KR19990044321A - 야생형 시토킨의 뮤테인의 면역원으로서의 용도 - Google Patents
야생형 시토킨의 뮤테인의 면역원으로서의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 활성 성분으로서 특정 야생형 시토킨의 뮤테인을 1종 이상 함유하는 것을 특징으로 하는, 야생형 시토킨의 과도한 생성에 의해 야기되는 질병의 치료 또는 억제에 사용되는 제약 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 가장 넓은 범위에서 특정 야생형 시토킨에 대해 작용하고 이 시토킨의 과도한 생성에 의해 야기되는 질병에서 시토킨을 중화시킬 수 있는 항체를 생성시키는 면역원으로서, 야생형 시토킨의 수용체 길항제인 특정 야생형 시토킨의 뮤테인의 용도로 이루어진다. 도 4는 인간 인터루킨 6으로 면역접종된 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 발생한 항체가 야생형 인터루킨 6을 인식하여 그 생물학적 활성을 중화시킬 수 있다는 것을 보여주고 있다.
Description
본 발명은 특정 야생형(wildtype) 시토킨의 수용체 길항제이면서 동시에 야생형 시토킨의 과도한 생성에 의해 야기되는 질병에서 야생형 시토킨의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 야생형 시토킨에 대한 항체를 생성시키는 면역원(immunogen)으로서의 특정 야생형 시토킨의 뮤테인(mutein)의 용도에 관한 것이다.
예를 들면 인간 이터루킨 6 (hIL-6)가 나선형 시토킨의 종류에 속하는 184개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드라는 사실은 공지된 사실이다. 인터루킨 6은 다양한 종류의 세포에 의해 생성되는 다기능성 시토킨이다. 인터루킨 6은 다양한 종류의 세포, 예를 들면 면역계의 세포, 간세포, 신장 세포, 조혈 간세포, 케라티노사이트 및 뉴런에 대한 분화 및 성장 인자로서 작용한다. 그러나, hIL-6의 과도한 생성은 많은 질병, 예를 들면 만성 자기면역 질환, 전신계 홍반성 낭창, 골수종/형질세포종, 폐경기 후의 골다공증 및 암 악액질을 야기한다.
따라서, 상기 특정 질병에서 일반적으로 야생형 시토킨, 특히 hIL-6의 과도한 생성을 억제할 필요성이 예방 및 치료의 측면에서 존재한다.
본 발명의 용도는 이러한 필요성을 충족시키는 동시에 다른 이점을 제공하고, 이것은 하기 설명으로부터 분명히 알 수 있다.
본 발명의 대상은 특정 특정 야생형 시토킨의 과도한 생성에 의해 발생하는 질병의 치료 또는 예방을 위한 제약 화합물의 제조를 위한 야생형 시토킨의 변이체의 용도이다.
본 발명의 또다른 대상은 야생형 시토킨의 과도한 생성에 의해 야기되는 질병 치료용 제약 화합물, 또는 활성 성분으로서 상기 야생형 시토킨의 변이체를 1 이상 함유하는 상기 질병 예방용 백신이다.
본 발명에 따른 제약 화합물은 예를 들면 제약상 허용되는 비히클의 존재를 필요로 하는 공지의 방법에 따라 제제화될 수 있다. 이러한 비히클 및 제제화 방법의 예는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science]에 기재되어 있다. 효과적인 투여에 적합한 제약상 허용되는 화합물을 형성하기 위해서, 이들 화합물은 본 발명에 따른 활성 성분의 유효량을 함유하여야 한다. 본 발명의 제약 화합물은 투여 대상의 질병, 체중, 성별 및 연령에 따라 적절한 양으로 투여된다. 다른 고려 인자로는 투여 방법을 들 수 있다. 본 발명에 따른 제약 화합물은 매우 다양한 방법, 예를 들면 피하, 국소, 경구 및 근육내 투여할 수 있다.
활성 성분으로서 야생형 시토킨의 뮤테인을 1종 이상 함유하는 본 발명에 따른 제약 화합물은 통상적인 투여 비히클 중의 매우 다양한 형태로 치료 투여량으로 투여될 수 있다.
예를 들면, 본 발명에 따른 제약 화합물은 정제, 캡슐제, 환제, 분말제, 과립제, 엘릭시르제, 연고제, 용액제, 현탁액제, 시럽제 및 에멀젼제의 형태로 경구 투여되거나 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 동일한 방식으로, 본 발명에 따른 화합물은 정맥내, 복강내, 피하, 폐색 여부 불문한 국소, 또는 근육내 투여할 수 있다. 상기 모든 투여 형태는 제약 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 어떠한 경우라도, 본 발명의 활성 성분은 비독성의 유효량으로 사용되어야 한다.
상기 활성 성분의 1일 투여량은 성인의 경우 1일당 0.01 내지 1000 mg일 수 있다. 본 발명에 따른 활성 성분의 유효량은 일반적으로 약 0.001 내지 약 100 mg/kg(체중)/일의 투여량으로 제공된다.
본 발명에 따르면, 특정 야생형 시토킨의 뮤테인으로 구성되는 활성 성분은 통상 목적 투여 형태에 적합하게 선택되는 적합한 희석제, 부형제 또는 제약 비히클 (일반적으로 "비히클"로 칭함)과 혼합되어 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 백신의 제제화는 당업계의 숙련가에게 알려져 있다. 일반적으로, 이러한 백신은 용액 또는 현탁액으로서 주사가능 형태로 제제화된다. 제제는 에멀젼화되거나 활성 성분은 리포좀 내에 캡슐화될 수 있다. 활성 면역원 성분은 활성 성분과 상용성인 적합한 제약상 허용되는 부형제와 종종 혼합된다. 적합한 부형제의 예는 물, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합물이다. 또한, 필요한 경우, 백신은 소량의 추가의 물질, 예를 들면 습윤제 또는 에멀젼화제, pH 환충제, 및(또는) 백신의 효용성을 증가시키는 보조제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 백신은 예를 들면 근육내 또는 피하 주사에 의해 비경구적으로 투여되는 것이 바람직하다. 다른 투여 방법에 적합한 다른 제제로는 좌제 및 경구 제제를 들 수 있다. 이들 화합물은 10 내지 95%, 바람직하게는 25 내지 70%의 활성 성분을 함유한다.
지금까지 본 발명에 대하여 일반적인 내용을 기술하였다. 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 본 발명을 설명하고 본 발명에 참고할 수 있으며 본 발명의 목적, 특성, 잇점 및 가능한 용도에 대한 보다 분명한 이해를 제공할 수 있는 특정 상황을 기술할 것이다.
도 1a 및 1b는 야생형 hIL-6을 사용한 정상 및 NSE/hIL-6 트랜스제닉(transgenic) 마우스에 대한 면역접종 실험 결과는 나타낸 것이다.
도 2a 및 2b는 Sant1로 약칭되는 변이체 형태 (돌연변이 Tyr 31 Asp, Gly 35 Phe, Ser 118 Arg, Val 121 Asp, Gln 175 Ile, Ser 176 Arg, Gln 183 Ala를 함유하고 hIL-6의 길항제임)를 사용한 정상 및 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에 대한 면역접종 실험 결과는 나타낸 것이다.
도 3은 Sant1에 대하여 마우스에서 발생한 항체의 야생형 IL-6 인식 가능 여부를 확인하기 위하여 시행한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 야생형 인터루킨 6의 변이체인 Sant1로 면역접종한 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 발생한 항체의 야생형 인간 인터루킨 6의 생물학적 활성 중화 가능 여부를 확인하기 위하여 시행한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5a 및 5b는 실시예 7에서 실시한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 및 6b는 실시예 11에서 실시한 실험 결과를 나타낸 것이다.
실시예 1
hIL-6 및 Sant1을 사용한 hIL-6에 대한 면역 내성(immune tolerance)을 갖는 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스의 면역접종
NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스는 쥐의 신경 특이적 에놀라제 유전자 프로모터의 조절 하에 마우스의 게놈 내에 통합된 인간 인터루킨 6의 cDNA를 갖는다.
상기 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스 (군당 5마리)를 재조합 인간 IL-6을 사용하여 면역접종하고, 대조군으로서 동일한 어미에게서 태어났지만 트랜스제닉되지 않은 마우스를 사용하여 내성 이론을 확인하였다. 또한, 5마리의 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스로 이루어진 군을 7개의 돌연변이 (Tyr 31 Asp, Gly 35 Phe, Ser 118 Arg, Val 121 Asp, Gln 175 Ile, Ser 176 Arg, Gln 183 Ala)를 함유하는 IL-6의 변이체 형태, 즉 Sant1 (인체 세포에 대해 잔류 생물학적 활성을 갖지 않고 hIL-6 수용체 길항제로서 작용함)로 면역접종하였다. 이 경우에도 역시 동일한 어미에게서 태어났지만 트랜스제닉되지 않은 마우스 5마리를 대조군으로 사용하였다. 면역접종 프로토콜은 다음과 같다: 시간 0에서 혈액 시료 (면역전 시료)를 각각의 트랜스제닉 및 비트랜스제닉 마우스로부터 차례로 채취한 후 완전 프로인트 보조제 (Complete Freund Adjuvant, CFA)의 존재 하에 항원 (마우스의 군에 따라 야생형 hIL-6 또는 Sant1) 100 ㎍을 복강내(IP) 투여하여 각각의 마우스를 면역접종하였다. 제1 면역접종 10일 후에 혈액 시료를 채취하였다 (시료 1). 제1 면역접종 20일 후에 불완전 프로인트 보조제 (Incomplete Freund Adjuvant, IFA)의 존재 하에 항원 100 ㎍을 다시 사용하여 제2 면역접종을 실시하고 (제1 부스터(booster)), 10일 후에 (제1 면역접종 30일 후에) 제2 혈액 시료를 채취하였다 (시료 2). 최종적으로, 제1 면역접종 40일 후에 IFA의 존재 하에 항원 100 ㎍을 다시 사용하여 제3 면역접종을 실시하고 (제2 부스터), 10일 후에 (제1 면역접종 50일 후에) 제3 혈액 시료를 채취하였다 (시료 3). 통상의 방법에 따라 각각의 혈액 시료로부터 대응하는 혈청을 제조하였다.
"ELISA"법 (효소 결합 면역흡착 분석법)을 사용하여 면역접종에 사용된 항원에 대하여 작용하는 항체가 제2 및 제3 시료로부터 수득한 혈청에 존재하는지를 시험하였다. 이를 위해서 상기 종류의 실험을 위해 특별히 제조된 배양 평판 (ELISA 평판) 중의 웰(well)의 기저부에 면역접종에 사용된 것과 동일한 항원을 비공유결합 방식으로 결합시켰다. 1x PBS 중에 10 ㎕/ml로 용해시킨 항원 용액 100 ㎕를 코팅되는 각각의 웰 중에서 14시간 동안 실온에서 배양하여 항원을 고정시켰다 ("코팅(coating)"으로 명명된 조작). 항원 고정 후에 1x PBS 중의 0.8% BSA (소 혈청 알부민) 용액을 각각의 웰 중에서 4시간 동안 실온에서 배양하여 웰 내부의 플라스틱을 단백질로 코팅하였다 ("차단(blocking)"으로 명명된 조작). "차단" 용액의 제거 후에 적당하게 희석된 각각의 혈청 100 ㎕를 실온에서 90분 동안 각 웰 중에서 따로따로 배양하였다. 이 단계 동안에 웰의 기저부에 고정된 항원에 대한 어떤 항체가 혈청 중에 존재한다면 이들 항체는 항원 자체에 결합할 것이고 이에 의해 웰의 기저부에 결합될 것이다. 90분 동안의 배양 후에 혈청을 웰로부터 제거하고 적절하게 세척한 후에 마우스 항체에 작용하는 토끼 항체를 함유하는 1x PBS 중의 0.8% BSA 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고 실온에서 50분 동안 계속 배양하였다. 이 단계 동안에 마우스 항체가 웰의 기저부에 고정된 항원을 인식하여 결합하였다면 이들 마우스 항체는 토끼 항체에 의해 인식되어 이 항체에 결합될 것이고 따라서 토끼 항체는 웰의 기저부에 고정될 것이다. 또한, 다코사(DAKO)에서 제조하여 시판하는 마우스 항체 (상기 실험에서 PBS/BSA 중에 1:100의 비율로 희석 사용됨)에 작용하는 토끼 항체는 효소 양고추냉이 퍼록시다제에 공유결합된다. 50분 동안 배양한 후에 토끼 항체를 함유하는 용액을 제거한 후 웰을 적절하게 세척하였다. 이 때, 양고추냉이 퍼록시다제에 대한 기질 (TBM: 3,-3',-5,-5'-테트라메틸-벤지딘-디클로라이드)을 함유하는 용액 100 ㎕을 각 웰에 첨가하였다. 상기 효소는 기질을 450 nm에서 가시광선을 흡수하는 생성물로 전환시키고 이와같은 전환량은 ELISA 판독기를 사용하여 각각의 웰 중에서 분광광도계에 의한 450 nm에서의 흡광도 측정치로 계산할 수 있다. 실험을 적정하게 수행한 경우에는 흡광도 (즉, 흡수된 광의 양)은 효소의 양에 비례하고, 이것은 혈청에 본래 존재하는 항원에 작용하는 마우스 항체의 양에 비례하는 토끼 항체의 양에 비례한다. 따라서, 흡광도 측정치는 혈청에 존재하는 항원에 작용하는 마우스 항체의 양에 대한 추정치를 제공한다. 이것은 항원에 작용하는 마우스 항체가 상기 반응 사슬의 제한 인자인 경우에 들어맞는다. 따라서, 적절한 조건을 수득하기 위해서는 조사되는 각 혈청에 대하여 면역접종에 사용된 항원에 대한 마우스 항체의 양을 정밀하게 측정할 수 있을 정도로 충분히 높지만 반응계를 포화시킬 정도로 높지는 않는 특정 희석물이 존재하도록 하기 위해, 조사되는 각각의 혈청에 대한 일련의 희석물 (1:33 내지 1:8100)을 사용하는 것이 권고된다.
일반적인 정상 마우스 및 일반적인 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에 대한 야생형 IL-6 (wt IL-6) 면역접종 실험 결과를 도 1a 및 1b에 도시하였다. 도 1a에서 알 수 있듯이, 정상 마우스는 혈청이 1:8100으로 희석된 경우에도 시그날을 검출할 수 있을 정도로 항-wtIL-6 항체를 다량 생성하였다. 그 반대로, 도 1b에서 알 수 있는 바와 같이, 트랜스제닉 마우스는 훨씬 소량의 항체를 생성하였다: 사실상 신호는 제2 시료에서 채취한 혈청을 1:300의 비율로 희석한 경우 및 제3 시료에서 채취한 혈청을 1:2700으로 희석한 경우에 소멸된다. 모든 동물에 비교할 수 있는 객관적인 측정을 수행하기 위해서 면역접종전 혈청의 가장 높은 판독치보다 0.5 O.D.450높은 판독치를 제공하는 혈청의 희석율을 통상 "역가"로 명명하였다. 도 1a 및 1b는 제2 및 제3 시료의 역가를 각각 정상 마우스 및 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에 대해 계산하는 방법을 나타내고 있다.
도 2a 및 2b는 각각 일반적인 정상 마우스 및 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에 대한 IL-6 변이체인 Sant1을 사용한 면역접종 실험 결과를 도시한 것이다. 이 경우에, 두 종의 마우스는 모두 다량의 항-Sant1 항체를 생성시켰다. 사실상, 혈청이 1:8100으로 희석된 경우에도 비교적 강한 시그날을 검출할 수 있다. 도 2a 및 2b는 제2 및 제3 시료의 역가를 정상 마우스 및 트랜스제닉 마우스에 대해 계산하는 방법을 나타내고 있다.
표 1은 상기 실험 동안 접종된 모든 마우스의 제2 및 제3 시료에 대한 역가 데이터(상기한 바와 같이 계산함)를 요약한 것이다.
| 마우스 군 | 혈청 역가 | |
| 제2 시료 | 제3 시료 | |
| WT/wtIL-6 | ||
| 16 | 245 | 5150 |
| 17 | 1100 | 3900 |
| 18 | 1250 | 2600 |
| 19 | 430 | 1600 |
| 20 | 210 | 1800 |
| 평균 | 674 | 3010 |
| NSE/wtIL-6 | ||
| 11 | 80 | 92 |
| 12 | 90 | 215 |
| 13 | 24 | 155 |
| 14 | 135 | 135 |
| 15 | 27 | 54 |
| 평균 | 71 | 130 |
| wt 마우스 역가/NSE 마우스역가의 비율 | 9.5 | 23 |
| WT/Sant1 | ||
| 6 | 150 | 270 |
| 7 | 1450 | 사망 |
| 8 | 2900 | 3600 |
| 9 | 1300 | 2700 |
| 10 | 3300 | 3800 |
| 평균 | 1820 | 2600 |
| NSE/Sant1 | ||
| 1 | 4000 | 4000 |
| 2 | 21.5 | 49 |
| 3 | 1750 | >10000 |
| 4 | 1750 | 1150 |
| 5 | 2000 | 1800 |
| 평균 | 1900 | 3400 |
| wt 마우스 역가/NSE 마우스역가의 비율 | 1 | 0.76 |
wtIL-6 항원을 접종한 마우스에 있어서 동물 사이에 차이는 있지만 비트랜스제닉 마우스에는 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 수득한 것보다 평균적으로 10 내지 20배 더 강한 wtIL-6에 대한 항체 반응이 발생하였음을 알 수 있고, 이것은 트랜스제닉 마우스에 인간 hIL-6의 면역 내성이 생성되었음을 입증한다.
이와 반대로, Sant1 항원이 접종된 마우스에 있어서는 동물 사이에 차이는 있지만 비트랜스제닉 마우스에는 평균적으로 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 수득한 것과 동일한 항체 반응이 발생하였음을 알 수 있고, 이것은 hIL-6에 도입되어 Sant1을 생성시키는 7개의 돌연변이가, 그렇지 않다면 hIL-6에 내성을 보일 것인 면역계에 대하여 변이체 Sant1을 완전히 외부 단백질로 만들었다는 것을 시사한다.
실시예 2
Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6의 혈청에서 발생한 항체는 Sant1 뿐만 아니라 야생형 hIL-6도 인식할 수 있다.
본 실시예는 Sant1에 대하여 마우스에 의해 생성된 항체가 Sant1 자체 뿐만 아니라 야생형 hIL-6 (wt hIL-6)도 인식할 수 있는지를 시험하기 위한 것이다. 이 가설은 다시 ELISA 시험을 사용하여 시험하였다. Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 발생한 항체가 ELISA 평판 웰의 기저부에 고정된 동일한 변이체 Sant1을 인식하여 결합할 수 있음을 확인한 후에, 제2 실험에서 야생형 IL-6을 ELISA 평판 웰의 기저부에 비공유적으로 결합시켰다. 웰의 플라스틱이 BSA로 포화되는 단계 후에, wtIL-6을 인식할 수 있는 항체의 존재 여부를 확인하기 위해 Sant1로 면역접종된 마우스로부터 채취한 혈청의 희석물을 웰에 첨가하였다. 예를 들면, 도 3은 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에 대한 실험 결과를 도시한 것이다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, Sant1 및 야생형 IL-6에 대해 수득된 항체 반응은 지극히 유사하다. 달리 표현하면, 제3 시료가 1:8100의 비율로 희석된 경우에도 웰의 기저부에 고정된 wtIL-6에 결합한 항체의 존재를 제3 시료의 혈청에서 검출할 수 있다. NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스가 야생형 IL-6을 사용하여 직접 면역접종된 경우에는 야생형 IL-6 자체에 대한 항체 반응이 훨씬 낮고 실질적으로 1:8100으로 희석된 혈청 중에서 항-wtIL-6 항체를 검출할 수 없다 (도 1 참조). 다른 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스는 본 실시예에서 예시한 마우스와 유사한 반응을 보였다.
실시예 3
Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6에서 발생한 항체는 야생형 hIL-6의 생물학적 활성도 중화시킬 수 있다.
본 실시예의 목적은 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 발생하였지만 야생형 IL-6을 인식할 수 있는 항체가 야생형 IL-6 자체의 생물학적 활성도 중화시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위한 것이다.
야생형 IL-6의 고려되는 생물학적 활성은 인간 Hep3B 혈종 세포에서 교차(C)-반응성 단백질 유전자 프로모터에 의한 전사를 자극하는 능력이었다. 전사 자극 효능은 통상의 방법에 따라 측정하였다 (Gregory, B., Savino, R. and Ciliberto, G., J. Immunological Methods, 170, 47-56, 1994). NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스 #4 및 #5(두 마우스 모두 Sant1로 면역접종됨)로부터 채취한 제3 시료에서 수득한 혈청의 연속적인 희석물의 존재 하에 야생형 IL-6 4 ng/ml을 사용하여 인간 Hep3B 혈종 세포를 자극하였다. 실험 결과는 도 4에 도시하였다. 도 4에서 1:100으로 희석된 두 개의 혈청은 모두 인간 혈종 세포에 대한 야생형 hIL-6의 생물학적 활성을 4 ng/ml에서 거의 완전히 억제함을 알 수 있다.
이 때, 상기 야생형 hIL-6에 대한 교차 반응성 항체 반응의 발생이 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스의 혈청에서 측정된 야생형 hIL-6의 농도를 변경시킬 수 있는지를 조사하였다. hIL-6 농도는 "R&D 시스템스(Systems)"사에서 시판하는 키트를 제조자의 지시에 따라 정확하게 사용하여 "샌드위치" ELISA 시험에 의해 통상의 방법에 따라 측정하였다. 면역접종전 시료 및 제3 시료 모두에서 발견된 hIL-6의 농도를 Sant1로 면역접종된 트랜스제닉 마우스 4마리에 대해 측정하였다. 그 결과를 표 2에 요약하였다. 표에서 알 수 있는 바와 같이, Sant1을 사용한 면역접종은 Sant1 자체와 wtIL-6을 모두 인식하는 강한 항체 반응을 발생시킬 뿐만 아니라 R&D 시스템스사에서 시판하는 ELISA "샌드위치" 키트를 사용하여 NSE/hIL-6 마우스의 혈청에서 검출될 수 있는 hIL-6의 농도를 평균 500배 이상 저하시킨다.
| 혈청 내 hIL-6 농도 | ||
| 면역 처리전 혈청 | 제3 시료 | |
| 마우스 번호 1 | 26 ng/ml | 0.02 ng/ml |
| 마우스 번호 2 | 39 ng/ml | 0.01 ng/ml |
| 마우스 번호 3 | 28 ng/ml | 0.10 ng/ml |
| 마우스 번호 4 | 35 ng/ml | 0.10 ng/ml |
| 평균 | 32 ng/ml | 0.057 ng/ml |
실시예 4
Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스에서 발생한 항체는 또한 체내에서의 야생형 hIL-6의 생물학적 활성도 중화시킬 수 있다.
IL-6이 간에 의한 일련의 단백질 ("급성상(acute phase) 단백질"로 칭함)의 생성을 유도한다는 것은 공지되어 있다. 본원에서 SAA로 약칭되는 혈청 아밀로이드 A는 급성 사건 동안 강하고 신속한 증가를 보인다.
본 실시예의 목적은 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 발생하고 wtIL-6에 교차반응할 수 있는 항체가 hIL-6의 주사 후에 마우스 SAA (mSAA)의 증가 억제도로서 측정되는, 야생형 hIL-6의 생물학적 활성을 체내에서도 중화시킬 수 있는지를 시험하기 위한 것이다. 이를 위해서, 혈액 시료 (이하, 주사전 시료로 칭함)를 비면역접종된 (대조군) NSE/hIL-6 마우스, wt hIL-6 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스 및 Sant1 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스로부터 채취하였다. 시험 동물을 회복시킨 후에 hIL-6 10 ㎍을 복강내 주사하였다. 주사 9시간 후에 제2 혈액 시료 (이하 주사후 시료로 칭함)를 양군의 동물로부터 채취하였다. "바이오소스 인터내셔날(Biosource International)"사에서 시판하는 키트를 제조자의 지시에 따라 정확하게 사용하여 "샌드위치" ELISA 시험에 의해 통상의 방법에 따라 주사전 시료 및 주사후 시료의 mSAA를 측정하였다. 그 결과를 표 3에 요약하였다. 표에서 알 수 있는 바와 같이, 동물 사이에 차이는 있지만 평균적으로 hIL-6 10 ㎍을 주사한 비면역접종된 마우스에서 혈청내 SAA 농도의 상당한 증가가 측정되었고 이러한 증가는 동일한 양의 hIL-6을 주사한 Sant1 면역접종 마우스에서는 존재하지 않았다. 따라서, Sant1을 사용한 면역접종은 Sant1 자체와 wtIL-6을 모두 인식하고 인간 혈종 세포에 대한 wt hIL-6의 시험관내 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 강한 항체 반응을 발생시킬 뿐만 아니라 hIL-6의 주사에 의해 유도되는 mSAA의 체내 농도 증가를 억제한다. 즉, Sant1을 사용한 면역접종은 hIL-6의 체내 생물학적 활성도 중화시킨다. 야생형 hIL-6을 사용한 면역접종은 소량의 항 hIL-6 항체의 생성을 유도하고 (실시예 1), 이것은 야생형 hIL-6으로 면역접종된 마우스가 비면역접종된 대조군 마우스에서 관찰되는 것과 비교할만한 혈청내 SAA 농도 증가를 보이기 때문에 hIL-6의 주사에 의해 유도되는 mSAA 농도의 증가를 체내에서 억제할 수 없다는 것을 알아야 한다.
| 혈청내 mSAA 농도 | mSAA 농도 증가 배수 | ||||
| 마우스 군 | 마우스 번호 | 주사전 시료 | 주사후 시료 | 각각의 마우스 | 군 평균 |
| Sant1로면역처리된 군 | 1 | 68 ㎍/ml | 24 ㎍/ml | 0.53 | 1.13 |
| 3 | 23 ㎍/ml | 14 ㎍/ml | 0.61 | ||
| 28 | 83 ㎍/ml | 93 ㎍/ml | 1.12 | ||
| 36 | 62 ㎍/ml | 105 ㎍/ml | 1.7 | ||
| 37 | 95 ㎍/ml | 177 ㎍/ml | 1.87 | ||
| 비면역처리된 대조군 | 5 | 112 ㎍/ml | 718 ㎍/ml | 6.4 | 9.01 |
| 8 | 41 ㎍/ml | 694 ㎍/ml | 16.9 | ||
| 14 | 140 ㎍/ml | 613 ㎍/ml | 4.4 | ||
| 21 | 47 ㎍/ml | 479 ㎍/ml | 10.13 | ||
| 22 | 51 ㎍/ml | 412 ㎍/ml | 8.1 | ||
| 51 | 53 ㎍/ml | 433 ㎍/ml | 8.15 | ||
| wt hIL-6로면역처리된 군 | 11 | 72 ㎍/ml | 784 ㎍/ml | 10.3 | 8.9 |
| 12 | 54 ㎍/ml | 380 ㎍/ml | 6.9 | ||
| 13 | 28 ㎍/ml | 310 ㎍/ml | 11.1 | ||
| 15 | 16 ㎍/ml | 117 ㎍/ml | 7.2 |
실시예 5
보조제로서의 수산화알루미늄 중에 제제화된 hIL-6 및 Sant1을 사용한 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스의 면역접종
상이한 항원은 상이한 보조제 중에 제제화되는 경우에 상이하게 작용한다는 것은 잘 알려져 있다 (Gupta, R. K. and Siber, G. R., Vaccine, 13, 1263-1276, 1995). 실시예 1에서 기술한 면역접종 실험에서 사용된 완전 (또는 불완전) 프로인트 보조제는 부작용, 대체로 주사 부위에서의 국소 반응, 예를 들면 육아종 및 포낭 형성 때문에 인체에 사용될 수 없다 (Gupta, R. K. and Siber, G. R., Vaccine, 13, 1263-1276, 1995). 본 실시예의 목적은 인간에 대한 면역접종에 통상 사용되는 보조제를 사용하는 경우에도 Sant1 및 wt hIL-6에 대한 고역가의 항체를 사용할 때 유사한 면역 반응이 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 발생할 수 있는지를 조사하는 것이다. 이를 위해서, 현재 매우 우수한 안전성 기록을 가지면서 인체에 통상 사용되는 보조제이기 때문에 수산화알루미늄을 선택하였다 (Gupta, R. K. and Siber, G. R., Vaccine, 13, 1263-1276, 1995).
NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스 8 내지 10마리로 이루어진 군(동일한 어미에게서 태어난 비트랜스제닉 마우스 10마리를 대조군으로 사용)에 대하여 실시예 1에서 기술한 것과 동일한 면역접종 프로토콜을 사용하여 각 주사당 총 용량 100 ㎕(수산화알루미늄 100 ㎍) 중에 1 mg/ml로 수산화알루미늄 중에 제제화된 항원 100 ㎍(Sant1 또는 야생형 hIL-6)을 복강내 주사하여 면역접종하였다. 제2 혈액 시료 (제2 주사 또는 제1 부스터 후에 채취) 및 제3 시료 (제3 주사 또는 제2 부스터 후에 채취)에 대하여 면역접종에 사용된 항원에 대한 항체의 존재 여부를 실시예 1에서 기술한 "ELISA"에 의해 시험하였다.
모든 시험 동물에 대해 비교할 수 있는 객관적인 측정을 실시하기 위해서 동일한 동물로부터 채취한 면역접종전 혈청의 가장 높은 판독치보다 0.5 O.D.450높은 판독치를 제공하는 혈청의 희석율을 통상 "역가"로 명명하였다. 이러한 역가는 도 1a, 1b, 2a 및 2b에 예시한 바와 같이 야생형 hIL-6 및 Sant1로 면역접종된 정상 마우스 및 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에 대해 측정하였다.
일반적으로, 이러한 면역접종 실험에서 수득한 항원에 대한 항체의 양(역가)은 실시예 1에서 설명한 면역접종 실험에서 수득한 항체의 양보다 더 높았고, 실제로 알루미늄 보조제가 혈청 항체의 유도를 위한 보조제라는 사실은 현재 통상적인 기술의 일부이다 (Gupta, R. K. and Siber, G. R., Vaccine, 13, 1263-1276, 1995). 보다 구체적으로는, wt hIL-6 항원으로 면역접종된 마우스에 있어서 (동물 사이에 차이는 있지만) 비트랜스제닉 마우스에는 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 수득한 것보다 평균적으로 12 내지 18배 더 강한 wt IL-6에 대한 항체 반응이 발생하였음을 알 수 있고, 이것은 트랜스제닉 마우스가 보조제로서의 수산화알루미늄 중에 제제화된 인간 hIL-6 항원이 주사된 경우에도 인간 IL-6에 대한 면역 내성을 생성시켰음을 입증한다. 이와 반대로, 수산화알루미늄 중에 제제화된 Sant1 항원으로 면역접종된 마우스에 있어서는 이 경우에도 실시예 1에서 설명한 면역접종 실험에서와 같이 평균적으로 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 수득한 것과 동일한 항체 반응이 비트랜스제닉 마우스에서 발생하였음을 알 수 있고, 이것은 (hIL-6에 도입되어 Sant1을 생성시키는) 7개의 돌연변이가 변이체 Sant1을 수산화알루미늄 중에 제제화된 경우에도 완전히 외부 단백질로 만들었다는 것을 시사한다.
| 마우스 군 | 마우스 번호 | 혈청 역가 | |
| 제2 시료 | 제3 시료 | ||
| 수산화알루미늄 중의 야생형 hIL-6의복강내 투여로 면역처리된 비트랜스제닉 마우스 | 30 | 21960 | 11848 |
| 32 | 6070 | 15790 | |
| 34 | 7460 | 46000 | |
| 46 | 14145 | 19600 | |
| 49 | 6240 | 18600 | |
| 54 | 1270 | 6960 | |
| 56 | 218 | 320 | |
| 58 | 5470 | 5260 | |
| 63 | 2138 | 2373 | |
| 65 | 1200 | 13056 | |
| 군 평균 | 6617 | 3810 | |
| 수산화알루미늄 중의 야생형 hIL-6의복강내 투여로 면역처리된 NSE/hIL-6마우스 | 35 | 450 | 530 |
| 51 | 2200 | 1630 | |
| 53 | 169 | 100 | |
| 60 | 160 | 630 | |
| 75 | 55 | 217 | |
| 85 | 81 | 1440 | |
| 87 | 110 | 176 | |
| 90 | 64 | 390 | |
| 93 | 1900 | 1700 | |
| 99 | 194 | 555 | |
| 군 평균 | 538 | 737 |
| 마우스 군 | 마우스 번호 | 혈청 역가 | |
| 제2 시료 | 제3 시료 | ||
| 수산화알루미늄 중의 Sant1의 복강내 투여로 면역처리된비트랜스제닉마우스 | 20 | 7270 | 28185 |
| 21 | 7580 | 30200 | |
| 26 | 3555 | 54330 | |
| 27 | 2185 | 10960 | |
| 28 | 9060 | 35700 | |
| 29 | 7910 | 34515 | |
| 33 | 7380 | 43980 | |
| 34 | 1160 | 10550 | |
| 36 | 5785 | 19880 | |
| 43 | 5035 | 23155 | |
| 군 평균 | 5692 | 29145 | |
| 수산화알루미늄 중의 Sant1의 복강내 투여로 면역처리된 NSE/hIL-6마우스 | 22 | 4520 | 23105 |
| 35 | 3516 | 28690 | |
| 38 | 9990 | 44680 | |
| 44 | 3580 | 14430 | |
| 46 | 1480 | 9940 | |
| 59 | 9780 | 20525 | |
| 61 | 2360 | 63970 | |
| 79 | 2250 | 26330 | |
| 군 평균 | 4400 | 30210 |
실시예 6
수산화알루미늄 중에 제제화된 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스의 혈청에서 발생한 항체는 Sant1과 야생형 hIL-6을 모두 인식할 수 있다.
본 실시예는 수산화알루미늄 중에 제제화된 Sant1로 면역접종된 NSE 마우스에서 Sant1에 대하여 발생한 항체가 야생형 hIL-6 (wt hIL-6)과 교차반응할 수 있는지를 시험하기 위한 것이다. 이 시험은 실시예 2에 설명된 것과 동일한 방법을 사용하여 "ELISA"에 의해 실시하였다. 항체 역가는 상기한 바와 같이 도 1a, 1b, 2a 및 2b에 도시한 바와 같이 계산하였고 수득한 데이터를 표 5에 기록하였다.
| 마우스 군 | 마우스번호 | 제2 시료 혈청 역가 | 제3 시료 혈청 역가 | ||
| wt hIL-6 | Sant1 | wt hIL-6 | Sant1 | ||
| 수산화알루미늄 중의 Sant1의 복강내 투여로 면역처리된 NSE/hIL-6 마우스 | 22 | 2525 | 4520 | 31180 | 33105 |
| 35 | 1925 | 3516 | 11860 | 28690 | |
| 38 | 7065 | 9990 | 43850 | 44680 | |
| 44 | 3580 | 3580 | 10585 | 14430 | |
| 46 | 1480 | 1480 | 8675 | 9940 | |
| 59 | 9990 | 9780 | 20360 | 20525 | |
| 61 | 2800 | 2360 | 52000 | 63970 | |
| 79 | 1980 | 2250 | 14890 | 26330 | |
| 군 평균 | 3630 | 4400 | 22800 | 28750 |
또한, 수산화알루미늄을 면역접종용 보조제로서 사용한 경우에도 Sant1 및 야생형 hIL-6에 대한 항체 역가는 유사하였다. NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스를 야생형 hIL-6으로 면역접종한 경우에 야생형 hIL-6 자체에 대해 작용하는 항체 반응은 훨씬 낮음을 주목하여야 한다. 예를 들면 제3 혈액 시료에서 wt hIL-6에 대한 평균 역가는 wt hIL-6으로 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스의 군에서 737이고 (실시예 5 참조), 이에 비해 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스의 군에서 wt hIL-6에 대한 항체 역가는 평균 22800(13배)이다.
실시예 7
수산화알루미늄 중에 제제화된 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스에서 발생한 항체는 야생형 hIL-6의 생물학적 활성도 중화시킬 수 있다.
본 실시예의 목적은 수산화알루미늄 중에 제제화된 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 발생하였지만 야생형 hIL-6을 인식할 수 있는 항체가 야생형 hIL-6 자체의 생물학적 활성도 중화시킬 수 있는지를 시험하기 위한 것이다.
야생형 IL-6의 고려되는 생물학적 활성은 인간 Hep3B 혈종 세포에서 C-반응성 단백질 유전자 프로모터에 의한 전사를 자극하는 능력이었다. 전사 자극 효능은 통상의 방법에 따라 측정하였다 (Gregory, B., Savino, R. and Ciliberto, G., J. Immunological Methods, 170, 47-56, 1994). 야생형 IL-6 4 ng/ml을 사용하여 인간 Hep3B 혈종 세포를 자극하고, 이러한 정도의 자극을 100%로서 설정하고 Sant1과 야생형 hIL-6에 의해 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스로부터 채취한 제3 혈액 시료에서 수득한 혈청의 연속적인 희석물의 존재 하에 야생형 hIL-6 4 ng/ml으로 자극하였다. 후자의 경우에 전사 자극의 정도는 야생형 hIL-6 4 ng/ml만을 사용하여 배양한 혈종 세포에서 수득한 자극에 대한 비율로서 표현하였다. 실험 결과는 도 5a 및 5b에 도시하였다. 도 5에서 1:400으로 희석된 모든 마우스의 혈청은 인간 혈종 세포에 대한 야생형 hIL-6의 생물학적 활성을 4 ng/ml에서 거의 완전히 억제함을 알 수 있다. 따라서, 외부 첨가된 hIL-6의 인간 혈종 세포에 대한 생활성을 중화시키는 능력은 CFA로 면역접종된 동물에서보다 수산화알루미늄으로 면역접종된 동물의 혈청에서 훨씬 높았다 (실시예 3 참조 및 도 4와 도 5a 비교). NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스를 야생형 hIL-6으로 면역접종한 경우에 수득된 매우 소량의 항 hIL-6 항체는 인간 혈종 세포에 대한 야생형 hIL-6의 생물학적 활성을 억제하기에는 충분하지 않다 (도 5b 참조).
또한, 이 경우에 상기 야생형 hIL-6에 대한 교차 반응성 면역 반응의 발생이 Sant1 및 야생형 hIL-6에 의해 면역접종된 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스의 혈청에서 측정된 야생형 hIL-6의 농도를 변경시킬 수 있는지를 조사하였다. hIL-6 농도는 두 군의 마우스의 면역접종전 시료 및 제3 시료 모두에서 실시예 3에서 기술한 바와 같이 측정하였다. 그 결과를 표 6에 요약하였다. 표에서 알 수 있는 바와 같이, 수산화알루미늄 중에 제제화된 Sant1을 사용한 면역접종은 Sant1 자체와 wt hIL-6을 모두 인식하는 강한 항체 반응을 발생시킬 뿐만 아니라 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스의 혈청에서 검출될 수 있는 hIL-6의 농도를 평균 약 1,400배 저하시킨다. 동일한 보조제 중에 제제화된 야생형 hIL-6을 사용한 면역접종은 혈청에서 검출될 수 있는 hIL-6의 농도를 단지 약간 저하시킨다 (상기 1,400배에 비해 단지 3배에 불과함).
| 마우스 군 | 마우스 번호 | 혈청내 hIL-6 농도 (pg/ml) | |
| 면역처리 전 시료 | 제3 시료 | ||
| 수산화알루미늄 중의 야생형 hIL-6의 복강내 투여로 면역처리된 NSE/hIL-6 마우스 | 35 | 27505 | 3522 |
| 51 | 24950 | 2662 | |
| 53 | 25817 | 4566 | |
| 60 | 23283 | 9810 | |
| 75 | 26373 | 8186 | |
| 85 | 23000 | 8959 | |
| 87 | 25527 | 9172 | |
| 90 | 25590 | 20041 | |
| 93 | 23275 | 5834 | |
| 99 | 30830 | 6582 | |
| 군 평균 | 25585 | 7933 | |
| 수산화알루미늄 중의 Sant1의 복강내 투여로 면역처리된 NSE/hIL-6 마우스 | 22 | 27300 | *9 |
| 35 | 31778 | *9 | |
| 38 | 25223 | *9 | |
| 44 | 29385 | 41 | |
| 46 | 20600 | *9 | |
| 59 | 22820 | 45 | |
| 61 | 23125 | *9 | |
| 79 | 24510 | *9 | |
| 균 평균 | 25593 | 18 | |
| 별(*)은 분석 감도의 보다 낮은 한도를 나타낸다. |
실시예 8
수산화알루미늄 중에 제제화된 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스에서 생성된 항체는 wt hIL-6의 생물학적 활성을 체내에서도 중화시킬 수 있다.
본 실시예의 목적은 수산화알루미늄 중에 제제화된 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 발생하였지만 wtIL-6을 인식할 수 있는 항체가, 실시예 4에서 기술한 바와 같이 hIL-6의 주사에 의해 마우스에서 유도되는 마우스 SAA (mSAA)의 혈청내 농도 증가로서 측정되는 야생형 hIL-6의 생물학적 활성을 체내에서도 중화시킬 수 있는지를 시험하기 위한 것이다. 수산화알루미늄 중에 제제화된 Sant1로 면역접종되지 않은 NSE/hIL-6 마우스 (대조군) 및 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스에 대해 실시예 4에서 기술한 바와 같은 실험을 실시하였다. 그 결과를 표 7에 요약하였다. 표에서 알 수 있는 바와 같이, 동물 사이에 차이는 있지만 hIL-6 10 ㎍을 주사한 비면역접종된 마우스에서는 평균적으로 혈청내 SAA 농도의 5 내지 6배 증가가 측정되었다. 수산화알루미늄 중에 제제화된 Sant1로 면역접종되고 동일한 양의 hIL-6을 주사한 마우스에서는 증가하지 않았다.
| 마우스 군 | 마우스 번호 | 혈청내 mSAA 농도(㎍/ml) | mSAA 농도 증가 배수 | ||
| 주사전 시료 | 주사후 시료 | 각 마우스 | 군 평균 | ||
| Sant1로면역처리됨 | 22 | 6.1 | 7.1 | 1.14 | 1.19 |
| 35 | 4.4 | 5.5 | 1.24 | ||
| 38 | 7.4 | 9.9 | 1.34 | ||
| 44 | 4.6 | 6.5 | 1.4 | ||
| 46 | 5.2 | 6.9 | 1.33 | ||
| 59 | 6.7 | 7.5 | 1.13 | ||
| 61 | 8.6 | 10.2 | 1.19 | ||
| 79 | 8.8 | 6.8 | 0.77 | ||
| 비면역처리된 대조군 | 15 | 85 | 265 | 3.1 | 5.41 |
| 16 | 99 | 366 | 3.7 | ||
| 19 | 296 | 2997 | 10.1 | ||
| 20 | 41 | 146 | 3.6 | ||
| 21 | 45 | 276 | 6.1 | ||
| 55 | 41 | 303 | 7.4 | ||
| 56 | 75 | 291 | 3.9 |
따라서, Sant1을 사용한 면역접종은 Sant1 자체와 wtIL-6을 모두 인식하고 인간 혈종 세포에 대한 wt hIL-6의 시험관내 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 강한 항체 반응을 발생시킬 뿐만 아니라 hIL-6의 주사에 의해 유도되는 mSAA의 체내 농도 증가를 억제한다. 즉, Sant1을 사용한 면역접종은 hIL-6의 체내 생물학적 활성도 중화시킨다.
실시예 9
수산화알루미늄 중에 제제화되고 피내 투여 경로로 투여된 hIL-6 및 Sant1을 사용한 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스의 면역접종
상기 실시예 5, 6, 7 및 8은 인체에 사용하기 적합한 보조제 (수산화알루미늄) 중에 제제화된 hIL-6의 변이형 (Sant1)을 사용하여 시험관내 및 체내 모두에서 hIL-6 생활성을 중화시킬 수 있는 wt hIL-6 자체에 대한 강한 항체 반응을, 그렇지 않으면 wt hIL-6에 내성인 동물에서 수득할 수 있다는 것을 보여준다. 그러나, 실시예 5에서 설명한 면역접종 실험에서 항원은 인간 면역접종에 일반적인 투여 경로가 아닌 복강내 주사되었다. 본 실시예의 목적은 Sant1 및 wt hIL-6에 대한 높은 역가의 항체를 사용한 유사한 면역 반응이 인간 면역접종에 사용되는 투여 경로를 사용하는 경우에도 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 발생할 수 있는지를 시험하는 것이다.
NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스 8 내지 9마리로 이루어지는 군 (동일한 어미에게서 태어난 비트랜스제닉 마우스 10마리를 대조군으로 사용)에 대하여 통상의 방법에서 설명되는 수종의 백신 투여를 위해 현재 사용되는 인간에 대한 피하(S.C.) 투여 경로에 대응하는 마우스에 대한 피내(I.D.) 투여 경로로 투여하여 면역접종하였다. 다시, 실시예 1에서 설명한 바와 동일한 면역접종 프로토콜을 사용하여 각 주사당 총 용량 100 ㎕(수산화알루미늄 100 ㎍)에 1 mg/ml로 수산화알루미늄 중에 제제화된 항원 (Sant1 또는 야생형 hIL-6) 100 ㎍을 사용하였다. 제2 혈액 시료 (제2 주사 또는 제1 부스터 후에 채취) 및 제3 혈액 시료 (제3 주사 또는 제2 부스터 후에 채취)에 대하여 면역접종에 사용된 항원에 대한 항체의 존재 여부를 실시예 1에서 기술한 바와 동일한 "ELISA"에 의해 시험하였다.
모든 시험 동물에 대해 비교할 수 있는 객관적인 측정을 실시하기 위해서 동일한 동물로부터 채취한 면역접종전 혈청의 가장 높은 판독치보다 0.5 O.D.450높은 판독치를 제공하는 혈청의 희석율을 통상 "역가"로 명명하였다. 이러한 역가는 도 1a, 1b, 2a 및 2b에 예시한 바와 같이 야생형 hIL-6 및 Sant1로 면역접종된 정상 마우스 및 트랜스제닉 마우스에 대해 측정하였다.
wt hIL-6 항원으로 면역접종된 마우스에 있어서 (동물 사이에 차이는 있지만) 비트랜스제닉 마우스에는 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 수득한 것보다 평균적으로 40 내지 50배 더 강한 wt IL-6에 대한 항체 반응이 발생하였음을 알 수 있고, 이것은 수산화알루미늄 중에 제제화된 인간 hIL-6 항원이 피내 투여 경로로 투여된 경우에도 트랜스제닉 마우스에서 인간 IL-6에 대한 면역 내성이 발생하였음을 입증한다. 이와 대조적으로, 수산화알루미늄 중에 제제화된 Sant1 항원으로 면역접종된 마우스에 있어서는 이 경우에도 실시예 1 및 5에서 설명한 면역접종 실험에서와 같이 평균적으로 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 수득한 것과 대등한 항체 반응이 비트랜스제닉 마우스에서 발생하였음을 알 수 있고, 이것은 (hIL-6에 도입되어 Sant1을 생성시키는) 7개의 돌연변이가 수산화알루미늄 중에 제제화되어 피내 투여 경로에 의해 주사된 경우에도 변이체 Sant1을 완전히 외부 단백질로 만들었다는 것을 시사한다.
| 마우스 군 | 마우스 번호 | 혈청 역가 | |
| 제2 시료 | 제3 시료 | ||
| 수산화알루미늄 중의 야생형 hIL-6의 피내 투여로 면역처리된비트랜스제닉 마우스 | 31 | 6220 | 4250 |
| 45 | 888 | 1270 | |
| 48 | 52 | 1150 | |
| 50 | 1060 | 7640 | |
| 55 | 4050 | 4560 | |
| 57 | 4337 | 9260 | |
| 61 | 4065 | 9020 | |
| 64 | 13690 | 20000 | |
| 66 | 5460 | 7500 | |
| 65 | 680 | 700 | |
| 군 평균 | 4050 | 6535 | |
| 수산화알루미늄 중의 야생형 hIL-6의 피내 투여로 면역처리된NSE/hIL-6 마우스 | 47 | 240 | 195 |
| 52 | 51 | 25 | |
| 62 | 30 | 120 | |
| 81 | 39 | 160 | |
| 86 | 97 | 200 | |
| 91 | 77 | 100 | |
| 96 | 306 | 210 | |
| 2 | 25 | 100 | |
| 군 평균 | 108 | 139 |
| 마우스 군 | 마우스 번호 | 혈청 역가 | |
| 제2 시료 | 제3 시료 | ||
| 수산화알루미늄 중의Sant1의 피내 투여로면역처리된 비트랜스제닉 마우스 | 25 | 890 | 4610 |
| 30 | 540 | 3670 | |
| 31 | 4370 | 13960 | |
| 32 | 1770 | 10690 | |
| 37 | 7860 | 13235 | |
| 39 | 8400 | 26680 | |
| 40 | 7360 | 49774 | |
| 45 | 6510 | 4770 | |
| 50 | 1000 | 16280 | |
| 53 | 470 | 3100 | |
| 군 평균 | 3920 | 14680 | |
| 수산화알루미늄 중의Sant1의 피내 투여로면역처리된 NSE/hIL-6마우스 | 41 | 4640 | 5735 |
| 42 | 2145 | 7640 | |
| 47 | 1150 | 4490 | |
| 48 | 1600 | 8700 | |
| 49 | 2110 | 6740 | |
| 51 | 8980 | 20250 | |
| 52 | 11400 | 23380 | |
| 56 | 2030 | 9880 | |
| 65 | 4290 | 14080 | |
| 군 평균 | 4260 | 11210 |
실시예 10
수산화알루미늄 중에 제제화된 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스의 혈청에서 발생한 항체는 Sant1 뿐만 아니라 야생형 hIL-6도 모두 인식할 수 있다.
본 실시예는 수산화알루미늄 중에 제제화된 Sant1의 피내 투여 경로에 의한 주사로 면역접종된 NSE 마우스에서 발생한 항체가 야생형 hIL-6 (wt hIL-6)과 교차반응할 수 있는지를 시험하기 위한 것이다. 이 시험은 실시예 2에 설명된 것과 동일한 방법을 사용하여 "ELISA"에 의해 실시하였다. 항체 역가는 상기한 바와 같이 도 1a, 1b, 2a 및 2b에 도시한 바에 따라 계산하였고 수득한 데이터를 표 9에 기록하였다.
| 마우스 군 | 마우스번호 | 제2 시료 혈청 역가 | 제3 시료 혈청 역가 | ||
| wt hIL-6 | Sant1 | wt hIL-6 | Sant1 | ||
| 수산화알루미늄 중의 Sant1의 피내 투여로 면역처리된 NSE/hIL-6 마우스 | 41 | 960 | 4640 | 5800 | 5735 |
| 42 | 2720 | 2145 | 7820 | 7640 | |
| 47 | 665 | 1150 | 2190 | 4490 | |
| 48 | 1010 | 1600 | 7075 | 8700 | |
| 49 | 2660 | 2110 | 5060 | 6740 | |
| 51 | 6660 | 8980 | 17970 | 20250 | |
| 52 | 13380 | 11400 | 20740 | 23380 | |
| 56 | 2360 | 2030 | 7240 | 9880 | |
| 65 | 4290 | 4290 | 10700 | 14080 | |
| 군 평균 | 3856 | 4260 | 9400 | 11210 |
수산화알루미늄을 피내 투여 경로를 통한 면역접종용 보조제로서 사용한 경우에도 Sant1 및 야생형 hIL-6에 대한 항체 역가는 유사하였다. NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스를 야생형 hIL-6으로 면역접종한 경우에 야생형 hIL-6 자체에 대한 항체 반응은 훨씬 낮음을 주목하여야 한다. 예를 들면 제3 혈액 시료에서 wt hIL-6에 대한 평균 역가는 wt hIL-6으로 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스의 군에서 139이고 (실시예 9 참조), 이에 비해 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스의 군에서 wt hIL-6에 대한 평균 역가는 9400(70배)이다.
실시예 11
수산화알루미늄 중에 제제화되어 피내 주사된 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스에서 발생한 항체는 야생형 hIL-6의 생물학적 활성도 중화시킬 수 있다.
본 실시예의 목적은 수산화알루미늄 중에 제제화되어 피내 주사된 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 발생한 항체가 야생형 hIL-6 자체의 생물학적 활성을 중화시킬 수도 있는지를 시험하기 위한 것이다.
야생형 IL-6의 고려되는 생물학적 활성은 인간 Hep3B 혈종 세포에서 C-반응성 단백질 유전자 프로모터에 의한 전사를 자극하는 능력이었다. 전사 자극 효능은 통상의 방법에 따라 측정하였다 (Gregory, B., Savino, R. and Ciliberto, G., J. Immunological Methods, 170, 47-56, 1994). 실시예 7에서 기술한 바와 같이, 야생형 hIL-6 4 ng/ml을 사용하여 인간 Hep3B 혈종 세포를 자극하고, 이러한 정도의 자극을 100%로서 설정하고 Sant1 및 야생형 hIL-6의 피내 투여로 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스로부터 채취한 제3 혈액 시료에서 수득한 혈청의 연속적인 희석물의 존재 하에 야생형 hIL-6 4 ng/ml으로 자극하였다. 후자의 경우에 전사 자극의 정도는 4 ng/ml의 야생형 hIL-6만을 사용하여 배양한 세포에서 수득한 자극에 대한 비율로서 표현하였다. 실험 결과는 도 6a 및 6b에 도시하였다. 도 6에서 1:400으로 희석된 모든 마우스의 혈청은 인간 혈종 세포에 대한 야생형 hIL-6의 생물학적 활성을 4 ng/ml에서 80% 이상 억제함을 알 수 있다. NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스를 야생형 hIL-6으로 면역접종한 경우에, 수득된 매우 소량의 항 hIL-6 항체는 인간 혈종 세포에 대한 야생형 hIL-6의 생물학적 활성을 억제하기에는 충분하지 않다는 것을 유의하여야 한다 (도 6b 참조).
또한, 이 경우에 상기 야생형 hIL-6에 대한 교차 반응성 항체 반응의 발생이 Sant1과 야생형 hIL-6에 의해 면역접종된 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스의 혈청에서 측정된 야생형 hIL-6의 농도를 변경시킬 수 있는지를 조사하였다. hIL-6 농도는 두 군의 마우스의 면역접종전 시료 및 제3 시료에 대하여 실시예 3에서 기술한 바와 같이 측정하였다. 그 결과를 표 10에 요약하였다. 표에서 알 수 있는 바와 같이, 수산화알루미늄 중에 제제화되어 피내 주사된 Sant1을 사용한 면역접종은 Sant1 자체와 야생형 hIL-6을 모두 인식하는 강한 항체 반응을 발생시킬 뿐만 아니라 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스의 혈청에서 검출될 수 있는 hIL-6의 농도를 평균 약 350배 저하시킨다. 이와 대조적으로, 동일한 보조제 중에 제제화된 야생형 hIL-6 자체를 사용한 면역접종은 혈청에서 검출될 수 있는 hIL-6의 농도를 단지 약간 저하시킬 뿐이다 (상기 350배에 비해 단지 2.4배에 불과함).
| 마우스 군 | 마우스 번호 | 혈청내 hIL-6 농도 (pg/ml) | |
| 면역처리 전 시료 | 제3 시료 | ||
| 수산화알루미늄 중의 야생형 hIL-6의피내 투여로 면역처리된 NSE/hIL-6마우스 | 47 | 23790 | 5684 |
| 52 | 25450 | 3110 | |
| 62 | 26190 | 4490 | |
| 81 | 24690 | 25930 | |
| 86 | 22890 | 8600 | |
| 91 | 16600 | 6884 | |
| 96 | 16760 | 5800 | |
| 2 | 22970 | 14670 | |
| 군 평균 | 22418 | 9396 | |
| 수산화알루미늄 중의 Sant1의 피내 투여로 면역처리된 NSE/hIL-6 마우스 | 41 | 21640 | *9 |
| 42 | 19040 | *9 | |
| 47 | 22940 | 173 | |
| 48 | 23990 | *9 | |
| 49 | 21640 | 79 | |
| 51 | 25680 | 21 | |
| 52 | 24410 | 17 | |
| 56 | 26540 | 204 | |
| 65 | 20410 | 78 | |
| 균 평균 | 22920 | 66 | |
| 별(*)은 분석 감도의 보다 낮은 한도를 나타낸다. |
실시예 12
수산화알루미늄 중에 제제화되어 피내 주사된 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스에서 생성된 항체는 체내에서의 wt hIL-6의 생물학적 활성도 중화시킬 수 있다.
본 실시예의 목적은 수산화알루미늄 중에 제제화되어 피내 주사된 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 트랜스제닉 마우스에서 발생한 항체가, 실시예 4에서 기술한 바와 같이 hIL-6의 주사에 의해 마우스에서 정상적으로 유도되는 마우스 SAA (mSAA) 농도의 증가인 야생형 hIL-6의 생물학적 활성의 하나를 체내에서도 중화시킬 수 있는지를 시험하기 위한 것이다. 수산화알루미늄 중에 제제화되어 피내 주사된 Sant1로 면역접종된 NSE/hIL-6 마우스에 대해 실시예 4에서 기술한 바와 같은 실험을 실시하였다. 수득한 수치를 실시예 4 (표 3) 및 8 (표 7)에서 기술한 바와 같은 실험의 대조군으로서의 면역접종되지 않은 마우스와 비교하였다. 그 결과를 표 11에 요약하였다. 표에서 알 수 있는 바와 같이, 동물 사이에 차이는 있지만 비면역접종된 마우스에서 hIL-6 주사에 의해 야기된 SAA 농도의 7배 증가는 수산화알루미늄 중에 제제화되어 피내 주사된 Sant1로 면역접종된 마우스에서는 발생하지 않았다.
| 마우스 군 | 마우스 번호 | 혈청내 mSAA 농도(㎍/ml) | mSAA 농도 증가 배수 | ||
| 주사전 시료 | 주사후 시료 | 각 마우스 | 군 평균 | ||
| Sant1로면역처리됨 | 41 | 49 | 20 | 0.46 | 1.22 |
| 42 | 10 | 9 | 0.9 | ||
| 47 | 64 | 56 | 0.87 | ||
| 48 | 31 | 18 | 0.74 | ||
| 49 | 8 | 18 | 2.2 | ||
| 51 | 23 | 23 | 1.0 | ||
| 52 | 23 | 40 | 1.7 | ||
| 56 | 39 | 41 | 1.05 | ||
| 65 | 31 | 66 | 2.1 | ||
| 비면역처리된 대조군 | 5 | 112 | 718 | 6.4 | 7.07 |
| 8 | 41 | 694 | 16.9 | ||
| 14 | 140 | 613 | 4.4 | ||
| 15 | 85 | 265 | 3.1 | ||
| 16 | 99 | 366 | 3.7 | ||
| 19 | 296 | 2997 | 10.1 | ||
| 20 | 41 | 146 | 3.6 | ||
| 21 | 47 | 479 | 10.13 | ||
| 21 bis | 45 | 276 | 6.1 | ||
| 22 | 51 | 412 | 8.1 | ||
| 51 | 53 | 433 | 8.15 | ||
| 55 | 41 | 303 | 7.4 | ||
| 56 | 75 | 291 | 3.9 |
따라서, 인체에 사용하기 적합한 보조제 및 투여 경로에 의한 Sant1을 사용한 면역접종은 Sant1 자체와 wt hIL-6을 모두 인식하고 인간 혈종 세포에 대한 wt hIL-6의 시험관내 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 강한 항체 반응을 발생시킬 뿐만 아니라 hIL-6의 주사에 의해 유도되는 mSAA의 체내 농도 증가를 억제한다. 즉, 상기 Sant1을 사용한 면역접종은 hIL-6의 체내 생물학적 활성도 중화시킨다.
Claims (10)
- 특정 야생형 시토킨의 과도한 생성에 의해 야기되는 질병의 치료 또는 억제용 조성물 제조를 위한, 상기 시토킨의 수용체 길항제이면서 면역원인 야생형 시토킨의 뮤테인의 용도.
- 제1항에 있어서, 야생형 시토킨이 인간 인터루킨 6인 야생형 시토킨의 뮤테인의 용도.
- 제2항에 있어서, 만성 자기면역 질환, 전신계 홍반성 낭창, 골수종/형질세포종, 폐경기 후의 골다공증 및 암 악액질과 같은 상기 야생형 시토킨의 과도한 생성에 의해 야기되는 질병의 치료 또는 억제를 위한 인간 인터루킨 6의 뮤테인의 용도.
- 활성 성분으로서 야생형 시토킨의 뮤테인의 1종 이상을 제약상 유효량 함유하는 것을 특징으로 하는, 야생형 시토킨의 과도한 생성에 의해 야기되는 질병의 치료 또는 억제용 제약 화합물.
- 제4항에 있어서, 요구되는 투여 형태에 따라 적합하게 선택되고 투여되는 희석제, 부형제 또는 제약 비히클을 함유하는 제약 제제.
- 제4항에 있어서, 희석제, 부형제 또는 제약상 허용되는 비히클 중에 활성 성분으로서의 야생형 시토킨의 뮤테인의 1종 이상을 제약상 유효량 함유하는, 과도하게 생성되면 질병을 유발하는 야생형 시토킨에 대한 면역접종을 위한 백신.
- 제6항에 있어서, 과도하게 생성되면 만성 자기면역 질환, 전신계 홍반성 낭창, 골수종/형질세포종, 폐경기 후의 골다공증 및 암 악액질과 같은 질병을 유발하는 인간 인터루킨 6에 대한 면역접종을 위한 백신.
- 제7항에 있어서, 돌연변이 Tyr 31 Asp, Gly 35 Phe, Ser 118 Arg, Val 121 Asp, Gln 175 Ile, Ser 176 Arg, Gln 183 Ala를 함유하는, Sant1로 명명된 인간 인터루킨 6 (hIL-6)의 뮤테인을 활성 성분으로서 함유하는 백신.
- 제8항에 있어서, 주사당 뮤테인 0.1 내지 100 ㎍이 3회 주사되는, 수산화알루미늄 중에 1 mg/ml로 제제화된 뮤테인 Sant1을 활성 성분으로서 함유하는 백신.
- 제7항에 있어서, hIL-6을 hIL-6 수용체 길항제로 만들 수 있는 아미노산 치환체를 함유하는 임의의 hIL-6 변이체를 활성 성분으로서 함유하는 백신.
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