DE19622091A1

DE19622091A1 - Verfahren zur Beseitigung von Hämoglobin-Störungen bei der Bestimmung von Albumin

Info

Publication number: DE19622091A1
Application number: DE19622091A
Authority: DE
Inventors: Ralph Dipl Chem Weisheit
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1996-05-31
Publication date: 1998-01-08
Also published as: DE59703148D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestim mung von Albumin in einer freies Hämoglobin enthaltenden Probe durch optische Messung.

Bekanntermaßen wird die nichtimmunologische Bestimmung von Albumin in Serum und Plasma (z. B. mittels Bromcresolgrün-Me thode) durch Hämoglobin (Hb) und Hämoglobin-analoge Verbin dungen derart gestört, daß bei Anwesenheit dieser Störsubstan zen falsch erhöhte Albuminwerte erhalten werden. Die Ursache hierfür liegt in einer Reaktion von Hämoglobin mit dem Farb stoff, wodurch Hb quantitativ als Albumin erfaßt wird (Doumas et al, Clin. Chem. Acta 31, 87-96 (1971)).

Im Patent EP 0 268 025 B1 wird darauf verwiesen, daß die Hb- Störung des Albumin-Tests nicht durch eine konventionelle 2-Punkt- Messung beseitigt werden kann. Es wird jedoch vorge schlagen, aus dem Zusammenhang zwischen Hämolysegrad und Meß fehler einen Korrekturfaktor zu ermitteln und mit dessen Hilfe (im Anschluß an eine separate Bestimmung des Hämolysegrades) das für eine bestimmte Probe erhaltene fehlerhafte Albumin ergebnis rechnerisch zu korrigieren.

Jay und Provasek (Clin. Chem. 39/9, 1804-1810 (1993)) be schrieben, daß in ihrem Labor bei jeder erkennbar hämolyti schen Probe der Hb-Gehalt dieser Probe separat bestimmt und über ein Computerprogramm das (verfälschte) Ergebnis der Ana lytbestimmung rechnerisch korrigiert wird. Die Höhe dieser Korrektur wird anschließend auf dem Analysenbefund angegeben.

Eine weitere Möglichkeit zur Korrektur der Hb-Störung für Albumin beschreibt die Offenlegungsschrift DE 44 27 492 A1. Hier entfällt eine separate Bestimmung des Hämolysegrades, da die ser aus einer der eigentlichen Hauptreaktion vorgeschalteten Vorreaktion abgeleitet werden kann. Nach dem sogenannten Rate_plus-Verfahren wird das in der Hauptreaktion erhaltene Meß ergebnis unter Ausnutzung eines gefundenen Zusammenhanges zwischen Hämolysegrad und Störbeitrag rechnerisch korrigiert.

In den bisher beschriebenen Methoden zur Beseitigung der Hb- Störung bei Albumin-Bestimmungen ist generell eine rechne rische Korrektur des Analysenergebnisses um einen dem Hb-Ge halt entsprechenden Betrag erforderlich. Dabei wird der Hb- Gehalt bzw. Hämolysegrad entweder durch separate Messung (z. B. durch Multiwellenlängenanalyse oder eine unabhängige Methode) ermittelt oder durch eine Vorreaktion abgeleitet, wobei immer ein 2-Reagenzien-Test erforderlich ist.

Die Bestimmung von Albumin erfolgt derzeit jedoch häufig als 1-Punkt-Messung mittels eines Monoreagenzes, wobei die Farb reaktion durch Vermischen von Probe und Reagenz gestartet wird (z. B. Albumin-Reagenz der Fa. Boehringer Mannheim GmbH). Der Vorteil einer solchen Bestimmung ist neben der einfachen Hand habung auch ein niedriger Preis. Aufwendig ist jedoch die Beseitigung der Hb-Störung: Entweder Monoreagenz und separate Ermittlung des Hb-Gehaltes oder ein 2-Reagenzien-Test und Vermeidung einer separaten Ermittlung des Hb-Gehaltes. In jedem Fall muß das erhaltene Analysenergebnis anschließend rechnerisch korrigiert werden.

Ideal wäre also ein Verfahren zur Hb-Entstörung für ein Albu min-Monoreagenz ohne anschließende rechnerische Korrektur des Analysenergebnisses.

Gelöst wurde diese Aufgabe durch Veränderung der Haupt- und der Nebenmeßwellenlänge. Überraschenderweise wurde gefunden, daß bei einer veränderten Kombination von Wellenlängen sich ein durch freies Hämoglobin in der Probe hervorgerufener Meß fehler weitgehend unterdrücken läßt (siehe Abb. 1, 3 und 4).

Dieser Effekt wird jedoch nicht beobachtet bei den üblicher weise zur Bestimmung von Albumin verwendeten Wellenlängen, d. h. einer Hauptwellenlänge von 600 nm und einer Nebenwellen länge von 700 nm. Hier findet man einen hohen Meßfehler bei einer Hämoglobin-haltigen Probe gegenüber einer Hämoglobin freien Probe (vgl. Abb. 2).

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Ver fahren zur Bestimmung von Albumin in einer freies Hämoglobin enthaltenden Probe durch optische bichromatische Messung, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Bestimmung bei einer Hauptmeßwellenlänge von 560-600 nm und einer Nebenmeß wellenlänge von 540-552 nm durchführt. Mit Hilfe einer solchen Wellenlängenkombination wird überraschenderweise bei Messung einer Hämoglobin enthaltenden Probe ein zumindest weitgehend unverfälschter Wert für die Albuminkonzentration in der Probe erhalten, der anschließend nicht mehr rechnerisch korrigiert werden muß. Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann eine Wiederfindung von Albumin im Bereich von 100 ± 10% und vor zugsweise von 100 ± 5% erreicht werden, insbesondere bei Albu minwerten im medizinischen Entscheidungsbereich < 3,5 g/dl.

Als besonders geeignet zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens haben sich eine Hauptmeßwellenlänge von 570 ± 10 nm, vorzugsweise 570 ± 5 nm und insbesondere ca. 570 nm und eine Nebenmeßwellenlänge von 540 nm bis 552 nm, vorzugsweise von 546 ± 5 nm und besonders bevorzugt von ca. 546 nm erwie sen.

Die optimale Reaktionszeit für das erfindungsgemäße Verfahren kann durch einfache Vorversuche bestimmt werden und liegt im allgemeinen im Bereich von 1-10 min. Bei einer Probe, die Hämoglobin aus Hämolyse enthält, wurde festgestellt, daß das Meßsignal innerhalb einer Reaktionszeit von 1-10 min im wesentlichen konstant bleibt, so daß die Messung zu beliebigen Zeitpunkten innerhalb dieses Bereichs oder gegebenenfalls auch danach erfolgen kann. Bei einer Probe, die als Blutersatzmit tel ein vernetztes Hämoglobin, z. B. Diaspirin-crosslinked (DCL) Hämoglobin enthält, führt man die Messung vorzugsweise nach einer Reaktionszeit von 3-10 min, besonders bevorzugt von 5-7 min und am meisten bevorzugt von ca. 6 min durch.

Bei einer Probe, die als Blutersatzmittel rekombinant herge stelltes Hämoglobin enthält, wird die Messung vorzugsweise nach einer Reaktionszeit von 1-3 min, besonders bevorzugt nach 1-2 min und am meisten bevorzugt nach ca. 1,5 min durchgeführt.

Entscheidend für das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch die neuartige Kombination von Haupt- und Meßwellenlänge. Die Mes sung bei unterschiedlichen optimalen Meßzeitpunkten für ver schiedene Hb-Arten kann jedoch zu einer weiteren Verringerung des Meßfehlers verwendet werden.

Auf diese Weise ist es erstmals möglich, ohne zusätzliche Ermittlung des Hämoglobingehaltes oder Hämolysegrads und ohne anschließende rechnerische Korrektur eines durch Hämoglobin verfälschten Analysenergebnisses den korrekten Albumingehalt in nur einem Meßschritt, d. h. als 1-Punkt-Messung zu bestim men. Ein weiterer entscheidender Vorteil ist es, daß die Be stimmung korrekter Albuminwerte auch mit einem Monoreagenz möglich ist. Dies ist mit erheblichen Handhabungs- und Preis vorteilen verbunden.

Ein 2-Reagenzientest kann weiterhin verwendet werden, ist jedoch nicht mehr zwingend erforderlich. Aber auch für einen 2-Reagenzientest ergibt sich durch die vorliegende Erfindung der Vorteil, daß die Ermittlung des Hämolysegrades mit an schließender rechnerischer Korrektur der durch Hämoglobin verfälschten Meßwerte für Albumin vermieden werden kann.

Die Bestimmung des Albumingehalts nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt durch optische Messung über eine Farbstoff reaktion. Vorzugsweise erfolgt die Bestimmung des Albuminge halts nach der Bromcresolgrün- oder Bromcresolpurpur-Methode.

Als Hämoglobin-enthaltende Proben werden üblicherweise Serum- oder Plasmaproben verwendet. Dabei ist anzumerken, daß die Bezeichnung "freies Hämoglobin" im Sinne der vorliegenden Erfindung sich sowohl auf hämolytische Proben als auch auf Proben bezieht, denen eine Hämoglobin-analoge Verbindung als Blutersatzmittel, z. B. ein modifiziertes, polymerisiertes oder/und quervernetztes Derivat von Human- oder Rinderhämoglo bin, z. B. Diaspirin-crosslinked (DCL)-Hämoglobin, oder auch ein rekombinant hergestelltes Hämoglobin zugesetzt worden ist.

Bevorzugt ist es außerdem, daß das erfindungsgemäße Verfahren an einem Analyseautomaten durchgeführt wird. Ein Beispiel für einen geeigneten Analyseautomaten ist das Boehringer Mann heim/Hitachi 717-Gerät.

Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch Abbildungen und Beispiele erläutert werden.

Es zeigen:

Abb. 1 den zeitabhängigen Verlauf des Meßsignals bei der Bestimmung von Albumin bei einer Meßwellenlängenkom bination 546/570 nm in Anwesenheit von vernetztem Hämoglobin (DCL-Hb) gemäß vorliegender Erfindung,

Abb. 2 den zeitabhängigen Verlauf des Meßsignals bei der Bestimmung von Albumin bei einer Meßwellenlängenkom bination 700/600 nm in Anwesenheit von vernetztem Hämoglobin (DCL-Hb) gemäß dem Stand der Technik,

Abb. 3 den zeitabhängigen Verlauf des Meßsignals bei der Bestimmung von Albumin bei einer Meßwellenlängenkom bination 546/570 nm in Anwesenheit von rekombinant hergestelltem Hämoglobin gemäß vorliegender Erfin dung und

Abb. 4 den zeitabhängigen Verlauf des Meßsignals bei der Bestimmung von Albumin bei einer Meßwellenlängenkom bination 546/570 nm in Anwesenheit von Hämoglobin aus Hämolyse gemäß vorliegender Erfindung.

Beispiel 1

Es wurde eine Bestimmung von Albumin nach der Bromcresolgrün- Methode (Doumas et al., Clin. Chem. Acta 31 (1971), 87-96) durchgeführt. Als Reagenz wurde verwendet:
Succinatpuffer 75 mmol/l, pH 4,2; 0,15 mmol/l Bromcresolgrün
Die Testdurchführung war wie folgt:
Zu 3 µl Probe wurden 350 µl Reagenz gegeben und dann der zeit abhängige Verlauf des Meßsignals (mE) bestimmt.

Die Bestimmung erfolgte in einem Boehringer Mannheim/Hitachi 717-Analysegerät unter Verwendung der Meßwellenlängenkombina tionen 700/600 nm (Stand der Technik) und 546/570 nm (Erfind ung).

Der zeitabhängige Verlauf des Meßsignals für Proben ohne Hämo globin, mit 1000 mg/dl Hämoglobin und mit 2000 mg/dl Hämoglo bin in Form von vernetztem Hämoglobin (DCL-Hb) ist für die Wellenlängenkombination 546/570 nm in Abb. 1 und für die Wel lenlängenkombination 700/600 nm in Abb. 2 dargestellt.

Es ist zu erkennen, daß bei der Wellenlängenkombination 546/570 nm mit zunehmender Reaktionsdauer eine Abnahme des Meßsignals bei den hämoglobinhaltigen Proben gefunden wird, während das Meßsignal für die Probe ohne Hämoglobin im wesent lichen konstant bleibt. Die bevorzugte Reaktionsdauer, bei der das Meßsignal dem Signal einer Hb-freien Probe entspricht, ist ca. 5-7 min. Abb. 2 zeigt, daß bei Verwendung der Meßwellen längenkombination 700/600 nm sowohl die Signale der hämoglo binfreien Probe als auch die Signale der Hämoglobin enthalten den Proben im wesentlichen konstant bleiben.

In Tabelle 1 ist die prozentuale Wiederfindung des Albuminge halts in Proben mit unterschiedlichem Hämoglobingehalt ge zeigt. Bei der Meßwellenlängenkombination 700/600 nm gemäß Stand der Technik (Messung nach einer Reaktionsdauer von 80 s) wurde mit zunehmendem Hämoglobingehalt eine starke Meßwertver fälschung festgestellt. Bei der erfindungsgemäßen Meßwellen längenkombination 546/570 nm (Messung nach einer Reaktions dauer von 340 s) wurde hingegen eine vom Hämoglobingehalt der Probe unabhängige Wiederfindung von 100 ± 2% erreicht.

Abb. 3 zeigt den zeitabhängigen Verlauf des Meßsignals für Proben ohne Hb sowie mit 1000 bzw. 2000 mg/dl rekombinant hergestelltem Hämoglobin für die Wellenlängenkombination 546/570 nm. Die bevorzugte Reaktionsdauer ist ca. 1-2 min.

Abb. 4 zeigt den zeitabhängigen Verlauf des Meßsignals für Proben ohne Hb sowie mit 1000 mg/dl Hämoglobin aus Hämolyse.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von Albumin in einer freies Hämoglobin enthaltenden Probe durch optische Messung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung bei einer Hauptmeßwellenlänge von 560-600 nm und bei einer Nebenmeßwellenlänge von 540-552 nm durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung bei einer Hauptmeßwellenlänge von 570 ± 5 nm und bei einer Nebenwellenlänge von 546 ± 5 nm durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung bei einer Hauptmeßwellenlänge von ca. 570 nm und bei einer Nebenmeßwellenlänge von ca. 546 nm durchführt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung nach einer Reaktionsdauer von 1-10 min. erfolgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe bestimmt, die Hämoglobin aus Hämolyse enthält.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe bestimmt, die vernetztes Hämoglobin enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung nach einer Reaktionsdauer von 5-7 min erfolgt.

8. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe bestimmt, die rekombinant hergestell tes Hämoglobin enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung nach einer Reaktionsdauer von 1-2 min erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung des Albumingehalts der Probe nach der Bromcresolgrün- oder Bromcresolpurpur-Methode erfolgt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung als 1-Punktmessung durchgeführt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung mit einem Monoreagenz durchgeführt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Bestimmung keine rechnerische Korrektur des Analysenergebnisses stattfindet.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung an einer Serum- oder Plasmaprobe durchgeführt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren an einem Analyseautomaten durch führt.