
ち、粒径を小さくしておく方が高感度に測定できること
になる。
また，抗体（又は抗原）を担持したラテックスの濃度を
薄くすると，同一の抗原（又は抗体）濃度に対する抗原
−抗体反応によるラテックスの凝集のスピードは遅くな
るが，時間をかけて飽和状態まで凝集させた場合，凝集
していないラテックスの数が減るため，平均粒径は見か
け上大きくなる。すなわち，低濃度の抗原（又は抗体）
を測定する場合のＡλ1C／Ａλ2Cの値の抗原（又は抗
体）濃度Ｃに対する変化率は，ラテックスの濃度を薄く
した方が大きくなり，高感度になることになる。
薄くすると，同一の抗原（又は抗体）濃度に対する抗原
−抗体反応によるラテックスの凝集のスピードは遅くな
るが，時間をかけて飽和状態まで凝集させた場合，凝集
していないラテックスの数が減るため，平均粒径は見か
け上大きくなる。すなわち，低濃度の抗原（又は抗体）
を測定する場合のＡλ1C／Ａλ2Cの値の抗原（又は抗
体）濃度Ｃに対する変化率は，ラテックスの濃度を薄く
した方が大きくなり，高感度になることになる。
(ホ)作用 この発明によれば，抗体（又は抗原）を担持したラテッ
クス試薬と血清などの試料を反応させて，試料中の抗原
（又は抗体）の濃度を測定するラテックス凝集反応によ
る抗原−抗体反応測定法において，２つの波長λ1，λ2
における吸光度Ａλ1，Ａλ2の比Ａλ1／Ａλ2を測定す
る方法を採用し，使用ラテックスの粒を小さくし，かつ
ラテックス濃度を薄くしたり，することにより，高感度
な測定が可能になる。
クス試薬と血清などの試料を反応させて，試料中の抗原
（又は抗体）の濃度を測定するラテックス凝集反応によ
る抗原−抗体反応測定法において，２つの波長λ1，λ2
における吸光度Ａλ1，Ａλ2の比Ａλ1／Ａλ2を測定す
る方法を採用し，使用ラテックスの粒を小さくし，かつ
ラテックス濃度を薄くしたり，することにより，高感度
な測定が可能になる。
また，吸光度比をとることにより，ラテックス濃度を薄
くしても感度低下がなく，反応時間を十分長くすること
により，むしろより高感度になるので，高価なラテック
ス試薬を節約できるという効果もある。
くしても感度低下がなく，反応時間を十分長くすること
により，むしろより高感度になるので，高価なラテック
ス試薬を節約できるという効果もある。
以下実施例によりこの発明を詳細に説明するがこれによ
り，この発明が限定されるものではない。
り，この発明が限定されるものではない。
(ヘ)実施例 第１表はCRP抗体を粒径約0.2μｍのラテックスに担持し
た試薬について，その濃度を変えてCRP濃度既知の血清
と37℃で30分および90分反 応させた時点での吸光度A340,A500,A600,A1000と吸光度
比A340/A1000,A500/A1000,A600/A1000を示す。
た試薬について，その濃度を変えてCRP濃度既知の血清
と37℃で30分および90分反 応させた時点での吸光度A340,A500,A600,A1000と吸光度
比A340/A1000,A500/A1000,A600/A1000を示す。
第１表の結果よりCRP濃度と従来の１波長の吸光度測定
法に相当するAλの関係をラテックス希釈比1/2の場合に
ついて第７図に示す。短波長側では吸光度が大きくなり
すぎて，測定不能となる。
法に相当するAλの関係をラテックス希釈比1/2の場合に
ついて第７図に示す。短波長側では吸光度が大きくなり
すぎて，測定不能となる。
また，第１表の結果よりラテックス希釈比を変えた場合
のCRP濃度と600nmにおける吸光度A600の関係を第８図に
示す。１波長の吸光度により抗原（又は抗体）の濃度を
測定する方法の場合，ラテックス濃度を薄くすると感度
が低下することが判る。
のCRP濃度と600nmにおける吸光度A600の関係を第８図に
示す。１波長の吸光度により抗原（又は抗体）の濃度を
測定する方法の場合，ラテックス濃度を薄くすると感度
が低下することが判る。
次に第１表の結果よりCRP濃度とA500/A1000の関係にお
けるラテックス希釈比の影響を第９図に示す。ラテック
スを希釈して用いた場合CRP濃度が高いところでは凝集
が飽和するため感度は低下するが，CRP濃度が低いとこ
ろではむしろ高感度となることが判る。これは第10図に
示すようにラテックス濃度が低いほど，平均粒径の変化
が大きくなるためである。第10図における平均粒径は第
１表のA600/A1000の値と第２図を用いて計算したもので
ある。
けるラテックス希釈比の影響を第９図に示す。ラテック
スを希釈して用いた場合CRP濃度が高いところでは凝集
が飽和するため感度は低下するが，CRP濃度が低いとこ
ろではむしろ高感度となることが判る。これは第10図に
示すようにラテックス濃度が低いほど，平均粒径の変化
が大きくなるためである。第10図における平均粒径は第
１表のA600/A1000の値と第２図を用いて計算したもので
ある。
以上の結果より，本発明がラテックス凝集反応を高感度
に的確にとらえることができる簡便でかつ経済的な方法
であることが判る。
に的確にとらえることができる簡便でかつ経済的な方法
であることが判る。
(ト)発明の効果 本発明により専用の自動吸光度変化測定装置やシースフ
ローとレーザ光散乱を用いた特殊な装置を用いなくと
も，汎用の分光光度計により，ラテックス凝集を利用し
た抗原−抗体反応における抗原（又は抗体）の濃度を高
感度で精度よく測定することが可能となる。
ローとレーザ光散乱を用いた特殊な装置を用いなくと
も，汎用の分光光度計により，ラテックス凝集を利用し
た抗原−抗体反応における抗原（又は抗体）の濃度を高
感度で精度よく測定することが可能となる。
さらに本発明により感度の低下をきたすことなく，従来
の高価なラテックス試薬を希釈して使用することが可能
となるので，試薬代を節約できる。
の高価なラテックス試薬を希釈して使用することが可能
となるので，試薬代を節約できる。
第１図は，各種粒径のラテックス溶液の波長1000nmの吸
光度に対する他の波長での吸光度の比Aλ／A1000を示す
図，第２図はラテックス粒径とA340/A1000,A500/A1000,
A600/A1000の関係を示す図，第３図はラテックス凝集を
利用した抗原−抗体反応を示す図であり，第４図は吸光
度測定による従来のラテックス凝集反応を利用した抗原
−抗体反応の測定法，第５図はシースフローとレーザ光
散乱光法による従来のラテックス凝集反応を利用した抗
原−抗体反応の測定法，第６図は抗原濃度と吸光度ある
いは凝集ラテックスの平均粒径の関係の１例を示す図，
第７図，第８図はラテックス凝集反応を利用してCRP濃
度を測定する場合のCRP濃度と各波長での吸光度の関係
を示す図，第９図はCRP濃度と２波長の吸光度比の関係
を示す図，第10図はCRP濃度と平均粒径の関係を示す図
である。
光度に対する他の波長での吸光度の比Aλ／A1000を示す
図，第２図はラテックス粒径とA340/A1000,A500/A1000,
A600/A1000の関係を示す図，第３図はラテックス凝集を
利用した抗原−抗体反応を示す図であり，第４図は吸光
度測定による従来のラテックス凝集反応を利用した抗原
−抗体反応の測定法，第５図はシースフローとレーザ光
散乱光法による従来のラテックス凝集反応を利用した抗
原−抗体反応の測定法，第６図は抗原濃度と吸光度ある
いは凝集ラテックスの平均粒径の関係の１例を示す図，
第７図，第８図はラテックス凝集反応を利用してCRP濃
度を測定する場合のCRP濃度と各波長での吸光度の関係
を示す図，第９図はCRP濃度と２波長の吸光度比の関係
を示す図，第10図はCRP濃度と平均粒径の関係を示す図
である。
Claims (1)
- 【請求項１】微細粒径の不溶性担体に抗体又は抗原を支
持したものを溶媒中に分散させ、これと抗原又は抗体を
反応させて生成する抗原−抗体複合物に光を照射し２つ
の波長λ１，λ２における吸光度Ａλ１，Ａλ２の比Ａ
λ１／Ａλ２を測定し、その値より抗原又は抗体の濃度
を測定する方法において、前記担体の粒径を小さくした
り、あるいは抗体の濃度を下げ反応時間を長くしてＡλ
１／Ａλ２の値を大きく変化させることを特徴とする抗
原−抗体反応の高感度測定法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62001366A JPH0635981B2 (ja) | 1987-01-07 | 1987-01-07 | 抗原−抗体反応の高感度測定法 |
| US07/124,997 US5093271A (en) | 1986-11-28 | 1987-11-24 | Method for the quantitative determination of antigens and antibodies by ratio of absorbances at different wavelengths |
| DE87402674T DE3787706T2 (de) | 1986-11-28 | 1987-11-26 | Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Antigene und Antikörper. |
| EP87402674A EP0269526B1 (en) | 1986-11-28 | 1987-11-26 | Method of quantitative determination of antigens and antibodies |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62001366A JPH0635981B2 (ja) | 1987-01-07 | 1987-01-07 | 抗原−抗体反応の高感度測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63169563A JPS63169563A (ja) | 1988-07-13 |
| JPH0635981B2 true JPH0635981B2 (ja) | 1994-05-11 |
Family
ID=11499497
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62001366A Expired - Fee Related JPH0635981B2 (ja) | 1986-11-28 | 1987-01-07 | 抗原−抗体反応の高感度測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0635981B2 (ja) |
-
1987
- 1987-01-07 JP JP62001366A patent/JPH0635981B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63169563A (ja) | 1988-07-13 |
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