NO300508B1 - Biologisk renkultur av Bacillus thuringiensis-bakterie, krystallinsk, parasporalt proteintoksin erholdt fra denne, insekticidpreparat som inneholder dette, samt anvendelse av disse til bekjempelse av insekter - Google Patents
Biologisk renkultur av Bacillus thuringiensis-bakterie, krystallinsk, parasporalt proteintoksin erholdt fra denne, insekticidpreparat som inneholder dette, samt anvendelse av disse til bekjempelse av insekter Download PDFInfo
- Publication number
- NO300508B1 NO300508B1 NO903378A NO903378A NO300508B1 NO 300508 B1 NO300508 B1 NO 300508B1 NO 903378 A NO903378 A NO 903378A NO 903378 A NO903378 A NO 903378A NO 300508 B1 NO300508 B1 NO 300508B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- bacillus thuringiensis
- ncimb
- crystalline
- toxin
- donegani
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 title claims abstract description 19
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 title claims description 13
- 101000664393 Bacillus thuringiensis subsp. finitimus S-layer protein Proteins 0.000 title claims description 12
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims description 12
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 title claims description 8
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 30
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 30
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 11
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 3
- 239000012265 solid product Substances 0.000 claims description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 206010011906 Death Diseases 0.000 description 2
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 241000256250 Spodoptera littoralis Species 0.000 description 2
- 241000254109 Tenebrio molitor Species 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 241000256111 Aedes <genus> Species 0.000 description 1
- 108010082340 Arginine deiminase Proteins 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241000630736 Ephestia Species 0.000 description 1
- 241000122098 Ephestia kuehniella Species 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 1
- 241000254112 Tribolium confusum Species 0.000 description 1
- 239000012963 UV stabilizer Substances 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000002318 adhesion promoter Substances 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000004798 organs belonging to the digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 1
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002623 sporogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 235000011845 white flour Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
- A01N63/23—B. thuringiensis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en varietet av Bacillus thuringiensis, betegnet "var. donegani" (Btd) NCIMB
40152, nærmere bestemt en renkultur derav, samt et krystallinsk, parasporalt proteintoksin erholdt fra den som har insekticidaktivitet mot Coleoptera, et insekticidpreparat og anvendelse av disse.
Det er velkjent at den sporogene bacillus, Bacillus thuringiensis (Bt) under sporogenesetrinnet produserer parasporale krystaller av proteinnatur og utviser en insekticidaktivitet mot et stort antall insekter som tilhører ordenen Lepidoptera, Diptera og Coleoptera. Slike krystaller forår-saker når de tas inn av et insekt som er følsomt for aktivi-teten deres, irreversible skader på slimhinnen i fordøyelses-organene, idet insektet følgelig ikke lenger får tilført nær-ing og dør.
Det er kjent mange varieteter av Bt som adskiller seg fra hverandre på grunnlag av biokjemiske og/eller fysiolog-
iske parametrer, og på grunnlag av deres spesifikke/selek-
tive insekticidaktivitet. Noen av disse varietetene for-
handles som preparater for anvendelse ved bekjempelse av insekter.
Bt-varietetene som hittil har vært kjent, er oppdelt
på grunnlag av deres spesifikke/selektive aktivitet i tre patotyper:
Som patotype C, utstyrt med spesifikk aktivitet mot Coleoptera, er det innen teknikken bare kjent to varieteter, dvs. var. tenebrionis, krevet i europeisk patentsøknad EPO 149.162, og var. san diego, krevet i EPO 202.739.
Formålet ved foreliggende oppfinnelse er å tilveie-bringe en Bt-varietet, et insekticidpreparat eller et toksin erholdt fra det, som har en utmerket spesifikk insekticidaktivitet mot Coleoptera, hvor fremstillingen er enklere, billigere og mer effektiv.
Det er nå blitt funnet en varietet av Bacillus thuringiensis, patotype C, betegnet var. donegani (Btd.) NCIMB 40152 og det tilsvarende insekticidpreparat eller toksin som, ved siden av å være mer fordelaktig sammenlignet med Bt-ene, patotype C, som hittil har vært kjent, på grunn av sin insekticidaktivitet av tildekkende type, fremstilling og anvendelse på landbruksområdet, viste seg å være uventet utstyrt med en systemisk insekticidaktivitet.
Gjenstanden for foreliggende oppfinnelse er derfor en biologisk renkultur av Bacillus thuringlenses-bakterie, kjennetegnet ved at den er Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152 som fremstiller krystallinsk, parasporalt proteintoksin ifølge krav 2.
En annen gjenstand for foreliggende oppfinnelse er et krystallinsk, parasporalt proteintoksin, kjennetegnet ved at det er erholdt fra kulturer av Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152 etter sporogenesen og den etterfølgende lyse av sporangium, idet toksinet er oppløselig i vann ved nøytral pH og har en insekticid aktivitet av tildekningstype samt av systemisk type mot Coleoptera.
En ytterligere gjenstand ved foreliggende oppfinnelse er et insekticidpreparat som er kjennetegnet ved at det inneholder som aktivt prinsipp det krystallinske, parasporale proteintoksin ifølge krav 2, erholdt fra kulturer av Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152 etter sporogenesen og den etterfølgende lyse av sporangium.
En foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er et insekticidpreparat hvor det aktive prinsipp utgjø-res av de faste, lyofiliserte produkter erholdt fra fermenteringen og sporogenesen av Btd NCIMB 40152.
Nok en ytterligere gjenstand ved foreliggende oppfin-; neise er anvendelse av en biologisk renkultur av Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152 ifølge krav 1, et krystallinsk, parasporalt proteintoksin ifølge krav 2 eller et insekticidpreparat ifølge krav 3 eller 4 til bekjempelse av insekter.
Bacillus thuringiensis var. donegani (Btd) NCIMB 40152 har en spesifikk insekticidaktivitet mot Coleoptera og særlig mot viktige landbruksmål, slik som bladbillen Leptinotarsa decemlineata (potet-Doriphora), og tilhører derfor "patotype C" i henhold til det som er beskrevet av A. Krieg et al., Z. Ang. Ent., 96. (1983), s. 500-508.
Btd NCIMB 40152 adskiller-seg fra de kjente varieteter av Bt ved at den utviser andre biokjemiske og fysiologiske karakteristika, og er særlig forskjellig fra tenebrionis- og san diego-varietetene også ved at den produserer et parasporalt krystall med andre morfologiske kjennetegn, samt med en annen oppførsel ut fra det fysikalsk-kjemiske og fysiologiske synspunkt.
Morfologi og biokjemiske kjennetegn for Btd NCIMB 40152
Bacillus thuringiensis var. donegani (Btd) NCIMB 40152 ble isolert fra larver av Tenebrio molitor som var døde av naturlige årsaker, og ble katalogisert for intern labora-toriebruk med den konvensjonelle kode BT/43.
Isoleringen fant sted på næringsagarmedium som var gjort selektivt ved hjelp av tilsetning av 10 U/ml Peni-cillin G. Innholdet av insektene ble først behandlet ved 80°C over et tidsrom på 15-20 minutter for det formål å isolere sporogene basiller selektivt. En kultur av denne mikroorganismen ble deponert 31. mai 1989 i samsvar med Budapestkonven-sjonen ved National Collection of Industrial Bacteria (c/o The National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Torry Research Station, postboks 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB 98 DG, Skottland, Storbritannia), hvor den fikk deponeringsnummeret NCIMB 40152.
Btd NCIMB 40152 kan opprettholdes på vanlige medier, f.eks. næringsagarmedium ved 25-30°C, og kan formeres ved hjelp av teknikker som er i og for seg kjent for fagfolk innen teknikken.
Bestemmelsen av slekten og artene ble utført på grunnlag av de morfologiske og kjemiske kjennetegn til mikroorganismen.
Morfologi
De isolerte kolonier av Btd NCIMB 40152 på næringsagarmedium er flate, med enten rund eller irregulær form, og en oppbrutt eller fliket kant, og de har en hvitaktig farge. Den vegetative celle har form av en liten stav, er gram-positiv, har en diameter på 1-2'/um og en lengde på 6-8 /um.
Dyrkningstemperaturen ligger innenfor området 25-35°C.
Når kulturen av mikroorganismen behandles i en auto-klav ved 121°C i 15 minutter, inaktiveres både sporene og toksinet.
Posisjonen til sporen er sentral eller subterminal. Det parasporale krystall har, når det iakttas under elektron-mikroskopet, form av et parallellepiped med kvadratisk grunn-flate og med to pyramider med like grunnflater på oversiden og på undersiden, og med størrelser som ligger innenfor området 1-2 /um og derfor er forskjellig fra det parasporale krystall produsert av varietetene Bt tenebrionis og san diego, som begge er flate og romboide.
Biokjemiske kjennetegn
Btd NCIMB 40152 har i sitt vegetative trinn de biokjemiske kjennetegn som er angitt i tabell 1.
Forskjellen mellom Btd 40152 og varietetene som er kjent fra teknikkens stand, kan utledes også ved å sammen-ligne de biokjemiske kjennetegn til Btd 40152 med kjenne-tegnene til de kjente varietetene av Bt, slik det er angitt i den følgende tabell 2. Fotnoter til tabell 2: MAN, SAC, SAL, syredannelse av mannose, sakkarose og salicin: AMI, hydrolyse av stivelse; CHT, vekst på kitin; URE, urease; ARG, arginin-dihydrolase; LCT, lecitinase; + = positiv respons, - = negativ respons; (+) = delvis positiv respons; v = variabel respons.
Kjennetegn som vedrører dyrkning, og fremgangsmåter for separasjon av det aktive prinsipp
Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152 kan dyrkes på vanlige, flytende medier, slik som f.eks. næringsvæske, ved 25-30°C, ved hjelp av kjente teknikker.
Ved slutten av fermenteringen og sporogeneseprosessen kan biomassen fraskilles ved sentrifugering av fermentasjons-væsken.
Den således fraskilte biomasse kan deretter under-kastes inndamping eller lyofilisering, hvorved man får et fast produkt i pulverform som har insekticidaktivitet.
Insekticidaktiviteten av Btd NCIMB 40152 skyldes hovedsakelig et parasporalt, krystallinsk toksin av protein-type som er oppløselig i vann ved en nøytral pH-verdi, og som er forskjellig fra toksinet som fremstilles ved hjelp av Bt var. tenebrionis og var. san diego. Et slikt toksin kan derfor fraskilles ved å oppslemme på nytt i vann, ved en nøytral pH-verdi, biomassen som er skilt fra fermentasjons-væsken ved sentrifugering etter sporogenesen, og holde den således erholdte suspensjon med omrøring ved værelsetemperatur i et tidsrom som ligger innenfor 1-12 timer.
Etter den etterfølgende sentrifugering eller filtrer-ing av vannsuspensjonen kan det utvinnes en vandig oppløsning som er fri for sporer og fermentasjonsrester, og som hovedsakelig inneholder proteintoksinet, som kan utvinnes fra opp-løsningen ved hjelp av velkjente teknikker, slik som f.eks. lyofilisering.
Bestemmelsen av molekylvekten til toksinet i SDS-elektroforese på polyacrylamidgel ifølge metoden til Laemmli (Nature, 227, s. 680, (1970)), gir bevis for to hovedgrupper av bånd: <*> En første gruppe med tre bånd med en molekylvekt som ligger innenfor området 64.000-72.000, <*> en andre gruppe med to bånd med en molekylvekt som ligger innenfor området 34.000-36.000.
Biologisk aktivitet
Btd NCIMB 40152, preparatet eller toksinet erholdt fra den, utviser en insekticidaktivitet av tildekkende type, samt av systemisk type, mot Coleoptera, slik som f.eks. Leptinotarsa decemlineata.
Derimot ble det ikke iakttatt noen toksiske effekter når det gjelder noen Lepidoptera, slik som f.eks. Spodoptera littoralis og Ephestia kuehniella, samt på den to-vingete Åedes aegypti.
Den måten som det aktive prinsipp virker på larvene av Coleoptera på, er den samme som iakttatt tidligere i til-fellet med preparater på grunnlag av Bt "patotype A": noen få timer etter behandlingen stanser larvene inntaket av føde og dør etter et tidsrom fra 24 til 48 timer. Døden finner sted på grunn av effekten av toksinet på epitelet i fordøy-elseskanalen i insektet, som får irreversible skader.
Btd NCIMB 40152, de lyofiliserte, faste produktene erholdt fra dens fermentering og sporogenese, samt dens parasporale proteintoksin som sådant, eller som et egnet preparat, kan således anvendes ved bekjempelsen av Coleoptera som infiserer landbruksdyrkningene.
For dette formål er anvendelsen av det separerte toksin foretrukket.
Sammenlignet med toksinene erholdt fra de kjente varietetene av Bt og særlig av "patotype C"-varietetene tenebrionis og san diego, utviser toksinet utvunnet fra Btd NCIMB 40152 ifølge foreliggende oppfinnelse et stort antall fordeler på det industriøkonomiske nivå, i forhold til dets utvinning, dets anvendelse og dets insekticidaktivitet.
Slike fordeler er f.eks.:
<*> Adskillelsen av toksinet fra dyrkningsmediet er enklere
og lettere takket være oppløseligheten av toksinet i vann, og som en følge av dette kan toksinet erholdes i konsen-trert form fri for sporer, celler og fermentasjonsrester.
<*> De konsentrerte, vandige oppløsninger av toksinet, som til forskjell fra suspensjonene eller dispersjonene av toksinene kjent fra teknikkens stand, ikke utfelles, kan
lagres og transporteres lettere.
<*> Toksinet kan anvendes fra dets oppløsninger lettere og mer effektivt enn de analoge toksinene som anvendes dis-pergert i den faste form på grunn av deres uforenlighet med de vanlige organiske oppløsningsmidler som anvendes i preparater.
Videre har oppfinnerne overraskende og med fordel funnet at toksinet utvunnet fra Btd NCIMB 40152, ved siden av å ha en insekticidaktivitet av dekkende type, også utviser en systemisk insekticidaktivitet som er forskjellig fra toksinene fremstilt av andre varieteter av Bt.
En slik systemisk aktivitet som hovedsakelig består i at det aktive prinsipp forflytter seg fra plantedeler til og med svært langt borte fra applikasjonspunktet, sikrer en videre beskyttelse av planten og gjør det mulig å anvende mindre mengder aktivt prinsipp; særlig forflytter toksinet ifølge foreliggende oppfinnelse seg via rotapparatet til plantene.
Dessuten kan toksinet være effektivt i lengre tidsrom ved at det ved å trenge gjennom det vaskulære system til planten, viser seg å være mer beskyttet mot de eksterne midlene som ville være tilbøyelige til å spalte det eller vaske det bort.
Den systemiske aktivitet av toksinet er enda mer fordelaktig når behandlingen vedrører planter som er i vekst-trinnet og som følgelig gir insektet unge skudd, vokst frem etter behandlingsdatoen.
Videre gir den systemiske aktivitet toksinet en høyere virkningsfullhet ved de preventive behandlinger, og reduserer behovet for å gjenta behandlingene under plantens vekstsyklus.
Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152, produktet erholdt fra dens fermentering og sporogenese, samt dens parasporale toksin, kan formuleres som konsentrerte væsker og fuktbare pulvere ved å anvende flytende eller faste, inerte bæreref og formuleringshjelpestoffer og/eller additiver, slik som fuktemidler, adhesjonspromoterer, over-flateaktive midler, UV-stabiliseringsmidler og ytterligere andre additiver som normalt anvendes i insekticidpreparater.
For de praktiske anvendelser i landbruk er det egnet med doser som, referert til toksinet utvunnet fra Btd NCIMB 40152, ligger innenfor området fra 0,05 til 4 kg/hektar, og ligger fortrinnsvis innenfor området 0,2-2 kg/hektar.
Det er gjengitt noen eksempler nedenunder for å illustrere foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 1
Erlenmeyer-kolber med 500 ml kapasitet inneholdende 100 ml av et medium bestående av "Tryptone Soy Broth (OXOID)", ble inokulert med 1 ml av en 16-timer gammel kultur av Bacillus thuringiensis NCIMB 40152 i næringsvæske som medium.
Erlenmeyer-kolbene ble holdt på orbitalomrøring ved temperaturer som ligger innenfor området 25-35°C. Sporogenesen ble sjekket på mikroskop. Ved fermenteringsslutt ble biomassen frasentrifugert, oppslemmet på nytt i vann ved pH 7 og holdt under omrøring i 3 timer ved værelsetemperatur. Den erholdte oppløsning etter separasjon ved frasentrifugering av sporene og fermentasjonsrestene ble lyofilisert og an-
vendt for bestemmelsene av biologisk aktivitet eller for fremstillingen av preparatene.
Eksempel 2
Bestemmelser av insekticidaktivitet av det lyofiliserte preparat erholdt ifølge eksempel 1, hovedsakelig ut-gjort av det parasporale proteintoksin, ble utført ved å anvende preparatet som en vandig oppløsning ved forskjellige konsentrasj oner.
Måtene som aktivitetstestene ble utført på, alt etter det anvendte insekt, er beskrevet nærmere nedenunder:
LEPTINOTARSA DECEMLINEATA
Dekningsaktivitet:
Andre-generasjons larver ble foret med unge potetplanter behandlet ved dypping med den vandige oppløsning av det lyofiliserte toksin beskrevet i eksempel 1.
Miljøbetingelsene under observasjonstiden var:
Sluttbestemmelsen av dødsrate ble utført 48 timer etter infeksjonene; resultatene er gjengitt i tabell 3.
Systemisk aktivitet
Andre-generasjons larver av insektet ble foret med unge potetplanter oppbevart i hhv. 12 og 24 timer i en hydroponkultur inneholdende det lyofiliserte preparat fremstilt i eksempel 1, oppløst ved en konsentrasjon på 200 ppm.
Etter å ha holdt larvene i 48 timer i et kondisjon-ert miljø ved 25°C og med en relativ fuktighet på 60%, ble det fastslått en dødsrate på 100% i begge testene.
TRIBOLIUM CONFUSUM, TENEBRIO MOLITOR, EPHESTIA KUHENIELLA
Tredje-generasjons larver ble dyrket under kontrol-lerte betingelser ved en temperatur på 25°C - 1°C ved en relativ fuktighet på 65% i 2% i hvitt mel hvortil det lyofiliserte produkt ifølge eksempel 1 var tilsatt på forhånd.
Dødsraten ble bestemt etter 14 dager med angrep av skadedyret. Resultatene er gjengitt i tabell 3.
ÅEDES AEGYPTI
Aktivitet
Tredje-generasjons larver ble overført i destillert vann inneholdende det lyofiliserte preparat ifølge eksempel 1. Larvene ble holdt under regulerte betingelser ved 25°C 1°C med en relativ fuktighet på 60%, og ble foret daglig. Dødsraten gjengitt i tabell 3, ble målt etter 5 dager med behandlingen.
SPODOPTERA LITTORALIS
Dekninqsaktivitet
Andre-generasjons larver ble foret med tobakkblader behandlet ved dypping i den vandige oppløsning av det lyofiliserte produkt ifølge eksempel 1.
Omgivelsesbetingelsene under observasjonstiden var:
Bestemmelsen av dødsrate ble utført 5 dager etter infeksjonen. Resultatene er gjengitt i tabell 3.
Claims (5)
1. Biologisk renkultur av Bacillus thuringiensis-bakterie,
karakterisert ved at den er Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152- som fremstiller krystallinsk, parasporalt proteintoksin ifølge krav 2.
2. Krystallinsk, parasporalt proteintoksin, karakterisert ved at det er erholdt fra kulturer av Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152 etter sporogenesen bg den etterfølgende lyse av sporangium, idet toksinet er oppløselig i vann ved nøytral pH og har en insekticid aktivitet av tildekningstype samt av systemisk type mot Coleoptera.
3. Insekticidpreparat,
karakterisert ved at det inneholder som aktivt prinsipp det krystallinske, parasporale proteintoksin ifølge krav 2, erholdt fra kulturer av Bacillus fchuringriensis var. donegani NCIMB 40152 etter sporogenesen og den etter-følgende lyse av sporangium.
4. Insekticidpreparat ifølge krav 3, karakterisert ved at det aktive prinsipp utgjøres av de faste produktene som er lyofilisert, erholdt fra fermenteringen og sporogenesen av Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152.
5. Anvendelse av en biologisk renkultur av Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152 ifølge krav 1, et krystallinsk, parasporalt proteintoksin ifølge krav 2 eller et insekticidpreparat ifølge krav 3 eller 4 til bekjempelse av insekter.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT8921412A IT1231766B (it) | 1989-08-01 | 1989-08-01 | Bacillus thuringiensis var. donegani, preparato o tossina da esso ottenuta aventi attivita' insetticida contro i coleotteri. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO903378D0 NO903378D0 (no) | 1990-07-31 |
| NO903378L NO903378L (no) | 1991-02-04 |
| NO300508B1 true NO300508B1 (no) | 1997-06-09 |
Family
ID=11181378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO903378A NO300508B1 (no) | 1989-08-01 | 1990-07-31 | Biologisk renkultur av Bacillus thuringiensis-bakterie, krystallinsk, parasporalt proteintoksin erholdt fra denne, insekticidpreparat som inneholder dette, samt anvendelse av disse til bekjempelse av insekter |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5120536A (no) |
| EP (1) | EP0411582B1 (no) |
| JP (1) | JPH0380074A (no) |
| AT (1) | ATE128186T1 (no) |
| AU (1) | AU636633B2 (no) |
| BR (1) | BR9003738A (no) |
| DE (1) | DE69022509T2 (no) |
| DK (1) | DK0411582T3 (no) |
| ES (1) | ES2077614T3 (no) |
| HU (1) | HU210680B (no) |
| IL (1) | IL95224A (no) |
| IT (1) | IT1231766B (no) |
| NO (1) | NO300508B1 (no) |
| PL (1) | PL165207B1 (no) |
| RU (1) | RU2048099C1 (no) |
| ZA (1) | ZA905973B (no) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK141790D0 (da) * | 1990-06-08 | 1990-06-08 | Novo Nordisk As | Middel |
| GB9023735D0 (en) * | 1990-11-01 | 1990-12-12 | Ici Plc | Bacterial strain |
| AU675628B2 (en) * | 1991-08-02 | 1997-02-13 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Novel microorganism and insecticide |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3346138A1 (de) * | 1983-12-21 | 1985-07-11 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Bacillus thuringiensis var. tenebrionis sowie ein insektizid wirkendes, hieraus erhaeltliches praeparat bzw. toxin sowie deren verwendung zur bekaempfung von coleoptera |
| US4764372A (en) * | 1985-03-22 | 1988-08-16 | Mycogen Corporation | Compositions containing bacillus thuringiensis toxin toxic to beetles of the order coleoptera, and uses thereof |
| US4865981A (en) * | 1985-08-16 | 1989-09-12 | Mycogen Corporation | Cloning and expression of Bacillus Thuringiensis toxin gene toxic to bettles of the order coleoptera |
| US4771131A (en) * | 1985-08-16 | 1988-09-13 | Mycogen Corporation | Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene encoding a protein toxic to beetles of the order Coleoptera |
| US4950471A (en) * | 1987-05-18 | 1990-08-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Acetate selected bacillus thuringiensis and the method of use |
| US4910016A (en) * | 1987-08-03 | 1990-03-20 | Mycogen Corporation | Novel Bacillus thuringiensis isolate |
| US4948734A (en) * | 1987-08-12 | 1990-08-14 | Mycogen Corporation | Novel isolates of bacillus thuringiensis having activity against nematodes |
| US4849217A (en) * | 1987-11-19 | 1989-07-18 | Mycogen Corporation | Novel isolates of bacilus thuringiensis having activity against the alfalfa weevil, hypera brunneipennis |
| US4966765A (en) * | 1988-02-23 | 1990-10-30 | Mycogen Corporation | Novel coleopteran-active Bacillus thuringiensis isolate |
| IT1240335B (it) * | 1990-03-21 | 1993-12-07 | Ministero Dell'universita' E Della Ricerca Scientifica E Tecnologi | Composizioni insetticide a base di bacillus thuringiensis |
-
1989
- 1989-08-01 IT IT8921412A patent/IT1231766B/it active
-
1990
- 1990-07-30 IL IL9522490A patent/IL95224A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-07-30 ZA ZA905973A patent/ZA905973B/xx unknown
- 1990-07-30 AU AU59984/90A patent/AU636633B2/en not_active Ceased
- 1990-07-31 DE DE69022509T patent/DE69022509T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-07-31 AT AT90114708T patent/ATE128186T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-07-31 ES ES90114708T patent/ES2077614T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-31 DK DK90114708.2T patent/DK0411582T3/da active
- 1990-07-31 BR BR909003738A patent/BR9003738A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-07-31 NO NO903378A patent/NO300508B1/no not_active IP Right Cessation
- 1990-07-31 EP EP90114708A patent/EP0411582B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-31 HU HU904691A patent/HU210680B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-07-31 US US07/560,848 patent/US5120536A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-07-31 PL PL90286279A patent/PL165207B1/pl unknown
- 1990-07-31 RU SU904830849A patent/RU2048099C1/ru active
- 1990-08-01 JP JP2204942A patent/JPH0380074A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1231766B (it) | 1991-12-21 |
| HU210680B (en) | 1995-06-28 |
| BR9003738A (pt) | 1991-09-03 |
| ATE128186T1 (de) | 1995-10-15 |
| PL286279A1 (en) | 1991-12-02 |
| RU2048099C1 (ru) | 1995-11-20 |
| EP0411582A1 (en) | 1991-02-06 |
| IL95224A0 (en) | 1991-06-10 |
| HUT58789A (en) | 1992-03-30 |
| PL165207B1 (pl) | 1994-11-30 |
| IL95224A (en) | 1995-01-24 |
| US5120536A (en) | 1992-06-09 |
| HU904691D0 (en) | 1991-01-28 |
| DK0411582T3 (da) | 1995-11-06 |
| JPH0380074A (ja) | 1991-04-04 |
| ZA905973B (en) | 1991-05-29 |
| DE69022509D1 (de) | 1995-10-26 |
| AU5998490A (en) | 1991-02-07 |
| NO903378L (no) | 1991-02-04 |
| ES2077614T3 (es) | 1995-12-01 |
| DE69022509T2 (de) | 1996-03-14 |
| NO903378D0 (no) | 1990-07-31 |
| IT8921412A0 (it) | 1989-08-01 |
| AU636633B2 (en) | 1993-05-06 |
| EP0411582B1 (en) | 1995-09-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Spiegel et al. | Evaluation of a newly isolated bacterium, Pseudomonas chitinolytica sp. nov., for controlling the root‐knot nematode Meloidogynejavanica | |
| KR100736253B1 (ko) | 식물 질병을 방제하는 ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ의균주 | |
| US5837526A (en) | Bacillus strain and harmful organism controlling agents | |
| JP2571842B2 (ja) | 新規なバチルス・スリンギエンシス菌株、それらの分離方法および関連する組成物 | |
| JPH0722506B2 (ja) | 抗菌活性を有する微生物菌株 | |
| EP0228228A2 (en) | Mutants of bacillus thuringiensis | |
| HU220582B1 (hu) | Készítmény és eljárás növénybetegségek elleni védelemhez | |
| US8076119B2 (en) | Brevibacillus laterosporus strain compositions containing the same and method for the biological control of Dipters | |
| JPH01273581A (ja) | 新規なバチルス菌株ａ２０及びａ２９及びそれを含有する殺虫剤組成物並びに植物保護法 | |
| JPH10504451A (ja) | 新規の双翅類活性化合物及びバチルス チューリングエンシス株 | |
| US5266483A (en) | Bacillus strain and insect pest controlling agent | |
| NO300508B1 (no) | Biologisk renkultur av Bacillus thuringiensis-bakterie, krystallinsk, parasporalt proteintoksin erholdt fra denne, insekticidpreparat som inneholder dette, samt anvendelse av disse til bekjempelse av insekter | |
| JP2003530097A (ja) | ｐＨ調節された発酵培養液を加熱処理することによる殺線虫性組成物の製造方法 | |
| KR100280380B1 (ko) | 바실러스투린지엔시스 엔티0423 균주의 내독소단백질 및 이를 이용한 미생물 살충제 | |
| KR102110201B1 (ko) | 바실러스 시아멘시스 emlb-20nts3 균주를 포함한 생물학적 방제제 및 이를 이용한 방제방법 | |
| KR100319135B1 (ko) | 식물병해 길항 미생물 제제 | |
| CN108070534B (zh) | 防治黄曲条跳甲的苏云金芽孢杆菌及制剂与应用 | |
| JP2001149066A (ja) | バチルス・ポピリエの胞子嚢の製造方法 | |
| WO2024085482A1 (ko) | 살충 및 살균 활성을 갖는 신규한 메타리지움 핑핸스 １５ｒ 균주 및 이의 용도 | |
| JPS61205202A (ja) | 殺線虫材及び殺線虫法 | |
| KR20220097326A (ko) | 포자 형성속도가 빠르며 파리목 해충에 살충 효과를 가지는 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주 및 이의 용도 | |
| RU1825300C (ru) | Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS VaR.кURSтакI дл получени инсектицидного препарата против насекомых отр да LерIDортеRа | |
| JPH06305927A (ja) | 黒腐病の防除方法 | |
| CA2022362A1 (en) | Bacillus thuringiensis var. donegani, preparate or toxin obtained from it, endowed with insecticide activity against coleoptera | |
| JP2005295924A (ja) | 植物の病害を防除する放線菌、およびそれを用いた植物の病害の防除剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN JANUARY 2001 |