ITRM950589A1 - Uso di muteine di citochine naturali come immunogeni per la preparazione di composizioni farmaceutiche per curare o prevenire - Google Patents
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Abstract
Si tratta di composizioni farmaceutiche per curare o prevenire malattie provocate dalla sovrapproduzione di una specifica citochina naturale, caratterizzate dal fatto di contenere come principio attivo almeno un mutante di questa citochina naturale. Nella sua portata più ampia l'invenzione consiste nell'uso di muteine di una specifica citochina naturale, che siano anche antagonisti recettoriali di questa, come immunogeni per provocare la comparsa di anticorpi contro questa citochina naturale capaci di neutralizzarla nelle malattie provocate dalla sua sovrapproduzione. Figura 4 mostra che anticorpi sviluppati in topi transgenici NSE/hIL-6 immunizzati con una muteina di interleuchina 6 naturale e di neutralizzare l'attività biologica.
Description
"USO DI MUTEINE DI CITOCHINE NATURALI COME IMMUNOGENI PER LA PREPARAZIONE DI COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE PER CURARE O PREVENIRE MALATTIE CAUSATE DALLA SOVRAPPRODUZIONE DI DETTE CITOCHINE NATURALI, E COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE COSI' OTTENIBILI"
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce all'uso di muteine di una specifica citochina naturale, che siano anche antagonisti recettoriali di questa, come immunogeni per provocare la comparsa di anticorpi contro la citochina naturale capaci di neutralizzare la sua attività biologica nelle malattie provocate dalla sua sovrapproduzione.
Come è noto, ad esempio, 1'interleuchina 6 umana (hIL-6) è un polipeptide di 184 amminoacidi che appartiene alla classe della citochine elicoidali. L'interleuchina 6 è una citochina multifunzionale prodotta da vari tipi di cellule.
Essa agisce come fattore di differenziazione e crescita su cellule di vario tipo, quali ad esempio cellule del sistema immunitario, epatociti, cellule renali, cellule staminali ematopoietiche, cheratinociti e neuroni. Tuttavia, la sovrapproduzione di hIL-6 è alla base di numerose malattie, quali disordini autoimmuni cronici, lupus eritematoso sistemico, mieloma/plasmacitoma, osteoporosi successiva alla menopausa e cachessia da cancro.
Esiste pertanto nello specifico settore l'esigenza di ovviare alla sovrapproduzione, in generale di una citochina naturale, in particolare di hIL-6, sia a livello di prevenzione che di cura .
L'adozione della presente invenzione consente di soddisfare questa esigenza offrendo nel contempo altri vantaggi che saranno evidenti nel seguito .
E' infatti oggetto della presente invenzione l'uso di mutanti di una citochina naturale per la preparazione di composizioni farmaceutiche per curare o prevenire malattie provocate dalla sovrapproduzione di questa specifica citochina naturale .
Sono anche oggetto della presente invenzione composizioni farmaceutiche per curare malattie provocate dalla sovrapproduzione di una citochina naturale o vaccini per prevenirle che contengono come principio attivo almeno un mutante di questa citochina naturale.
Le composizioni farmaceutiche secondo la presente invenzione possono essere formulate secondo metodi noti, che prevedono ad esempio la presenza di un veicolo farmaceuticamente accettabile. Esempi di questi veicoli e metodi di formulazione si pqssono trovare in Remington's Pharmaceutical Sciences. Per formare una composizione farmaceuticamente accettabile, adatta per una efficace somministrazione, queste composizioni debbono contenere una quantità efficace del principio attivo secondo la presente invenzione. Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione sono somministrate ad un individuo in quantità sufficienti per curare la relativa malattia. La quantità relativa può variare in base ad una varietà di fattori, quali le condizioni individuali, il peso, il sesso e l'età. Altri fattori includono il modo di sommistrazione . Le composizioni farmaceutiche secondo l'invenzione possono essere somministrate in una grande varietà di modi, quali ad esempio quelli per via cutanea, topica, orale ed intramuscolare .
Le composizioni farmaceutiche secondo la presente invenzione, che contengono come ingrediente attivo almeno una muteina di citochina naturale, possono essere somministrate in una grande varietà di forme di dosaggio terapeutico in veicoli convenzionali per la somministrazione.
Ad esempio, possono essere somministrate in forme orali di dosaggio quali tavolette, capsule, pillole, polvere, granuli, elisir, tinture, soluzioni, sospensioni , sciroppi ed emulsioni, oppure per iniezione. Allo stesso modo, queste composizioni secondo l'invenzione possono essere somministrate per via endovenosa, intraperitoneale, sottocutanea, topica con o senza occlusione, oppure intramuscolare. Tutte queste forme di dosaggio sono ben note alle persone esperte nel settore dell'arte farmaceutica. In ogni caso deve essere impiegata una quantità efficace, ma non tossica, del principio attivo secondo l'invenzione.
Il dosaggio giornaliero di questo principio attivo può essere variato in un ampio intervallo da 0,01 a 1000 mg per adulto/per giorno. Una quantità efficace del principio attivo secondo l'invenzione è di solito fornita ad un livello di dosaggio da circa 0,001 mg/kg a circa 100 mg/kg di peso corporeo per giorno.
Secondo la presente invenzione, il principio attivo, che è costituto da muteine di una specifica citochina naturale, può essere somministrato tipicamente in miscuglio con adatti diluenti, eccipienti o veicoli farmaceutici (a cui si fa solitamente riferimento con il nome generico di "veicoli") selezionati in modo opportuno tenendo conto della forma di sommistrazione desiderata .
La preparazione dei vaccini secondo la presente invenzione è noto alle persone esperte del ramo. Tipicamente, questi vaccini sono preparati come iniettabili, sia come soluzioni che come sospensioni . La preparazione può essere emulsionata, oppure il principio attivo può essere incapsulato in liposomi. L'ingrediente attivo immunogenico è spesso mescolato con eccipienti che siano accettabili farmaceuticamente e compatibili con l'ingrediente attivo. Adatti eccipienti sono, ad esempio, acqua, destrosio, glicerolo, etanolo o simili e loro combinazioni. Inoltre, se lo si desidera, il vaccino può contenere piccole quantità di sostanze ausiliarie, quali ad esempio agenti bagnanti od emulsionanti, agenti per tamponare il pH, e/oppure adiuvanti che esaltano l'efficacia del vaccino.
I vaccini secondo l'invenzione sono preferibilmente somministrati parenteralmente, ad esempio mediante iniezione sia sottocutanea che intramuscolare. Ulteriori formulazioni che sono adatte per altri modi di somministrazione includono supposte e formulazioni orali. Queste composizioni contengono dal 10 al 95% dell'ingrediente attivo, preferibilmente dal 25 al 70%.
Si è data finora della presente invenzione una descrizione di carattere generale. Con l'aiuto dei seguenti esempi verrà ora fornita una descrizione particolareggiata di specifiche situazioni riferibili alla presente invenzione, finalizzate a meglio comprenderne scopi, caratteristiche, vantaggi e potenzialità applicative .
Figura la e lb mostrano i risultati dell'esperimento di immunizzazione con h.IL-6 naturale di topi normali e di topi transgenici NSE/hIL-6 .
Figura 2a e 2b mostrano i risultati dell'esperimento di immunizzazione con la forma mutante, sinteticamente indicata come Santi (contenente le mutazioni Tyr 31 Asp, Gly 35 Phe, Ser 118 Arg, Val 121 Asp, Gin 175 Ile, Ser 176 Arg, Gin 183 Ala ed essendo unantagonista di hlL-6) di topi normali e di topi transgenici NSE/hlL-6 .
Figura 3 mostra l'esito dell'esperimento finalizzato alla verifica se gli anticorpi sviluppati nei topi contro Santi sono in grado di riconoscere anche hIL-6 naturale.
Figura 4 mostra l'esito dell'esperimento finalizzato a verificare se gli anticorpi, sviluppati in topi transgenici NSE/hIL-6 immunizzati col mutante di interleuchina 6 naturale Santi, sono in grado di neutralizzare l'attività biologica della interleuchina 6 naturale umana.
ESEMPIO 1
Immunizzazione_-di topi transgenici NSE/hIL-6. con tolleranza immunitaria nei confronti-di-hlL-S..
con hIL-6 e Santi
I topi transgenici NSE/hIL-6 hanno integrato nel loro genoma il cDNA della interleuchina 6 umana sotto il controllo del promotore del gene dell'enolasi neuro-specifica di ratto.
L'ipotesi della tolleranza è stata verificata provando ad immunizzare i summenzionati topi transgenici NSE/hIL-6 (un gruppo di cinque topi) con IL-6 umana ricombinante; come controllo, sono stati utilizzati fratelli generati nella stessa cucciolata, ma mancanti del transgene. Un gruppo di cinque topi transgenici NSE/hIL-6 è stato anche immunizzato con una forma mutante di IL-6, chiamata Santi (che non ha attività biologica residua su cellule umane e si comporta come antagonista recettoriale di h-IL 6) e contenente le sette mutazioni di seguito riportate: Tyr 31 Asp, Gly 35 Phe, Ser 118 Arg, Val 121 Asp, Gin 175 Ile, Ser 176 Arg, Gin 183 Ala. Anche in questo caso come controllo sono stati utilizzati cinque fratelli generati nella stessa cucciolata, ma mancanti del transgene. Il protocollo per l'immunizzazione è stato il seguente: a tempo zero in sequenza è stato eseguito un prelievo di sangue (prelievo preimmune) da ogni animale sia transgenico che non, e poi ogni animale è stato immunizzato intraperitonealmente (IP) con 100 μg di antigene (wt hIL-6 oppure Santi, a seconda del gruppo di topi) in presenza di adiuvante di Freund completo (Complete Freund Adjuvant, CFA). Dieci giorni dopo la prima immunizzazione, è stato effettuato un prelievo di sangue (1° prelievo). Venti giorni dopo la prima immunizzazione è stata eseguita la seconda immunizzazione (primo richiamo) sempre con 100 μg di antigene, in presenza di adiuvante di Freund incompleto (Incomplete Freund's Adjuvant, IFA), seguita a dieci giorni di distanza (30 giorni dalla prima immunizzazione) dal secondo prelievo di sangue (2° prelievo) . Infine, quaranta giorni dopo la prima immunizzazione è stata eseguita la terza immunizzazione (secondo richiamo) sempre con 100 μg di antigene, in presenza di IFA, seguita a dieci giorni di distanza (50 giorni dalla prima immunizzazione) dal terzo prelievo di sangue (3° prelievo) . Da ognuno dei prelievi di sangue è stato preparato il siero corrispondente, secondo lo stato della tecnica.
A questo punto si è testato con metodica "ELISA" (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) se nei sieri ottenuti con il secondo e con il terzo prelievo erano presenti anticorpi diretti contro 1'antigene utilizzato per l'immunizzazione. Per far ciò, lo stesso antigene utilizzato per l'immunizzazione è stato legato in maniera non covalente sul fondo dei pozzetti di piastre prodotte per questo tipo di esperimenti (piastre ELISA). L'immobilizzazione dell'antigene è avvenuta incubando in ciascun pozzetto da rivestire 100 μΐ di una soluzione di antigene disciolto a 10 /ig/ml in IX PBS per 14 ore a temperatura ambiente (operazione denominata in gergo "coating"). Dopo l'immobilizzazione dell'antigene, la plastica dei pozzetti è stata rivestita di proteine incubando in ogni pozzetto una soluzione di BSA (Bovine Serum Albumin) allo 0,8% in IX PBS per 4 ore a temperatura ambiente (operazione chiamata in gergo "blocking"). Rimossa la soluzione di "blocking", 100 μΐ di ogni siero opportunamente diluito sono stati incubati singolarmente in ciascun pozzetto per 90 minuti a temperatura ambiente: durante questa fase, se ci sono nel siero anticorpi contro 1'antigene immobilizzato sul fondo del pozzetto, essi legheranno 1'antigene stesso restando a loro volta immobilizzati sul fondo del pozzetto. Terminati i 90 minuti di incubazione, i sieri sono stati rimossi dai pozzetti e, dopo opportuni lavaggi, in ogni pozzetto sono stati aggiunti 100 μΐ di BSA allo 0,8% in IX PBS, contenti anticorpi di coniglio diretti contro anticorpi di topo e l'incubazione è proseguita per 50 minuti a temperatura ambiente. Durante questa fase, se anticorpi di topo hanno riconosciuto e legato 1'antigene immobilizzato sul fondo del pozzetto, questi anticorpi di topo saranno riconosciuti e legati dagli anticorpi di coniglio, che saranno quindi a loro volta immobilizzati sul fondo del pozzetto. Inoltre gli anticorpi di coniglio, diretti contro anticorpi di topo (utilizzati diluiti 1:100 in PBS/BSA per l'esperimento summenzionato) prodotti e distribuiti dalla ditta DAKO, sono uniti covalentemente ad un enzima, la perossidasi del rafano. Terminati i 50 minuti di incubazione, la soluzione contenente anticorpi di coniglio è stata rimossa, ed i pozzetti sono stati opportunamente lavati. A questo punto sono stati aggiunti in ogni pozzetto 100 μΐ di una soluzione contenente un substrato (TMB: 3,-3',-5,-5'-tetrametil-benzidina-diidrocloruro) per la perossidasi del rafano. L'enzima converte il substrato in un prodotto che assorbe luce visibile a 450 nanometri; quindi la quantità di conversione può essere calcolata misurando spettrofotometricamente l'assorbimento a 450 nm in ogni singolo pozzetto tramite un lettore ELISA. Se l'esperimento viene eseguito in maniera corretta, l'assorbanza (cioè la quantità di luce assorbita) è proporzionale alla quantità di enzima che è proporzionale alla quantità di anticorpo di coniglio che è proporzionale alla quantità di anticorpo di topo diretto contro 1'antigene originariamente presente nel siero. Quindi, la misura dell'assorbanza dà una stima della quantità di anticorpi di topo diretti contro 1'antigene presente nel siero. Ciò è vero se l'anticorpo di topo diretto contro 1'antigene è il fattore limitante della catena di . reazioni sopra descritta. Quindi, per mettersi nelle condizioni appropriate, è opportuno eseguire una serie di diluizioni (da 1:33 fino a 1:8100) per ogni siero da esaminare, cosicché, per ogni siero ci saranno alcune diluizioni in cui la quantità di anticorpo di topo diretto contro 1'antigene usato per l'immunizzazione sarà sufficientemente alta da essere misurata con precisione, ma non talmente alta da saturare il sistema.
I risultati dell'esperimento di immunizzazione con IL-6 naturale (wtIL-6) sono illustrati in figura la ed lb per un tipico topo normale e per un tipico topo transgenico NSE/hlL-6. Come si può vedere dalla figura la, il topo normale ha sviluppato una notevole quantità di anticorpi diretti contro wtIL-6, tanto è vero che è possibile rilevare un segnale anche quando il siero è diluito fino a 1:8100. Viceversa, come si vede dalla figura lb, il topo transgenico ha sviluppato una quantità di anticorpi di molto inferiore: infatti il segnale si azzera quando il siero del secondo prelievo viene diluito 1:300 ed il siero del terzo prelievo viene diluito 1:2700. Per effettuare misure oggettive comparabili per tutti gli animali, per convenzione è stato definito "titolo" la diluizione di siero che dà una lettura di 0,5 O.D.4S0 al di sopra della lettura più alta del siero preimmune dello stesso animale. Nelle figure la e lb è mostrato come vengono calcolati il titolo del secondo e terzo prelievo per il topo normale e per il topo transgenico NSE/hIL-6 rispettivamente.
Le figure 2a e 2b mostrano i risultati dell'esperimento di immunizzazione con una forma mutante di IL-6, Santi, di un tipico topo normale e di un tipico topo transgenico NSE-hIL-6 rispettivamente. In questo caso entrambi i topi hanno sviluppato una notevole quantità di anticorpi diretti contro Santi. Infatti, è possibile rilevare un segnale relativamete forte anche quando il siero è diluito fino a 1:8100. Nelle figure 2a e 2b è mostrato come vengono calcolati i titoli del secondo e terzo prelievo per il topo normale e il topo transgenico.
In tabella 1 sono riportati i dati riassuntivi nel titolo (calcolato come definito sopra) nel secondo e del terzo prelievo per tutti i topi immunizzati in questo esperimento.
Per quanto riguarda i topi immunizzati con l'antigene wtIL-6, si può notare che al di là della variabilità da animale ad animale, in media i topi non transgenici hanno sviluppato una risposta anticorpale contro wtIL-610-20 volte più forte di quella ottenuta nei topi transgenici NSE/IL-6, a riprova del fatto che i topi transgenici hanno sviluppato tolleranza immunitaria nei confronti di hIL-6 umana.
Al contrario, per quanto riguarda i topi immunizzati con l'antigene Sant 1, si può notare che, ancora una volta al di là della variabilità da animale ad animale, in media i topi non transgenici hanno sviluppato una risposta anticorporale uguale a quella ottenuta nei topi transgenici NSE/hIL-6, suggerendo che le sette mutazioni, che introdotte in hIL-6 hanno generato Santi, hanno anche reso lo stesso mutante Santi una proteina completamente estranea per un sistema immunitario che altrimenti mostra tolleranza nei confronti di hIL-6.
ESEMPIO...2
Gli anticorpi sviluppati nei sieri di NSE/hIL-6 immunizzati EAR Santi sono in grado di riconoscere. oltre Santi, anche hIL-6 naturale Si è voluto verificare se gli anticorpi sviluppati dai topi contro Santi erano in grado di riconoscere, oltre allo stesso Santi, anche la hIL-6 naturale (wt IL-6). Questa ipotesi è stata verificata ancora una volta con un esperimento ELISA. Dopo aver verificato che anticorpi sviluppati in topi transgenici NSE/hIL-6 immunizzati con Santi sono in grado di riconoscere e legare lo stesso mutante Santi immobilizzato sul fondo di pozzetti di piastre ELISA, in un secondo esperimento è stata la IL-6 naturale ad essere legata in maniera non covalente sul fondo di pozzetti di piastre ELISA. Dopo la fase di saturazione della plastica dei pozzetti da parte della BSA , diluizioni di sieri di topi immunizzati con Santi sono state aggiunte negli stessi pozzetti per verificare la presenza di anticorpi in grado di riconoscere la wtIL-6. Come esempio, nella figura 3 è illustrato l'esito dell'esperimento per il topo transgenico NSE/hlL-6. Come si può notare, le risposte anticorpali ottenute contro Santi e contro la IL-6 naturale sono estremamente simili. In altre parole, è possibile rilevare la presenza di anticorpi che hanno legato la wtIL-6 immobilizzata sul fondo dei pozzetti nel siero del terzo prelievo anche quando quest'ultimo è diluito 1:8100. E' da notare che quando i topi transgenici NSE/hIL-6 vengono immunizzati direttamente con la IL-6 naturale, la risposta anticorpale diretta contro la IL-6 naturale stessa è molto più ridotta: infatti non è possibile rilevare anticorpi contro wtIL-6 nei sieri diluiti 1:8100 (vedi figura 1). Altri topi transgenici NSE/hIL-6 hanno mostrato una risposta simile a quella del topo mostrato nell'esempio. ESEMPIO 3
Gli anticorpi sviluppati in NSE/hIL-6 immunizzati con Santi sono in grado anche di neutralizzare l'attività biologica di hIL-6 naturale.
Si è voluto verificare se questi anticorpi, sviluppati in topi transgenici NSE/hIL-6 immunizzati con Santi, ma in grado di riconoscere IL-6 naturale, fossero anche in grado di neutralizzare l'attività biologica della stessa IL-6 naturale.
L'attività biologica della IL-6 naturale presa in esame è stata la capacità di stimolare la trascrizione da parte del promotore del gene della proteina C-reattiva in cellule umane di epatoma Hep3B. La misura dell'efficienza della stimolazione della trascrizione è stata effettuata secondo lo stato della tecnica (Gregory, B., Savino, R. e Ciliberto, G., J. Inuminologicai Methods, 170, 47-56, 1994). Cellule umane di epatoma Hep3B sono state stimolate con 4 ng/ml di IL-6 naturale, in presenza di diluizioni seriali dei sieri ottenuti al terzo prelievo da due topi transgenici NSE/hIL-6 #4 e #5 (immunizzati entrambi con Santi). I risultati dell'esperimento sono riportati in figura 4. Si può notare che entrambi i sieri diluiti 1:100 inibiscono quasi completamente l'attività biologica di hIL-6 naturale a 4 ng/ml su cellule umane di epatoma.
A questo punto, si è indagato se l'insorgenza di questa risposta anticorporale cross-reattiva contro hIL-6 naturale fosse in grado di far variare i livelli di hIL-6 naturale misurabile nei sieri dei topi transgenici NSE/hIL-6 immunizzati con Santi. I livelli di hIL-6 sono stati misurati secondo lo stato della tecnica con un esperimento ELISA a "sandwich", utilizzando un kit prodotto dalla ditta "R&D Systems" e disponibile a livello commerciale, seguendo scrupolosamente le istruzioni fornite dal produttore. I livelli di hIL-6 presenti sia nel prelievo preimmune che nel terzo prelievo sono stati misurati per quattro topi transgenici che erano stati immunizzati con Santi. I risultati sono riassunti nella tabella 2. Come si può notare, l'immunizzazione con Santi, oltre a causare l'insorgenza di una forte risposta anticorporale che riconosce sia Santi stesso sia wtIL-6, determina anche una diminuzione media di oltre 500 volte nei livelli di hIL-6 rilevabili nel siero dei topi NSE/hIL-6 mediante il kit ELISA a "sandwich" della R&D Systems.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Uso di muteine di una citochina naturale, che siano anche antagonisti recettoriali di questa, come immunogeni per la preparazione di composizioni farmaceutiche per curare o prevenire malattie provocate dalla sovrapproduzione di questa specifica citochina naturale.
- 2 . Uso di muteine di una citochina naturale come da rivendicazione 1, in cui la citochina naturale è interleuchina 6 umana.
- 3 . Uso di muteine di interleuchina 6 umana come da rivendicazione 2 per curare o prevenire malattie provocate dalla sovrapproduzione di questa citochina naturale, quali disordini autoimmuni cronici, lupus eritematoso sistemico, mieloma/plasmacitoma , osteoporosi successiva alla menopausa e cachessia da cancro.
- 4. Composizioni farmaceutiche per curare o prevenire malattie provocate dalla sovrapproduzione di una citochina naturale, caratterizzate dal fatto di contenere come principio attivo almeno una muteina di questa citochina naturale in quantità farmacologicamente efficace .
- 5. Farmaci come da rivendicazione 4, che contengono diluenti, eccipienti o veicoli farmaceutici, opportunamente selezionati e dosati tenendo conto della forma di somministrazione desiderata .
- 6. Vaccini come da rivendicazione 4 per l'immunizzazione verso una citochina naturale la cui sovrapproduzione provoca malattie, contenenti come principio attivo almeno una muteina di questa citochina, in una quantità farmaceuticamente efficace in diluenti, eccipienti o veicoli farmaceuticamente accettabili.
- 7. Vaccini come da rivendicazione 6, per l'immunizzazione verso interleuchina 6 umana, la cui sovrapproduzione provoca malattie quali disordini autoimmuni cronici, lupus eritematoso sistemico, mieloma/plasmacitoma, osteoporosi successiva alla meopausa e cachessia da cancro.
- 8. Vaccini come da rivendicazione 7, contenenti come principio attivo la muteina di interleuchina 6 umana (hIL-6), denominata Santi, con le mutazioni Tyr 31 Asp, Gly 35-Phe, Ser 118 Arg, Val 121 Asp, Gin 175 Ile, Ser 176 Arg, Gin 183 Ala.
- 9. Vaccini come da rivendicazione 7, contenenti come principio attivo una qualsiasi variante di hIL-6 con sostituzioni amminoacidiche tali da renderla antagonista recettoriale di hlL-6.
- 10. Uso di muteine di una citochina naturale per la preparazione di composizioni farmaceutiche per curare o prevenire malattie provocate da questa specifica citochina naturale, e farmaci e vaccini così ottenibili come precedentemente descritto, esemplificato e rivendicato,
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