RU2048099C1 - Штамм бактерий bacillus thuringiensis var donegani для получения инсектицидного препарата против жесткокрылых насекомых, кристаллический параспоральный белковый токсин и способ борьбы с жесткокрылыми насекомыми - Google Patents
Штамм бактерий bacillus thuringiensis var donegani для получения инсектицидного препарата против жесткокрылых насекомых, кристаллический параспоральный белковый токсин и способ борьбы с жесткокрылыми насекомыми Download PDFInfo
- Publication number
- RU2048099C1 RU2048099C1 SU904830849A SU4830849A RU2048099C1 RU 2048099 C1 RU2048099 C1 RU 2048099C1 SU 904830849 A SU904830849 A SU 904830849A SU 4830849 A SU4830849 A SU 4830849A RU 2048099 C1 RU2048099 C1 RU 2048099C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- toxin
- bacillus thuringiensis
- donegani
- ncimb
- strain
- Prior art date
Links
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 title claims abstract description 17
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 101000664393 Bacillus thuringiensis subsp. finitimus S-layer protein Proteins 0.000 title abstract 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title description 12
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 title 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims abstract 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims abstract 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract 2
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims description 17
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 5
- 241000256626 Pterygota <winged insects> Species 0.000 claims 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 abstract description 32
- 239000003053 toxin Substances 0.000 abstract description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 4
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 abstract description 4
- 241000254109 Tenebrio molitor Species 0.000 abstract description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 29
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000122098 Ephestia kuehniella Species 0.000 description 2
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 241000256250 Spodoptera littoralis Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000254112 Tribolium confusum Species 0.000 description 1
- 239000002318 adhesion promoter Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000822 sequential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 235000011845 white flour Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
- A01N63/23—B. thuringiensis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Использование: производство микробиологических средств защиты растений от насекомых и касается нового штамма бактерий для получения вышеуказанного средства, кристаллического параспорального белкового токсина и способа борьбы с жесткокрылыми насекомыми. Сущность изобретения: штамм Bacillus thuringiensis var donegani выделен из мертвых личинок Tenebrio molitor, депонирован в Национальной коллекции промышленных и морских бактерий, Лимитед, под. NNCIMB 40152. При культивировании штамма на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, продуцирует параспоральный белковый токсин, имеющий форму параллелепипеда с квадратным основанием, в верхней и нижней плоскостях которого построены две пирамиды с равными основаниями. Токсин растворим в воде при нейтральном значении pH и имеет мол.м. 64000-72000 и 34000-36000 Да. При обработке личинок Leptinotarsa decemlineata второй возрастной стадии на 5 сут. наблюдается 100%-ная смертность. 3 с.п.ф-лы, 15 табл.
Description
Изобретение относится к штамму Bacillus thuringiensis "var. donegani" (Btd) NCIMB 40152, к препарату или токсину, полученному из него, обладающему инсектицидной активностью против Coleoptera.
Известно, что спорогенная бацилла Bacillus Thutingiensis (Bt) во время стадии спорогенеза продуцирует параспоральные кристаллы белковой природы и проявляет инсектицидную активность против большого числа насекомых, принадлежащих к отрядам Lepidoptera, Diptera и Coleoptera. Такие кристаллы при проглатывании насекомым, чувствительным к их активности, вызывают необратимые разрушения кишечной слизистой оболочки, причем насекомое перестает питаться и погибает.
Известны многие разновидности Bt, которые отличаются друг от друга биохимическими и/или физиологическими характеристиками и их удельной/селективной инсектицидной активностью. Некоторые из этих разновидностей поставляются на рынок в качестве средств для использования в борьбе против насекомых.
Известные разновидности Bt подразделяются на основе их удельной/селективной активности на три патотипа (табл. 1).
В качестве патотипа С, обладающего удельной активностью против coleoptera, в литературе известны только две разновидности, то есть var. tenebrionis, заявленная в заявке на Европатент N 149162, и var. san diego, заявленная в заявке на Европатент N 202739.
Предлагаемое изобретение касается получения штамма Bt и инсектицидного препарата или токсина, полученного из него, обладающего улучшенной удельной инсектицидной активностью против coleoptera. Получение данного штамма является более дешевым, простым и более эффективным.
Обнаружен штамм Bacillus thurin- giensis патотип С, обозначенный var. donegani (Btd), NCIMB 40152. Выделенный из него инсектицидный препарат или токсин неожиданно обладает общей инсектицидной активностью.
Следовательно, предметом изобретения является разновидность donegani штамм NCIMB 40152 Bacillus thuringiensis.
Другим предметом изобретения является кристаллический параспоральный белковый токсин, получаемый из культур разновидности donegani NCIMB 40152 Bacillus thuringiensis после спорогенеза и последующего лизиса спорангия.
Кроме того, предметом изобретения является способ борьбы с насекомыми, в частности coleoptera, который предусматривает нанесение на растения или на их части, такие как листья, стебли, или в почву, на которой они произрастают, эффективного количества Btd NCIMB 40152, препарата или токсина на основе выделенного из данной разновидности, как такового или в качестве пригодной композиции, содержащей инертный, твердый или жидкий носитель или другие добавки.
Bacillus thuringiensis var. donegani (Btd) NCIMB 40152 обладает удельной инсектицидной активностью против coleoptera, в частности против листоеда Leptinotarsa decemlineata (Doriphora картофеля), и поэтому принадлежит к патотипу С. Btd NCIMB 40152 отличается от известных разновидностей Btd тем, что она обладает другими биохимическими и физиологическими характеристиками и, в частности, отличается от разновидностей tenebrionis и san diego также тем, что продуцирует параспоральный кристалл с другими морфологическими характеристиками, а также иными физико-химическими и физиологическими характеристиками.
Морфология и биохимические характеристики Btd NCIMB 40152.
Штамм Bacillus thuringiensis var. donegani (Btd) NCIMB 40152 был выделен из мертвых личинок Tenebrio molitor и включен в прейскурант для внутреннего лабораторного использования с традиционным кодом ВТ/43. Выделенный клон культивировали на агаризованной твердой питательной среде, которой была придана селективность при помощи добавления 10 ед./мл Пенициллина G. Насекомых предварительно обрабатывали при температуре 80оС в течение 15-20 мин с целью селективного выделения спорогенных бацилл. Культуру данного микроорганизма внесли в реестр в соответствии с Будапештским Договором в Национальной Коллекции Промышленных Бактерий (свидетельство о происхождении: Национальная коллекция промышленных и морских бактерий Лимитед. Торри Рисерч Стэйшн, Р.О. Вох 31, 135 Abbey Road, Абердин АВ 98 DG, Шотландия, Великобритания), где ей присвоен депозитарный номер NCIMB 40152.
Btd NCIMB 40152 можно хранить на обычных средах, например агаризованной твердой питательной среде, при температуре 25-30оС, и размножать с использованием методик, известных специалисту в данной области знания.
Определение рода и вида было осуществлено на основе морфологических и биологических характеристик микроорганизма.
Морфология.
Выделенные колонии Btd NCIMB 40152 на агаризованной твердой питательной среде являются плоскими, имеющими либо кольцевую, либо нерегулярную форму, а также аэродированный или дольчатый край, причем они имеют бледный цвет. Вегетативная клетка имеет форму маленького стержня, является грамположительной, имеет диаметр от 1 до 2 мкм и длину от 6 до 8 мкм.
Температура выращивания составляет от 25 до 35оС.
Когда культуру микроорганизма обрабатывают в автоклаве при температуре 121оС в течение 15 мин, и споры, и токсин инактивируются.
Положение споры является центральным или субтерминальным. Параспоральный кристалл, наблюдаемый под растровым электронным микроскопом, имеет форму параллелепипеда с прямоугольным основанием и двумя пирамидами с равными основаниями на верхней грани и нижней грани, с размерами, составляющими от 1 до 2 мкм, и поэтому отличается от параспорального кристалла, продуцируемого разновидностями Bt tenebrionis и san diego, который в обоих случаях является плоским и имеет форму параллелограмма.
Биохимические характеристики.
Btd NCIMB 40152 в своей вегетативной стадии имеет биохимические характеристики, приведенные в табл. 2.
Метод, используемый в данном описании, описан (Прокариоты. Спрингер Верлаг, 1981. Руководство по методом для общей бактериологии. Американское общество микробиологии).
Расхождение между Btd 40152 и известными в данной области техники разновидностями можно также выявить путем сравнения биохимических характеристик Btd 40152 c теми, которые присущи известным разновидностям Bt, как приведено в табл. 3.
Характеристики, относящиеся к культуре, и методы выделения активного начала.
Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152 можно культивировать на общих жидких средах, таких как, например, питательный бульон, при температуре 25-30оС с использованием известных в данной области техники методик.
К концу процесса ферментации и спорогенеза биомассу можно разделить центрифугированием ферментационного бульона.
Разделенную таким образом биомассу можно затем подвергнуть упариванию или лиофилизации с тем, чтобы получить твердый продукт в порошковой форме, обладающий инсектицидной активностью. Инсектицидная активность Btd NCIMB 40152 в основном обусловлена параспоральным кристаллическим токсином белковой природы, который растворяется в воде при нейтральном значении рН в отличие от токсина, продуцируемого разновидностями Bt tenebrionis и san diego. Следовательно, такой токсин может быть выделен путем суспендирования в воде при нейтральном значении рН, при этом биомассу выделяют центрифугированием из ферментационного бульона после спорогенеза, и путем сохранения полученной таким образом суспензии при перемешивании, при комнатной температуре в течение периода времени от 1 до 12 ч.
После последовательного центрифугирования или фильтрации водной суспензии восстанавливают водный раствор, свободный от спор и ферментационных остатков, который в основном содержит белковый токсин. Белковый токсин может быть извлечен из раствора при помощи хорошо известных методик, таких как лиофилизация.
Затем определен молекулярный вес токсина с использованием электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. При этом были выявлены две следующие основные группы полос:
первая группа из трех полос с мол.м. составляющей от 64000 до 72000,
вторая группа из двух полос с мол.м. составляющей от 34000 до 36000.
первая группа из трех полос с мол.м. составляющей от 64000 до 72000,
вторая группа из двух полос с мол.м. составляющей от 34000 до 36000.
Биологическая активность.
Btd NCIMB 40152, препарат или токсин, полученный из данного штамма, проявляет инсектицидную активность против coleoptera, например Leptinotarsa decemlineata.
В противоположность этому никаких токсичных эффектов не наблюдается в отношении некоторых Lepidoptera, таких как например, Spodoptera littoralis и Ephestia kuehniella, а также в отношении Dipteran Aedes aegypti.
Модульность действия активного начала против личинок Coleoptera является аналогичной, как в случае препаратов на основе патотипа А Bt, несколько часов после обработки личинки прекращают питание и умирают через 24-48 ч. Смерть происходит в результате воздействия токсина на кишечный эпителий насекомого, который подвергается необратимым повреждениям.
Лиофилизированные твердые продукты, полученные в результате ферментации и спорогенеза Btd NCIMB 40152, а также его параспоральный белковый токсин как таковой или в виде пригодной композиции, следовательно, являются пригодными в борьбе против Coleoptera, которые заражают сельскохозяйственные угодия. По этой причине предпочтительно использовать выделенный токсин.
По сравнению с токсинами, полученными из известных разновидностей Bt и, в частности, разновидностей tenebrionis и san diego патотипа С, токсин, полученный из Btd NCIMB 40152 в соответствии с предлагаемым изобретением имеет целый ряд преимуществ на коммерческо-промышленном уровне относительно его извлечения, его применения и его инсектицидной активности. Эти преимущества состоят в следующем:
выделение токсина из культуральной среды является более простым и более легким благодаря растворимости данного токсина в воде, а следовательно, указанный токсин может быть получен в концентрированной форме, свободной от спор, клеток и ферментационных остатков;
концентрированные водные растворы токсина, которые в отличие от суспензий или дисперсий известных токсинов не осаждаются, могут храниться и транспортироваться более легко;
токсин может наноситься из его растворов более легко и эффективно, нежели аналогичные токсины, которые наносят диспергированными в твердой форме благодаря их несовместимости с традиционными органическими растворителями, используемыми в композициях.
выделение токсина из культуральной среды является более простым и более легким благодаря растворимости данного токсина в воде, а следовательно, указанный токсин может быть получен в концентрированной форме, свободной от спор, клеток и ферментационных остатков;
концентрированные водные растворы токсина, которые в отличие от суспензий или дисперсий известных токсинов не осаждаются, могут храниться и транспортироваться более легко;
токсин может наноситься из его растворов более легко и эффективно, нежели аналогичные токсины, которые наносят диспергированными в твердой форме благодаря их несовместимости с традиционными органическими растворителями, используемыми в композициях.
Кроме того, неожиданно обнаружено, что токсин, происходящий от Btd NCIMB 40152, также проявляет общую инсектицидную активность в отличие от токсинов, продуцируемых другими разновидностями Bt.
Такая общая активность заключается в том, что активное начало мигрирует к частям растений более быстро от точки нанесения, что гарантирует более широкую защиту растения и делает возможным использование меньших количеств активного начала; в частности, токсин в соответствии с предлагаемым изобретением движется через корневой аппарат растений.
Кроме того, токсин может действовать эффективно в течение более продолжительных периодов времени, так как, проникая в васкулярную систему растения, он более защищен от воздействия внешних агентов, которые имеют склонность к его расщеплению или вымыванию.
Общая активность токсина является еще более благоприятной, когда обрабатывают растения, которые находятся в стадии их роста.
Кроме того, общая (системная) активность наделяет токсин более высокой эффективностью в превентивных обработках и уменьшает необходимость проведения повторных обработок во время цикла роста растений.
Продукт Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152, полученный в результате его ферментации и спорогенеза, а также параспоральный токсин может использоваться в виде концентрированных жидкостей, смачиваемых порошков с использованием жидких или твердых инертных носителей, а также композиционных вспомогательных средств и/или добавок, таких как смачивающие вещества, промоторы адгезии, поверхностно-активные вещества, стабилизаторы и другие добавки, обычно используемые в инсектицидных составах.
Для практического применения в сельском хозяйстве пригодны те дозы, которые, как в случае использования токсина из Btd NCIMB 40152, составляют от 0,05 до 4 кг/га и предпочтительно от 0,2 до 2 кг/га.
П р и м е р 1. Колбы Эрленмейера объемом 500 мл, содержащие 100 мл среды, состоящей из триптонового соевого бульона (OXOID), инокулируют 1 мл 16-часовой культуры Bacillus thuringiensis NCIMB 40152 в питательном бульоне в качестве среды.
Колбы Эрленмейера поддерживают при орбитальном перемешивании при температуре от 25 до 35оС. Спорогенез проверяют на микроскопе. В конце ферментации биомассу центрифугируют, суспендируют вновь в воде с рН 7 и поддерживают при перемешивании в течение 3 ч при комнатной температуре. Раствор, полученный после выделения центрифугированием спор и ферментационных остатков, лиофилизируют и используют для определения биологической активности или для получения составов.
П р и м е р 2. Определение инсектицидной активности лиофилизированного препарата, полученного в соответствии с примером 1, в основном состоящего из параспорального белкового токсина, осуществляют с использованием данного препарата в виде водного раствора при различных концентрациях.
Модальности проведения испытаний на активность в соответствии с используемым насекомым приведены ниже.
LEPTINOTARSA DECEMLINEATA
Покрывающая активность.
Покрывающая активность.
Личинок второй возрастной стадии кормят молодыми растениями картофеля, обработанными водным раствором лиофилизированного токсина, как описано в примере 1. Условия окружающей среды во время наблюдения следующие: температура составляет 25±1оС, относительная влажность составляет 60±2% Конечное определение смертности осуществляют через 48 ч после заражения; результаты приведены в табл. 4.
Общая активность.
Личинок насекомого второй возрастной стадии кормят молодыми растениями картофеля, которые поддерживаются 12 ч и 24 ч в культуре без почвы, содержащей лиофилизированный препарат в соответствии с примером 1, растворенный при концентрации 200 ppm. По истечении 48-часового периода сохранения личинок в кондиционированной среде, температура 25оС и относительная влажность 60% в обоих случаях определяют 100%-ную смертность насекомых.
TRIBOLIUM CONFUSUM, TENEBRIO MOLITOR, EPHESTIA KUEHNIELLA
Личинок третьей возрастной стадии выращивают при регулируемых условиях, температуре 25±1оС, относительной влажности 65±2% в белой муке с предварительным прибавлением в нее лиофилизированного продукта примера 1. Смертность определяют через 14 дней заражения; результаты приведены в табл. 4.
Личинок третьей возрастной стадии выращивают при регулируемых условиях, температуре 25±1оС, относительной влажности 65±2% в белой муке с предварительным прибавлением в нее лиофилизированного продукта примера 1. Смертность определяют через 14 дней заражения; результаты приведены в табл. 4.
AEDES AEGYPTI
Активность: личинок третьей возрастной стадии переносят в дистиллированную воду, содержащую лиофилизированный препарат примера 1. Личинок сохраняют при регулируемых условиях при температуре 25±1оС, относительной влажности 60% и кормят ежедневно. Смертность, приведенную в табл. 4, измеряют через 5 дней после начала обработки.
Активность: личинок третьей возрастной стадии переносят в дистиллированную воду, содержащую лиофилизированный препарат примера 1. Личинок сохраняют при регулируемых условиях при температуре 25±1оС, относительной влажности 60% и кормят ежедневно. Смертность, приведенную в табл. 4, измеряют через 5 дней после начала обработки.
SPODOPTERA LITTORALIS
Покрывающая активность: личинок второй возрастной стадии кормят табачными листьями, обработанными погружением в водный раствор лиофилизированного продукта, описанного в примере 1. Окружающие условия во время наблюдения: температура 25±1оС, относительная влажность 60±2% Определение смертности осуществляют через 5 дней после заражения; результаты приведены в табл. 4.
Покрывающая активность: личинок второй возрастной стадии кормят табачными листьями, обработанными погружением в водный раствор лиофилизированного продукта, описанного в примере 1. Окружающие условия во время наблюдения: температура 25±1оС, относительная влажность 60±2% Определение смертности осуществляют через 5 дней после заражения; результаты приведены в табл. 4.
Для определения активности B. thuringiensis в отношении Coleoptera в качестве стандарта использовали упомянутый препарат 5653, который имеет активность 50000 колор. жидкости МЕ/мг (СРВ 1 Us/mg) (табл. 5).
Claims (3)
1. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var donegani N NCIMB 40152 для получения инсектицидного препарата против жесткокрылых насекомых.
2. Кристаллический пароспоральный белковый токсин, обладающий инсектицидной активностью против жесткокрылых насекомых, полученный путем культивирования штамма бактерий Bacillus thuringiensis var donegani N NCIMB 40152 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, имеющий форму параллелепипеда с квадратным основанием, в верхней и нижней плоскостях которого построены две пирамиды с равными основаниями, размером 1 2 нт, растворимый в воде при нейтральном значении рН и имеющий мол.м. 64000 72000 и 34000 36000 Да, при определении электрофорезом и додецил-сульфат-натрий полиакриламидном геле.
3. Способ борьбы с жесткокрылыми насекомыми путем обработки растений или почвы, на которой выращивают растения, препаратом, полученным на основе штамма бактерии Bacillus thuringiensis, отличающийся тем, что из штаммов бактерий Bacillus thuringiensis используют штамм бактерий Bacillus thuringiensis var donegani N NCIMB 40152.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT8921412A IT1231766B (it) | 1989-08-01 | 1989-08-01 | Bacillus thuringiensis var. donegani, preparato o tossina da esso ottenuta aventi attivita' insetticida contro i coleotteri. |
| IT21412A/89 | 1989-08-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2048099C1 true RU2048099C1 (ru) | 1995-11-20 |
Family
ID=11181378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU904830849A RU2048099C1 (ru) | 1989-08-01 | 1990-07-31 | Штамм бактерий bacillus thuringiensis var donegani для получения инсектицидного препарата против жесткокрылых насекомых, кристаллический параспоральный белковый токсин и способ борьбы с жесткокрылыми насекомыми |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5120536A (ru) |
| EP (1) | EP0411582B1 (ru) |
| JP (1) | JPH0380074A (ru) |
| AT (1) | ATE128186T1 (ru) |
| AU (1) | AU636633B2 (ru) |
| BR (1) | BR9003738A (ru) |
| DE (1) | DE69022509T2 (ru) |
| DK (1) | DK0411582T3 (ru) |
| ES (1) | ES2077614T3 (ru) |
| HU (1) | HU210680B (ru) |
| IL (1) | IL95224A (ru) |
| IT (1) | IT1231766B (ru) |
| NO (1) | NO300508B1 (ru) |
| PL (1) | PL165207B1 (ru) |
| RU (1) | RU2048099C1 (ru) |
| ZA (1) | ZA905973B (ru) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK141790D0 (da) * | 1990-06-08 | 1990-06-08 | Novo Nordisk As | Middel |
| GB9023735D0 (en) * | 1990-11-01 | 1990-12-12 | Ici Plc | Bacterial strain |
| ES2124738T3 (es) * | 1991-08-02 | 1999-02-16 | Mycogen Corp | Nuevo microorganismo e insecticida. |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3346138A1 (de) * | 1983-12-21 | 1985-07-11 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Bacillus thuringiensis var. tenebrionis sowie ein insektizid wirkendes, hieraus erhaeltliches praeparat bzw. toxin sowie deren verwendung zur bekaempfung von coleoptera |
| US4764372A (en) * | 1985-03-22 | 1988-08-16 | Mycogen Corporation | Compositions containing bacillus thuringiensis toxin toxic to beetles of the order coleoptera, and uses thereof |
| US4771131A (en) * | 1985-08-16 | 1988-09-13 | Mycogen Corporation | Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene encoding a protein toxic to beetles of the order Coleoptera |
| US4865981A (en) * | 1985-08-16 | 1989-09-12 | Mycogen Corporation | Cloning and expression of Bacillus Thuringiensis toxin gene toxic to bettles of the order coleoptera |
| US4950471A (en) * | 1987-05-18 | 1990-08-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Acetate selected bacillus thuringiensis and the method of use |
| US4910016A (en) * | 1987-08-03 | 1990-03-20 | Mycogen Corporation | Novel Bacillus thuringiensis isolate |
| US4948734A (en) * | 1987-08-12 | 1990-08-14 | Mycogen Corporation | Novel isolates of bacillus thuringiensis having activity against nematodes |
| US4849217A (en) * | 1987-11-19 | 1989-07-18 | Mycogen Corporation | Novel isolates of bacilus thuringiensis having activity against the alfalfa weevil, hypera brunneipennis |
| US4966765A (en) * | 1988-02-23 | 1990-10-30 | Mycogen Corporation | Novel coleopteran-active Bacillus thuringiensis isolate |
| IT1240335B (it) * | 1990-03-21 | 1993-12-07 | Ministero Dell'universita' E Della Ricerca Scientifica E Tecnologi | Composizioni insetticide a base di bacillus thuringiensis |
-
1989
- 1989-08-01 IT IT8921412A patent/IT1231766B/it active
-
1990
- 1990-07-30 AU AU59984/90A patent/AU636633B2/en not_active Ceased
- 1990-07-30 ZA ZA905973A patent/ZA905973B/xx unknown
- 1990-07-30 IL IL9522490A patent/IL95224A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-07-31 US US07/560,848 patent/US5120536A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-07-31 AT AT90114708T patent/ATE128186T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-07-31 EP EP90114708A patent/EP0411582B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-31 RU SU904830849A patent/RU2048099C1/ru active
- 1990-07-31 DE DE69022509T patent/DE69022509T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-07-31 BR BR909003738A patent/BR9003738A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-07-31 DK DK90114708.2T patent/DK0411582T3/da active
- 1990-07-31 HU HU904691A patent/HU210680B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-07-31 NO NO903378A patent/NO300508B1/no not_active IP Right Cessation
- 1990-07-31 PL PL90286279A patent/PL165207B1/pl unknown
- 1990-07-31 ES ES90114708T patent/ES2077614T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-01 JP JP2204942A patent/JPH0380074A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Европейский патент N 0149162, кл. A 01N 63/00, 1985. * |
| Европейский патент N 0202739, кл. A 01N 63/00, 1986. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL165207B1 (pl) | 1994-11-30 |
| EP0411582A1 (en) | 1991-02-06 |
| IL95224A (en) | 1995-01-24 |
| IT8921412A0 (it) | 1989-08-01 |
| IL95224A0 (en) | 1991-06-10 |
| HUT58789A (en) | 1992-03-30 |
| JPH0380074A (ja) | 1991-04-04 |
| AU5998490A (en) | 1991-02-07 |
| PL286279A1 (en) | 1991-12-02 |
| ATE128186T1 (de) | 1995-10-15 |
| BR9003738A (pt) | 1991-09-03 |
| AU636633B2 (en) | 1993-05-06 |
| DK0411582T3 (da) | 1995-11-06 |
| US5120536A (en) | 1992-06-09 |
| EP0411582B1 (en) | 1995-09-20 |
| NO300508B1 (no) | 1997-06-09 |
| NO903378L (no) | 1991-02-04 |
| ZA905973B (en) | 1991-05-29 |
| HU210680B (en) | 1995-06-28 |
| DE69022509D1 (de) | 1995-10-26 |
| DE69022509T2 (de) | 1996-03-14 |
| ES2077614T3 (es) | 1995-12-01 |
| NO903378D0 (no) | 1990-07-31 |
| IT1231766B (it) | 1991-12-21 |
| HU904691D0 (en) | 1991-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69227911T2 (de) | Neuer mikroorganismus und insektizid | |
| Karamanlidou et al. | Toxicity of Bacillus thuringiensis to laboratory populations of the olive fruit fly (Dacus oleae) | |
| US5063055A (en) | Preparation of strains of bacillus thuringiensis having an improved activity against certain lepidopterous pests and novel strain produced thereby | |
| HU195724B (en) | Insecticide compositions containing new c-pathotipe bacillus thuringiensis stock or theyr toxin as active component and process for producing the active component | |
| EP0366668B1 (en) | Novel bacillus thuringiensis strains, method for their isolation and related insecticidal compositions | |
| JPS63273470A (ja) | 抗菌活性を有する微生物菌株 | |
| EP0228228A2 (en) | Mutants of bacillus thuringiensis | |
| DE3888958T2 (de) | Bakterienstämme. | |
| US5747025A (en) | Biological control of pests | |
| Junge et al. | Strain selection, production, and formulation of the biological plant vitality enhancing agent FZB24® Bacillus subtilis | |
| JPH10504451A (ja) | 新規の双翅類活性化合物及びバチルス チューリングエンシス株 | |
| RU2048099C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus thuringiensis var donegani для получения инсектицидного препарата против жесткокрылых насекомых, кристаллический параспоральный белковый токсин и способ борьбы с жесткокрылыми насекомыми | |
| US5516514A (en) | Insect controlling agent from strains of Bacillus thuringiensis var. Kurstaki | |
| DE3874512T2 (de) | Bazillus thuringiensis-staemme. | |
| KR20220097325A (ko) | 포자 형성속도가 빠르며 나방목 해충에 살충 효과를 가지는 바실러스 투린지엔시스 아종 쿠르스타키(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki) KNU-25 균주 및 이의 용도 | |
| JPH11332556A (ja) | 新規微生物及びそれを用いたコガネムシ科昆虫の防除方法 | |
| JP2001149066A (ja) | バチルス・ポピリエの胞子嚢の製造方法 | |
| KR20220097326A (ko) | 포자 형성속도가 빠르며 파리목 해충에 살충 효과를 가지는 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis) KNU-26 균주 및 이의 용도 | |
| RU1825300C (ru) | Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS VaR.кURSтакI дл получени инсектицидного препарата против насекомых отр да LерIDортеRа | |
| RU1794434C (ru) | Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS дл изготовлени энтомопатогенного препарата | |
| CA2022362A1 (en) | Bacillus thuringiensis var. donegani, preparate or toxin obtained from it, endowed with insecticide activity against coleoptera | |
| CA2118207C (en) | Bacillus thuringiensis m200 for the biological control of agricultural and horticultural entomological pests | |
| Jayaraman et al. | Active against Lepidopteran Agricultural Pests, by the Use of Continuous Culture Studies | |
| JPH07227275A (ja) | 新規なバチルス チュリンゲンシス及びそれを含有する害虫防除剤並びに植物保護法 |