JP3157837B2 - 免疫原としての野生型サイトカインのミューティンの使用 - Google Patents
免疫原としての野生型サイトカインのミューティンの使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、野生型サイトカインの過剰産生によって惹
起される疾患における野生型サイトカインの生物学的活
性を中和することができる、野生型サイトカインに対す
る抗体を誘発するための免疫原としての、野生型サイト
カインの受容体アンタゴニストでもある、特定の野生型
サイトカインのミューテインの使用に関する。
起される疾患における野生型サイトカインの生物学的活
性を中和することができる、野生型サイトカインに対す
る抗体を誘発するための免疫原としての、野生型サイト
カインの受容体アンタゴニストでもある、特定の野生型
サイトカインのミューテインの使用に関する。
例えば、ヒトインターロイキン６（hIL−６）がヘリ
カル・サイトカインのクラスに属する184アミノ酸のポ
リペプチドであることは、公知の事実である。インター
ロイキン６は種々な細胞種類によって産生される多官能
性サイトカインである。これは、例えば免疫系細胞、肝
細胞、腎細胞、造血幹細胞、角質細胞及びニューロンの
ような、種々な種類の細胞に対して分化増殖因子として
作用する。しかし、hIL−６の過剰産生は例えば慢性自
己免疫障害、全身性エリテマトーデス、黒色腫／プラズ
マ細胞腫、閉経後骨粗しょう症及び癌悪液質のような、
多くの疾患の病因である。
カル・サイトカインのクラスに属する184アミノ酸のポ
リペプチドであることは、公知の事実である。インター
ロイキン６は種々な細胞種類によって産生される多官能
性サイトカインである。これは、例えば免疫系細胞、肝
細胞、腎細胞、造血幹細胞、角質細胞及びニューロンの
ような、種々な種類の細胞に対して分化増殖因子として
作用する。しかし、hIL−６の過剰産生は例えば慢性自
己免疫障害、全身性エリテマトーデス、黒色腫／プラズ
マ細胞腫、閉経後骨粗しょう症及び癌悪液質のような、
多くの疾患の病因である。
したがって、この特定の分野には、一般にサイトカイ
ンの、特にhIL−６の過剰産生を予防と治療の両方に関
して抑制する必要性がある。
ンの、特にhIL−６の過剰産生を予防と治療の両方に関
して抑制する必要性がある。
本発明の使用はこの必要性を満たすことを可能にし、
同時に、下記から明らかになる他の利点を提供する。
同時に、下記から明らかになる他の利点を提供する。
本発明の課題は、実際に、この特定の野生型サイトカ
インの過剰産生によって惹起される疾患の治療と予防の
ための薬剤コンパウンド（compound）を製造するための
野生型サイトカインの突然変異体の使用である。
インの過剰産生によって惹起される疾患の治療と予防の
ための薬剤コンパウンド（compound）を製造するための
野生型サイトカインの突然変異体の使用である。
本発明の他の課題は、野生型サイトカインの過剰産生
によって惹起される疾患の治療のための薬剤コンパウン
ド又は、この野生型サイトカインの少なくとも１種の突
然変異体を有効成分（active principle）として含有す
る前記疾患の予防のためのワクチンである。
によって惹起される疾患の治療のための薬剤コンパウン
ド又は、この野生型サイトカインの少なくとも１種の突
然変異体を有効成分（active principle）として含有す
る前記疾患の予防のためのワクチンである。
本発明による薬剤コンパウンドは、例えば製薬的に受
容されるビヒクルの存在を必要とする公知方法によって
製剤化することができる。これらのビヒクルと製剤化方
法との例はRemington's Pharmaceutical Scienceに見い
だすことができる。有効な投与のために適した製薬的に
受容されるコンパウンドを形成するために、これらのコ
ンパウンドは本発明による有効成分の有効量を含有しな
ければならない。本発明の薬剤コンパウンドは問題の個
人の疾患、体重、性別及び年齢に適した量で個人に投与
される。他の要素は投与方法を包含する。本発明による
薬剤コンパウンドは広範囲な方法で、例えば皮下に、局
所に、経口的に、また筋肉内注射によって投与すること
ができる。
容されるビヒクルの存在を必要とする公知方法によって
製剤化することができる。これらのビヒクルと製剤化方
法との例はRemington's Pharmaceutical Scienceに見い
だすことができる。有効な投与のために適した製薬的に
受容されるコンパウンドを形成するために、これらのコ
ンパウンドは本発明による有効成分の有効量を含有しな
ければならない。本発明の薬剤コンパウンドは問題の個
人の疾患、体重、性別及び年齢に適した量で個人に投与
される。他の要素は投与方法を包含する。本発明による
薬剤コンパウンドは広範囲な方法で、例えば皮下に、局
所に、経口的に、また筋肉内注射によって投与すること
ができる。
有効成分として野生型サイトカインの少なくとも１種
のミューテイン（mutein）を含有する、本発明による薬
剤コンパウンドは通常の投与ビヒクルに含めて非常に多
様な形式で治療量で投与することができる。
のミューテイン（mutein）を含有する、本発明による薬
剤コンパウンドは通常の投与ビヒクルに含めて非常に多
様な形式で治療量で投与することができる。
例えば、これらは錠剤、カプセル、ピル、粉末、顆
粒、エリキシル剤、軟膏、溶液、懸濁液、シロップ及び
エマルジョンとして経口的に又は注射によって摂取され
る用量で投与することができる。同様にして、本発明に
よるこれらのコンパウンドは静脈内に、腹腔内に、皮下
に、密封した若しくは密封なしの局所的に（topically
with or without occlusion）、又は筋肉内に投与する
ことができる。全ての上記投与形は製薬分野に熟練した
人に周知である。いずれにせよ、本発明による有効成分
の有効な、非毒性量を用いなければならない。
粒、エリキシル剤、軟膏、溶液、懸濁液、シロップ及び
エマルジョンとして経口的に又は注射によって摂取され
る用量で投与することができる。同様にして、本発明に
よるこれらのコンパウンドは静脈内に、腹腔内に、皮下
に、密封した若しくは密封なしの局所的に（topically
with or without occlusion）、又は筋肉内に投与する
ことができる。全ての上記投与形は製薬分野に熟練した
人に周知である。いずれにせよ、本発明による有効成分
の有効な、非毒性量を用いなければならない。
この有効成分の一日量は0.01〜1000mg/成人／日の広
範囲内で変化することができる。本発明による有効成分
の有効量は通常は、約0.001mg/体重kg/日〜約100mg/体
重kg/日の範囲内の用量で与えられる。
範囲内で変化することができる。本発明による有効成分
の有効量は通常は、約0.001mg/体重kg/日〜約100mg/体
重kg/日の範囲内の用量で与えられる。
本発明によると、特定の野生型サイトカインのミュー
テインから構成される有効成分は典型的には、所望の投
与形を留意して選択された、適当な希釈剤、賦形剤又は
製薬的ビヒクル（一般には、一般名称“ビヒクル”と呼
ばれる）との混合物として投与することができる。
テインから構成される有効成分は典型的には、所望の投
与形を留意して選択された、適当な希釈剤、賦形剤又は
製薬的ビヒクル（一般には、一般名称“ビヒクル”と呼
ばれる）との混合物として投与することができる。
本発明によるワクチンの製造法は当業者に公知であ
る。典型的に、これらのワクチンは溶液又は懸濁液のい
ずれかとして、注射可能な形で製造される。製剤はエマ
ルジョン化することができる、又は有効成分はリポソー
ム中に封入されることができる。有効な免疫原成分（im
mungenic ingredient）はしばしば、有効成分と適合し
うる製薬的に受容される賦形剤と混合される。適当な賦
形剤は例えば水、デキストロース、グリセロール、エタ
ノール等、及びこれらの混合物である。さらに、必要な
場合には、ワクチンは例えば湿潤剤若しくは乳化剤、pH
緩衝剤、及び／又はアジュバントのような付加的物質の
少量をワクチンの有効性を高めるために含有することが
できる。
る。典型的に、これらのワクチンは溶液又は懸濁液のい
ずれかとして、注射可能な形で製造される。製剤はエマ
ルジョン化することができる、又は有効成分はリポソー
ム中に封入されることができる。有効な免疫原成分（im
mungenic ingredient）はしばしば、有効成分と適合し
うる製薬的に受容される賦形剤と混合される。適当な賦
形剤は例えば水、デキストロース、グリセロール、エタ
ノール等、及びこれらの混合物である。さらに、必要な
場合には、ワクチンは例えば湿潤剤若しくは乳化剤、pH
緩衝剤、及び／又はアジュバントのような付加的物質の
少量をワクチンの有効性を高めるために含有することが
できる。
本発明によるワクチンは例えば筋肉内又は皮下注射を
用いて非経口的に投与することが好ましい。他の投与方
法に適した他の製剤は座薬と経口製剤を包含する。これ
らのコンパウンドは10〜95％、好ましくは25〜70％の有
効成分を含有する。
用いて非経口的に投与することが好ましい。他の投与方
法に適した他の製剤は座薬と経口製剤を包含する。これ
らのコンパウンドは10〜95％、好ましくは25〜70％の有
効成分を含有する。
これまでに、本発明を一般的に説明した。次では、下
記実施例を用いて、本発明に関する特定の状況を示し、
本発明の目的、特徴、利点及び可能な用途をさらに明確
に理解されることを目的として、さらに詳細に説明す
る。
記実施例を用いて、本発明に関する特定の状況を示し、
本発明の目的、特徴、利点及び可能な用途をさらに明確
に理解されることを目的として、さらに詳細に説明す
る。
図1aと1bは、正常なマウスとNSE/hIL−６トランスジ
ェニックマウスとの野生型hIL−６による免疫処置の実
験結果を示す。
ェニックマウスとの野生型hIL−６による免疫処置の実
験結果を示す。
図2aと2bは、正常なマウスとNSE/hIL−６トランスジ
ェニックマウスとにおけるSant1と略記される突然変異
体（mutant form）（突然変異:Tyr 31 Asp、Gly 35
Phe、Ser 118 Arg、Val 121 Asp、Gln 175 Il
e、Ser 176 Arg、Gln 183 Alaを含有し、hIL−６の
アンタゴニストである）による免疫処置の実験結果を示
す。
ェニックマウスとにおけるSant1と略記される突然変異
体（mutant form）（突然変異:Tyr 31 Asp、Gly 35
Phe、Ser 118 Arg、Val 121 Asp、Gln 175 Il
e、Ser 176 Arg、Gln 183 Alaを含有し、hIL−６の
アンタゴニストである）による免疫処置の実験結果を示
す。
図３は、Sant1に対してマウスに発生した抗体が野生
型IL−６を認識することもできるか否かを確認すること
を目的とした実験結果を示す。
型IL−６を認識することもできるか否かを確認すること
を目的とした実験結果を示す。
図４は、野生型インターロイキン６突然変異体Sant1
によって免疫処置されたNSE/hIL−６トランスジェニッ
クマウスに発生した抗体が野生型ヒトインターロイキン
６の生物学的活性を中和することができるか否かを確認
することを目的とした実験結果を示す。
によって免疫処置されたNSE/hIL−６トランスジェニッ
クマウスに発生した抗体が野生型ヒトインターロイキン
６の生物学的活性を中和することができるか否かを確認
することを目的とした実験結果を示す。
図5aと5bは、実施例７においておこなった実験の結果
を示す。
を示す。
図6aと6bは、実施例11においておこなった実験の結果
を示す。
を示す。
実施例１ hIL−６とSant1とを用いた、hIL−６に対して免疫寛容
を有するNSE/hIL−６トランスジェニックマウスの免疫
処置 NSE/hIL−６トランスジェニックマウスは、それらの
ゲノムにヒトインターロイキン６のcDNAを、ラット ニ
ューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモートの制御下
で、組み込んでいる。
を有するNSE/hIL−６トランスジェニックマウスの免疫
処置 NSE/hIL−６トランスジェニックマウスは、それらの
ゲノムにヒトインターロイキン６のcDNAを、ラット ニ
ューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモートの制御下
で、組み込んでいる。
上記NSE/hIL−６トランスジェニックマウス（マウス
５匹の群）を組換えヒトIL−６によって免疫処置しよう
と試みることによって、寛容の理論を立証した；対照と
して、同じ腹子として生まれた、但し導入遺伝子を有さ
ないきょうだいを用いた。５匹のNSE/hIL−６トランス
ジェニックマウスの群をSant1と呼ばれるIL−６の突然
変異体（ヒト細胞に対する残留生物学的活性を有さず、
ｈ−IL6受容体アンタゴニストとして挙動する）（これ
は以下に示す７個の突然変異を含有した:Tyr 31 As
p、Gly 35 Phe、Ser 118 Arg、Val 121 Asp、Gln
175 Ile、Ser 176 Arg、Gln 183 Ala）によって
も免疫処置した。この場合に、同じ腹子からの、但し導
入遺伝子を有さない、５匹のきょうだいも対照として用
いた。免疫処置プロトコールは次の通りであった：零時
点において、血液サンプル（免疫前サンプル）をトラン
スジェニックと非トランスジェニックの各動物から逐次
採取し；次に、各動物を完全フロイントアジュバンド
（CFA）の存在下で100μｇの抗原（マウスの群によっ
て、wt hIL−６又はSant1）によって腹腔内（IP）免疫
処置した。第１回免疫処置後10日目に、血液サンプルを
採取した（サンプル１）。第１回免疫処置後20日目に、
再び100μｇの抗原を用いて、不完全フロイントアジュ
バンド（IFA）の存在下で第２回免疫処置をおこない
（第１回追加免疫）、10日間後に（第１回免疫処置から
30日間）第２回血液サンプルを採取した（サンプル
２）。最後に、第１回免疫処置後40日目に、再び100μ
ｇの抗原を用いて、IFAの存在下で第３回免疫処置をお
こない（第２回追加免疫）、10日間後に（第１回免疫処
置から50日間）第３回血液サンプルを採取した（サンプ
ル３）。血液サンプルの各々から先行技術（the state
of the art）にしたがって、対応血清を調製した。
５匹の群）を組換えヒトIL−６によって免疫処置しよう
と試みることによって、寛容の理論を立証した；対照と
して、同じ腹子として生まれた、但し導入遺伝子を有さ
ないきょうだいを用いた。５匹のNSE/hIL−６トランス
ジェニックマウスの群をSant1と呼ばれるIL−６の突然
変異体（ヒト細胞に対する残留生物学的活性を有さず、
ｈ−IL6受容体アンタゴニストとして挙動する）（これ
は以下に示す７個の突然変異を含有した:Tyr 31 As
p、Gly 35 Phe、Ser 118 Arg、Val 121 Asp、Gln
175 Ile、Ser 176 Arg、Gln 183 Ala）によって
も免疫処置した。この場合に、同じ腹子からの、但し導
入遺伝子を有さない、５匹のきょうだいも対照として用
いた。免疫処置プロトコールは次の通りであった：零時
点において、血液サンプル（免疫前サンプル）をトラン
スジェニックと非トランスジェニックの各動物から逐次
採取し；次に、各動物を完全フロイントアジュバンド
（CFA）の存在下で100μｇの抗原（マウスの群によっ
て、wt hIL−６又はSant1）によって腹腔内（IP）免疫
処置した。第１回免疫処置後10日目に、血液サンプルを
採取した（サンプル１）。第１回免疫処置後20日目に、
再び100μｇの抗原を用いて、不完全フロイントアジュ
バンド（IFA）の存在下で第２回免疫処置をおこない
（第１回追加免疫）、10日間後に（第１回免疫処置から
30日間）第２回血液サンプルを採取した（サンプル
２）。最後に、第１回免疫処置後40日目に、再び100μ
ｇの抗原を用いて、IFAの存在下で第３回免疫処置をお
こない（第２回追加免疫）、10日間後に（第１回免疫処
置から50日間）第３回血液サンプルを採取した（サンプ
ル３）。血液サンプルの各々から先行技術（the state
of the art）にしたがって、対応血清を調製した。
この時点で、“ELISA"方法（固相酵素免疫測定法）を
用いて、免疫処置に用いた抗原に対する抗体が第２サン
プルと第３サンプルとから得られた血清中に存在するか
否かを検査した。これをするために、免疫処置に用いた
同じ抗原をこの種の実験のために特製した培養プレート
（ELISAプレート）の孔の底部に非共有結合式に結合さ
せた。抗原の固定化は1XPBS中に10μl/mlで溶解した抗
原の溶液100μｌをコートされるべき各孔において室温
において14時間インキュベートすることによっておこな
った（“コーティング”と名付けられた操作）。抗原の
固定化後に、孔中のプラスチックをタンパク質でコート
し、1XPBS中の0.8％BSA（ウシ血清アルブミン）の溶液
を各孔において室温において４時間インキュベートした
（“ブロッキング”と名付けられた操作）。“ブロッキ
ング”溶液を除去した後に、適当に希釈した各血清100
μｌを単独で各孔において室温で90分間インキュベート
した：この段階中に、血清中に孔の底部に固定化した抗
原に対する抗体が存在する場合には、これらは抗原自体
と結合して、次に孔の底部に結合する。90分間のインキ
ュベート期間後に、血清を孔から取り出し、充分に洗浄
した後に、マウス抗体に対するウサギ抗体を含有する1X
PBS中0.8％BSA 100μｌを各孔に加え、室温においてイ
ンキュベーションを50分間続けた。この段階中に、マウ
ス抗体が認識され、これが孔の底部に固定化された抗原
に結合するならば、これらのマウス抗体はウサギ抗体に
よって認識され、結合され、次に、ウサギ抗体が孔の底
部に固定化される。さらに、DAKO社によって製造され、
分配されるマウス抗体（上記実験のためにPBS/BSA中で
1:100の比に希釈して用いる）に対するウサギ抗体は酵
素、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに共有結合
する。50分間のインキュベーション後に、ウサギ抗体を
含有する溶液を取り出し、孔を充分に洗浄した。この時
点で、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに対する
基質（TMB:3,−３′，−5,−５′−テトラメチル−ベン
ジジン−ジクロリド）を含有する溶液100μｌを各孔に
加えた。酵素が基質を450ナノメートルにおいて可視光
線を吸光する産物に転化する；このようにして、ELISA
リーダー（reader）を用いて、各単一孔中の450nmの吸
光度の分光測光的測定によって転化量を算出することが
できる。この実験を正確におこなうならば、吸光度（即
ち、吸収された光の量）は酵素量に比例し、次に、この
酵素量はウサギ抗体量に比例し、次に、ウサギ抗体量は
血清中に本来（originally）存在する抗原に対するマウ
ス抗体の量に比例する。したがって、吸光度の測定は血
清中に存在する抗原に対するマウス抗体の量の推定値を
与える。このことは、抗原に対するマウス抗体が上記反
応の連鎖を限定するファクターであるならば、事実であ
る。したがって、適当な条件を得るためには、各血清に
対して、免疫処置に用いた抗原に対するマウス抗体量が
正確に測定されるために充分な大きさであるが、系を飽
和するほどの大きさにはならないある一定の希釈度が存
在するように、試験すべき各血清の一連の希釈（1:33か
ら1:8100まで）を実施することが望ましい。
用いて、免疫処置に用いた抗原に対する抗体が第２サン
プルと第３サンプルとから得られた血清中に存在するか
否かを検査した。これをするために、免疫処置に用いた
同じ抗原をこの種の実験のために特製した培養プレート
（ELISAプレート）の孔の底部に非共有結合式に結合さ
せた。抗原の固定化は1XPBS中に10μl/mlで溶解した抗
原の溶液100μｌをコートされるべき各孔において室温
において14時間インキュベートすることによっておこな
った（“コーティング”と名付けられた操作）。抗原の
固定化後に、孔中のプラスチックをタンパク質でコート
し、1XPBS中の0.8％BSA（ウシ血清アルブミン）の溶液
を各孔において室温において４時間インキュベートした
（“ブロッキング”と名付けられた操作）。“ブロッキ
ング”溶液を除去した後に、適当に希釈した各血清100
μｌを単独で各孔において室温で90分間インキュベート
した：この段階中に、血清中に孔の底部に固定化した抗
原に対する抗体が存在する場合には、これらは抗原自体
と結合して、次に孔の底部に結合する。90分間のインキ
ュベート期間後に、血清を孔から取り出し、充分に洗浄
した後に、マウス抗体に対するウサギ抗体を含有する1X
PBS中0.8％BSA 100μｌを各孔に加え、室温においてイ
ンキュベーションを50分間続けた。この段階中に、マウ
ス抗体が認識され、これが孔の底部に固定化された抗原
に結合するならば、これらのマウス抗体はウサギ抗体に
よって認識され、結合され、次に、ウサギ抗体が孔の底
部に固定化される。さらに、DAKO社によって製造され、
分配されるマウス抗体（上記実験のためにPBS/BSA中で
1:100の比に希釈して用いる）に対するウサギ抗体は酵
素、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに共有結合
する。50分間のインキュベーション後に、ウサギ抗体を
含有する溶液を取り出し、孔を充分に洗浄した。この時
点で、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに対する
基質（TMB:3,−３′，−5,−５′−テトラメチル−ベン
ジジン−ジクロリド）を含有する溶液100μｌを各孔に
加えた。酵素が基質を450ナノメートルにおいて可視光
線を吸光する産物に転化する；このようにして、ELISA
リーダー（reader）を用いて、各単一孔中の450nmの吸
光度の分光測光的測定によって転化量を算出することが
できる。この実験を正確におこなうならば、吸光度（即
ち、吸収された光の量）は酵素量に比例し、次に、この
酵素量はウサギ抗体量に比例し、次に、ウサギ抗体量は
血清中に本来（originally）存在する抗原に対するマウ
ス抗体の量に比例する。したがって、吸光度の測定は血
清中に存在する抗原に対するマウス抗体の量の推定値を
与える。このことは、抗原に対するマウス抗体が上記反
応の連鎖を限定するファクターであるならば、事実であ
る。したがって、適当な条件を得るためには、各血清に
対して、免疫処置に用いた抗原に対するマウス抗体量が
正確に測定されるために充分な大きさであるが、系を飽
和するほどの大きさにはならないある一定の希釈度が存
在するように、試験すべき各血清の一連の希釈（1:33か
ら1:8100まで）を実施することが望ましい。
野生型IL−６（wtIL−６）免疫処置実験の結果を各典
型的正常マウスと典型的なNSE/hIL−６トランスジェニ
ックマウスとに関して図1aと1bに示す。図1aから知るこ
とができるように、正常マウスは、血清を1:8100に希釈
するときにさえもシグナルを検出することが可能である
ほどに、多量の抗wtIL−６抗体を発生させた。これに反
して、図1bから知ることができるように、トランスジェ
ニックマウスは非常に低い量の抗体を発生させ：実際
に、第２サンプルからの血清を1:300の比で希釈し、第
３サンプルからの血清を1:2700の比で希釈すると、シグ
ナルは停止する。全ての動物に関して比較可能である目
的の測定を実施するために、同じ動物からの免疫前血清
の最高読取り値よりも0.5 O.D.450高い読取り値を与え
る血清希釈度が慣用的に“抗体価（titer）”と呼ばれ
ている。図1aと1bは、正常マウスとNSE/IL−６トランス
ジェニックマウスとに関して、それぞれ、第２サンプル
と第３サンプルの抗体価がどのように算出されるかを示
す。
型的正常マウスと典型的なNSE/hIL−６トランスジェニ
ックマウスとに関して図1aと1bに示す。図1aから知るこ
とができるように、正常マウスは、血清を1:8100に希釈
するときにさえもシグナルを検出することが可能である
ほどに、多量の抗wtIL−６抗体を発生させた。これに反
して、図1bから知ることができるように、トランスジェ
ニックマウスは非常に低い量の抗体を発生させ：実際
に、第２サンプルからの血清を1:300の比で希釈し、第
３サンプルからの血清を1:2700の比で希釈すると、シグ
ナルは停止する。全ての動物に関して比較可能である目
的の測定を実施するために、同じ動物からの免疫前血清
の最高読取り値よりも0.5 O.D.450高い読取り値を与え
る血清希釈度が慣用的に“抗体価（titer）”と呼ばれ
ている。図1aと1bは、正常マウスとNSE/IL−６トランス
ジェニックマウスとに関して、それぞれ、第２サンプル
と第３サンプルの抗体価がどのように算出されるかを示
す。
図2aと2bは、それぞれ、典型的な正常マウスと典型的
なNSE/hIL−６トランスジェニックマウスとの、IL−６
の突然変異体Sant1を用いた免疫処置に関する実験結果
を示す。この場合、両方のマウスは多量の抗Sant1抗体
を発生させた。実際に、血清を1:8100に希釈した場合に
も比較的強いシグナルを検出することが可能である。図
2aと2bは、正常マウスとトランスジェニックマウスとに
関して第２サンプルと第３サンプルの抗体価がどのよう
に算出されるかを示す。
なNSE/hIL−６トランスジェニックマウスとの、IL−６
の突然変異体Sant1を用いた免疫処置に関する実験結果
を示す。この場合、両方のマウスは多量の抗Sant1抗体
を発生させた。実際に、血清を1:8100に希釈した場合に
も比較的強いシグナルを検出することが可能である。図
2aと2bは、正常マウスとトランスジェニックマウスとに
関して第２サンプルと第３サンプルの抗体価がどのよう
に算出されるかを示す。
表１は、この実験中に接種した全てのマウスに関する
第２サンプルと第３サンプルの抗体価データ（上述した
ように算出）の要約を示す。
第２サンプルと第３サンプルの抗体価データ（上述した
ように算出）の要約を示す。
wtIL−６抗原を接種したマウスに関して、動物毎の変
異は別として、平均して、非トランスジェニックマウス
がNSE/hIL−６トランスジェニックマウスにおいて得ら
れた抗体応答よりも10〜20倍強い抗体応答をwtIL−６に
対して発生させたことを知ることができ、このことはト
ランスジェニックマウスがヒトhIL−６の免疫寛容を発
生させた事実を立証する。
異は別として、平均して、非トランスジェニックマウス
がNSE/hIL−６トランスジェニックマウスにおいて得ら
れた抗体応答よりも10〜20倍強い抗体応答をwtIL−６に
対して発生させたことを知ることができ、このことはト
ランスジェニックマウスがヒトhIL−６の免疫寛容を発
生させた事実を立証する。
これに反して、抗原Sant1を接種したマウスに関して
は、さらに、動物毎の変異は別として、平均して、非ト
ランスジェニックマウスがNSE/hIL−６トランスジェニ
ックマウスにおいて得られた抗体応答に等しい抗体応答
を発生させたことを知ることができ、このことは、hIL
−６中に導入されたときに、Sant1を形成した７種の突
然変異が突然変異体Sant1を、さもなくばhIL−６に対し
て寛容を示す免疫系に対する完全な異種タンパク質（fo
reign protein）にすることを示唆する。
は、さらに、動物毎の変異は別として、平均して、非ト
ランスジェニックマウスがNSE/hIL−６トランスジェニ
ックマウスにおいて得られた抗体応答に等しい抗体応答
を発生させたことを知ることができ、このことは、hIL
−６中に導入されたときに、Sant1を形成した７種の突
然変異が突然変異体Sant1を、さもなくばhIL−６に対し
て寛容を示す免疫系に対する完全な異種タンパク質（fo
reign protein）にすることを示唆する。
実施例２ Sant1によって免疫処置されたNSE/hIL−６の血清中に発
生した抗体はSant1のみでなく、野生型hIL−６をも認識
することができる これは、Sant1に対してマウスによって発生した抗体
がSant1自体のみでなく、野生型hIL−６（wtIL−６）を
も認識することができるか否かを試験することであっ
た。この仮説をELISA試験を用いてさらに試験した。San
t1によって免疫処置されたNSE/hIL−６トランスジェニ
ックマウス中に発生した抗体が、ELISAプレート孔の底
部に固定化された同じ突然変異体Sant1を認識し、結合
することができるという事実を立証した後に、第２実験
では野生型IL−６をELISAプレート孔の底部に非共有結
合式に結合させた。孔のプラスチックがBSAによって飽
和される段階後に、Sant1によって免疫処置されたマウ
スからの血清の希釈物をこれらの孔に加えて、wtIL−６
を認識することができる抗体が存在するか否かを立証し
た。例えば、図３はNSE/hIL−６トランスジェニックマ
ウスに関する実験の結果を示す。この図から見ることが
できるように、Sant1及び野生型IL−６に関して得られ
た抗体応答は極めて類似する。換言すると、第３サンプ
ルの血清中に、この血清を1:8100の比に希釈する場合に
も、孔の底部に固定化したwtIL−６に結合した抗体の存
在を検出することができる。NSE/hIL−６トランスジェ
ニックマウスを野生型IL−６を用いて直接免疫処置する
場合に、野生型IL−６自体に対する抗体応答が非常に低
く：実際に、1:8100に希釈した血清中に抗wtIL−６抗体
を検出することが不可能であることに注目すべきである
（図１参照）。他のNSE/hIL−６トランスジェニックマ
ウスはこの実施例に例示したマウスの応答と同様な応答
を示した。
生した抗体はSant1のみでなく、野生型hIL−６をも認識
することができる これは、Sant1に対してマウスによって発生した抗体
がSant1自体のみでなく、野生型hIL−６（wtIL−６）を
も認識することができるか否かを試験することであっ
た。この仮説をELISA試験を用いてさらに試験した。San
t1によって免疫処置されたNSE/hIL−６トランスジェニ
ックマウス中に発生した抗体が、ELISAプレート孔の底
部に固定化された同じ突然変異体Sant1を認識し、結合
することができるという事実を立証した後に、第２実験
では野生型IL−６をELISAプレート孔の底部に非共有結
合式に結合させた。孔のプラスチックがBSAによって飽
和される段階後に、Sant1によって免疫処置されたマウ
スからの血清の希釈物をこれらの孔に加えて、wtIL−６
を認識することができる抗体が存在するか否かを立証し
た。例えば、図３はNSE/hIL−６トランスジェニックマ
ウスに関する実験の結果を示す。この図から見ることが
できるように、Sant1及び野生型IL−６に関して得られ
た抗体応答は極めて類似する。換言すると、第３サンプ
ルの血清中に、この血清を1:8100の比に希釈する場合に
も、孔の底部に固定化したwtIL−６に結合した抗体の存
在を検出することができる。NSE/hIL−６トランスジェ
ニックマウスを野生型IL−６を用いて直接免疫処置する
場合に、野生型IL−６自体に対する抗体応答が非常に低
く：実際に、1:8100に希釈した血清中に抗wtIL−６抗体
を検出することが不可能であることに注目すべきである
（図１参照）。他のNSE/hIL−６トランスジェニックマ
ウスはこの実施例に例示したマウスの応答と同様な応答
を示した。
実施例３ Sant1によって免疫処置されたNSE/hIL−６中に発生した
抗体は野生型hIL−６の生物学的活性を中和することも
できる。
抗体は野生型hIL−６の生物学的活性を中和することも
できる。
この目的は、Sant1によって免疫処置されたNSE/hIL−
６トランスジェニックマウスに発生した、但し、野生型
IL−６を認識することができる、これらの抗体が野生型
IL−６自体の生物学的活性を中和することもできるか否
かを試験することであった。
６トランスジェニックマウスに発生した、但し、野生型
IL−６を認識することができる、これらの抗体が野生型
IL−６自体の生物学的活性を中和することもできるか否
かを試験することであった。
考慮中の野生型IL−６の生物学的活性は、ヒトHep3B
ヘパトーム細胞中のＣ−反応性タンパク質遺伝子プロモ
ーターによる転写を刺激する能力であった。転写の刺激
の効果は先行技術によって測定した（Gregory,B.,Savin
o,R.及びCiliberto,G.,J.Immunological Methods,170,4
7〜56,1994）。２匹のNSE/hIL−６トランスジェニック
マウス＃４と＃５（両方ともSant1によって免疫処置）
からの第３サンプル中で得られた血清の連続希釈物の存
在下で、ヒトHep3Bヘパトーム細胞を4ng/mlの野生型IL
−６によって刺激した。この実験の結果は図４に示す。
1:100に希釈した両方の血清がヒトヘパトーム細胞に対
する4ng/mlの野生型hIL−６の生物学的活性をほぼ完全
に阻害することを見ることができる。
ヘパトーム細胞中のＣ−反応性タンパク質遺伝子プロモ
ーターによる転写を刺激する能力であった。転写の刺激
の効果は先行技術によって測定した（Gregory,B.,Savin
o,R.及びCiliberto,G.,J.Immunological Methods,170,4
7〜56,1994）。２匹のNSE/hIL−６トランスジェニック
マウス＃４と＃５（両方ともSant1によって免疫処置）
からの第３サンプル中で得られた血清の連続希釈物の存
在下で、ヒトHep3Bヘパトーム細胞を4ng/mlの野生型IL
−６によって刺激した。この実験の結果は図４に示す。
1:100に希釈した両方の血清がヒトヘパトーム細胞に対
する4ng/mlの野生型hIL−６の生物学的活性をほぼ完全
に阻害することを見ることができる。
この時点において、野生型hIL−６に対するこの交差
反応性抗体応答の発生が、Sant1によって免疫処置され
たNSE/hIL−６トランスジェニックマウスの血清中で測
定された野生型hIL−６のレベルを変化させることがで
きるか否かに関して、研究をおこなった。hIL−６レベ
ルは先行技術に従い、“サンドイッチ"ELISA試験によっ
て、“Ｒ＆Ｄ System"社によって製造される商業的に
入手可能なキットを用いて、製造者の指示に綿密に従っ
て測定した。免疫前サンプルと第３サンプルの両方に見
い出されるhIL−６レベルをSant1によって免疫処置され
た４匹のトランスジェニックマウスに関して測定した。
結果は表２に要約する。この表から知ることができるよ
うに、Sant1を用いて、Sant1自体とwtIL−６の両方を認
識する強い抗体応答を発生させる免疫処置は、Ｒ＆Ｄ
Systemによって製造されたELISA“サンドイッチ”キッ
トを用いてNSE/hIL−６マウスの血清中で検出すること
ができるhIL−６レベルを500分のより大きく平均的に低
下させる。
反応性抗体応答の発生が、Sant1によって免疫処置され
たNSE/hIL−６トランスジェニックマウスの血清中で測
定された野生型hIL−６のレベルを変化させることがで
きるか否かに関して、研究をおこなった。hIL−６レベ
ルは先行技術に従い、“サンドイッチ"ELISA試験によっ
て、“Ｒ＆Ｄ System"社によって製造される商業的に
入手可能なキットを用いて、製造者の指示に綿密に従っ
て測定した。免疫前サンプルと第３サンプルの両方に見
い出されるhIL−６レベルをSant1によって免疫処置され
た４匹のトランスジェニックマウスに関して測定した。
結果は表２に要約する。この表から知ることができるよ
うに、Sant1を用いて、Sant1自体とwtIL−６の両方を認
識する強い抗体応答を発生させる免疫処置は、Ｒ＆Ｄ
Systemによって製造されたELISA“サンドイッチ”キッ
トを用いてNSE/hIL−６マウスの血清中で検出すること
ができるhIL−６レベルを500分のより大きく平均的に低
下させる。
実施例４ Sant1を予防接種したNSE/hIL−６マウスに発生した抗体
はin vivoにおいても野生型hIL−６の生物学的活性を
中和することができる IL−６が肝臓による一連のタンパク質（“急性期タン
パク質”と呼ばれる）の産生を誘導することは周知であ
る。血清アミロイドＡ（以下ではSAAと略記）は急性イ
ベント中に大きい、迅速な増加を示す。
はin vivoにおいても野生型hIL−６の生物学的活性を
中和することができる IL−６が肝臓による一連のタンパク質（“急性期タン
パク質”と呼ばれる）の産生を誘導することは周知であ
る。血清アミロイドＡ（以下ではSAAと略記）は急性イ
ベント中に大きい、迅速な増加を示す。
この目的は、Sant1を予防接種したNSE/hIL−６トラン
スジェニックマウスに発生した、wtIL−６と交差反応す
ることができる、これらの抗体が、hIL−６の注入後の
マウスSAA（mSAA）の増加の阻害として測定された、in
vivoでの野生型hIL−６の生物学的活性を中和すること
もできるか否かを試験することであった。この目的のた
めに、非免疫処置（対照）NSE/hIL−６マウスから、免
疫処置されたwt hIL−６から、及びSant1免疫処置され
たNSE/hIL−６マウスから血液サンプル（以下では注入
前サンプルと呼ぶ）を採取した。動物が採血から回復し
た後に、これらの動物に10μｇのwt hIL−６を腹腔内
注入した。この注入の９時間後に、両群の動物から第２
血液サンプル（以下では、注入後サンプルと呼ぶ）を採
取した。注入前サンプルと注入後サンプルの両方におい
てmSAAレベルを、先行技術に従い、“サンドイッチ"ELI
SA試験によって、“Biosource International"社によっ
て製造される商業的に入手可能なキットを用いて、製造
者の指示に綿密に従って測定した。結果は表３に要約す
る。表から知ることができるように、動物毎の変異は別
として、平均して、非免疫処置マウスでは10μｇのhIL
−６の注入が血清SAAレベルの有意な増加を決定し、こ
の増加は同量のhIL−６を注入されたSant1接種マウスに
は存在しなかった。それ故、Sant1による予防接種は、S
ant1自体とwt hIL−６の両方を認識する強い抗体応答
を発生させるばかりでなく、ヒトヘパトーム細胞でのin
vitroでのwtIL−６生物学的活性を中和することがで
き、hIL−６の注入によって誘導されたmSAAレベルの増
加をin vivoで防止する、換言すると、in vivoにおいて
もhIL−６の生物学的活性を中和する。注目すべきこと
に、野生型hIL−６による免疫処置は少量の抗hIL−６抗
体の産生を誘導するが（実施例１参照）、これはhIL−
６の注入によって誘導されるmSAAレベルの増加をin viv
oで防止することができない、というのは、野生型hIL−
６によって免疫処置されたマウスは免疫処置されなかっ
た対照マウスに観察された血清SAAレベルに匹敵する血
清SAAレベルの増加を示すからである。
スジェニックマウスに発生した、wtIL−６と交差反応す
ることができる、これらの抗体が、hIL−６の注入後の
マウスSAA（mSAA）の増加の阻害として測定された、in
vivoでの野生型hIL−６の生物学的活性を中和すること
もできるか否かを試験することであった。この目的のた
めに、非免疫処置（対照）NSE/hIL−６マウスから、免
疫処置されたwt hIL−６から、及びSant1免疫処置され
たNSE/hIL−６マウスから血液サンプル（以下では注入
前サンプルと呼ぶ）を採取した。動物が採血から回復し
た後に、これらの動物に10μｇのwt hIL−６を腹腔内
注入した。この注入の９時間後に、両群の動物から第２
血液サンプル（以下では、注入後サンプルと呼ぶ）を採
取した。注入前サンプルと注入後サンプルの両方におい
てmSAAレベルを、先行技術に従い、“サンドイッチ"ELI
SA試験によって、“Biosource International"社によっ
て製造される商業的に入手可能なキットを用いて、製造
者の指示に綿密に従って測定した。結果は表３に要約す
る。表から知ることができるように、動物毎の変異は別
として、平均して、非免疫処置マウスでは10μｇのhIL
−６の注入が血清SAAレベルの有意な増加を決定し、こ
の増加は同量のhIL−６を注入されたSant1接種マウスに
は存在しなかった。それ故、Sant1による予防接種は、S
ant1自体とwt hIL−６の両方を認識する強い抗体応答
を発生させるばかりでなく、ヒトヘパトーム細胞でのin
vitroでのwtIL−６生物学的活性を中和することがで
き、hIL−６の注入によって誘導されたmSAAレベルの増
加をin vivoで防止する、換言すると、in vivoにおいて
もhIL−６の生物学的活性を中和する。注目すべきこと
に、野生型hIL−６による免疫処置は少量の抗hIL−６抗
体の産生を誘導するが（実施例１参照）、これはhIL−
６の注入によって誘導されるmSAAレベルの増加をin viv
oで防止することができない、というのは、野生型hIL−
６によって免疫処置されたマウスは免疫処置されなかっ
た対照マウスに観察された血清SAAレベルに匹敵する血
清SAAレベルの増加を示すからである。
実施例５ 異なるアジュバント、水酸化アルミニウム中で製剤化し
た、hIL−６とSant1とによるNSE/hIL−６トランスジェ
ニックマウスの免疫処置 異なる抗原が、異なるアジュバント中で製剤化された
ときに、異なって挙動することは周知である（Gupta,R.
K.とSibre,G.R.,Vaccine,13,1263〜1276,1995）。実施
例１に述べた免疫処置実験に用いた完全（又は不完全）
フロイント・アジュバントは、副作用、主として、例え
ば肉芽腫及び嚢胞形成のような、注入部位における局所
反応のために、ヒトに用いることができない（Gupta,R.
K.とSiber,G.R.,Vaccine,13,1263〜1276,1995）。この
目的は、Sant1に対する及びwt hIL−６にも対する高い
抗体価での同じような免疫反応を、ヒトの予防接種に一
般に用いられるアジュバントを用いて、NSE/hIL−６ト
ランスジェニックマウスに起こすことができるかどうか
を知ることであった。この目的のために、水酸化アルミ
ニウムを選択した、というのは、水酸化アルミニウムが
安全性の優れたトラックレコードを有し、現在ヒト使用
のために一般的なアジュバンドであるからである（Gupt
a,R.K.とSiber,G.R.,Vaccine,13,1263〜1276,1995）。
た、hIL−６とSant1とによるNSE/hIL−６トランスジェ
ニックマウスの免疫処置 異なる抗原が、異なるアジュバント中で製剤化された
ときに、異なって挙動することは周知である（Gupta,R.
K.とSibre,G.R.,Vaccine,13,1263〜1276,1995）。実施
例１に述べた免疫処置実験に用いた完全（又は不完全）
フロイント・アジュバントは、副作用、主として、例え
ば肉芽腫及び嚢胞形成のような、注入部位における局所
反応のために、ヒトに用いることができない（Gupta,R.
K.とSiber,G.R.,Vaccine,13,1263〜1276,1995）。この
目的は、Sant1に対する及びwt hIL−６にも対する高い
抗体価での同じような免疫反応を、ヒトの予防接種に一
般に用いられるアジュバントを用いて、NSE/hIL−６ト
ランスジェニックマウスに起こすことができるかどうか
を知ることであった。この目的のために、水酸化アルミ
ニウムを選択した、というのは、水酸化アルミニウムが
安全性の優れたトラックレコードを有し、現在ヒト使用
のために一般的なアジュバンドであるからである（Gupt
a,R.K.とSiber,G.R.,Vaccine,13,1263〜1276,1995）。
８〜10匹のNSE/hIL−６トランスジェニックマウス
（これに加えて、対照として用いた、同じ腹子として生
まれた10匹の非トランスジェニックきょうだい）の群
を、実施例１に述べたプロトコールと同じ免疫処置プロ
トコールを用いて、各注入に対して1mg/mlにおいて水酸
化アルミニウム中で製剤化した100μｇの抗原（Sant1又
は野生型hIL−６のいずれか）を総量100μｌ（100μｇ
の水酸化アルミニウム）で腹腔内免疫処置した。次に、
第２血液サンプル（第２回注入又は第１回追加免疫後に
採取）と第３血液サンプル（第３回注入又は第２回追加
免疫後に採取）とを、実施例１に述べた“ELISA"によっ
て、免疫処置のために用いた抗原に対する抗体の存在に
関して試験した。
（これに加えて、対照として用いた、同じ腹子として生
まれた10匹の非トランスジェニックきょうだい）の群
を、実施例１に述べたプロトコールと同じ免疫処置プロ
トコールを用いて、各注入に対して1mg/mlにおいて水酸
化アルミニウム中で製剤化した100μｇの抗原（Sant1又
は野生型hIL−６のいずれか）を総量100μｌ（100μｇ
の水酸化アルミニウム）で腹腔内免疫処置した。次に、
第２血液サンプル（第２回注入又は第１回追加免疫後に
採取）と第３血液サンプル（第３回注入又は第２回追加
免疫後に採取）とを、実施例１に述べた“ELISA"によっ
て、免疫処置のために用いた抗原に対する抗体の存在に
関して試験した。
全ての動物に関して比較可能である、目的の測定を実
施するために、同じ動物からの免疫前血清の最高読取り
値よりも0.5 O.D.450高い読取り値を与える血清の希釈
度が慣用的に“抗体価”と呼ばれている。抗体価は野生
型hIL−６及びSant1によって免疫処置された正常マウス
とトランスジェニックマウスの両方に関して、図1a、1
b、2a及び2bに示したように測定した。結果は表４に報
告する。
施するために、同じ動物からの免疫前血清の最高読取り
値よりも0.5 O.D.450高い読取り値を与える血清の希釈
度が慣用的に“抗体価”と呼ばれている。抗体価は野生
型hIL−６及びSant1によって免疫処置された正常マウス
とトランスジェニックマウスの両方に関して、図1a、1
b、2a及び2bに示したように測定した。結果は表４に報
告する。
一般に、この免疫処置実験で得られた、抗原に対する
抗体量（抗体価）は、実施例１に述べた免疫処置実験に
おいて得られた抗体量に比べて高い；実際に、アルミニ
ウムアジュバンドが血清抗体の誘導のために選択された
アジュバンドであるという事実は先行技術の一部である
（Gupta,R.K.とSiber,G.R.,Vaccine,13,1263〜1276,199
5）。さらに詳しくは、wt hIL−６抗原によって免疫処
置されたマウスに関して、（動物毎の変異を別とし
て）、平均して、非トランスジェニックマウスが、NSE/
hIL−６トランスジェニックマウスにおいて得られた抗
体応答よりも12〜18倍強い、wt hIL−６に対する抗体
応答を発生したことを再び見ることができる、このこと
は、トランスジェニックマウスが、この抗原をアジュバ
ントとしての水酸化アルミニウム中で製剤化された状態
で注入されたときにも、ヒトIL−６に対して免疫寛容を
発生させたという事実の証拠である。これに反して、水
酸化アルミニウム中で製剤化されたSant1で免疫処置さ
れたマウスに関しては、この場合にも、平均して、非ト
ランスジェニックマウスが、実施例１に述べた免疫処置
実験におけると同様に、NSE/hIL−６トランスジェニッ
クマウスにおいて得られた抗体応答に等しい抗体応答を
発生したことを知ることができ、このことは７種の突然
変異（hIL−６中に導入されたときにSant1を形成した）
がこの突然変異体を水酸化アルミニウム中で製剤化され
たときにも完全な異種タンパク質にしたことを示唆す
る。
抗体量（抗体価）は、実施例１に述べた免疫処置実験に
おいて得られた抗体量に比べて高い；実際に、アルミニ
ウムアジュバンドが血清抗体の誘導のために選択された
アジュバンドであるという事実は先行技術の一部である
（Gupta,R.K.とSiber,G.R.,Vaccine,13,1263〜1276,199
5）。さらに詳しくは、wt hIL−６抗原によって免疫処
置されたマウスに関して、（動物毎の変異を別とし
て）、平均して、非トランスジェニックマウスが、NSE/
hIL−６トランスジェニックマウスにおいて得られた抗
体応答よりも12〜18倍強い、wt hIL−６に対する抗体
応答を発生したことを再び見ることができる、このこと
は、トランスジェニックマウスが、この抗原をアジュバ
ントとしての水酸化アルミニウム中で製剤化された状態
で注入されたときにも、ヒトIL−６に対して免疫寛容を
発生させたという事実の証拠である。これに反して、水
酸化アルミニウム中で製剤化されたSant1で免疫処置さ
れたマウスに関しては、この場合にも、平均して、非ト
ランスジェニックマウスが、実施例１に述べた免疫処置
実験におけると同様に、NSE/hIL−６トランスジェニッ
クマウスにおいて得られた抗体応答に等しい抗体応答を
発生したことを知ることができ、このことは７種の突然
変異（hIL−６中に導入されたときにSant1を形成した）
がこの突然変異体を水酸化アルミニウム中で製剤化され
たときにも完全な異種タンパク質にしたことを示唆す
る。
実施例６ 水酸化アルミニウム中で製剤化されたSant1を予防接種
されたNSE/hIL−６マウスの血清中に発生した抗体はSan
t1のみでなく野生型hIL−６をも認識することができる これは、水酸化アルミニウム中で製剤化されたSant1
を予防接種されたNSEマウス中でSant1に対して発生した
抗体が野生型hIL−６（wt hIL−６）と交差反応するこ
とができるかどうかを試験することであった。このこと
をさらに、実施例２に述べた同じ方法を用いて、“ELIS
A"によって試験した。抗体価は既述し、図1a、1b、2a及
び2bに示したように算出し、得られたデータを表５に報
告する。
されたNSE/hIL−６マウスの血清中に発生した抗体はSan
t1のみでなく野生型hIL−６をも認識することができる これは、水酸化アルミニウム中で製剤化されたSant1
を予防接種されたNSEマウス中でSant1に対して発生した
抗体が野生型hIL−６（wt hIL−６）と交差反応するこ
とができるかどうかを試験することであった。このこと
をさらに、実施例２に述べた同じ方法を用いて、“ELIS
A"によって試験した。抗体価は既述し、図1a、1b、2a及
び2bに示したように算出し、得られたデータを表５に報
告する。
水酸化アルミニウムを免疫処置のためのアジュバンド
として用いる場合にも、再び、Sant1と野生型hIL−６と
に対する抗体価は同じである。この場合にも、NSE/hIL
−６トランスジェニックマウスを野生型hIL−６によっ
て免疫処置したときに、野生型hIL−６自体に対する抗
体応答が非常に低いことに注目すべきである：例えば、
第３血液サンプルでは、Sant1を予防接種されたNSE/hIL
−６マウス群における22800のwt hIL−６に対する平均
抗体価（13倍高い）に比べて、wt hIL−６によって免
疫処置されたNSE/hIL−６マウス群ではwt hIL−６に対
する平均抗体価は737である（実施例５参照）。
として用いる場合にも、再び、Sant1と野生型hIL−６と
に対する抗体価は同じである。この場合にも、NSE/hIL
−６トランスジェニックマウスを野生型hIL−６によっ
て免疫処置したときに、野生型hIL−６自体に対する抗
体応答が非常に低いことに注目すべきである：例えば、
第３血液サンプルでは、Sant1を予防接種されたNSE/hIL
−６マウス群における22800のwt hIL−６に対する平均
抗体価（13倍高い）に比べて、wt hIL−６によって免
疫処置されたNSE/hIL−６マウス群ではwt hIL−６に対
する平均抗体価は737である（実施例５参照）。
実施例７ 水酸化アルミニウム中で製剤化されたSant1を予防接種
されたNSE/hIL−６マウス中に発生した抗体は野生型hIL
−６の生物学的活性を中和することもできる この目的は、水酸化アルミニウム中で製剤化されたSa
nt1を予防接種されたNSE/hIL−６トランスジェニックマ
ウス中に発生した、野生型hIL−６を認識することがで
きる、これらの抗体が、野生型hIL−６自体の生物学的
活性を中和することもできるか否かを試験することであ
った。
されたNSE/hIL−６マウス中に発生した抗体は野生型hIL
−６の生物学的活性を中和することもできる この目的は、水酸化アルミニウム中で製剤化されたSa
nt1を予防接種されたNSE/hIL−６トランスジェニックマ
ウス中に発生した、野生型hIL−６を認識することがで
きる、これらの抗体が、野生型hIL−６自体の生物学的
活性を中和することもできるか否かを試験することであ
った。
考慮中の野生型IL−６の生物学的活性はヒトHep3Bヘ
パトーム細胞におけるＣ−反応性遺伝子プロモーターに
よる転写を刺激する能力であった。転写刺激効果は先行
技術によって測定した（Gregory,B.,Savino,R.及びCili
beto,G.,J.Immunological Methods,170,47〜56,199
4）。ヒトHep3Bヘパトーム細胞を4ng/mlの野生型hIL−
６によって刺激し、この刺激度を100％と見なした、又
はSant1と野生型hIL−６の両方によって免疫処置された
NSE/hIL−６マウスからの第３血液サンプルから得られ
た血清の連続希釈物の存在下での4ng/mlの野生型hIL−
６によって刺激した；後者の場合に、転写刺激度を4ng/
mlの野生型hIL−６のみと共にインキュベートした細胞
中で得られた刺激の％として表現した。この実験の結果
は図5aと5bに示す。1:400に希釈した、全てのマウスの
血清がヒトヘパトーム細胞に対する4ng/mlの野生型hIL
−６の生物学的活性を殆ど完全に阻害することを見るこ
とができる。それ故、ヒトヘパトーム細胞に対する、外
因的に加えられたhIL−６の生物活性（bioactivity）を
中和する能力は、CFAによって免疫処置された動物の場
合におけるよりも水酸化アルミニウムによって免疫処置
された動物の血清に関していっそう高かった（実施例３
を参照し、図5aと図４を比較すること）。NSE/hIL−６
トランスジェニックマウスを野生型hIL−６によって免
疫処置された場合には、得られた非常に少量の抗hIL−
６抗体はヒトヘパトーム細胞に対する野生型hIL−６生
物学的活性を阻害するために充分ではない（図5b参
照）。
パトーム細胞におけるＣ−反応性遺伝子プロモーターに
よる転写を刺激する能力であった。転写刺激効果は先行
技術によって測定した（Gregory,B.,Savino,R.及びCili
beto,G.,J.Immunological Methods,170,47〜56,199
4）。ヒトHep3Bヘパトーム細胞を4ng/mlの野生型hIL−
６によって刺激し、この刺激度を100％と見なした、又
はSant1と野生型hIL−６の両方によって免疫処置された
NSE/hIL−６マウスからの第３血液サンプルから得られ
た血清の連続希釈物の存在下での4ng/mlの野生型hIL−
６によって刺激した；後者の場合に、転写刺激度を4ng/
mlの野生型hIL−６のみと共にインキュベートした細胞
中で得られた刺激の％として表現した。この実験の結果
は図5aと5bに示す。1:400に希釈した、全てのマウスの
血清がヒトヘパトーム細胞に対する4ng/mlの野生型hIL
−６の生物学的活性を殆ど完全に阻害することを見るこ
とができる。それ故、ヒトヘパトーム細胞に対する、外
因的に加えられたhIL−６の生物活性（bioactivity）を
中和する能力は、CFAによって免疫処置された動物の場
合におけるよりも水酸化アルミニウムによって免疫処置
された動物の血清に関していっそう高かった（実施例３
を参照し、図5aと図４を比較すること）。NSE/hIL−６
トランスジェニックマウスを野生型hIL−６によって免
疫処置された場合には、得られた非常に少量の抗hIL−
６抗体はヒトヘパトーム細胞に対する野生型hIL−６生
物学的活性を阻害するために充分ではない（図5b参
照）。
この場合にも、野生型hIL−６に対するこの交差反応
性免疫応答の発生が、Sant1と野生型hIL−６の両方によ
って免疫処置されたNSE/hIL−６トランスジェニックマ
ウスの血清中で測定された野生型hIL−６のレベルを変
化させることができるか否かに関して、研究をおこなっ
た。hIL−６・レベルを両群のマウスの免疫前サンプル
と第３サンプルの両方において実施例３に述べたように
測定した。結果は表６に要約する。表から知ることがで
きるように、水酸化アルミニウム中で製剤化されたSant
1を用いた、Sant1自体と野生型hIL−６の両方を認識す
る強い抗体応答を出現させる予防接種はまた、NSE/hIL
−６トランスジェニックマウスの血清中で検出されるこ
とができるhIL−６のレベルを約1,400分の１に平均的に
低下させる。同じアジュバント中で製剤化された野生型
hIL−６自体を用いた免疫処置は血清中で検出されるこ
とができるhIL−６レベルをごく軽度に低下させる（1,4
00分の１に比べて３分の１）。
性免疫応答の発生が、Sant1と野生型hIL−６の両方によ
って免疫処置されたNSE/hIL−６トランスジェニックマ
ウスの血清中で測定された野生型hIL−６のレベルを変
化させることができるか否かに関して、研究をおこなっ
た。hIL−６・レベルを両群のマウスの免疫前サンプル
と第３サンプルの両方において実施例３に述べたように
測定した。結果は表６に要約する。表から知ることがで
きるように、水酸化アルミニウム中で製剤化されたSant
1を用いた、Sant1自体と野生型hIL−６の両方を認識す
る強い抗体応答を出現させる予防接種はまた、NSE/hIL
−６トランスジェニックマウスの血清中で検出されるこ
とができるhIL−６のレベルを約1,400分の１に平均的に
低下させる。同じアジュバント中で製剤化された野生型
hIL−６自体を用いた免疫処置は血清中で検出されるこ
とができるhIL−６レベルをごく軽度に低下させる（1,4
00分の１に比べて３分の１）。
実施例８ 水酸化アルミニウム中で製剤化されたSant1を予防接種
されたNSE/hIL−６マウス中に発生した抗体は、in vivo
においてもwt hIL−６の生物学的活性を中和すること
もできる この目的は、水酸化アルミニウム中で製剤化されたSa
nt1を予防接種されたNSE/hIL−６トランスジェニックマ
ウス中に発生した、wtIL−６を認識することができる、
これらの抗体が、実施例４に述べたように、hIL−６の
注入によってマウス中に誘導されたマウスSAA（mSAA）
血清レベルの増加として測定される、in vivoでの野生
型hIL−６の生物学的活性を中和することもできるか否
かを試験することである。この実験は、免疫処置されな
い（対照）NSE/hIL−６マウスと、水酸化アルミニウム
中で製剤化されたSant1によって免疫処置されたNSE/hIL
−６マウスに対して、実施例４に述べたように、おこな
った。結果は表７に要約する。表から知ることができる
ように、動物毎の変異を別として、免疫処置されないマ
ウスにおいて、再び平均して、10μｇのhIL−６の注入
が血清SAAレベルの５倍〜６倍の増加を決定した。同量
のhIL−６を注入された、水酸化アルミニウム中で製剤
化されたSant1を予防接種されたマウスでは、この増加
が得られなかった。
されたNSE/hIL−６マウス中に発生した抗体は、in vivo
においてもwt hIL−６の生物学的活性を中和すること
もできる この目的は、水酸化アルミニウム中で製剤化されたSa
nt1を予防接種されたNSE/hIL−６トランスジェニックマ
ウス中に発生した、wtIL−６を認識することができる、
これらの抗体が、実施例４に述べたように、hIL−６の
注入によってマウス中に誘導されたマウスSAA（mSAA）
血清レベルの増加として測定される、in vivoでの野生
型hIL−６の生物学的活性を中和することもできるか否
かを試験することである。この実験は、免疫処置されな
い（対照）NSE/hIL−６マウスと、水酸化アルミニウム
中で製剤化されたSant1によって免疫処置されたNSE/hIL
−６マウスに対して、実施例４に述べたように、おこな
った。結果は表７に要約する。表から知ることができる
ように、動物毎の変異を別として、免疫処置されないマ
ウスにおいて、再び平均して、10μｇのhIL−６の注入
が血清SAAレベルの５倍〜６倍の増加を決定した。同量
のhIL−６を注入された、水酸化アルミニウム中で製剤
化されたSant1を予防接種されたマウスでは、この増加
が得られなかった。
それ故、Sant1による予防接種は、Sant1自体とwthIL
−６の両方を認識し、ヒトヘパトーム細胞においてin v
itroでwt hIL−６生物学的活性を中和することができ
る、強い抗体応答を出現させるばかりでなく、hIL−６
の注入によって誘導されるmSAAレベルの増加をin vivo
防止する、換言すると、in vivoにおいてもhIL−６の生
物学的活性を中和する。
−６の両方を認識し、ヒトヘパトーム細胞においてin v
itroでwt hIL−６生物学的活性を中和することができ
る、強い抗体応答を出現させるばかりでなく、hIL−６
の注入によって誘導されるmSAAレベルの増加をin vivo
防止する、換言すると、in vivoにおいてもhIL−６の生
物学的活性を中和する。
実施例９ 皮内投与ルートによる水酸化アルミニウム中で製剤化さ
れたhIL−６とSant1によるNSE/hIL−６トランスジェニ
ックマウスの予防接種 上記実施例５、６、７及び８は、さもなくばwt hIL
−６に対して寛容である動物に、ヒト使用に適合しうる
アジュバント（水酸化アルミニウム）中で製剤化された
hIL−６の突然変異体（Sant1）を用いることによって、
in vitroとin vivoの両方においてhIL−６生物活性を中
和することができる、wt hIL−６自体に対する強い抗
体応答を得ることが可能であることを示す。しかし、実
施例５に述べた免疫処置実験では、ヒトにおける免疫処
置に一般に用いられる投与ルートではない腹腔内ルート
によって、抗原を注入した。この目的は、Sant1に対し
て及びwt hIL−６に対しても高抗体価の抗体による同
じような免疫応答を、ヒトの予防接種に用いた投与ルー
トを用いて、NSE/hIL−６トランスジェニックマウスに
惹起することができるかどうかを知ることであった。
れたhIL−６とSant1によるNSE/hIL−６トランスジェニ
ックマウスの予防接種 上記実施例５、６、７及び８は、さもなくばwt hIL
−６に対して寛容である動物に、ヒト使用に適合しうる
アジュバント（水酸化アルミニウム）中で製剤化された
hIL−６の突然変異体（Sant1）を用いることによって、
in vitroとin vivoの両方においてhIL−６生物活性を中
和することができる、wt hIL−６自体に対する強い抗
体応答を得ることが可能であることを示す。しかし、実
施例５に述べた免疫処置実験では、ヒトにおける免疫処
置に一般に用いられる投与ルートではない腹腔内ルート
によって、抗原を注入した。この目的は、Sant1に対し
て及びwt hIL−６に対しても高抗体価の抗体による同
じような免疫応答を、ヒトの予防接種に用いた投与ルー
トを用いて、NSE/hIL−６トランスジェニックマウスに
惹起することができるかどうかを知ることであった。
８〜９匹のNSE/hIL−６トランスジェニックマウス
（これに加えて、対照として用いた、同じ腹子として生
まれた10匹の非トランスジェニックきょうだい）の群
を、先行技術に述べられたように、数種類のワクチンの
投与のために現在用いられるヒトにおける皮下（S.C.）
投与ルートに相当する、マウスにおける皮内（I.D.）投
与ルートによって、免疫処置した。この場合にも、実施
例１に述べたプロトコールと同じ免疫処置プロトコール
を用いて、1mg/mlにおいて水酸化アルミニウム中で製剤
化した100μｇの抗原（Sant1又は野生型hIL−６のいず
れか）を総量100μｌ（100μｇの水酸化アルミニウム）
で、各注入に対して用いた。次に、第２血液サンプル
（第２回注入又は第１回追加免疫後に採取）と第３血液
サンプル（第３回注入又は第２回追加免疫後に採取）と
を、実施例１に既に述べた方法と同じの“ELISA"方法に
よって、免疫処置のために用いた抗原に対する抗体の存
在に関して試験した。
（これに加えて、対照として用いた、同じ腹子として生
まれた10匹の非トランスジェニックきょうだい）の群
を、先行技術に述べられたように、数種類のワクチンの
投与のために現在用いられるヒトにおける皮下（S.C.）
投与ルートに相当する、マウスにおける皮内（I.D.）投
与ルートによって、免疫処置した。この場合にも、実施
例１に述べたプロトコールと同じ免疫処置プロトコール
を用いて、1mg/mlにおいて水酸化アルミニウム中で製剤
化した100μｇの抗原（Sant1又は野生型hIL−６のいず
れか）を総量100μｌ（100μｇの水酸化アルミニウム）
で、各注入に対して用いた。次に、第２血液サンプル
（第２回注入又は第１回追加免疫後に採取）と第３血液
サンプル（第３回注入又は第２回追加免疫後に採取）と
を、実施例１に既に述べた方法と同じの“ELISA"方法に
よって、免疫処置のために用いた抗原に対する抗体の存
在に関して試験した。
全ての動物に関して比較可能である、目的の測定を実
施するために、同じ動物からの免疫前血清の最高読取り
値よりも0.5 O.D.450高い読取り値を与える血清の希釈
度が慣用的に“抗体価”と呼ばれている。抗体価は野生
型hIL−６及びSant1によって免疫処置された正常マウス
とトランスジェニックマウスの両方に関して、図1a、1
b、2a及び2bに示したように測定した。結果は表８に報
告する。
施するために、同じ動物からの免疫前血清の最高読取り
値よりも0.5 O.D.450高い読取り値を与える血清の希釈
度が慣用的に“抗体価”と呼ばれている。抗体価は野生
型hIL−６及びSant1によって免疫処置された正常マウス
とトランスジェニックマウスの両方に関して、図1a、1
b、2a及び2bに示したように測定した。結果は表８に報
告する。
この場合にも、wt hIL−６抗原によって免疫処置さ
れたマウスに関して、（動物毎の変異を別として）、平
均して、非トランスジェニックマウスが、NSE/hIL−６
トランスジェニックマウスにおいて得られた抗体応答よ
りも40〜50倍強い、wt hIL−６に対する抗体応答を発
生したことを再び見ることができる、このことは、トラ
ンスジェニックマウスが、この抗原を水酸化アルミニウ
ム中で製剤化されて、皮内投与ルートを介して注入され
たときにも、ヒトIL−６に対して免疫寛容を発生させた
という事実の証拠である。これに反して、水酸化アルミ
ニウム中で製剤化されたSant1で免疫処置されたマウス
に関しては、この場合にも、平均して、非トランスジェ
ニックマウスが、実施例１と５に述べた免疫処置実験に
おけると同様に、NSE/hIL−６トランスジェニックマウ
スにおいて得られた抗体応答に等しい抗体応答を発生し
たことを知ることができ、このことは７種の置換（hIL
−６中に導入されたときにSant1を形成した）がこの突
然変異体を水酸化アルミニウム中で製剤化され、皮内投
与ルートを介して注入されたときにも完全な異種タンパ
ク質にしたことを示唆する。
れたマウスに関して、（動物毎の変異を別として）、平
均して、非トランスジェニックマウスが、NSE/hIL−６
トランスジェニックマウスにおいて得られた抗体応答よ
りも40〜50倍強い、wt hIL−６に対する抗体応答を発
生したことを再び見ることができる、このことは、トラ
ンスジェニックマウスが、この抗原を水酸化アルミニウ
ム中で製剤化されて、皮内投与ルートを介して注入され
たときにも、ヒトIL−６に対して免疫寛容を発生させた
という事実の証拠である。これに反して、水酸化アルミ
ニウム中で製剤化されたSant1で免疫処置されたマウス
に関しては、この場合にも、平均して、非トランスジェ
ニックマウスが、実施例１と５に述べた免疫処置実験に
おけると同様に、NSE/hIL−６トランスジェニックマウ
スにおいて得られた抗体応答に等しい抗体応答を発生し
たことを知ることができ、このことは７種の置換（hIL
−６中に導入されたときにSant1を形成した）がこの突
然変異体を水酸化アルミニウム中で製剤化され、皮内投
与ルートを介して注入されたときにも完全な異種タンパ
ク質にしたことを示唆する。
実施例10 水酸化アルミニウム中で製剤化されたSant1を予防接種
されたNSE/hIL−６マウスの血清中に発生した抗体はSan
t1のみでなく野生型hIL−６をも認識することができる これは、水酸化アルミニウム中で製剤化されたSant1
を予防接種されたNSEマウス中でSant1に対して発生した
抗体が野生型hIL−６（wt hIL−６）と交差反応するこ
とができるかどうかを試験することであった。このこと
をさらに、実施例２に述べた同じ方法を用いて、“ELIS
A"によって試験した。抗体価は既述し、図1a、1b、2a及
び2bに示したように算出し、得られたデータを表９に報
告する。
されたNSE/hIL−６マウスの血清中に発生した抗体はSan
t1のみでなく野生型hIL−６をも認識することができる これは、水酸化アルミニウム中で製剤化されたSant1
を予防接種されたNSEマウス中でSant1に対して発生した
抗体が野生型hIL−６（wt hIL−６）と交差反応するこ
とができるかどうかを試験することであった。このこと
をさらに、実施例２に述べた同じ方法を用いて、“ELIS
A"によって試験した。抗体価は既述し、図1a、1b、2a及
び2bに示したように算出し、得られたデータを表９に報
告する。
再び、今度は皮内投与ルートによって、水酸化アルミ
ニウムを免疫処置のためのアジュバンドとして用いる場
合にも、Sant1と野生型hIL−６とに対する抗体価は極め
て類似する。さらに、NSE/hIL−６トランスジェニック
マウスを野生型hIL−６によって免疫処置したときに、
野生型hIL−６自体に対する抗体応答が非常に低いこと
に注目すべきである：例えば、第３血液サンプルでは、
Sant1を予防接種されたNSE/hIL−６マウス群における94
00のwt hIL−６に対する平均抗体価（70倍高い）に比
べて、wt hIL−６によって免疫処置されたNSE/hIL−６
マウス群ではwt hIL−６に対する平均抗体価は139であ
る（実施例９参照）。
ニウムを免疫処置のためのアジュバンドとして用いる場
合にも、Sant1と野生型hIL−６とに対する抗体価は極め
て類似する。さらに、NSE/hIL−６トランスジェニック
マウスを野生型hIL−６によって免疫処置したときに、
野生型hIL−６自体に対する抗体応答が非常に低いこと
に注目すべきである：例えば、第３血液サンプルでは、
Sant1を予防接種されたNSE/hIL−６マウス群における94
00のwt hIL−６に対する平均抗体価（70倍高い）に比
べて、wt hIL−６によって免疫処置されたNSE/hIL−６
マウス群ではwt hIL−６に対する平均抗体価は139であ
る（実施例９参照）。
実施例11 水酸化アルミニウム中で製剤化され、皮内注入されたSa
nt1によって予防接種されたNSE/hIL−６マウス中に発生
した抗体は野生型hIL−６の生物学的活性を中和するこ
ともできる この目的は、水酸化アルミニウム中で製剤化され、皮
内注入されたSant1によって予防接種されたNSE/hIL−６
トランスジェニックマウス中に発生した、これらの抗体
が、野生型hIL−６自体の生物学的活性を中和すること
もできるか否かを試験することであった。
nt1によって予防接種されたNSE/hIL−６マウス中に発生
した抗体は野生型hIL−６の生物学的活性を中和するこ
ともできる この目的は、水酸化アルミニウム中で製剤化され、皮
内注入されたSant1によって予防接種されたNSE/hIL−６
トランスジェニックマウス中に発生した、これらの抗体
が、野生型hIL−６自体の生物学的活性を中和すること
もできるか否かを試験することであった。
再び、考慮中の野生型IL−６の生物学的活性はヒトHe
p3Bヘパトーム細胞におけるＣ−反応性遺伝子プロモー
ターによる転写を刺激する能力であった。転写刺激効果
は先行技術によって測定した（Gregory,B.,Savino,R.及
びCiliberto,G.,J.Immunological Methods,170,47〜56,
1994）。実施例７におけると同様に、ヒトHep3Bヘパト
ーム細胞を4ng/mlの野生型hIL−６によって刺激し、こ
の刺激度を100％と見なした、又はSant1と野生型hIL−
６の両方によって皮内的に免疫処置されたNSE/hIL−６
マウスからの第３血液サンプルから得られた血清の連続
希釈物の存在下での4ng/mlの野生型hIL−６によって刺
激した；後者の場合に、転写刺激度を4ng/mlの野生型hI
L−６のみと共にインキュベートした細胞中で得られた
刺激の％として表現した。この実験の結果は図6aと6bに
示す。1:400に希釈した、全てのマウスの血清がヒトヘ
パトーム細胞に対する4ng/mlの野生型hIL−６の生物学
的活性の80％以上を阻害することを見ることができる。
再び、NSE/hIL−６トランスジェニックマウスを野生型h
IL−６によって免疫処置する場合には、得られた非常に
少量の抗hIL−６抗体はヒトヘパトーム細胞に対する野
生型hIL−６の生物学的活性を阻害するために充分では
ないことに注目すべきである（図6b参照）。
p3Bヘパトーム細胞におけるＣ−反応性遺伝子プロモー
ターによる転写を刺激する能力であった。転写刺激効果
は先行技術によって測定した（Gregory,B.,Savino,R.及
びCiliberto,G.,J.Immunological Methods,170,47〜56,
1994）。実施例７におけると同様に、ヒトHep3Bヘパト
ーム細胞を4ng/mlの野生型hIL−６によって刺激し、こ
の刺激度を100％と見なした、又はSant1と野生型hIL−
６の両方によって皮内的に免疫処置されたNSE/hIL−６
マウスからの第３血液サンプルから得られた血清の連続
希釈物の存在下での4ng/mlの野生型hIL−６によって刺
激した；後者の場合に、転写刺激度を4ng/mlの野生型hI
L−６のみと共にインキュベートした細胞中で得られた
刺激の％として表現した。この実験の結果は図6aと6bに
示す。1:400に希釈した、全てのマウスの血清がヒトヘ
パトーム細胞に対する4ng/mlの野生型hIL−６の生物学
的活性の80％以上を阻害することを見ることができる。
再び、NSE/hIL−６トランスジェニックマウスを野生型h
IL−６によって免疫処置する場合には、得られた非常に
少量の抗hIL−６抗体はヒトヘパトーム細胞に対する野
生型hIL−６の生物学的活性を阻害するために充分では
ないことに注目すべきである（図6b参照）。
この場合にも、野生型hIL−６に対するこの交差反応
性免疫応答の発生が、Sant1と野生型hIL−６の両方によ
って免疫処置されたNSE/hIL−６トランスジェニックマ
ウスの血清中で測定された野生型hIL−６のレベルを変
化させることができるか否かに関して、研究をおこなっ
た。hIL−６・レベルを両群のマウスの免疫前サンプル
と第３サンプルの両方において実施例３に述べたように
測定した。結果は表10に要約する。表から知ることがで
きるように、水酸化アルミニウム中で製剤化され、皮内
注入されたSant1による予防接種は、Sant1自体と野生型
hIL−６の両方を認識する強い抗体応答を出現させるば
かりでなく、NSE/hIL−６トランスジェニックマウスの
血清中で検出されることができるhIL−６のレベルを約3
50分の１に平均的に低下させる。これに反して、同じア
ジュバント中で製剤化された野生型hIL−６自体を用い
た免疫処置は、血清中で検出されることができるhIL−
６レベルをごく軽度に低下させる（350分の１に比べて
2.4分の１）。
性免疫応答の発生が、Sant1と野生型hIL−６の両方によ
って免疫処置されたNSE/hIL−６トランスジェニックマ
ウスの血清中で測定された野生型hIL−６のレベルを変
化させることができるか否かに関して、研究をおこなっ
た。hIL−６・レベルを両群のマウスの免疫前サンプル
と第３サンプルの両方において実施例３に述べたように
測定した。結果は表10に要約する。表から知ることがで
きるように、水酸化アルミニウム中で製剤化され、皮内
注入されたSant1による予防接種は、Sant1自体と野生型
hIL−６の両方を認識する強い抗体応答を出現させるば
かりでなく、NSE/hIL−６トランスジェニックマウスの
血清中で検出されることができるhIL−６のレベルを約3
50分の１に平均的に低下させる。これに反して、同じア
ジュバント中で製剤化された野生型hIL−６自体を用い
た免疫処置は、血清中で検出されることができるhIL−
６レベルをごく軽度に低下させる（350分の１に比べて
2.4分の１）。
実施例12 水酸化アルミニウム中で製剤化され、皮内注入されたSa
nt1によって予防接種されたNSE/hIL−６マウス中に発生
した抗体はin vivoにおいてもwt hIL−６の生物学的活
性を中和することができる この目的は、水酸化アルミニウム中で製剤化され、皮
内注入されたSant1によって予防接種されたNSE/hIL−６
トランスジェニックマウス中に発生した、これらの抗体
が、実施例４に述べたように、hIL−６の注入によって
マウス中に通常誘導されるマウスSAA（mSAA）血清レベ
ルの増加である、in vivoでの野生型hIL−６の生物学的
活性の１種を中和することもできるか否かを試験するこ
とであった。この実験は、水酸化アルミニウム中で製剤
化され、皮内注入されたSant1によって予防接種されたN
SE/hIL−６マウスに対して、実施例４に述べたように、
おこなった。得られた値を実施例４（表３）と実施例８
（表７）に述べた実験の対照の免疫処置されないマウス
と比較した。結果は表11に要約する。表から知ることが
できるように、動物毎の変異を別として、再び平均し
て、免疫処置されないマウスにおいてhIL−６注入によ
って惹起されたSAAレベルの７倍の増加は、水酸化アル
ミニウム中で製剤化され、皮内注入されたSant1によっ
て予防接種されたマウスでは、存在しなかった。
nt1によって予防接種されたNSE/hIL−６マウス中に発生
した抗体はin vivoにおいてもwt hIL−６の生物学的活
性を中和することができる この目的は、水酸化アルミニウム中で製剤化され、皮
内注入されたSant1によって予防接種されたNSE/hIL−６
トランスジェニックマウス中に発生した、これらの抗体
が、実施例４に述べたように、hIL−６の注入によって
マウス中に通常誘導されるマウスSAA（mSAA）血清レベ
ルの増加である、in vivoでの野生型hIL−６の生物学的
活性の１種を中和することもできるか否かを試験するこ
とであった。この実験は、水酸化アルミニウム中で製剤
化され、皮内注入されたSant1によって予防接種されたN
SE/hIL−６マウスに対して、実施例４に述べたように、
おこなった。得られた値を実施例４（表３）と実施例８
（表７）に述べた実験の対照の免疫処置されないマウス
と比較した。結果は表11に要約する。表から知ることが
できるように、動物毎の変異を別として、再び平均し
て、免疫処置されないマウスにおいてhIL−６注入によ
って惹起されたSAAレベルの７倍の増加は、水酸化アル
ミニウム中で製剤化され、皮内注入されたSant1によっ
て予防接種されたマウスでは、存在しなかった。
それ故、ヒトにおける使用に適用可能な、アジュバン
トと投与ルートとによっておこなわれた、Sant1におけ
る予防接種は、Sant1自体とwt hIL−６の両方を認識
し、ヒトヘパトーム細胞に対するin vitroでのwt hIL
−６生物学的活性を中和することができる、強い抗体応
答を出現させるばかりでなく、hIL−６の注入によって
誘導されるmSAAレベルの増加をin vivo防止する、換言
すると、in vivoにおいてもhIL−６の生物学的活性を中
和する。
トと投与ルートとによっておこなわれた、Sant1におけ
る予防接種は、Sant1自体とwt hIL−６の両方を認識
し、ヒトヘパトーム細胞に対するin vitroでのwt hIL
−６生物学的活性を中和することができる、強い抗体応
答を出現させるばかりでなく、hIL−６の注入によって
誘導されるmSAAレベルの増加をin vivo防止する、換言
すると、in vivoにおいてもhIL−６の生物学的活性を中
和する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 サビノ，ロッコ イタリア国 アイ − 00040 ポメジ ア アールエム，ビア デラ テクニカ 76 (72)発明者 コルテセ，リカルド イタリア国 アイ − 00144 ローマ, ビア マッシミリアノ マッシモ，16 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 39/00 A61P 43/00 C12N 15/01 ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)
Claims (10)
- 【請求項１】サイトカインの受容体アンタゴニストでも
ある、野生型サイトカインのミューテインの、特定の野
生型サイトカインの過剰産生によって惹起される疾患の
治療又は予防のための薬剤組成物を製造するための免疫
原としての使用。 - 【請求項２】野生型サイトカインがヒトインターロイキ
ン−６である、請求項１記載の野生型サイトカインのミ
ューテインの使用。 - 【請求項３】野生型サイトカインの過剰産生によって惹
起される疾患である慢性自己免疫障害、全身性エリテマ
トーデス、黒色腫／プラズマ細胞腫、閉経後骨粗しょう
症及び癌悪液質の治療又は予防のための、請求項２記載
のヒトインターロイキン−６のミューテインの使用。 - 【請求項４】野生型サイトカインの過剰産生によって惹
起される疾患の治療又は予防のための薬剤コンパウンド
であって、該サイトカインの受容体アンタゴニストでも
ある、該サイトカインの少なくとも１種のミューテイン
を有効成分として薬理学的有効量で含有することを特徴
とする薬剤コンパウンド。 - 【請求項５】必要である投与形態を留意して、適当に選
択され、添加された希釈剤、賦形剤又は製薬的ビヒクル
を含有する、請求項４記載の薬剤製剤。 - 【請求項６】その過剰産生が疾患を惹起する野生型サイ
トカインに対する免疫処置のためのワクチンであって、
希釈剤、賦形剤又は製薬的受容されるビヒクル中に製薬
的有効量で、該サイトカインの受容体アンタゴニストで
もある、該サイトカインの少なくとも１種のミューテイ
ンを有効成分として含有する前記ワクチン。 - 【請求項７】その過剰産生が慢性自己免疫障害、全身性
エリテマトーデス、黒色腫／プラズマ細胞腫、閉経後骨
粗しょう症及び癌悪液質の疾患を惹起するヒトインター
ロイキン−６に対する免疫処置のための、請求項６記載
のワクチン。 - 【請求項８】突然変異:Tyr 31 Asp、Gly 35 Phe、S
er 118 Arg、Val 121 Asp、Gln 175 Ile、Ser 1
76 Arg、Gln 183 Alaを含有する、Sant1と呼ばれる
ヒトインターロイキン−６（hIL−６）のミューテイン
を有効成分として含有する、請求項７記載のワクチン。 - 【請求項９】１回の注入につきミューテイン0.1〜100μ
ｇの量で３回皮下注入されるべき、水酸化アルミニウム
中で1mg/mlにおいて製剤化されたミューテインSant1を
有効成分として含有する、請求項８記載のワクチン。 - 【請求項１０】hIL−６をhIL−６受容体アンタゴニスト
にすることができるアミノ酸置換を含有する、任意のバ
ージョンのhIL−６を有効成分として含有する、請求項
７記載のワクチン。
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