KR19990082596A

KR19990082596A - 항균성 및 항박테리아성 펩티드

Info

Publication number: KR19990082596A
Application number: KR1019980706334A
Authority: KR
Inventors: 필리페 불렛; 찰스 헤트루; 줄스 호프만; 로렌스 사바티에르
Original assignee: 떼따즈 프랑크; 롱-쁠랑 아그로
Priority date: 1996-02-16
Filing date: 1997-02-17
Publication date: 1999-11-25
Also published as: EA000843B1; BR9707292A; US6331522B1; TR199801582T2; IL125778A0; AU722891B2; WO1997030082A3; HUP9900935A2; WO1997030082A2; IL125778A; FR2745004B1; EP0882063A2; US6127336A; PL328579A1; EA199800731A1; CN1216047A; JP2000505440A; HUP9900935A3; CA2245518A1; AU1884397A

Abstract

발명은 하기식의 항박테리아성 및 항균성 펩티드에 관한 것이다:

Description

항균성 및 항박테리아성 펩티드

본 발명은 항바이러스성 및 항균성을 갖는, 단백질이 풍부한 펩티드, 그리고 활성 물질로서 상기 펩티드를 함유하는 조성물에 관한 것인데, 상기 조성물은 농업 그리고 인간과 동물 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 사용한 식물의 치료 방법, 그리고 상기 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

곤충이 박테리아에 대해 효과적인 내성을 갖는다는 것은 오랜 기간 알려져왔다. 이러한 방어 능력은 크게 몇 군의 펩티드의 신속한 합성을 기초로한다. 이러한 방어 능력은 광범위한 활성 스펙트럼을 갖는 몇 군의 펩티드의 신속한 합성에 기인한다. 이러한 합성은 패혈성 상처 또는 저복용의 박테리아의 주입에 의해 야기된다. 유도 항박테리아성 펩티드 중에서, 곤충 세크로핀 및 데펜신이 가장 특징적인 것이다. 몇 개의 다른 항바이러스성 펩티드는 부분적으로 특징적이었다.

곤충 부류는 별문제로하고, 다른 절지 동물에 대해서는 거의 공지되어 있지 않다. 전갈은 필로저니(philogeny) 에 대해 곤충보다 더 오래 존재해왔다.

펩티드는 전갈 안드록토누스 아우스트랄리스의 유도체로부터 분리되었는데, 이러한 펩티드는 현저한 특징 그리고 항바이러스성 및 항균성을 나타낸다.

더욱 구체적으로, 본 발명의 일면은 하기식 I 의 펩티드에 관한 것이다:

이하, 식 I 의 분자는 안드록토닌이라 칭한다. 이러한 비교적 작은 분자는두 개의 분자간 다리에 속해있는 4개의 시스테인 잔류물을 함유한다.

본 발명의 다른 면은 상기 펩티드를 얻어서 분리하는 제1 방법에 관한 것인데, 여기서, 하기는 계속해서 수행된다:

a) 헤모림프를 전갈 안드록토누스 아우스트랄리스에서 취하고;

b) 교반하면서, 상기에서 얻은 안드록토누스 아우스트랄리스 헤모림프를 산 매질과 접촉시켜 추출한 다음 원심분리하고;

c) 알맞은 성분을 갖는 소수성 분자의 용리 그리고 친수성 분자의 세척에 의한 분리로 상청액을 분리 칼럼 상에서 분별하고;

d) 추출물을 정제하고;

e) 펩티드의 특성을 규명한다.

표피를 절개해서 헤모림프를 취한다. 이를 프로테아제 억제제를 함유하는 튜브에 수집한다. 혈구를 제거하기 위해 원심 분리한 후, 플라스마를 -30 ℃ 에 저장한다.

바람직한 방법으로, 제2 단계 (추출)에서, 안드록토누스 아우스트랄리스 헤모림프를 산 (pH 2) 의 산성 용액으로 이루어진 산성 매질과 접촉시킨다. 용액은 무기산 또는 유기산, 예컨대 트리플루오로아세트산의 용액이 될 수 있다. 그 다음, 얻은 추출물을 4 ℃ 에서, 30,000 × g 의 속도에서, 차가운 조건하에서, 25 분 동안 원심분리한다.

바람직하게는, 제3 단계 (분별)에서, 고상 추출을 수행하기 위해 역상 카트리지 상에 추출물을 놓는다. 수용액 분자를 희석된 산 용액으로 세척하고 소수성 분자를 알맞은 용리액으로 용리한다. 그 결과, 세척용 트리플루오로아세트산 그리고 희석된 산 용액 중 다량의 아세토니트릴을 함유하는 용리액을 얻는다.

바람직하게는, 제4 단계 (정제) 를 이전 단계 중의 하나와 동일하거나 상이할 수 있는 알맞은 용리액으로 수행한다.

바람직하게는, 최종 단계 (특성화)에서, 펩티드의 본질은 Edman 분해의 서열화법에 의해 분석된다 (Acta Chemica Scandinavia 10 (1956), pp. 761-768). 상기 방법에 따라, 하기 구조를 얻는다:

위치 4, 10, 16 및 20 에서 어떤 신호도 감지할 수 없다 (Edman 분해). 이러한 위치 중 시스테인의 존재는 질량분석법으로 알 수 있고, 이렇게 얻은 구조는 하기와 같다:

측정된 안드록토닌의 질량은 각각 하기와 같다:

3076.65 ± 0.24 Da

그러나, 서열화 데이터의 기준으로 계산된 질량은 각각 하기와 같다:

3080.65 ± 0.24 Da

질량의 차이는 두 개의 분자간 디술파이드 다리의 형성과 일치한다.

디술파이드 다리를 연결하기 위해, 분자는 효소, Lys-C 엔도프로테아제로 분해되는데, 이러한 효소는 리신 후의 펩티드 사슬을 분쇄한다. 얻은 펩티드는 분리되고, 질량분석법은 상기 펩티드가 디술파이드 다리에 의해 결합된 두 개의 펩티드라는 것을 알려준다. 추측 서열은 Arg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys plus Cys Thr Asn Arg Asn Pro Tyr 및 Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly Cys Tyr Tyr 이다.

디술파이드 다리는 이렇게 연결되고 시스테인 1 은 시스테인 4 에, 시스테인 2 는 시스테인 3 에 연결된다. 따라서, 이러한 결과는 하기에 나타나 있다:

이 우수한 상호관계는 제안된 서열임을 확인시켜 준다.

또한, 본 발명에 따른 펩티드는 제2 공정에 따른 어려움없이, FMOC 화학 합성 (Atherton 및 Sheppard R.C.(1989), 고상 펩티드 합성 (IRL, Oxford, UK)) 한 다음, 실온에서, 교반하면서, 24 시간 동안, pH 8.5에서, 100 mM 암모늄 아세테이트 용액에서 재숙성시켜서 얻는다. 얻은 안드록토닌은 본래의 분자와 동일한 크로마토그래피 특성을 가지며, 디술파이드 다리의 연결성은 본래 분자의 그것과 동일하다. 재숙성 후에 측정한 질량 (3076.61 ± 0.67) 은 본래 분자의 그것과 아주 유사하다. 합성 분자는 박테리아 마이크로코커스 리테우스 (Micrococcus liteus) 에 대해 본래 분자와 동일한 항바이러스 활성을 갖는다.

모든 항바이러스 및 용혈 테스트는 합성 분자로 수행된다.

1. 안드록토닌은 돼지 또는 소의 적혈구에 대해 세포용해 효과를 갖지 않는다.

2. 이들 분자는 그램 음성 및 그램 음성 박테리아 (참조, 표 1), 식물병원성 박테리아 및 식물병원성 균종에 대한 항바이러스성을 갖는다.

하기 실시예는 본 발명의 조성물 그리고 펩티드의 제조 및 항바이러스성을 나타내고 있다.

실시예 1: 펩티드의 분리 및 특성

하기 단계로 방법을 수행한다:

- 추출 및 정제:

표피를 절개해서 헤모림프 (3.8 ml)를 취한다. 프로테아제 억제제 (아프로티닌) 의 존재에서, 차갑게 유지한 튜브로 옮긴 다음, 4 ℃에서, 25 분 동안, 30,000× g에서 원심분리한다. 이렇게 얻은 상청액을 즉시 다양한 정제 단계를 수행한다.

Sep-Pak C18 카트리지 상의 추출물의 분별

Sep-Pak C18 카트리지 상의 추출물을 침전시킨 후, 친수성의 분자는 0.05 % 의 트리플루오로아세트산 (TFA) 로 산성화된 5 ml 의 물로 단순하게 세척함으로써 제거된다.

소수성 분자를, 산성화된 물 (0.05 % TFA, 카트리지를 통해 5 ml) 중 10, 40 및 80 % 의 아세토니트릴 용액으로 용리한다.

수집된 분획을 "10 % 용리", "40 % 용리" 및 "10 % 용리" 라 부르고, 진공하에서 농축한다. 그 다음, 분획에 HPLC 분석 전에 HPLC 급 물을 첨가한다.

항바이러스 활성을 갖는 분자의 HPLC 정제

첫 번째 단계:

"40 % 용리" 분획을, 1 ml/min. 의 유속에서, 90 분 (즉, 분 당 0.44 % 의 아세토니트릴의 증가) 에 걸쳐, 산성화된 물 (0.05 % TFA) 중 2 내지 52 % 아세토니트릴의 선형 기울기로 Aquapore OD 300 C18 역상 칼럼 상에서 분석한다.

그 다음, 수득한 활성 분획을 "고압 불활성(HPI)" Delta Pak C18 칼럼 (150*3.9 mm) 상에서 정제한다.

용리는 1 ml/min. 의 유속에서, 10 분에 걸쳐, 산성화된 물 (6 mM HCl) 중 2 내지 11 % 그리고 50 분에 걸쳐, 11 내지 21 % 의 아세토니트릴의 선형 2상 기울기로 수행된다. 활성 분획의 순도는 Edman 분해의 서열의 결정 및 질량분석법에 의한 분석 전에 모세관 전기 분석에 의해 조절된다.

실시예 2: 시험관내: 현미분광측정법에 의한 항바이러스 활성의 측정:

사용된 각 박테리아 (E. coli; M. luteus) 의 순수한 스트레인, 분리된 칼럼을 10 ml 의 DIFCO PB 매질 (Poor Broth, 효모 추출물이 없는 Luria Bertani 매질) 에 현탁시키고, 서서히 교반하면서 밤새, 30 ℃에서 배양한다.

시험된 박테리아는 새로운 배양 매질 중 0.001 의 600 nm 의 광학 밀도를 갖는다. 10 ㎕ 의 각 분획은 100 ㎕ 의 박테리아 서스펜션의 존재에서 미소적정 플레이트에서 침전된다. 25 ℃에서, 24 시간 동안, 배양한 후, 미소적정 플리이트 판독기를 사용해서 600 nm에서 흡수도를 측정해서 성장을 평가한다.

이러한 조건 하에서, 50 % 억제도는 농축에서 관찰되는데, μM 로 표현되고 하기표에 나타나 있다.

	그램+/-	안드록토닌MIC (μM)
박테리아
Micrococcus luteus(마이크로코커스 루테우스)	+	0.6-1.5
Aerococcus viridans(에어로코커스 비리단스)	+	0.3-0.6
Bacillus subtilis(바실루스 서브틸리스)	+	1.5-3.0
Staphylococcus aureus(스타필로코커스 아우레우스)	+	15-30
Clavibacter michi ganensis(클라비박터 미치 가넨시스)	+	6-15
Escherichia coli D22(에켈리치아 콜리 D22)	_	＞30
Escherichia coli D31(에켈리치아 콜리 D31)	_	3-6
Escherichia coli 1106(에켈리치아 콜리 1106)	_	6-15
Salmonella typhimurium(살모넬라 티피무리움)	_	3-6

동일한 프로토콜을 사용하지만 식물병원성 박테리아를 사용한 결과는 하기와 같다:

	안드록토닌MIC (μM)
박테리아
Clavibacter michiganensis(클라비박터 미시가넨시스)	6-15
Pseudomonas syringae(슈도모나스 시린가에)	0.5-1
Pseudomonas syringae pv syringae(슈도모나스 시린가에 피브이 시린가에)	15-22
Pseudomonas pisi(슈도모나스 피시)	6-15
Pseudomonas maculicola(슈도모나스 마컬리콜라)	3-6
Pseudomonas valerianella(슈도모나스 발레리아넬라)	15-22
Pseudomonas syr phaseoli(슈도모나스 시르 파세올리)	2-4
Xanthomonas campestris pv campestris(크산토모나스 캄페스트리스 피브이 캄페스트리스)	3-6
Xanthomonas vesicatoria 687.3(크산토모나스 베시카토리아 687.3)	1.5-3
Xanthomonas vesicatoria B229RI(크산토모나스 베시카토리아 B229RI)	1.5-3
Xanthomonas phaseolica(크산토모나스 파세올리카)	1-2

동일한 프로토콜을 사용하지만, 균종를 사용한 결과는 하기와 같다:

	안드록토닌MIC (μM)
균종	염이 부재함	염이 존재함*
Alternaria dauci(알테르나리아 다우찌)	4.1-8.2	16-32
Stemphyllium(스템필리움)	4-8	16-32
Fusarium oxysporum L(푸사리움 옥시스포럼 L)	2-4	＞ 32
Verticilium toreillis(베르티실리움 토레일리스)	2-4	＞ 32
Botrytis petuniae(보트리티스 페투니아에)	4-8	＞ 32
Fusarium oxysporum meloni(푸사리움 옥시스포럼 멜로니)	2-4	-
*: 1 mM CaCl₂및 20 mM KCl 로 보충된 매질

본 발명에 따른 화합물을 사용해서 항박테리아성 처리를 겪은 농작물 중에서, 예를 들어, 수목재배, 유실수 및 콩과 식물 뿐만 아니라 쌀, 곡물, 특히 밀 및 보리를 언급할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 사용하는 항균성 처리를 겪을 수 있는 농작물 중에서, 예를 들어, 박과, 꽃 재배 (피튜니아) 및 과수원 수확물 (당근, 토마토, 양배추)을 언급할 수 있다.

상기 결과는 본 발명에 따른 펩티드의 우수한 항균활성을 보여주며, 이는 사람, 동물 및 식물분야에 적용할 수 있다.

또한 본 발명의 과제는 상술된 본 발명에 따른 하나 (또는 그 이상) 의 화합물이 활성 물질로서 농업적으로 수용가능한 고형 또는 액형 지지체 및 또한 농업적으로 수용가능한 계면활성제와 혼합되어 함유된 조성물이다. 특히, 통상의 불활성 지지체 및 통상의 계면활성제를 사용할 수 있다. 이러한 조성물은 적합한 장치, 예컨대 분무장치와 같은 장치를 이용하여 처리하고자 하는 작물에 즉시 적용하기 쉬운 조성물 뿐만아니라, 작물에 적용하기 전에 반드시 희석하여야하는 상업용 농축 조성물도 포함한다.

또한 이러한 조성물은 예컨대, 보호성 콜로이드, 점착제, 증점제, 틱소트로픽제, 침투제, 안정화제, 금속이온봉쇄제 등과 같은 임의 종류의 기타 성분을 함유할 수 있다. 좀더 일반적으로는, 본 발명에서 사용하는 화합물은 통상의 제형 기술에 부합되는 임의의 고형 또는 액형 첨가제와 배합할 수 있다.

통상적으로, 본 발명에 따른 조성물은 통상 본 발명에 따른 화합물 (이하, 활성 물질로 칭함), 하나 이상의 고형 또는 액형 지지체 및, 임의적으로, 하나이상의 계면활성제를 약 0.05 내지 95 중량% 함유한다.

본 발명의 명세서에서, 용어 "지지체" 는 화합물이 결합하여 식물, 종자 또는 토양에 화합물의 적용을 손쉽게 하는 천연 또는 합성, 유기 또는 무기 물질이다. 따라서 이러한 지지체는 통상적으로 불활성이고, 특히 처리된 식물에 대해서는 농업적으로 수용가능하여야 한다. 지지체는 고형(점토, 천연 또는 합성 실리케이트, 실리카, 수지, 왁스, 고형 비료,등) 또는 액형(물, 알코올, 특히 부탄올, 등) 일 수 있다.

계면활성제는 이온형 또는 비이온형의 유화제, 분산제 또는 습윤제, 또는 이러한 계면활성제의 혼합물일 수 있다. 예로서, 폴리아크릴산염, 리그노술폰산염, 페놀술폰산 또는 나프탈렌술폰산염, 에틸렌 옥시드와 지방알코올 또는 지방산 또는 지방아민의 중축합물, 치환페놀 (특히 알킬페놀 또는 아릴페놀), 술포숙신산 에스테르의 염, 타우린 유도체 (특히 알킬 타우레이트), 알코올 또는 페놀의 폴리옥시에틸화 포스포릭 에스테르, 폴리올의 지방산 에스테르, 상기 화합물들의 술펜이트, 술폰에이트 및 포스페이트 작용기를 갖는 유도체를 들 수 있다. 하나 이상의 계면활성제의 존재는 통상적으로 화합물 및/또는 불활성 지지체가 불수용성이고, 적용을 위한 벡터제가 물인 경우 필수적이다.

따라서, 본 발명에 따른 농업용 조성물은 본 발명에 따른 활성 물질을 0.05 내지 95 중량 % 로 광범위하게 함유할 수 있다. 이 계면활성제의 함량은 유리하게는 5 내지 40 중량 % 이다.

본 발명에 따른 이러한 조성물은 그 자체로 상당히 다양한 고형 또는 액형 형태이다.

고형 형태의 조성물로서, 살포용 분말 (100 % 까지일 수 있는 화합물 함량) 및 과립, 특히 과립 지지체의 압출, 압축, 함침 또는 분말의 과립화로 얻어진 과립 (상기 과립의 화합물 함량은 후자의 경우 0.5 내지 80 % 이다), 및 기포성 정제 또는 로진(lozenge) 을 언급할 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드는 또한 살포용 분말 형태로 사용할 수 있고; 50 g 의 활성 물질 및 950 g 의 탈크를 함유하는 조성물을 또한 사용할 수 있으며; 20g 의 활성 물질, 10 g 의 미분쇄 실리카 및 970 g 의 탈크를 함유하는 조성물을 또한 사용할 수 있고; 이러한 구성성분들은 함께 혼합 및 분쇄하여 혼합물을 살포하여 적용한다.

액형 형태의 조성물 또는 적용 동안 액형 조성물을 구성하도록 고안된 형태로서, 용액, 특히 수용성 농축물, 유화성 농축물, 에멀션, 농축 현탁액, 에어로졸, 습윤성 분말 (또는 분무용 분말), 페이스트 및 겔을 예로 들 수 있다.

유화성 또는 가용성 농축물은 통상적으로 10 내지 80 % 의 활성 물질을 함유하지만, 즉석 적용용 에멀션 또는 용액은 0.001 내지 20 % 의 활성 물질을 함유한다.

용매 외에, 유화성 농축물은 필요에 따라, 전술한 안정화제, 계면활성제, 침투제, 부식 방지제, 염료 또는 점착제와 같은 적절한 첨가제를 2 내지 20% 함유할 수 있다.

이러한 농축물을 이용하여, 임의의 목적하는 농도의 에멀션은 물로 희석하여 수득할 수 있고, 이러한 에멀션은 특히 작물에 적용하는데 적합할 수 있다.

다양한 유화성 농축물의 조성을 실시예를 이용하여 후술하였다:

실시예 EC1 :

- 활성 물질 400 g/ℓ

- 알칼리 도데실벤젠 술폰에이트 24 g/ℓ

- 에틸렌 옥시드의 10개 분자로 옥시에틸화된 노닐페놀 16 g/ℓ

- 시클로헥사논 200 g/ℓ

- 방향족 용매 적정량 1 ℓ

기타 유화성 농축물 제형에 따라, 다음을 사용한다:

실시예 EC2

- 활성 물질 250 g

- 에폭시드화 식물유 25 g

- 알킬 아릴 술포네이트 및 폴리글리콜지방알코올 에테르의 혼합물100g

- 디안디포름아미드 50 g

- 크실렌 575 g

침적되지 않는 안정한 액성제품을 제조하기 위하여, 분무하여 적용할 수 있는 농축 현탁액을 또한 제조한다. 농축 현탁액은 통상적으로 10 내지 75 % 의 활성 물질, 0.5 내지 15 % 의 계면활성제, 0.1 내지 10 % 의 틱소트로픽제 및 0 내지 10 % 의 적당한 첨가제, 예컨대 소포제, 부식방지제, 안정화제, 침투제 및 점착제, 및, 지지체로서, 물 또는 활성 물질이 단지 약간 용해되거나 불용되는 유기성 액체 (특정 고형 유기물질 또는 무기염은 지지체 내에서 용해되어 침전을 방지하는데 도움을 줄 수 있거나 또는 물에 대한 부동제로서 사용할 수 있다) 를 함유한다.

여기에 농축 현탁액 조성을 예시하였다:

실시예 CS1:

- 활성 물질 500 g

- 폴리에톡실화 트리스티릴페놀 포스페이트 50 g

- 폴리에톡시화 알킬페놀 50 g

- 폴리소듐 카르복시레이트 20 g

- 에틸렌 글리콜 50 g

- 오르가노폴리실록산유(소포제) 1 g

- 폴리사카라이드 1.5 g

- 물 316.5 g

습윤성 분말 (또는 분무용 분말) 은 통상적으로 20 내지 95 % 의 활성 물질을 함유하도록 제조하고, 통상적으로 고형 지지체 외에 0 내지 30 % 의 습윤제를, 3 내지 20 % 의 분산제를 함유하며, 필요에 따라, 하나 이상의 안정화제 및/또는 기타 첨가제, 예컨대 침투제, 점착제, 응고 방지제, 염료 등을 0.1 내지 10 % 함유한다.

분무용 분말 또는 습윤성 분말을 수득하기 위해서는, 활성 물질은 적당한 혼합기에서 추가의 물질과 함께 균질하게 혼합하고 제분기 또는 기타 적합한 분쇄기로 분쇄한다. 유리한 습윤성 및 현탁 형성력을 갖는 분무용 분말이 이렇게 수득되고; 이 분말은 임의의 소정 농도로 물에 현탁될 수 있고 이러한 현탁액은 특히 식물잎에 적용하는데 매우 유리하게 사용할 수 있다.

페이스트는 습윤성 분말 대신에 제조할 수 있다. 이러한 페이스트의 제조 및 사용 조건 및 방법은 습윤성 분말 또는 분무용 분말에서와 유사하다.

여기에서 습윤성 분말 (또는 분무용 분말) 의 다양한 조성을 예시한다:

실시예 WP1

- 활성 물질 50 %

- 에톡시화 지방 알코올(습윤제) 2.5 %

- 에톡시화 페닐에틸페놀(분산제) 5 %

- 쵸크 (불활성 지지체) 42.5 %

실시예 WP2

- 활성 물질 10 %

- 8 내지 10 개의 에틸렌옥시드로 에톡시화된,

분지형의 합성 C13 옥소 알코올 (습윤제) 0.75 %

- 중성 칼슘 리그노술포네이트 (분산제) 12 %

- 탄산칼슘 (불활성 충전제) 적정량 100 %

실시예 WP3

이러한 습윤성 분말은 하기 비율로 상기 실시예에서와 동일한 성분을 함유한다:

- 활성 물질 75 %

- 습윤제 1.50 %

- 분산제 8 %

- 탄산 칼슘 (불활성 충전제) 적정량 100 %

실시예 WP 4 :

- 활성 물질 90 %

- 에톡실화 지방 알코올 (습윤제) 4 %

- 에토실화 페닐에틸페놀 (분산제) 6 %

실시예 WP 5 :

- 활성 물질 50 %

- 음이온성 및 비이온성 계면활성제의 혼합물 (습윤제) 2.5 %

- 소듐 리그노술포네이트 (분산제) 5 %

-카올린 클레이 (비활성 지지체) 42.5 %

수성 에멀션 및 분산제 예를 들면, 본 발명에 따른 유화가능한 농축물 또는 습윤성 분말을 물로 희석함으로써 수득된 조성물은 본 발명의 일반적인 범주에 포함된다. 에멀션은 유중수 (water-in-oil) 또는 수중유 (oil-in-water) 형일 수 있으며, 이들은 "마요네즈" 와 같은 걸쭉한 점도를 가질 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 수분산성 과립의 형태로 제형화될 수 있으며, 이 또한 발명의 범주에 포함된다.

상기 분산성 과립은 일반적으로 약 0.3 과 0.6 사이의 겉보기 밀도, 약 150 과 2000 미크론 사이, 바람직하게는 300 과 1500 미크론 사이의 입자 크기를 갖는다.

상기 과립의 활성 물질 함량은 일반적으로 약 1 % 와 90 % 사이, 바람직하게는 25 % 와 90 % 사이이다.

과립의 나머지는 필수적으로 고체 충전물, 임의로 과립에 수분산 특성을 부여하는 계면활성 보조제로 이루어진다. 상기 과립은 선택된 충전제가 수용성인지 아닌지에 따라 필수적으로 두가지 별개의 유형일 수 있다. 충전제가 수용성인 경우, 이는 무기 또는 바람직하게는 유기일 수 있다. 우수한 결과는 요소로부터 수득되어 왔다. 불용성 충전제의 경우, 바람직하게는 무기, 예를 들면 카올린 또는 벤토나이트이다. 유익하게는 반 이상이 예를 들면, 필수적으로 음이온성 예컨대 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 폴리나프탈렌 술포네이트 또는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 리그노술포네이트인 하나 이상의 분산제로 이루어지며, 나머지는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 알킬 나프탈렌 술포네이트와 같은 비이온성 또는 음이온성 습윤제로 이루어진 계면활성제 (과립의 2 내지 20 중량 % 비율) 가 수반된다.

더욱이, 필수는 아니라도, 발포방지제와 같은 기타 보조제가 첨가될 수 있다.

본 발명에 따른 과립은 필요한 성분과 함께 혼합된 다음, 공지된 그 자체의 몇가지 기법 (블렌더, 유동층, 미세분무기, 압출) 에 따라 과립화된다. 본 방법은 일반적으로 분쇄 조작 다음, 상기 범위 내에서 선택된 입자 크기로 체로 친다. 상기와 같이 수득된 다음, 활성 물질을 함유하는 조성물로 함침된 과립 또한 사용될 수 있다.

바람직하게는 과립은 압출에 의해 수득되며, 하기 실시예에서 지시된 바와 같이 작용한다.

실시예 DG1 : 분산성 과립

90 중량 % 의 활성 물질 및 10 % 의 요소 펠렛을 믹서 내에서 함께 혼합한다. 이어서, 혼합물을 스핀들 밀 (spindle mill) 내에서 분쇄한다. 약 8 중량 % 의 물로 가습된 분말을 수득한다. 습윤된 분말을 천공 롤 압출성형기를 통해 압출성형한다. 건조된 다음, 분쇄 및 체로 친 과립을 수득하여, 각각 150 과 2000 미크론 사이의 크기의 과립만을 보유하도록 한다.

실시예 DG2 : 분산성 과립

하기 성분을 믹서 내에서 함께 혼합한다.

- 활성 물질 75 %

- 습윤제 (소듐 알킬나프탈렌 술포네이트) 2 %

- 분산제 (소듐 폴리나프탈렌 술포네이트) 8 %

- 수-불용성 비활성 충전제 (카올린) 15 %

상기 혼합물을 물의 존재 하에 유동층 내에서 과립화한 다음, 건조, 분쇄 및 체로 쳐서, 0.15 및 0.80 mm 사이의 크기의 과립을 수득한다.

상기 과립은 단독으로 사용되거나 또는 물 내에서 용액 또는 분산제의 형태로 사용하여, 목적하는 투여량을 수득할 수 있다. 이들은 또한 기타 활성 물질, 특히 항박테리아제와 조합하여 제조에 사용될 수 있으며, 후자는 습윤성 분말 또는 수성 현탁액 또는 과립의 형태이다.

저장 및 수송에 적당한 조성물은 더욱 유리하게는 0.5 내지 95 (중량)% 의 활성 물질을 함유한다.

본 발명은 또한 유리된 형태 또는 적절하게는 산과의 부가 염, 안달릭 (Andallic) 염 또는 약학적으로 허용가능한 염기와의 부가 염, 순수한 형태 또는 기타 약학적으로 적합한 생성물과 조합된 조성물 형태로서 비활성 또는 생리학적으로 활성일 수 있는 본 발명에 따른 펩티드의 유효 투여량을 투여함으로써 인간 또는 동물의 치료적 항박테리아 처리를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약제는 경구, 비경구, 직장 또는 국소적으로 투여될 수 있다.

정제, 환제, 분말제 (특히, 젤라틴 캡슐 또는 교갑) 또는 과립제가 경구 투여를 위한 고형 조성물로서 사용될 수 있다. 상기 조성물에서, 본 발명에 따른 활성 생성물은 하나 이상의 비활성 희석제, 예컨대 전분, 셀룰로오스, 수크로오스, 락토오스 또는 실리카와 혼합된다. 상기 조성물은 또한 기타 물질, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 염료, 코팅제 (당의정) 또는 글레이즈와 같은 하나 이상의 윤활제를 함유할 수 있다.

물, 에탄올, 글리세롤, 식물성 오일 또는 액상 파라핀과 같은 비활성 희석제를 함유하는 약학적으로 허용가능한 용액, 현탁액, 에멀션, 시럽 및 엘릭시르 (elixirs) 는 경구 투여를 위한 액상 조성물로서 사용될 수 있다. 상기 조성물은 또한 기타 물질 예를 들면, 습윤성 생성물, 감미제, 증점제, 향료 또는 안정화제를 포함할 수 있다.

비경구적 투여를 위한 살균 조성물은 바람직하게는 에멀션, 현탁액 또는 수성 또는 비수성 용액일 수 있다. 물, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 특히 올리브 오일 및 적당한 유기 에스테르가 용매 또는 담체로서 사용될 수 있다. 상기 조성물은 또한 보조제, 특히 습윤제, 강장제, 유화제, 분산제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 살균은 예를 들면, 무균 여과, 살균제의 조성물로의 혼입, 조사 또는 가열에 의한 상이한 방법으로 수행될 수 있다. 이들은 또한 사용할 때 주사용 멸균 배지 내에 용해될 수 있는 멸균 고형 조성물의 형태로 제조될 수 있다.

직장 투여를 위한 조성물은 활성 펩티드 외에, 코코아 버터, 반 합성 글리세리드 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 부형제를 함유하는 좌약 또는 직장용 캡슐이다.

국소 적용을 위한 멸균 조성물은 예를 들면, 크림, 연고, 로션, 안약, 양치질 약, 코의 드로프스 (nasal drops) 또는 에어로졸일 수 있다.

인간 치료에서, 본 발명에 따른 펩티드는 특히 항박테리아 처리에 유용하다. 투여량은 목적하는 효과 및 치료 기간에 의존하며, 일반적으로 성인에 대한 경구 경로의 경우, 1 일 당 50 과 1000 mg 사이로 일 회 이상의 투여량으로 취해진다.

통상, 의사는 환자의 연령 및 체중 그리고 다른 개별 인자에 따라 가장 적합하다고 생각되는 복용량을 결정할 것이다.

하기의 실시예는 본 발명의 조성물을 설명하지만, 제한하는 것은 아니다.

실시예 A:

1 회분 50 mg 의 활성 펩티드를 함유하고 하기 조성을 갖는 정제를 통상의 기술로 조제한다:

- 안드록토닌 펩티드 M1 50 mg

- 녹말 60 mg

- 락토오스 50 mg

- 스테아르산 마그네슘 2 mg

실시예 B:

20 mg 의 활성 펩티드를 함유하고 하기 조성을 갖는 주사 용액을 조제한다:

- 안드록토닌 펩티드 M 2 22.4 mg

- 증류수 적정량 2 cm³

Claims

하기식의 펩티드:
활성 물질로서 제1항의 펩티드를 함유하는 항바이러스성 조성물.
제 2 항에 있어서, 병원성 박테리아에 대해 식물을 보호하기 위해 사용될 수 있는 조성물.
제 2 항에 있어서, 인간 또는 동물의 치료를 위해 사용될 수 있는 조성물.
활성 물질로서 제1항의 펩티드를 함유하는 항균성 조성물.
제 5 항에 있어서, 병원성 박테리아에 대해 식물을 보호하기 위해 사용될 수 있는 조성물.
제 5 항에 있어서, 인간 또는 동물의 치료를 위해 사용될 수 있는 조성물.
제1항의 펩티드가 활성 물질로서 적용되는, 박테리아성 질병에 대해 식물을 보호하는 방법.
제1항의 펩티드가 활성 물질로서 적용되는, 균종성 질병에 대해 식물을 보호하는 방법.
하기를 계속해서 수행하는, 제1항의 펩티드의 제조 방법:

a) 헤모림프를 전갈 안드록토누스 아우스트랄리스에서 취하고;

b) 교반하면서, 상기에서 얻은 분쇄물 또는 안드록토누스 아우스트랄리스 헤모림프를 산성 매질 또는 중성 매질과 접촉시켜 추출한 다음, 원심분리하고,

c) 알맞은 성분을 갖는 소수성 분자의 용리 그리고 친수성 분자의 세척에 의한 분리로 상청액을 분리 칼럼 상에서 분별하고;

d) 추출물을 정제하고;

e) 서열을 정한다.