HU210680B

HU210680B - Insecticid preparate againts cleoptera and process for its use and process for producing toxin from bacillus thuringiensis var. donegani

Info

Publication number: HU210680B
Application number: HU904691A
Authority: HU
Inventors: Vincenzo Caprioli; Adriana Vallesi; Andrea Cappai; Dante Cidaria; Giorgio Pirali
Original assignee: Mini Ricerca Scient Tecnolog
Priority date: 1989-08-01
Filing date: 1990-07-31
Publication date: 1995-06-28
Also published as: ATE128186T1; NO300508B1; NO903378D0; HUT58789A; EP0411582A1; BR9003738A; PL286279A1; IL95224A0; ES2077614T3; ZA905973B; IT8921412A0; HU904691D0; EP0411582B1; RU2048099C1; US5120536A; DE69022509D1; DK0411582T3; IL95224A; AU636633B2; DE69022509T2

Description

A találmány tárgya Coleoptera elleni szelektív hatású inszekticid készítmény, és eljárás a hatóanyagot képező toxin előállítására Bacillus thuringiensis var. donegani (Btd) NCIMB 40 152 baktériumból.

Ismeretes, hogy a spóraképző bacillusok közé tartozó Bacillus thuringiensis (Bt) a spóraképződési szakaszban fehéqe jellegű, paraspórás kristályokat képez, amelyek a Lepidoptera, Diptera és Coleoptera rendbe tartozó rovarok széles körére inszekticid aktivitást fejtenek ki. Ha a fenti kristályokat az arra érzékeny rovarok megeszik, a bél-nyálkahártyában olyan irreverzbíilis károsodás keletkezik, hogy a rovarok nem tudnak táplálkozni és ennek következtében elpusztulnak.

A Bt számos fajtája ismert, amelyek egymástól biokémiai és/vagy fiziológiai tulajdonságaikban és specifikus/szelektív inszekticid aktivitásukban különböznek. A fenti fajták némelyikét inszekticid készítmény formájában forgalomba is hozták.

Az ismert Bt fajták specifikus/szelektív aktivitásuk alapján három patotípusra oszthatók:

Patotípus	Specifikus inszekticid aktivitás	Fő fajták
A	Lepidoptera	kurstaki
B	Diptera	israelensis
C	Coleoptera	tenebrionis san diego

A Coleoptera elleni specifikus aktivitású C patotípust illetően, csak két fajta ismert a szakirodalomból, mégpedig a var. tenebrionis (149 162 számú európai szabadalmi leírás) és a var. san diego (202 739 számú európai szabadalmi leírás).

Célunk olyan új Bt fajta izolálása volt, amelyből Coleoptera ellen nagyobb hatású, specifikus inszekticid aktivitású készítmény vagy toxin nyerhető, egyszerűbb, olcsóbb és hatékonyabb módon, mint az ismert baktériumokból.

Sikerült egy olyan új, C patotípusba tartozó Bacillus thuringiensis fajtát izolálnunk, amelyet var. donegani-nak (Btd) neveztünk (letétbe helyezési szám NCIMB 40 152) és abból inszekticid készítményt, illetve toxint előállítanunk, amely az ismert C patotípusú Bt-fajtáknál előnyösebb, Coleoptera elleni inszekticid aktivitását, előállítását és mezőgazdasági alkalmazását tekintve, mivel meglepő szisztemikus inszekticid aktivitással rendelkezik.

A találmány tárgya eljárás a kristályos, paraspórás fehérje jellegű toxin előállítására Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40 152 tenyészetéből, a spóraképződés után a spórátok lízisével.

A találmány további tárgya inszekticid készítmény, amely hatóanyagként a Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40 152 tenyészetéből a spóraképződés után a spórátok lízisével kapott kristályos, paraspórás protein jellegű toxint tartalmazza.

A találmány további tárgya inszekticid készítmény, amelynek hatóanyagát Bacillus thuringienses var. donegani NCIMB 40 152 fermentálásával és spóraképzésével nyert szilárd, liofilezett termék (biomassza) képezi.

A találmány értelmében a rovarok, közelebbről a Coleoptera rendbe tartozó rovarok úgy irthatók, hogy a növényre, vagy annak részeire, például szárára, leveleire, vagy a talajra, amelyen termesztik, a Btd NCIMB 40 152 tenyészetéből kapott biomasszát vagy toxint 0,05-4 kg/ha dózisban felvisszük, megfelelő inért, szilárd vagy cseppfolyós hordozóanyagokat és egyéb adalékanyagokat tartalmazó készítmény formájában.

A Bacillus thuringiensis var. donegani (Btd) NCIMB 40 152 Coleoptera elleni specifikus inszekticid aktivitással rendelkezik, különösen a mezőgazdaságilag fontos kártevők, például a Leptinotarsa decemlineata levélbogár (burgonyakártevő) ellen, így a C patotípusba tartozik, A. Krieg és munkatársai osztályozása szerint [Z. Ang. Ént. 96, 500-508 (1983)].

A Btd NCIMB 40 152 az ismert Bt fajtáktól eltérő biokémiai és fiziológiai tulajdonságokkal rendelkezik, és különösen eltér a tenebrionis és san diego fajtáktól is, amennyiben eltérő morfológiai tulajdonságú paraspórás kristályt képez, amelynek fizikai-kémiai és fiziológiai tulajdonságai is eltérőek.

A Btd NCIMB 40 152 morfológiai és biokémiai jellemzői

A Bacillus thuringiensis var. donegani (Btd) NCIMB 40 152 törzset természetes okokból elpusztult Tenebrio molitor lárvákból izoláltuk, és belső laboratóriumi használatra BT/43 kódszámmal katalogizáltuk.

Az izolálást 10 egység/ml G-penicillinnel szelektívvé tett agaros tápközegen (Nutrient agar) végeztük. A rovarok béltartalmát előzőleg 80 ’C-on 15-20 percen keresztül kezeltük, a spóraképző bacillusok szelektív izolálása céljából. A fenti mikroorganizmus tenyészetét a Budapesti Szerződésnek megfelelően 1989.05.31-én helyeztük letétbe az Ipari Baktériumok Nemzeti Gyűjteményében (The National Collection of Industrial and Maríné Bacteria Ltd., Torry Research Station, P. O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB 98 DG, Scotland, Nagy-Britannia), a letéti szám: NCIMB 40 152.

A Btd NCIMB 40 152 törzset szokásos tápközegeken, például Nutrient agaron 25-30 ’C-on tarthatjuk fenn, és ismert eljárásokkal tenyészthetjük.

A nemzetséget és speciest a mikroorganizmus morfológiai és biokémiai jellemzői alapján határoztuk meg.

Morfológia

A Btd NCIMB 40 152 Nutrient agar tápközegen lapos, kör alakú vagy szabálytalan alakú, csipkézett vagy karéjos szélű különálló telepeket képez, amelyek fehéres színűek. A vegetatív sejtek kis rudacska formájúak, Gram-pozitívak, átmérőjük 1-2 pm, és hosszúságuk 6-8 pm.

A tenyésztési hőmérséklet 25 ’C és 35 ’C közötti tartományban van.

Ha a mikroorganizmus tenyészetét autoklávban 121 ’C-on 15 percen keresztül kezeljük, mind a spórák, mind a toxin inaktiválódnak.

HU 210 680 Β

A spóra helyzete centrális vagy szubterminális. A paraspórás kristályok formája elektronmikroszkópos letapogatás szerint négyzet alapú paralelepipedon, alsó és felső lapján azonos alapú két gúlával, amelyek mérete 1-2 pm, így eltérőek a Bt tenebrionis és san diego által termelt paraspórás kristályoktól, amelyek laposak és romboid alakúak.

Biokémiai jellemzők

A Btd NCIMB 40152 vegetatív alakjában az 1. táblázatban összefoglalt biokémiai jellemzőket mutatja.

Vizsgálat*	Biológiai válasz
glükóz savanyítása	+
mannitol savanyítása	-
mannóz savanyítása	-
szacharóz savanyítása	+
laktóz savanyítása
arabinóz savanyítása	-
xilóz savanyítása	-
szalicin savanyítása	+
eszkulin hidrolízise	+
keményítő hidrolízise	+
zselatin hidrolízise	+
gázfejlesztés glükózból	-
arginin-dihidroláz	-
lízin-dekarboxiláz	-
fenil-alanin-dezamináz	-
ureáz	-
kataláz	+
(szója)-lecitináz	+
nitrát-reduktáz	+
Voges-Proskauer reakció	+
szaporodás kitinen	-
szaporodás 7%-os nátriumklorid mellett	-
szaporodás 50 °C-on	-
szaporodás 10 egység/ml G-penicillin mellett	+
szaporodás 10 pg/ml kloramfenikol mellett	-
szaporodás 25 pg/ml sztreptomicin mellett	-
szaporodás 30 pg/ml nalidixsav mellett	-
szaporodás 50 pg/ml lizozim mellett	+

* a vizsgálatokat a Manual of Methods fór General Bacteriology (The American Society fór Microbiology, 1981) és a The Prokaryotes (Springer-Verlag, 1981) szerint végeztük

A Btd 40 152 és az ismert Bt fajták közötti különbségeket a Btd 40 152 és az ismert Bt fajták biokémiai jellemzőinek összehasonlításával is bizonyíthatjuk, a 2. táblázat szerint.

2. táblázat [A. Krieg „The Prokaryotes”, Springer Verlag, 1981,

1750. oldal; A. Krieg, J. Appl. Ént. 104, 417-424 (1987)]

Fajta	MÁN	SAC	SÁL	AMI	CHT	URE	ARG	LCT
thurin- giensis	+	+	+	+	V	-	+
finiti- mus	-	+	+	-	+	-	-
ales ti	-	-	-		V	-	+
kurstaki	-	-	+	+	V	+	+
sotto	-	+	-	+	V	-	-
dendro- limus	-	-	-	+	+	-	V
keniae	-	-	+	+	V	+	+
galle- riae	-	-	+	+	V	+	+
cana- densis	-	+	+	+	+	-	+
ento- moci- dus	+	+	-	+	-	-	-
aizawai	-	-	+	+	+	+	+
morri- soni	-	+	-	+	V	-	-
tolworti	-	+	+	+	V	-	+
darms- tadien- sis	-	-	-	+	-	-	+
touma- noffi	-	-	-		-	+	+
thomp- soni	-	+	+	+	V	+	+
pakista- ni	-	+	(+)	+	(+)	-	+
israe- lensis	+	-	-	+	-	-
wuha- nensis	-	-	+	+		-
tenebri- onis	+	+	-	+	-	-	+	-
san diego	+	+	-	+	-	-	+	-
NCIMB 40152	-	+	+	+	-	-	-	+

rövidítések:

MÁN, SAC, SÁL: mannóz, szacharóz és szalicin savanyítása

AMI: keményítő hidrolízise CHT: szaporodás kitinen URE: ureáz

HU 210 680 B

ARG: arginin-dihidroláz

LCT: lecitináz +: pozitív válasz negatív válasz (+): részben pozitív válasz

V: változó válasz

Tenyésztési jellemzők és a hatóanyag elválasztási módszerei

A Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40 152 szokásos folyékony tápközegekben, például Nutrient levesben tenyészthető, 25-30 °C-on, ismert módon.

A fermentációs és spóraképzési szakasz végén a biomasszát a fermentációs tápközeg centrifugálásával választjuk el.

Az így elválasztott biomasszát ezután liofilizálással vagy bepárlással szárítjuk, és por formában kapjuk az inszekticid aktivitással rendelkező szilárd anyagot.

A Btd NCIMB 40 152 inszekticid aktivitása lényegében egy fehérje jellegű, paraspórás, kristályos toxinnak tulajdonítható, amely vízben semleges pH-értéken oldódik, a Bt var. tenebrionis és var. san diego által termelt toxintól eltérően. Ezért az ilyen toxint úgy választhatjuk el, hogy a spórásodás után centrifugálással elválasztott biomasszát vízben újraszuszpendáljuk, semleges pH-értéken, és a kapott szuszpenziót szobahőmérsékleten 1-12 órán keresztül keverjük.

A vizes szuszpenziót ezután centrifugáljuk vagy szűrjük, és a spóráktól és fermentációs maradékoktól mentes vizes oldatból - amely lényegében a fehérje jellegű toxint tartalmazza - a toxint ismert módon, például liofilizálással kinyerjük.

A toxin móltömegét poli(akril-amid)-gélben SDSelektroforézissel meghatározva Laemmli [Natúré, 227, 680 (1970)] módszere szerint, két fő csoportba osztható sávokat kapunk:

- az első csoport három sávból áll, amelyek móltömege 64 000-72 000,

- a második csoport két sávot tartalmaz, amelyek móltömege 34 000-36 000.

Biológiai aktivitás

A Btd NCIMB 40 152, és az abból kapott készítmény vagy toxin inszekticid aktivitással rendelkezik Coleoptera, például Leptinotarsa decemlineata ellen, mind szisztémás, mind külsődleges alkalmazással.

Ezzel szemben nem tapasztalható toxikus hatás bizonyos Lepidoptera, például Spodoptera littoralis és Ephestia kuehniella, valamint a dipterák közé tartozó Aedes aegypti ellen sem.

A hatóanyag hatásmódja Coleoptera lárvákra azonos, mint amelyet korábban az A patotípusba tartozó Bt-preparátumoknál megfigyeltek: a kezelés után néhány órával a lárvák nem táplálkoznak, és 24-48 óra múlva elpusztulnak. A halál oka a toxinnak a rovarok bélhámjára kifejtett hatása, aminek következtében a bélhámon irreverzbíilis léziók keletkeznek.

A Btd NCIMB 40 152, annak fermentálásával és spóraképzésével kapott liofilizált szilárd termékek, valamint paraspórás fehérje természetű toxinja, mint olyan, vagy megfelelő készítmény formájában tehát a mezőgazdasági kártevő Coleoptera ellen használhatók.

A fenti célra előnyösen az elválasztott toxint használjuk.

Az ismert Bt fajtákból kapott toxinokkal, különösen a C patotípusba tartozó tenebrionis és san diego fajtákból nyert toxinokkal összehasonlítva, a Btd NCIMB 40 152 törzsből származó toxin számos előnyös tulajdonsággal rendelkezik, gazdaságossági-ipari szempontból, kinyerését, alkalmazását és inszekticid aktivitását tekintve. A fenti előnyök például:

- a toxin kinyerése a tenyészetből egyszerűbb és könnyebb, a toxin vízoldhatósága miatt, és ennek következtében a toxint koncentrált, spóráktól, sejtektől és fermentációs maradékoktól mentes formában kaphatjuk;

- a toxin koncentrált, vizes oldata - amely az ismert toxinok szuszpenzióitól vagy diszperzióitól eltérően nem ülepedik - könnyebben raktározható és szállítható;

- a toxin oldata formájában könnyebben és hatékonyabban alkalmazhatjuk, mint a hasonló ismert toxinokat, amelyeket - mivel a mezőgazdasági készítményekben általában használt szerves oldószerekkel nem összeférhetek - szilárd diszperzió formájában alkalmaznak.

Ezenkívül meglepő módon azt is kimutattuk, hogy a Btd NCIMB 40 152 törzsből származó toxin külsődleges inszekticid aktivitása mellett előnyösen szisztémás inszekticid aktivitással is rendelkezik, az egyéb Bt fajták által termelt toxinoktól eltérően.

Az ilyen szisztémás aktivitás - amely lényegében abból áll, hogy a hatóanyag az alkalmazás helyétől távol eső növényi részekhez is eljut - a növénynek szélesebb körű védelmet biztosít, és lehetővé teszi kisebb hatóanyag-mennyiségek alkalmazását; különösen jelentős, hogy a toxin a növény gyökérzetén keresztül halad.

Ezenkívül a találmány szerinti eljárással előállított toxin hosszabb időn keresztül hatásos, mert a növény érrendszerébe jutva a külső hatásoktól - amelyek lebonthatnák vagy lemoshatnák - védve van.

A toxin szisztémás aktivitása még előnyösebb, ha a kezelést a növény növekedési szakaszában végezzük, így a kezelés időpontja után hozott fiatal hajtásokat eszik meg a rovarok.

Ezen túlmenően, a szisztemikus aktivitás miatt a toxin hatékonysága nagyobb lesz preventív kezelések esetén; és csökkenti annak szükségességét, hogy a kezelést megismételjük a növény növekedése során.

A Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40 152 baktériumot, annak fermentálásából és spóraképzéséből kapott terméket, valamint paraspórás toxinját koncentrált cseppfolyós készítményekké, nedvesíthető porokká formálhatjuk, cseppfolyós vagy szilárd inért hordozóanyagok és formálási segédanyagok és/vagy adalékanyagok - például nedvesítőszerek, tapadást elősegítő szerek, felületaktív szerek, U. V. stabilizátorok és egyéb szokásosan használt formálási segédanyagok - segítségével.

HU 210 680 Β

Mezőgazdasági alkalmazás céljára a Btd NCIMB 40 152-ből származó toxinra vonatkoztatva a dózis célszerűen 0,05-4 kg/hektár, előnyösen 0,2-2 kg/hektár lehet.

A találmányt közelebbről az alábbi példákkal kívánjuk szemléltetni.

1. példa

500 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő 100 ml tripton-szója folyékony tápközeget (Oxoid) beoltunk a Bacillus thuringiensis NCIMB 40 152 folyékony nutrient tápközeges 16 órás tenyészetének 1 ml-ével.

Az Erlenmeyer-lombikot orbitális keverést biztosítva 25-35 °C-on tartjuk. A spóraképződést mikroszkóposán ellenőrizzük. A fermentálás befejeztével a biomasszát centrifugáljuk, pH 7 értékű vízben újraszuszpendáljuk és 3 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük. A spórák és fermentációs maradék lecentrifugálása után kapott oldatot - amely a paraspórás, kristályos toxint tartalmazza - liofilizáljuk és az így kapott toxint használjuk biológiai aktivitás meghatározására vagy inszekticid készítmények előállítására. 0,25 g fehérjeszerű paraspórás, kristályos toxint kapunk 1 liter Bacillus thuringiensis NCIMB 40 152 tenyészetre vonatkoztatva.

2. példa

Az 1. példa szerint előállított, alapvetően paraspórás, fehérje-jellegű toxinból álló liofilizált készítmény inszekticid aktivitását a fenti készítmény különböző koncentrációjú vizes oldatainak felhasználásával határozzuk meg. Az aktivitás meghatározását - a vizsgált rovarok szerinti csoportosításban - az alábbiakban ismertetjük.

Leptinotarsa decemlineata Külsődleges aktivitás

Második lárvaállapotú lárvákat az 1. példa szerint előállított liofilizált toxin vizes oldatába merítéssel kezelt fiatal burgonyanövénnyel etetünk. A megfigyeléseket az alábbi környezeti körülmények között végezzük:

- hőmérséklet 25 °C±1 °C

- relatív nedvességtartalom 60%±2%.

A pusztulás végső meghatározását a fertőzés után 48 órával értékeljük ki; az eredményeket a 3. táblázatban ismertetjük.

Szisztemikus aktivitás

Második lárvaállapotú rovar-lárvákat olyan fiatal burgonyanövénnyel etetünk, amelyet 12, illetve 24 órán keresztül az 1. példa szerint előállított, liofilizált terméket 200 ppm koncentrációban tartalmazó hidroponikus oldatban tartottunk.

A lárvákat 48 órán keresztül 25 °C-on, 60% relatív nedvességtartalmú kondicionált környezetben tartjuk.

Mind a két vizsgálatban 100% a pusztulás mértéke.

Tribolium confusum, Tenebrio molitor, Ephestia kuehniella

Harmadik lárvaállapotú rovar-lárvákat 25+1 °C-on,

65±2% relatív nedvességtartalmú kondicionált környezetben tartunk, az 1. példa szerint előállított liofilizált terméket tartalmazó fehér liszten.

A fertőzés után 14 nappal meghatározzuk a pusztulás mértékét; az eredményeket a 3. táblázat tartalmazza.

Aedes aegypti Aktivitás

Harmadik lárvaállapotú lárvákat helyezünk az 1. példa szerint előállított liofilizált terméket tartalmazó desztillált vízbe. A lárvákat 25 °C±1 °C-on, 60% relatív nedvességtartalmú kondicionált környezetben tartjuk, és naponta etetjük. A pusztulás mértékét a kezelés után 5 nappal határozzuk meg, az eredményeket a 3. táblázatban közöljük.

Spodoptera littoralis Külsődleges aktivitás

Második lárvaállapotú lárvákat dohánylevéllel etetünk, amelyeket az 1. példa szerint előállított liofilizált termék vizes oldatába merítéssel kezeltünk.

A vizsgálat alatt a lárvákat az alábbi körülmények között tartjuk:

- hőmérséklet 25 °C±1 °C — relatív nedvességtartalom 60%+2%

A pusztulás mértékét a fertőzés után 5 nappal határozzuk meg; az eredményeket a 3. táblázatban ismertetjük.

3. táblázat

Rend	Species	Dózis (ppm)	Pusztulás (%)
Coleoptera	Leptinotarsa decemlineata	100	100
	Tenebrio molitor	1000	100
	Tribolium confusum	1000	100
Lepidoptera	Ephestia kuehniella	1000	0
	Spodoptera littoralis	500	0
Diptera	Aedes aegypti	500	0

3. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, azzal az eltéréssel, hogy a fermentálás befejeztével a tenyészetet centrifugáljuk, az üledéket vízben felszuszpendáljuk, majd liofilizáljuk. Az így kapott szilárd termék amely Bacillus thuringiensis biomasszából áll - inszekticid aktivitása mintegy 1/10-e az 1. példa szerint előállított kristályos fehérje jellegű toxin biológiai aktivitásának. Ez a termék is alkalmazható rovarok irtására, önmagában, vagy inszekticid készítmények hatóanyagaként.

HU 210 680 Β

4. példa

Inszekticid készítmény előállítása

Folyóképes készítményt állítunk elő az alábbi komponensek összekeverésével:

g/100 ml ionmentes víz

3. példa szerint előállított, liofilizált szilárd termék 5,0 kukoricalekvár 10,0 nátrium-benzoát 2,0

EDTA-nátriumsó 0,3

A fentiek szerint eljárva állítjuk elő azokat a készítményeket is, amelyek hatóanyagként

- 20,0 g 3. példa szerint előállított, liofilizált szilárd terméket vagy

- 2,0 g 1. példa szerint előállított, liofilizált kristályos toxint, vagy

- 0,5 g 1. példa szerint előállított, liofilizált kristályos toxint tartalmaznak.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Inszekticid készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként Bacillus thuringiensis var. donegani

NCIMB 40 152 tenyészetéből a spóraképzés és a spórátok ezt követő lízise után kapott paraspórás, fehérje jellegű kristályos toxint tartalmaz 0,5-2,0 tömeg% mennyiségben a szokásos segédanyagok mellett.
2. Inszekticid készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40 152 fermentálásával és spóraképzésével kapott, liofilizált szilárd terméket tartalmaz 5-20 tömeg% mennyiségben, a szokásos segédanyagok mellett.
3. Eljárás kristályos, paraspórás, fehérje jellegű toxin előállítására, azzal jellemezve, hogy Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40 152 baktériumot a spóraképződés befejeződéséig tenyésztünk, és a spóratokot lizáljuk, majd a terméket ismert módon kinyerjük.
4. Eljárás rovarok irtására, azzal jellemezve, hogy a növényt vagy annak részeit - például leveleit vagy szárát - vagy a termesztésére szolgáló talajt 0,054 kg/ha dózisban hatóanyagként Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40 152 biomasszát vagy az abból származó kristályos toxint tartalmazó, szokásos segédanyagokkal készült inszekticid készítménnyel ismert módon kezeljük.