CN88102435A - 生物液体中白蛋白的测定方法 - Google Patents
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Abstract
血清与二硝基卤苯化合物反应，并测定产生卤的速率。该速率与样品中白蛋白含量成正比例。其他蛋白质，如球蛋白以及游离氨基酸和尿素都不干扰该反应。
Description
本发明是关于定量测定血清中白蛋白的方法，该方法即使在球蛋白和其他血清蛋白存在下也可以进行测定。
测定血液和生物液体（例如尿）中白蛋白的技术在医药、诊断和临床化学上是重要的。一般，血清中蛋白质总量是由所谓“双缩脲/铜反应”来确定的。该反应涉及Cu2+和蛋白质的肽键之间形成的带色配合物（紫色）。分别测定白蛋白和球蛋白时，用盐析法（例如用碱或硫酸铵）将球蛋白沉淀，并离心分离，然后也以双缩脲反应单独测定上清液中的白蛋白。由于这种操作费时，现在已将方法改进为在有其他蛋白质存在下直接测定血清中的白蛋白。例如Delaney于1964年（Proc.Australian Assoc.Clin.Biochem.64（1964），1）介绍了溴甲酚缘（BCG）染料结合的方法定量测定血清白蛋白。血清用缓冲的BCG（pH7.0）稀释，并于波长615nm测定其吸光度减小，吸光度是随着白蛋白浓度（高达50mg/ml）而呈线性变化，而且其他用电泳分离的蛋白质如血红蛋白和胆红素都不干扰。
然而最好能找到更具体的操作，即是说要找出更不易受到血清中其他分子干扰的方法。总结在权利要求1的方法（即一种定量测定生物液体（即使有球蛋白存在于其中）中血清白蛋白的方法，其特征在于：（1）血清样品与过量的卤代-芳族试剂反应，其中至少有一个卤原子被蛋白质取代，并且该反应导致蛋白质/试剂配合物的形成;（2）测定该反应速率;（3）用其他同位数据计算测得的速率数据，该同位数据是以白蛋白校准量在同样反应中完成，通过计算提供上述测定结果）是达到这个目的重要步骤。这是完全意想不到的发现，通过这种途径可以定量确定白蛋白，甚至有大量的球蛋白存在下也可以确定。实际上，本发明能应用的那一类试剂，例如邻、对二硝基卤苯，已知是能用蛋白质的NH2一端基进行双分子亲核取代（见Sager Biochem.J.39（1945），507，1945），其速率次序为F＞Cl~Br.这是意想不到的，至少当卤素是氟时显示白蛋白实际上是在血清中能产生明显反应速率的唯一蛋白质类型，该反应速率即使在其他蛋白质，例如球蛋白存在下也能产生。
另一个意想不到的发现是不必须用记录形成配合物的光学或其他性质的变化来测定反应速率，而可测定氟释放量从而方便地得知反应速率。这是意想不到的，因为虽然上述反应（见以下反应式）包括如下氟取代作用（X代表氟），但并未明显表明一定能找到可直接测定的方式（例如用离子选择性的氟化物电极测定）。反应式如下：
一种比较好的试剂是能少量溶于水的二硝基氟苯（DNFB）化合物。所以，为了取得最好结果，可用与血清样品相容的适宜的经缓冲的水介质来乳化DNFB有机溶液。例如，DNFB在苯中的溶液并由缓冲物质所乳化（特点是pH5.5～7.7的0.1～1N溶液），而要分析的血清样品与乳状液一起搅拌。析出的氟化物再用任何惯用型的氟离子选择性电极测定。校准曲线是通过一组白蛋白标准溶液而获得，并将未知浓度的样品与校准曲线对比进行测定。存在于血清中正常浓度范围的球蛋白和其他血蛋白以及游离氨基酸和尿素都不产生干扰。
有机试剂DNFB、醚、甲苯、DMF（二甲基甲酰胺）、DMSO（二甲基亚砜）、THF（四氢呋喃）、EtOH（乙醇）和MeOH（甲醇）也适宜，但较少用，因为它们之中有些能起亲核作用而使电极漂移。
缓冲物质的选择也很重要，已发现，例如惯用的乙酸盐、三羟甲基氨基甲烷和二甲胂酸盐缓冲液，其pH值在上述pH值范围内，结果产生电极漂移，而用磷酸盐缓冲液（pH5.8～7.6）则看不出电极漂移。虽然这些差别的原因还没有进行研究，但初步可以假设有机缓冲物质起亲核的作用使一些卤原子取代。虽然本方法可以用可使电极产生漂移的有机缓冲液进行操作（即连续步骤的时间受到控制，使测定结果有重现性），也可以用无机缓冲液，例如磷酸盐是最佳缓冲物质。
下面可取代的步骤已经被成功地用来代替用缓冲水溶液乳化DNFB试剂来提供反应介质。
用DNFB溶液浸渍一张滤纸并让其干燥。
进行分析时，把浸渍过的干燥滤纸置于烧杯底部，加入工作缓冲溶液和少量氟化物，用电磁搅拌器搅拌，电极浸入溶液，在稳定一段时间后加入血清样品，并测量其反应速率。
通常由已知的白蛋白溶液获得该反应速率存储于微处理器的存储装置里（该装置与惯用测量电极的仪器相连接），测定未知样品含量时，将速率记录，并用存储的数据进行计算，自动提供样品中白蛋白浓度的结果。该结果可以显示在有刻度的记录纸或显示在肉眼可以看到的荧光屏上。
下面以实例详细说明本发明。
图1是校准曲线图，该曲线图说明在磷酸盐缓冲液中，pH7.6时的F-产生速率的变化与白蛋白浓度的函数关系。
图2与图1相似，但测定是在pH5.8时进行。
实例1
用吸液管吸取0.1ml DNFB在苯中的5M溶液，滴在直径2cm的华特曼（whatman）滤纸上，并将圆形滤纸在暖空气流中干燥。在使用前准备和储存若干张这种圆形滤纸。
配制在0.1M磷酸盐缓冲液中，pH7.6的白蛋白校准样品，其范围为10～100mg/ml。
用聚丙烯烧杯（10ml）和F-选择性电极（Orion组合电极连接到与AppleⅡE微型电子计算机连接的Orion 901离子分析仪上）进行测定。
已干燥的滤纸置于烧杯（10ml）底部，并将5ml磷酸盐缓冲液和5ml10-3MNaF水溶液一起加入于烧杯中（给测定提供稳定的电位基线并在这之后能迅速返回基线）。溶液用电磁搅拌器搅拌，并把电极浸入溶液中，让其稳定1～2分钟。然后加入一等分（0.1ml）标准溶液，产生的F-是通过离子选择性电极的电位（mV）变化记录来测定。测定结果记录在图2的曲线上，其中横座标所示的为白蛋白的浓度（mg/ml），纵座标所示的为随时间变化的F-浓度（ (d［F-])/(dt) ，μMol/l/min<微摩尔/升/分钟>），这种变化是由用能斯脱方程式（NERNST equation）的方法求得的速率曲线获得的。
在不同量的球蛋白存在下也进行同样的实验，实验表明高达40mg/ml的球蛋白也没有干扰作用，而且这种浓度远远高于血清中能遇到的球蛋白浓度。
用上述方法测定未知白蛋白浓度的血清样品并对照图1曲线校核。所得结果与用先有技术的方法测得的结果极为一致。
实例2
重复在实例1说明的实验，但是在磷酸盐缓冲液（pH5.8）中进行操作。血清的pH值保持与实例1相同的pH值。图2曲线标出的结果，基本上与图1标出的结果相似，但其速率较低。在pH5.8进行测定的方法同样适用于未知含量的样品，但其灵敏度较低。存在有球蛋白和其他血蛋白、游离氨基酸和尿素都不干扰测定。
除了DNFB之外，在释放氟方面有类似性质的其他试剂也可以用，例如由下式表示的丹磺酰氟：
以下的化合物也可以使用：
2，4，6-三卤代对称三氮杂苯类及其一个或两个卤原子被有机取代基取代的衍生物，以及2，2，3，3-四氟环丁烷-1-甲酰胺。它们的结构式分别为：
其中Hal代表氟、氯和溴;R是有机基团。
Claims (8)
1、一种定量测定生物液体(即使有球蛋白存在于其中)中血清白蛋白的方法，其特征在于：(1)血清样品与过量的卤代-芳族试剂反应，其中至少有一个卤原子被蛋白质取代，并且该反应导致蛋白质/试剂配合物的形成；(2)测定该反应速率；(3)用其他同位数据计算测得的速率数据，该同位数据是以白蛋白校准量在同样反应中完成，通过计算提供上述测定结果。
2、根据权利要求1的方法，其中的试剂是二硝基氟苯（DNFB）或丹磺酰氟。
3、根据权利要求1的方法，其中的反应导致卤取代，而测定的速率是卤化物离子释放的速率。
4、根据权利要求3的方法，其中卤化物是以F-选择性电极测定的氟化物。
5、根据权利要求4的方法，其中的反应介质是pH5.5～7.8的缓冲液。
6、根据权利要求4的方法，其中的缓冲液含无机化合物，例如磷酸盐，并且pH值为5.8～7.6。
7、根据权利要求5的方法，其中的试剂是溶于有机试剂中，并且一等份此种溶液是用上述缓冲液乳化的。
8、根据权利要求5的方法，其中的试剂是均匀分布在一片多孔材料上，此后，该多孔材料在缓冲液中与样品接触。
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