JP2000512381A - アルブミン測定の際のヘモグロビン妨害の排除方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも２つの波長を用いる光学的測定により遊離ヘモグロビンを含有するサンプル中のアルブミンをアッセイする方法であって、（ａ）第１試験波長において、十分強いアルブミン測定シグナルが存在すること、（ｂ）第２試験波長については、(i)アルブミン測定シグナルが全く存在しないか、もしくは(ii)該第１試験波長における測定シグナルよりも実質的に小さいアルブミン測定シグナルが存在すること、および（ｃ）該第１試験波長および該第２試験波長において同程度に強い妨害シグナルが存在し、該妨害シグナルが、時間依存性であり、かつヘモグロビンとアルブミンのアッセイに用いられるアッセイ試薬との反応により生じているものであることを特徴とする上記方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 アルブミン測定の際のヘモグロビン妨害の排除方法 説明 本発明は、光学的測定を用いて、遊離ヘモグロビンを含有するサンプル中のア ルブミンをアッセイするための方法である。 血清および血漿中のアルブミンのアッセイ（例えば、ブロモクレゾールグリー ン法を用いるアッセイ）が、ヘモグロビン（Hb）またはヘモグロビンに類似する 化合物によって、示されるアルブミン含有率が擬似的(spuriously)に上昇すると いう妨害を受けることは周知である。この原因は、ヘモグロビンと色素との反応 であり、このためHbはアルブミンとして定量的に測定される［Doumasら、Clin． Chim．Acta．31，87-96(1971)］。 欧州特許明細書0,268,025 B1では、従来の二点測定(a 2-point measurement) によるアルブミンアッセイにおいてHbの妨害を除くことは不可能であることが指 摘されている。しかし、その明細書では、溶血の程度と測定誤差との関係から補 正率を決定し、（溶血程度を別に測定した後で）該率を用いて計算により所与の サンプルの擬似の(spurious)アルブミンの結果を補正することが提案されている 。 JayおよびProvasek（Clin．Chem．39/9，1804-1810，1993）は、彼らの実験室 において、検出可能な溶血サンプルの各々について、該サンプルのHb含有量を個 別に測定し、コンピュータープログラムを用いて、計算により、アナライト測定 の（擬似の）結果を補正することを記載している。次いで、その補正の大きさが 分析結果に提示される。 アルブミンに対するHbの妨害を補正するためのもう１つのアプローチは、ドイ ツ公開公報4,427,491 A1号に記載されている。そこでは、単独で行われる溶血程 度の測定が省かれている。その理由は、溶血程度が主反応に先立つ反応から誘導 できるからである。いわゆるレート_フ゜ラス法（rate_plus method）を用いた場合、 主反応から得た試験結果は、溶血程度と妨害との確認された関係を用いて計算に より補正される。 アルブミンアッセイにおいてHbの妨害を排除する従来記載の手法は、一般に、 分析結果をHb含有量に相当する量により数学的に補正することを必要とする。そ こにおいて、このHb含有量または溶血程度は、別個の測定［例えば、多波長分析 (multi-wavelength analysis)または単独の手法によるもの］または予備反応の いずれかにより確認され、常に二試薬アッセイ（a two-reagent assay）を必要 とする。 しかし、現在では、アルブミンは、単一の試薬を用いて一点測定（a one-poin t measurement）としてアッセイされることが多く、サンプルと試薬（例えば、B oehringer Mannheim GmbH製のアルブミン試薬）とを混合することによリ呈色反 応が開始される。操作の容易性に加えて、そのようなアッセイにはまた、低コス トという利点がある。しかし、Hbの妨害を排除することは複雑である。すなわち 、単一の試薬と単独のHb含有量測定、または二試薬アッセイと単独のHb含有量測 定の回避のいずれかを必要とする。いずれの場合も、得られた分析結果はその後 で計算により補正しなければならない。 さらに、ヘモグロビンを含有する血清または血漿のサンプルを試験する場合、 主反応（アルブミンと試験試薬）は、妨害反応（ヘモグロビンと試験試薬）、お よび該妨害反応により生じるヘモグロビン吸収シグナルの減少に上乗せされる。 最後に、該主反応および該妨害反応の双方から得た吸収スペクトルを、特定のア ルブミンアッセイ試薬の関数として区別する。 今回、驚くべきことに、主反応の試験結果に対する妨害反応の影響が、試験波 長の組合わせならびに反応時間に依存することがわかった。 したがって、アルブミンをアッセイする際にヘモグロビンの妨害を排除するこ とは非常に複雑である。何故ならば、擬似のシグナルは、簡単な二色測定により 、または単にダミーのサンプルの値を測定することにより排除しうる典型的な妨 害シグナルではないからである。どちらかといえば、妨害物質、すなわち天然の 、架橋した、重合した、もしくは組換えにより調製されたヘモグロビンが試薬と 直接反応するのである。したがって、この妨害反応が主反応のプロパー(proper) と決定的に区別できる試験波長を探さなければならない。 この問題は、試験波長（すなわち、二色アッセイの主たる試験波長と第２の 試験波長）の組合せを変更することにより解決してきた。今回、驚くべきことに 、波長の組合せを変更すると、サンプル中の遊離ヘモグロビンにより生じるアッ セイの誤差を実質的に低減できることがわかった（図１、３、４、５、７、８、 10および11を参照）。そのような波長の組合せ（通常はアッセイ試薬の吸収極大 点以外である）において、ヘモグロビン含有サンプルから得られる測定シグナル は経時的に変化するが、遊離ヘモグロビンを実質的に含有しないサンプルから得 られる測定シグナルは本質的に一定である。 しかし、そのような影響は、アルブミンのアッセイにおいて従来用いられてき た波長の組合せ（すなわち、600nmの主波長と700nmの副波長）では観察されない 。そのような場合、ヘモグロビン含有サンプルでは大きなアッセイ誤差が見られ るであろう（図２、６および９）。 したがって、本発明の１つの目的は、少なくとも２つの波長において光学的に 測定することにより、遊離ヘモグロビンを含有するサンプル中のアルブミンをア ッセイするための方法であって、 （ａ）該アッセイにとって十分に強いアルブミンの測定シグナルが第１試 験波長に存在すること、 （ｂ）第２試験波長では、(i)アルブミンの測定シグナルが全く存在しな いか、もしくは(ii)該第１試験波長においてよりも比較的小さなアルブミンの測 定シグナルが存在すること、および、 （ｃ）ヘモグロビンとアルブミンアッセイに用いられるアッセイ試薬との 反応により生じる比較的大きな経時的妨害シグナルが該第１試験波長および第２ 試験波長に存在すること を特徴とする前記方法である。 本発明の方法は試験波長の組合せを用いるものであり、そこにおいて第１試験 波長は、測定にとって十分に高いアルブミン測定シグナルを生じる。第１試験波 長は用いるアッセイ試薬の吸収極大点である必要はなく、好ましくは該吸収極大 点以外であることに留意されたい。第２試験波長は、第１試験波長の測定シグナ ルよりも実質的に小さなアルブミン測定シグナルを示す。好ましくは、第１試験 波長の測定シグナルは、第２試験波長の測定シグナルよりも少なくとも20mE、 さらに好ましくは少なくとも50mE高いものである。 さらに、該第１および該第２試験波長には比較的等しい妨害シグナルが存在す ると予想される。単一点測定（a single-point measurement）を行う場合、好ま しくは測定点は、アッセイ試薬と反応しているヘモグロビンにより生じる妨害シ グナルが、該第１および該第２の試験波長において等しくまたはほぼ等しく大き なものになるように選定すべきである。 多重点測定法(a multi-point measurement)、例えば二点測定（ダミーサンプ ルの値およびアナライトの値を測定する二試薬アッセイ）に関しては、測定点は 、好ましくは、個々の試薬のピペッティング容積からの希釈ファクターを考慮に 入れて、測定時点（例えば、第１および第２の測定時点）において等しくまたは ほぼ等しく大きな妨害シグナルが得られるようにして選定される。好ましくは、 該多重点アッセイは、速度論的測定（kinetic measurements）が可能であるとし ても、末端測定（a terminal measurement）として行う。 本発明の方法では、アルブミン含有量は、色素反応を用いて光学的に測定され る。好ましくは、アルブミン含有量は、ブロモクレゾールグリーン法またはブロ モクレゾールパープル法を用いて測定される。 これまでに行われた実験から、ブロモクレゾールグリーン法およびコハク酸緩 衝液を用いるアルブミンアッセイにとって好ましい３つの試験波長の組合せを確 認することができた。第１の好ましい実施態様において、該アッセイは、500〜6 00nm、さらに好ましくは560〜580nm、特に570±５nm、とりわけ約570nmの第１試 験波長、ならびに540〜552nm、特に546±５nm、とりわけ約546nmの第２試験波長 にて行われる。 本発明の第２の好ましい実施態様において、640〜680nm、好ましくは660±５n m、特に約660nmの第１試験波長、ならびに470〜490nm、好ましくは480±５nm、 特に約480nmの第２試験波長が用いられる。 本発明の第３の好ましい実施態様において、620〜640nm、好ましくは630±５n m、特に630nmの第１試験波長が用いられ、590〜610nm、好ましくは600nm±５nm 、特に約600nmの第２試験波長が用いられる。 好ましくは、クエン酸緩衝液を用いるブロモクレゾールグリーン法では、560 〜580nm、特に570±５nm、とりわけ約570nmの第１試験波長、ならびに490nm〜52 0nm、特に505±５nm、とりわけ約505nmの第２試験波長が用いられる。 他のアッセイ試薬および／または他の緩衝液を用いる場合、専門家であれば、 簡単なアッセイ、例えばダイオード−アレイ・スペクトル分析および経時的吸収 測定により、さらに適切な波長の組合せを特定することができるであろう。 驚くべきことに、上記のような波長の組合せを用いてヘモグロビン含有サンプ ルを測定した場合、該サンプル中のアルブミン濃度の少なくとも実質的に不純物 を含まない値が得られ、そのような値は、もはや後で計算により補正する必要が ない。本発明の方法は、特に約3.5g/dlという低い医療上の判定範囲（lower med ical decision range）にあるアルブミン値では、100±10％、好ましくは100± ５％の範囲のアルブミンの回収率を可能にする。 本発明の方法の最適反応時間は、簡単な予備試験により、反応を示す吸収／時 間プロットから確認できる。通常、それは0.2〜10分の範囲内である。コハク酸 緩衝液中でのブロモクレゾールグリーン法を用いて溶血性ヘモグロビンを含有す るサンプルについて行われるアルブミンのアッセイに関しては、（ａ）の組合せ の波長で試験した場合、測定シグナルは１〜10分間の測定時間にわたって実質的 に一定のままであり、このため、測定は、この範囲内の任意の時間において、も しくは必要に応じてこの範囲の時間の経過後に行うことが可能であることがわか った。 架橋ヘモグロビン［例えば、ジアスピリン架橋(DCL)ヘモグロビン］を代用血 液として含有するサンプルについては、波長の組合せ（ａ）のための単一の試薬 を用いて、好ましくは３〜10分、特に５〜７分、とりわけ約６分の反応時間の後 で一点測定が行われる。一方、波長の組合せ（ｂ）については、測定は、好まし くは、反応開始後１〜４分、好ましくは２〜３分、特に約2.5分の反応時間の後 で行われる。 組換えにより調製されたヘモグロビンを代用血液として含有するサンプルにつ いては、波長の組合せ（ａ）を用いて、好ましくは１〜３分、特に１〜２分、と りわけ約1.5分の反応時間の後で、単一試薬を用いる一点測定法が行われる。（ ｂ）の波長の組合せについては、一点測定法は、好ましくは１〜４分の反応時 間の後で行われる。 ブロモクレゾールグリーン法およびクエン酸緩衝液を用いてDCLヘモグロビン を含有するサンプルのアルブミンを測定する場合、アナライト値のアッセイは、 単一試薬を用いて、好ましくは20〜90秒後、特に30〜90秒後に行われ、二試薬ア ッセイを用いる場合には、好ましくは試薬２（開始試薬）添加の0.2〜５分後に 行われる。 この場合も、ブロモクレゾールパープル法を用いてアルブミンをアッセイする ための２つの好ましい試験波長の組合せを確認したが、それらは、サンプル中の 遊離ヘモグロビンにより引き起こされる妨害を実質的に排除した。第１の好まし い実施態様において、該アッセイは、560〜580nm、好ましくは570±５nm、特に 約570nmの第１試験波長、および490〜520nm、好ましくは505±５nm、特に約505n mの第２試験波長にて行われる。 本発明の第２の好ましい実施態様では、560〜580nm、好ましくは570±５nm、 特に約570nmの第１試験波長、および540〜552nm、好ましくは546±５nm、特に約 546nmの第２試験波長が用いられる。 架橋ヘモグロビン（例えば、DCLヘモグロビン）を代用血液として含有するサ ンプルについては、二試薬アッセイでのアナライト値の測定は、好ましくは試薬 ２（開始試薬）を添加した後0.2〜８分、特に約５分にわたって行う。ダミーサ ンプルの測定は、波長の第１の組合せ（570/546nm）において、該サンプルに試 薬１を添加した後１〜４分、特に約2.5分にわたって行う。波長の第２の組合せ において、ダミーサンプルの測定を、好ましくは該サンプルに試薬１を添加した 後0.2〜４分、特に0.2〜１分、とりわけ約0.5分にわたって行う。 しかし、本発明の方法の重要な特徴は、主波長と試験波長との新規な組合せで ある。さらに異なる種類のHbについて異なる最適測定時間における測定を用いて 、測定の精度をさらに高めることが可能である。 このようにして、ヘモグロビン含有量または溶血程度をさらに測定する必要な しに、そして、続いてヘモグロビンにより影響を受けた分析結果を補正するのた めの計算を行う必要なしに、アルブミンの正確な含有量を単一の測定工程で（す なわち、一点測定の形態で）測定することが初めて可能になる。本発明は、 単一の試薬を用いて正確なアルブミン値を測定することも可能である、というさ らに決定的な利点を提供する。この特徴は、操作性および費用に関する実質的な 利点を可能にする。 さらに、強制するものではないが、２試薬アッセイが使用可能である。しかし 、２試薬アッセイはまた、所望により、溶血程度の測定、ならびに後続するヘモ グロビンにより生じる擬似のアルブミン値の計算による補正を行う必要がない、 という本発明の範囲内の利点を提供する。 通常、ヘモグロビン含有サンプルとして血清または血漿のサンプルが用いられ る。これについて注意すべきことは、本発明の文脈における「遊離ヘモグロビン 」なる用語は、溶血性サンプル、ならびに代替血液としてヘモグロビンに類似す る化合物［例えば、ジアスピリン−架橋(DCL)ヘモグロビンのようなヒトまたは ウシヘモグロビンの修飾、重合、および／または架橋誘導体、または組換えによ って調製されたヘモグロビン］が添加されているサンプルの双方を意味する。 さらに、本発明の方法は、好ましくは、自動化分析法により行われる。好適な 自動化分析装置の一例はBoehringer Mannheim/Hitachi 717アナライザーである 。 図面および実施例により、本発明を以下に説明する。 図１は、架橋ヘモグロビン（DCL-Hb）の存在下、546／570nmの組合せの試験波 長（コハク酸緩衝液）にて単一試薬を用いた本発明によるアルブミンのアッセイ における経時的測定シグナルのプロットである。 図２は、架橋ヘモグロビン（DCL-Hb）の存在下、700/600nmの組合せの試験波 長（コハク酸緩衝液）にて単一試薬を用いた従来技術によるアルブミンのアッセ イにおける経時的測定シグナルのプロットである。 図３は、組換えにより調製したヘモグロビンの存在下、546／570nmの組合せの 試験波長（コハク酸緩衝液）にて単一試薬を用いた本発明によるアルブミンのア ッセイにおける経時的測定シグナルのプロットである。 図４は、溶血性ヘモグロビンの存在下、546／570nmの組合せの試験波長（コハ ク酸緩衝液）にて単一試薬を用いた本発明によるアルブミンのアッセイにおける 経時的測定シグナルのプロットである。 図５は、DCLヘモグロビンの存在下、480/660nmの組合せの試験波長（コハク酸 緩衝液）にて単一試薬を用いた本発明によるアルブミンのアッセイにおける経時 的測定シグナルのプロットである。 図６は、DCLヘモグロビンの存在下、700/600nmの組合せの試験波長（クエン酸 緩衝液）にて単一試薬を用いた従来技術によるアルブミンのアッセイにおける経 時的測定シグナルのプロットである。 図７は、DCLヘモグロビンの存在下、505/570nmの組合せの試験波長（クエン酸 緩衝液）にて単一試薬を用いた本発明によるアルブミンのアッセイにおける経時 的測定シグナルのプロットである。 図８は、DCLヘモグロビンの存在下、505／570nmの組合せの試験波長（クエン 酸緩衝液）にて二試薬アッセイを用いた本発明によるアルブミンのアッセイにお ける経時的測定シグナルのプロットである。 図９は、DCLヘモグロビンの存在下、700/600nmの組合せの試験波長にて二試薬 アッセイを行うブロモクレゾールパープル法を用いた従来技術によるアルブミン のアッセイにおける経時的測定シグナルのプロットである。 図10は、DCLヘモグロビンの存在下、505/570nmの組合せの試験波長にて二試薬 アッセイを行うブロモクレゾールパープル法を用いた本発明によるアルブミンの アッセイにおける経時的測定シグナルのプロットである。 図11は、DCLヘモグロビンの存在下、二試薬アッセイを行うブロモクレゾール パープル法を用いた本発明によるアルブミンのアッセイにおける経時的測定シグ ナルのプロットである。 図12は、単一試薬（コハク酸緩衝液）を用いたアルブミンのアッセイについて のダイオードアレイ・スペクトルを示すものである。 図13は、単一試薬（クエン酸緩衝液）を用いたアルブミンのアッセイについて のダイオードアレイ・スペクトルを示すものである。 実施例１ 単一試薬を用いて、コハク酸緩衝液中でのブロモクレゾールグリーン法（Doum asら、Clin．Chim．Acta．31，1971，87-96）にしたがってアルブミンを アッセイした。試薬は： コハク酸緩衝液75ミリモル／リットル、pH4.2;0.15ミリモル ／リットルのブロモクレゾールグリーン であった。 アッセイは以下のようにして行った。 350μｌの試薬を３μｌのサンプルに添加し、そこで直ちに経時的測定シグナ （mE）を測定した。 このアッセイは、Boehringer/Hitachi 717アナライザーにて700/600nmの組合 せの試験波長（従来技術）および546/570nmもしくは480/660nmの組合せの試験波 長（本発明）を用いて行つた。 ヘモグロビンを含まないサンプル、ならびに1,000mg/dlのヘモグロビンおよび 2,000mg/dlのヘモグロビンを架橋ヘモグロビン（DCL-Hb）の形態で含有するサン プルの経時的測定シグナルを、546/570nmの組合せの試験波長については図１に 、そして700/600nmの組合せの試験波長については図２に示す。 546/570nmの組合せの試験波長については、ヘモグロビン含有サンプルでは反 応時間が増加するに従って測定シグナルの降下が見られ、一方、ヘモグロビン非 含有サンブルでの測定シグナルは本質的に一定のままであったことが観察される であろう。測定シグナルがHb非含有サンプルのシグナルと一致する好ましい反応 時間は、約５〜７分である。図２は、700/600nmの組合せの試験波長を用いた場 合、Hb非含有サンプルからのシグナルもHb含有サンプルからのシグナルも本質的 に一定のままであることを示している。 表１に、各種ヘモグロビン含有量を有するサンプル中でのアルブミン含有量の 回収率を示す。従来技術の700/600nmの組合せの試験波長（80秒の反応時間の後 で測定）については、ヘモグロビン含有量が上昇するにつれてアッセイ値の顕著 な偽性(spuriousness)が注目された。一方、本発明の546/570nmの組合せの試験 波長（340秒の反応時間の後で測定）ならびに本発明の480/660nmの組合せの試験 波長（140秒の反応時間の後で測定）では、サンプルのヘモグロビン含有量とは 無関係に100±２％の回収率が観察された。 図３は、Hbを含有しないサンプル、ならびに1,000もしくは2,000mg/dlの組 換えにより調製したヘモグロビンを含有するサンプルの、546/570nmの組合せの 試験波長についての経時的測定シグナルを示すものである。好ましい反応時間は 約１〜２分である。 図４は、Hbを含有しないサンプルならびに1,000mg/dlの溶血性ヘモグロビンを 含有するサンプルの経時的測定シグナルを示すものである。 図５は、Hbを含有しないサンプル、ならびに1,000mg/dlもしくは2,000mg/dlの Hbを含有するサンプルの、本発明の480/660nmの組合せの試験波長についての経 時的測定シグナルを示すものである。DCL-Hb含有サンプルからの測定シグナルが Hb非含有サンプルからの該シグナルと一致する好ましい反応時間は約１〜３分で ある。 溶血性ヘモグロビンまたは組換えにより調製したヘモグロビンを含有するサン プルについては、本発明の480/660nmの組合せの試験波長を用いた場合にも妨害 の良好な排除が達成できた。 実施例２ 単一試薬を用いて、クエン酸緩衝液中（95ミリモル/リットル、pH4.1；0.11ミ リモル/リットルのクレゾールグリーン；界面活性剤）でのブロモクレゾールグ リーン法に従ってアルブミンをアッセイした。 このアッセイは、実施例１の記載に従って行った。このアッセイは、700/600n mおよび505/570nmの組合せの試験波長（それぞれ、従来技術および本発明）なら びに反応開始後80秒（従来技術）および40〜60秒、好ましくは50秒（本発明）の 測定時間を用いて行った。 700/600nmの組合せの試験波長については、ヘモグロビンを含有しないサンプ ル、ならびに1,000mg/dlのヘモグロビンおよび2,000mg/dlのヘモグロビンをDCL ヘモグロビンの形態で含有するサンプルの経時的測定シグナルを図６に、そして 、505/570nmの組合せの試験波長については図７に示す。 これらの図から、本発明の505/570nmの組合せの試験波長を用いた場合には、 反応時間が増加するにつれて、ヘモグロビン含有サンプルの測定シグナルは低下 し、一方ヘモグロビン非含有サンプルの測定シグナルは本質的に一定のままであ ることが示される。測定シグナルがHb非含有サンプルと一致する好ましい反応時 間は、約20〜90秒である。 表２は、各種のヘモグロビン含有量を有するサンプル中のアルブミン含有量の 回収率を示すものである。本発明の505/570nmの組合せの試験波長（60秒の反応 時間の後で測定）については、サンプルのヘモグロビン含有量とは無関係に100 ±５％の回収率が達成され、一方、従来技術の700/600nmの組合せの試験波長に ついては、ヘモグロビン含有量が増大するにつれて強い擬似のアッセイ値が観察 された。 溶血性ヘモグロビンまたは組換えにより調製したヘモグロビンを含有するサン プルでもまた、本発明の試験波長の組合せを用いた場合に良好な妨害抑制が達成 できた。 実施例３ クエン酸緩衝液中でのブロモクレゾールグリーン法により二試薬アッセイを用 いてアルブミンをアッセイした。試薬は以下のとおりであった。 試薬１：95ミリモル/リットルのクエン酸緩衝液、pH4.1；界面活性剤 試薬２：95ミリモル/リットルのクエン酸緩衝液、pH4.1；0.66ミリ モル/リットルのブロモクレゾールグリーン；界面活性剤 このアッセイは、以下のようにして行った。 250μｌの試薬１を３μｌのサンプルに添加し、約4.5分後にダミーサンプルの 値Ｅ₁を測定した。そこで直ちに、50μｌの試薬２を添加し、その0.5分後にアナ ライトの測定値Ｅ₂を得た。また、時間全体にわたって、経時的測定シグナルを 記録した。このアッセイは、Boehringer/Hitachi 717アナライザーにて、本発明 の505/570nmの組合せの試験波長を用いて行った。用いた対照は、実施例２で従 来技術の700/600nmの組合せの試験波長について述べた単一試薬であった。 図８は、ヘモグロビンを含有しないサンプル、ならびに1,000mg/dlのヘモグロ ビンおよび2,000mg/dlのヘモグロビンをDCLヘモグロビンの形態で含有するサン プルの、本発明の505/570nmの組合せの試験波長についての経時的測定シグナル を示すものである。 ヘモグロビン含有サンプルでは、505/570nmの組合せの試験波長において測定 シグナルの低下が見られることが観察できるであろう。好ましい測定時間ば、ヘ モグロビンにより生じる擬似のシグナルが、ピペッティング容積による希釈ファ クターを考慮に入れて、等しく大きくなるように選定される。したがって、そし て好ましくは、Ｅ₁（ダミーサンプルの値）はサンプルに試薬１を添加した約4.5 分後に、そしてＥ₂（アナライトの値）は試薬２を添加した約0.5分後に測定する 。 表３は、各種のヘモグロビン含有量を有するサンプル中のアルブミン含有量の 回収率を示すものである。本発明の505/570nmの組合せの試験波長ではヘモグロ ビン含有量とは無関係に100±２％の回収率が達成されたが、従来技術の700/600 nmの組合せの試験波長では強い擬似の測定値が観察された。 溶血性ヘモグロビンまたは組換えにより調製したヘモグロビンを含有するサン プルでも、本発明の組合せの波長を用いて良好な妨害抑制が達成できた。 実施例４ ブロモクレゾールパープル法により二試薬試験および二点測定を用いてアルブ ミンをアッセイした。以下の試薬を用いた。 試薬１：100ミリモル/リットルの酢酸緩衝液、pH5.3；界面活性剤 試薬２：100ミリモル/リットルの酢酸緩衝液、pH5.3；界面活性剤；526 ミリモル/リットルのブロモクレゾールパープル このアッセイは、以下のようにして行った。 250μｌの試薬１を３μｌのサンプルに添加し、約2.5分後にダミーサンプルの 値Ｅ₁を測定した。そこで直ちに150μｌの試薬２を添加し、５分後にアラナイト の値Ｅ₂を測定した。さらに、この間ずっと、経時的測定シグナルを測定した。 このアッセイは、Boehringer/Hitachi 717アナライザーにて、従来技術の700/ 600nmの組合せの試験波長および本発明の505/570nmもしくは546/570nmの組合せ の波長を用いて行った。 ヘモグロビンを含有しないサンプル、ならびに1,000mg/dlのヘモグロビンおよ び2,000mg/dlのヘモグロビンをDCLヘモグロビンの形態で含有するサンプル の経時的測定シグナルを、700/600nmの組合せの試験波長については図９に、505 /570nmの組合せの試験波長については図10に、そして546/570nmの組合せの試験 波長については図11に示す。 注目すべきことは、700/600nmの組合せの試験波長については、ヘモグロビン により引き起こされるシグナル強度の上昇は、試薬２の添加前よりも添加後のほ うが大きいことである。この特徴は、ヘモグロビン自体がブロモクレゾールパー プルとの反応に関与すること、およびその結果として、アルブミンのアッセイが 妨害されることを示している。しかし、ヘモグロビン含有サンプルからの測定シ グナルは、ヘモグロビン非含有サンプルからの測定シグナルと同様に、試薬２の 添加前および添加後の双方においてほぼ一定のままである。 一方、本発明の505/570nmの組合せの試験波長において、ヘモグロビン含有サ ンプルからの測定シグナルの降下が観察できるが、ヘモグロビン非含有サンプル からの該シグナルは実質的に一定のままである。したがって、好ましい反応時間 は、妨害を回避するために、上記の希釈ファクターを考慮に入れて、試薬２添加 前のヘモグロビンにより引き起こされる妨害シグナルが、試薬２添加後のヘモグ ロビンにより引き起こされる妨害シグナルと同等またはほぼ同等に大きなものに なるように選定されなければならない。したがって、実施例４におけるＥ₁は、 サンプルに試薬１を添加した2.5分後（505/570nm）または0.5分後（546/570nm） に測定し、Ｅ２は、双方の組合せの波長とも、試薬２を添加した約５分後に測定 する。 表４は、各種のアルブミン含有量を有するサンプルでのアルブミン含有量の回 収率を示すものである。本発明の505/570nmおよび546/570nmの組合せの試験波長 については、サンプルのヘモグロビン含有量とは無関係に100±４％の回収率が 達成されたが、従来技術の700/600nmの組合せの試験波長を用いた場合には、ヘ モグロビン含有量が増大するにつれて、強い擬似の測定値が見られた。 本発明の試験波長の組合せを用いた場合、良好な妨害抑制はまた、溶血性ヘモ グロビンまたは組換えにより調製したヘモグロビンを含有するサンプルでも達成 された。 実施例５ 図12および図13は、ブロモクレゾールグリーン法によるコハク酸緩衝液または クエン酸緩衝液中の単一試薬を用いたアルブミンのアッセイにおいて用いられた ダイオードアレイの波長依存性スペクトルを示すものである。サンプル１は0.9 ％ＮａＣｌを含有する対照である。サンプル２は血清＋ＮａＣｌであり、サンプ ル３は血清＋DCL-ヘモグロビンである。それぞれの場合において、反応時間は90 秒であった。 図12から、実施例１で述べた好ましい546/570nmまたは480/660nmの組合せの波 長以外に、さらに600/630nmの組合せの試験波長が好適であることが示された。 （表１）（表２）（表３）（表４）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＺ，ＰＬ，ＵＳ (72)発明者 マスターズ，バーバラ アメリカ合衆国 46250―0457 インディ アナ州，インディアナポリス，ピー．オ ー．ボックス 50457，ハーグ ロード 9115，エヴァリュエーション デパートメ ント．，ベーリンガー マンハイム コー ポレーション

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1．少なくとも２つの波長における光学的測定を用いて、遊離ヘモグロビンを 含有するサンプル中のアルブミンをアッセイするための方法であって、 （ａ）第１測定波長において、測定にとって十分強いアルブミン測定シグ ナルが存在すること、 （ｂ）第２測定波長において、(i)アルブミン測定シグナルが全く存在し ないか、もしくは(ii)該第１測定波長における測定シグナルより小 さいアルブミン測定シグナルが存在すること、そして （ｃ）該第１測定波長および該第２測定波長において、ヘモグロビンと、 アルブミンをアッセイするのに用いられるアッセイ試薬との反応に より生じ、かつ時間と共に変化する、比較的強い妨害シグナルが存 在すること を特徴とする前記方法。 2．前記アッセイが単一点測定の形態で行われることを特徴とする、請求項１ に記載の方法。 3．測定時間が、ヘモグロビンとアッセイ試薬との反応により生ずる妨害シグ ナルが前記第１試験波長と前記第２試験波長とにおいて同等またはほぼ同等 になるように選定されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。 4．前記アッセイが二点測定または多重点測定の形態で行われることを特徴と する、請求項１に記載の方法。 5．測定時間が、希釈ファクターを考慮に入れて、ヘモグロビンにより生じる 妨害シグナルが該測定時間において同等またはほぼ同等であるように選定さ れることを特徴とする、請求項４に記載の方法。 6．前記アルブミンアッセイがコハク酸緩衝液中でのブロモクレゾールグリー ン法を用いて行われることを特徴とする、請求項ｌ〜５のいずれか１項に記 載の方法。 7．前記アッセイが、 （ａ）560〜580nmの第１試験波長および540〜552nmの第２試験波長、 （ｂ）640〜680nmの第１試験波長および470〜490nmの第２試験波長、ま たは （ｃ）620〜640nmの第１試験波長および590〜610nmの第２試験波長 において行われることを特徴とする、請求項６に記載の方法。 8．前記アッセイが、 （ａ）570±５nmの第１試験波長および546±５nmの第２試験波長、 （ｂ）660±５nmの第１試験波長および480±５nmの第２試験波長、また は （ｃ）630±５nmの第１試験波長および600±５nmの第２試験波長 において行われることを特徴とする、請求項７に記載の方法。 9．前記アッセイが、 （ａ）約570nMの第１試験波長および約546nmの第２試験波長、 （ｂ）約660nmの第１試験波長および約480nmの第２試験波長、または （ｃ）約630nmの第１試験波長および約600nmの第２試験波長 において行われることを特徴とする、請求項８に記載の方法。 10．前記アルブミンアッセイがクエン酸緩衝液中でのブロモクレゾールグリー ン法により行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載 の方法。 11．前記アッセイが560〜580nmの第１試験波長および490〜520nmの第２試験 波長において行われることを特徴とする、請求項10に記載の方法。 12．前記アッセイが570±５nmの第１試験波長および505±５nmの第２試験波 長において行われることを特徴とする、請求項11に記載の方法。 13．前記アッセイが約570nmの第１試験波長および約505nmの第２試験波長に おいて行われることを特徴とする、請求項12に記載の方法。 14．前記アルブミンアッセイがブロモクレゾールパープル法により行われるこ とを特徴とする、請求項１〜５のいずか１項に記載の方法。 15．前記アッセイが（ａ）560〜580nmの第１試験波長および490〜520nmの第２ 試験波長、または（ｂ）560〜580nmの第１試験波長および540〜552nmの第 ２試験波長にて行われることを特徴とする、請求項14に記載の方法。 16．前記アッセイが（ａ）570±５nmの第１試験波長および505±５nmの第２試 験波長、または（ｂ）570±５nmの第１試験波長および546±５nmの第２試 験波長で行われることを特徴とする、請求項15に記載の方法。 17．前記アッセイが（ａ）約570nmの第１試験波長および約505nmの第２試験 波長、または（ｂ）約570nmの第１試験波長および約546nmの第２試験波長 で行われることを特徴とする、請求項16に記載の方法。 18．前記測定が0.5〜10分間の反応時間の後で行われることを特徴とする、請 求項１〜17のいずれか１項に記載の方法。 19．溶血性ヘモグロビンを含有するサンプルを分析することを特徴とする、請 求項１〜18のいずれか１項に記載の方法。 20．架橋ヘモグロビンを含有するサンプルを分析することを特徴とする、請求 項１〜18のいずれか１項に記載の方法。 21．組換えによって調製したヘモグロビンを含有するサンプルを分析すること を特徴とする、請求項１〜18のいずれか１項に記載の方法。 22．前記アッセイが、単一点測定として、５〜７分の反応時間の後で（ａ）の 波長の組合せを用いて、または２〜３分間の反応時間の後で（ｂ）の波長の 組合せを用いて行われることを特徴とする、請求項６〜９および20のいず れか１項に記載の方法。 23．前記アッセイが、単一点測定として、１〜２分の反応時間の後で（ａ）の 波長の組合せを用いて、または１〜３分間の反応時間の後で（ｂ）の波長の 組合せを用いて行われることを特徴とする、請求項６〜９、19および21の いずれか１項に記載の方法。 24．前記アッセイが20〜90秒の反応時間の後で単一点測定として行われること を特徴とする、請求項10〜13および19〜21のいずれか１項に記載の方法。 25．前記アッセイが、２つの試薬を用いて二点測定として行われ、アナライト の値の測定が第２試薬の添加後0.2〜5分間にわたって行われることを特徴 とする、請求項10〜13および19〜21のいずれか１項に記載の方法。 26．前記アッセイが、２つの試薬を用いて二点測定として行われ、アナライト の値の測定が第２試薬の添加後0.2〜８分間にわたって行われることを特徴 とする、請求項14〜17および19〜21のいずれか１項に記載の方法。 27．アッセイ後に試験結果の計算による補正が全く行われないことを特徴とす る、請求項１〜26のいずれか１項に記載の方法。 28．前記アッセイが血清または血漿のサンプルについて行われることを特徴と する、請求項１〜27のいずれか１項に記載の方法。 29．自動化アナライザーで行われることを特徴とする、請求項１〜28のいずれ か１項に記載の方法。