KR19990010146A - 파네실 전이효소 전해 효능을 갖는 2환 또는 3환 방향족 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파네실 전이효소 억제 활성을 갖는 화학식 1로 표시되는 화합물, 그의 이성질체 및 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

(상기 화학식 1에서 A, B, C, D 및 n 은 명세서에 정의한 바와 같다.)

상기 화학식 1의 화합물 및 그를 유효성분으로 함유하는 조성물은 파네실 전이효소를 억제하는 작용을 하므로 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

파네실 전이효소 저해 효능을 갖는 2환 또는 3환 방향족 화합물

본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 그의 이성질체 및 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물, 그의 제조방법 및 그를 유효성분으로 함유하는 파네실 전이효소 저해제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Ras 단백질은 세포가 성장하고 분화하는데 중요한 역할을 하는 21kDa 크기의 단백질로서 구아닌 뉴클레오티드와 결합하며, 구아노신 트리포스페이트(GTP)를 구아노신 다이 포스페이트(GDP)로 가수분해하거나 GDP를 GTP로 인산화하는 작용을 하는 GTPase회로에 참여하여 세포 신호전달 경로에 관련되어 있다고 알려져 있으며, 세포성장과 분화에 관련되어 있고, 포유동물 세포에서 3가지ras유전자로부터 생성되며 188개의 아미노산 잔기로 이루어진 K-Ras4B 단백질 또는 아미노산 189개로 이루어진 H-Ras, K-Ras4A, N-Ras 단백질의 4가지 종류가 있다(Bourne, H. R.; Sanders, D. A.; McCormick, F., Nature, 1991 , 349, 117).

Ras 단백질의 12, 13, 61번 위치에 있는 아미노산들은 GTP의 인산기 가까이 위치하고 있어서, 이 아미노산의 잔기들은 GTP의 가수분해에 관여하는 물분자의 공간적 위치에 큰 영향을 미친다. 인체에서 발생하는 암의 경우, 이 위치의 아미노산들의 돌연변이가 일어나면서 암을 유발하는 형태(발암성 Ras)가 되는 것이 그 원인인데, 이러한 돌연변이 Ras 단백질은 고유의 GTPase 활성을 잃어 GTP가 결합되어 활성화된 상태로 계속 존재하게 된다. 따라서, 이러한 돌연변이 Ras 단백질은 계속적으로 세포 신호를 전달하게 되어 발암성이 유발되는 것으로 보고되었으며, 실제로 췌장암, 폐암 및 피부암 등이ras유전자와 밀접하게 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Bos, J. L.Cancer Res.,1989,49, 4682).

Ras 단백질이 생물학적으로 활성화 상태에 있기 위해서는 세포막에 부착되어야 하며, Ras 단백질이 세포막에 부착되기 위해서는 우선 세포막 내의 지질층과 용이하게 결합할 수 있어야 한다. Ras 단백질은 파네실기가 결합하여 소수화되는데, 이러한 과정을 구체적으로 언급하자면 파네실화에 관여하는 Ras 파네실 전이효소(Farnecyltransferase)에 의한 과정, Ras 단백질 카복시 말단에 존재하는 3개 아미노산으로 구성된 AAX 펩티드 절단 효소에 의한 과정, 메틸 전이효소 및 팔미토일 전이효소 등에 의한 과정 등이 있으며, 이러한 과정들에 의하여 Ras 단백질의 카복시 말단이 변형된다. 이 단계들 중 첫번째인 파네실화는 파네실 전이효소(FTase)라는 효소에 의하여 진행되는데 Ras 단백질의 탄소 말단에 있는 CA₁A₂X라는 네 개의 아미노산으로 구성된 펩티드가 기질로서 이용된다. 여기서 A₁, A₂는 전기적 부하를 띄지않는 지방족의 아미노산이고 X는 메티오닌, 알라닌, 세린 등이다. 이 파네실화는 C(시스테인)부위에 일어나 황에테르 결합을 형성하는데, 특히 H-Ras와 N-Ras 단백질의 경우는 그의 카복시 말단 근처에 존재하는 또 다른 시스테인에 팔미토일화가 일어난다. 이러한 파네실화의 결과로 Ras 단백질은 소수성(Hydrophobicity)이 증가하게 되어 파네실화된 Ras 단백질은 세포막에 용이하게 부착될 수 있게 된다. 파네실화된 Ras 단백질은 다시 그의 카복시 말단의 3개의 아미노산이 AAX 펩티드 절단효소에 의해 떨어져 나가서 메틸화되어 파네실기가 세포막 내의 지질 이중층(lipid bilayer) 또는 다른 수용체와 용이하게 결합할 수 있다. 이렇게 생성된 Ras 단백질은 메틸 전이효소에 의하여 메틸에스테르화되는데, 그 결과 Ras 단백질의 전기적 부하상태나 공간적인 구조의 변화가 일어날 것으로 예상되며, 소수성도 증가하게 되므로 Ras 단백질이 세포막에 더욱 용이하게 부착될 수 있다.

한편, K-Ras4B 의 경우는 H-Ras, N-Ras 와는 달리 팔미토일화에 필요한 시스테인 대신 폴리베이직 도메인 (Poly basic domain)이라 불리는 여러개의 라이신 염기가 배열된 부위를 가지고 있으며, 이 부위가 세포막내의 음이온성 지질과의 결합을 더욱 용이하게 해주는 것으로 알려져 있다.

Ras 단백질이 세포막에 최적의 조건으로 부착되기 위해서는 상기의 모든 변형단계가 필요하지만, Ras 단백질이 생물학적 활성을 나타내는데는 파네실화 자체만으로도 충분하다. 따라서, 상기 세 단계중 첫번째 단계인 파네실화 과정을 저해하면 돌연변이 Ras 단백질이 세포막에 부착되는 것을 막을 수 있어 돌연변이 Ras 단백질이 세포신호를 계속 전달하여 세포를 분열 및 증식시키는 것을 막을 수 있게 된다. 따라서 파네실화를 저해하는 물질을 개발하는 것이 곧 항암제를 개발하는 것이라고 인식되어 최근에 여러기관에서 이에 대한 많은 연구가 활발히 진행되고 있다(N. E. Kohlet al., Science,1993,260, 1934; G. L. Jameset al., Science, 1993 , 260,1937; J. E. Busset al.,Chemistry Biology,1995,2, 787).

그간의 연구 결과, 파네실 전이효소를 저해했을 때 Ras 단백질로 형질전환된 세포성장이 저해될 뿐만 아니라 Ras 단백질에 의해 변형된 세포 형질이 개선되는 것이 관찰되었으며, 실제로 파네실 전이효소의 몇몇 저해제들은 발암성 Ras 단백질의 세포내 프레닐기에 의한 반응을 선택적으로 저해하는 것으로 밝혀졌다 [Kohl, N. E.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1994,91, 9141; Kohl, N. E.et al.,Nature Medicine,1995,1, 792].

두 개의 기질인 파네실기와 Ras 단백질을 결합하여 반응물을 생성하는 파네실 전이효소의 저해제는 크게 세가지로 나눌 수 있다. 먼저 파네실기 (FPP)를 경쟁적으로 저해할 수 있는 화합물, 둘째로는 Ras 단백질의 C-말단의 작용을 저해하는 화합물, 그리고 파네실 전이효소가 두 기질을 사용하는 촉매반응의 활성화 단계를 모사하는 안정한 화합물을 저해제로 응용하는 것이다.

지금까지 연구된 대부분의 저해제는 Ras 단백질의 C-말단에 있는 프레닐기의 도입반응을 매개하는 CAAX 모티브에 연관된 것들로서, 파네실 전이효소의 Ras 단백질 기질에 대한 경쟁적 저해기전을 응용한 것이다. 예로서 콜 (Kohl, N. E.) 등은 CAAX를 모사한 시스테인 티올 (thiol)기를 함유한 펩타이드 변형체 및 이를 개선한 저해제를 연구하였으며 [미국 특허 5,141,851; Kohl, N. E.et al.,Science, 1993,260, 1934; PCT/US95/12224, Grahamet al.], 셉티 (Sebti, S. M.) 등은 펩타이드의 골격구조를 페닐기로 변형한 파네실 전이효소 저해제를 연구하였다 [Sebti, S. M.et al.,J. Biol. Chem.,1995,270, 26802]. 또한 향정신성 의약품 골격구조 중 벤조다이아제핀을 펩타이드의 턴 (turn) 모사구조로 활용한 변형체가 보고된 바 있으며 [James, G. L.et al.,Science,1993,260, 1937], 펩타이드 구조에서 벗어난 트리사이클린 유기화합물을 골격으로 한 저해제가 연구되었다 [Bishop, W. R.et al.,J. Biol. Chem.,1995,270, 30611].

한편 파네실 전이효소의 촉매반응 단계를 모사하는 저해제의 연구는 풀터 (Poulter, C. D.) 등이 파네실 전이효소가 프레닐기를 전이하는 작용기전이 전자 친화적 치환반응 (Electriphilic Displacement)임을 제시한 후 [Poulter, C. D.et al.,Poc. Natl. Acad. Sci. USA], 반응이 전이 상태 (transition state)에서 양성 부하를 요구하는 것에 착안하여 프레닐기에 전이 상태의 양성 부하를 연결시킨 새로운 형태의 저해제를 연구하였다 [Poulter, C. D.et al.,J. Am. Chem. Soc.,1996,118, 8761].

그러나 최근 인체 암에서 많은 경우 K-Ras 활성화가 주요 원인이며, 상기한 대부분의 프레닐 전이효소 제해제들의 경우 H-Ras 또는 N-Ras 에 의해 형질전환된 세포의 성장을 저해하는 효력보다는 K-Ras 활성화에 의해 형질전환된 세포의 성장을 저해하는 효력이 떨어진다는 것이 규명되어 K-Ras 활성을 효과적으로 저해할 수 있는 새로운 저해제의 연구가 주목받고 있다.

이에 본 발명자들은 K-Ras 기질에 대한 효소 저해 및 세포내 K-Ras 프레닐화 저해능을 평가할 수 있는 방법을 알아내고, 이 방법을 활용하여 K-Ras 뿐만 아니라 H-Ras 및 N-Ras 기질의 파네실화를 저해하는 우수한 화합물을 합성하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는, 파네실 전이효소 저해효능을 가지는 화합물, 그의 이성질체 및 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물, 그의 제조방법 및 그를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 파네실 전이효소를 억제함으로써 항암효과를 갖는 하기 화학식 1의 화합물, 그의 이성질체 및 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물, 그의 제조방법 및 그를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약제학적 조성물을 제공한다.

화학식 1

상기 화학식 1에서

1) A 는 수소 및 저급알킬 중에서 선택되거나 하기 화학식 2로 표현된다.

화학식 2에서 R₁은 할로겐, CN, NO₂, N₃, COOH, 아미드, 티오아미드, 페녹시, 페닐, 저급 알킬 및 질소, 황 또는 산소를 포함하는 5환 또는 6환의 헤테로고리 화합물 중에서 선택된다. X 는 방향족 및 질소, 황 또는 산소를 포함하는 5환 또는 6환의 헤테로고리 화합물 중에서 선택된다.

2) B 는 산소 (-O-) 및 황 (-S-) 중에서 선택되어지거나 하기 화학식 3으로 표현된다.

화학식 3에서 R₂는 수소, 저급 알킬, 히드록시, 저급 알콕시 및 방향족이 치환된 저급 알킬 중에서 선택된다.

3) R 은 히드록시, 저급 알콕시를 나타내거나 3환 방향족 유도체 또는 화학식 4 및 화학식 5 로 표현되는 치환기 중에서 선택된다.

상기 화학식 4에서 R₃및 R₄는 각각 수소, 저급 알킬, 할로겐, 히드록시, CN, NO₂, NH₂, COOH, 아미드, 티오아미드, 저급 알콕시, 페녹시, 방향족, 및 방향족이 치환된 저급 알킬 중에서 선택되어지며, R₅는 수소, 저급 알킬, 방향족, 방향족이 치환된 저급 알킬 및 5환 또는 6환의 헤테로고리 화합물 중에서 선택되어진다.

상기 화학식 5에서 E 는 산소 (-O-) 및 황 (-S-) 중에서 선택되고, F 는 3환 방향족 유도체 또는 화학식 4 로 표현되는 2환 방향족 중에서 선택되어진다.

4) n 은 0 내지 2 중에서 선택된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 저급 알킬은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 측쇄알킬을 의미한다.

본 발명의 화합물들은 비대칭 탄소 중심을 가질 수 있으며, 라세미체, 라세미 화합물, 부분 입체 이성체 혼합물 및 각각의 부분 입체 이성체로서 존재할 수 있으며, 이들 모든 이성체 형태는 본 발명에 포함된다.

또한, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물의 형태로 된 유도체 화합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물 중 대표적인 화합물에는 다음과 같은 물질들이 있다.

1) 4-{5-[히드록시(4-나프탈렌-1-일페닐)메틸]이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴

2) 4-[5-(4-나프탈렌-1-일벤질)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴

3) 4-(4-나프탈렌-1-일벤질)이미다졸

4) 4-{5-[2-(4-나프탈렌-1-일페닐)에틸]이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴

5) 4-[5-(4-나프탈렌-1-일페녹시메틸)이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴

6) 4-{5-[히드록시-3-(나프탈렌-1-일옥시)페닐메틸]이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴

본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 화합물의 제조방법은 다음과 같은 4가지 방법으로 나눌 수 있다.

방법 Ⅰ.

1) p-디브로모벤젠과 나프탈렌보론산을 스즈끼 커플링 (Suzuki coupling)하는 단계 (제 1단계);

2) 상기 제 1단계에서 얻은 화합물에 그리냐르 반응 (Grignard reaction)을 수행하여 적절한 치환기 (화학식 1의 A)를 가지는 이미다졸 화합물을 도입하는 단계 (제 2단계)

로 이루어지거나, 이에 더하여 선택적으로 다음 제 3단계를 포함할 수 있다.

3) 상기 제 2단계에서 얻은 화합물을 환원 반응시키는 단계 (제 3단계).

방법 Ⅱ.

1) p-브로모벤질브로마이드를 염화반응시키는 단계 (제 1단계);

2) 상기 제 1단계에서 얻은 화합물을 위티그 반응 (Wittig reaction)시켜 적절한 치환기 (화학식 1의 A)를 가지는 이미다졸 화합물을 도입하는 단계 (제 2단계);

3) 상기 제 2단계에서 얻은 화합물을 스즈끼 커플링시켜 적절한 2원환 또는 3원환의 화합물을 도입시키는 단계 (제 3단계) 및

4) 상기 제 3단계에서 얻은 화합물을 환원반응시키는 단계 (제 4단계).

방법 Ⅲ.

1) 적절한 치환기 (A)를 가지는 히드록시 이미다졸 화합물과 브로모페놀을 미쯔노브 반응 (Mitsunob reaction)시키는 단계 (제 1단계) 및

2) 상기 제 1단계에서 얻은 화합물을 스즈끼 커플링시켜 적절한 2원환 또는 3원환의 화합물을 도입시키는 단계 (제 2단계).

방법 Ⅳ.

1) p-브로모플루오르벤젠과 1-나프톨을 치환반응시키는 단계 (제 1단계) 및

2) 상기 제 1단계에서 얻은 화합물에 그리냐르 반응을 수행하여 적절한 치환기를 가지는 이미다졸 화합물을 도입하는 단계 (제 2단계).

구체적으로, 본 발명의 화합물은 반응식 1 에서 반응식 6 까지 도시된 바와 같이 제조할 수 있다.

상기 반응식 1은 4-히드록시메틸 이미다졸 하이드로클로라이드로 부터 그 유도체들을 제조하는 방법을 나타낸 것으로 착보호기 및 아세틸화 반응, 염화 반응, 탈 보호기 반응 및 산화반응을 거친다. 상기 반응식 1에 의하여 제조된 화합물은 본 발명의 화합물을 제조하는데 중간체 화합물로 사용된다.

상기 반응식 2는 1-트리틸-4-히드록시메틸 이미다졸로부터 산화반응을 거쳐 알데히드 유도체를 만드는 방법을 나타낸 것으로 반응식 2에 의하여 제조된 화합물은 본 발명의 화합물을 제조하는데 중간체 화합물로 사용된다.

상기 반응식 3은 p-디브로모벤젠과 나프탈렌보론산의 스즈끼 커플링 (Suzuki coupling), 그리냐르 반응 (Grignard reaction) 및 환원반응을 거쳐 최종화합물을 제조하는 과정을 나타낸 것이다.

상기 반응식 4는 p-브로모벤질브로마이드로부터 포스포늄염을 사용한 염화반응, 위티그 반응 (Wittig reaction), 스즈끼 커플링 및 환원반응을 거쳐 최종화합물을 제조하는 과정을 나타낸 것이다.

상기 반응식 5는 1-(4-시아노벤질)-5-히드록시메틸이미다졸과 브로모페놀로부터 미쯔노부 반응 (Mitsunob reaction) 및 스즈끼 커플링을 거쳐 최종화합물을 제조하는 과정을 나타낸 것이다.

상기 반응식 6은 p-브로모플루오로벤젠과 1-나프톨로부터 치환반응 및 그리냐르 반응을 거쳐 최종화합물을 제조하는 과정을 나타낸 것이다.

이하 실시예에 의하여 본 발명의 화합물의 제조방법을 상세히 설명하기로 한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일뿐 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 한편 하기 제조예에서는 본 발명의 화합물을 만들기 위한 중간체의 합성방법을 예시한다.

제조예 1. 1-(4-시아노벤질)-이미다졸-5-카르복스알데히드의 제조

(단계 1) 1-트리틸-4-히드록시메틸 이미다졸의 제조

히드록시메틸 이미다졸 하이드로클로라이드 3.99 g (29.6 mmol)을 30 mL의 디메틸포름아미드와 10 mL의 트리에틸아민에 녹인 후, 9.35 g (33.5 mmol) 트리페닐메틸 클로라이드의 디메틸포름아미드 (110 mL) 용액을 서서히 가한다. 2 시간 후에 500 mL의 얼음물을 가한 다음, 생성된 고체를 얻는다. 이 고체를 디옥산으로 재결정하여 8.82 g (수율 87%)의 표제의 화합물을 얻었다.

mp 227-229 ℃.

(단계 2) (1-트리틸-4-아세톡시메틸)이미다졸의 제조

피리딘 100 mL에 제조예 1의 (단계 1)의 화합물 5.00 g (14.7 mmol)을 넣어주고, 아세틱 안하이드라이드 1.65 g (16.2 mmol)을 가한 다음 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 감압 증류하여 피리딘을 제거하고 200 mL의 에틸아세테이트에 녹인 다음, 100 mL의 소금물로 씻어 주었다. 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고 디클로로메탄/메탄올로 크로마토그래피를 실시하여 표제의 화합물 5.22 g (13.7 mmol, 수율 93%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 2.01 (s, 3H), 4.95 (s, 2H), 6.88 (s, 1H), 7.08 (s, 5H), 7.27 (s, 10H), 7.45 (s, 1H).

(단계 3) [1-트리틸-3-(4-시아노벤질)-4-아세톡시메틸]이미다졸 의 브롬화 염 의 제조

제조예 1의 (단계 2)의 화합물 5.00 g (13.1 mmol)을 디클로로메탄 20 mL에 녹인 후, 4-시아노벤질브로마이드 2.82 g (14.4 mmol)을 가한 다음 상온에서 60시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고 디클로로메탄/메탄올로 크로마토그래피를 실시하여 표제의 화합물 5.31 g (9.17 mmol, 수율 70%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃+ CD₃OD) δ 1.95 (s, 3H), 4.95 (s, 2H), 5.45 (s, 2H), 7.11 - 7.40 (m, 18H), 7.65 (d, 2H), 8.21 (s, 1H).

(단계 4) [1-(4-시아노벤질)-5-아세톡시메틸]이미다졸의 제조

제조예 1의 (단계 3)의 화합물 9.10 g (15.7 mmol)을 디클로로메탄 500 mL 에 녹인 후, 0 ℃에서 트리플루오로 아세트산 6.06 mL (78.7 mmol)과 트리에틸실란 12.5 mL (78.7 mmol)을 서서히 가한 다음 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고, K₂CO₃포화 용액으로 pH를 10으로 맞춘 다음 300 mL의 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고 에틸아세테이트로 크로마토그래피를 실시하여 표제의 화합물 3.60 g (14.1 mmol, 수율 90%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 1.90 (s, 3H), 4.97 (s, 2H), 5.25 (s, 2H), 7.14 (d, 2H), 7.21 (d, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.75 (d, 2H).

(단계 5) 1-(4-시아노벤질)-5-히드록시메틸이미다졸의 제조

제조예 1의 (단계 4)의 화합물 4.20 g (16.5 mmol)을 메탄올 200 mL에 녹인 후, K₂CO₃4.50 g (32.9 mmol)을 가한 다음 상온에서 20분 동안 교반하였다. 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고 300 mL의 에틸아세테이트로 추출한 다음, 디클로로메탄/메탄올로 크로마토그래피를 실시하여 표제의 화합물 3.19 g (15.0 mmol, 수율 91%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃+ CD₃OD) δ 4.28 (s, 2H), 5.18 (s, 2H), 6.84 (s, 1H), 7.12 (d, 2H), 7.42 (s, 1H), 7.55 (d, 2H).

(단계 6) 1-(4-시아노벤질)이미다졸-5-카르복스알데히드의 제조

제조예 1의 (단계 5)의 화합물 1.0 g (4.7 mmol) 과 이산화망간 4.1 g (47 mmol)을 디옥산 (50 mL)에서 12시간 동안 환류하였다. 촉매를 여과하여 제거하고 감압하에서 유기용매를 제거한 후 크로마토그래피하여 표제의 화합물 710 mg (3.4mmol, 수율 72%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃) δ 5.24 (s, 2H), 6.90 (m, 2H), 7.28 (m, 2H), 7.44 (s, 1H), 7.53 (d, 1H), 9.40 (s, 1H).

제조예 2. 1-트리틸이미다졸-4-카르복스알데히드의 제조

상기 제조예 1의 (단계 1)의 표제 화합물을 사용하여 제조예 1의 (단계 6)의 방법과 동일한 반응을 수행하여 표제의 화합물을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃) δ 7.10-7.38 (m, 15H), 7.54 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 9.85 (s, 1H).

실시예 1 4-{5-[히드록시(4-나프탈렌-1-일페닐)메틸]이미다졸-1-일메틸}벤조 니트릴의 제조

(단계 1) 1-(4-브로모페닐)나프탈렌의 제조

1-나프탈렌보론산 100 mg (0.581 mmol), p-디브로모벤젠 137mg (0.581 mmol), 소듐카보네이트 10하이드레이트 872 mg , 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 19 mg 을 테트라하이드로퓨란/물 (3 mL/0.5 mL) 에 넣고 10시간 동안 환류하였다. 촉매를 여과 하고 유기용매를 감압증류하여 제거한 후 디클로로메탄으로 추출하였다. 마그네슘설페이트로 건조한 후 농축하고, n-헥산으로 크로마토그래피 하여 표제의 화합물 106 mg (0.374 mmol, 수율 64%)을 합성하였다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 7.37-7.60 (m, 6H), 7.63 (d, 2H), 7.82-7.95 (m, 3H)

(단계 2) 4-{5-[히드록시(4-나프탈렌-1-일페닐)메틸]이미다졸-1-일메틸}벤조니 트릴의 제조

실시예 1의 (단계 1) 의 표제의 화합물 94 mg (0.33mmol)과 마그네슘 9.0 mg (0.37 mmol)을 건조된 테트라하이드퓨란 1 mL 에 넣고 30 분간 환류한 다음, 상온으로 온도를 낮추고 제조예 1의 (단계 6) 의 표제의 화합물 70 mg (0.33 mmol)을 가하였다. 30분간 교반 후 물 1mL 를 가하여 반응을 중지시키고 감압하에서 유기용매를 제거한 후 디클로로메탄으로 추출하였다. 마그네슘설페이트로 건조후 농축하여 디클로로메탄/메탄올 (20/1)로 칼럼 크로마토그래피하여 표제의 화합물 70 mg (0.17 mmol, 수율 52%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 5.30 (q, 2H), 5.83 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 7.10-7.70 (m, 13H), 7.80-7.95 (m, 3H)

FAB MS : 416 (M+1)

실시예 2 4-[5-(4-나프탈렌-1-일벤질)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴의 제조

상기 실시예 1의 표제의 화합물 20 mg(0.048 mmol)을 트리에틸실란/트리플루오로아세트산/디클로로메탄 (0.5 mL/1.0 mL/0.5 mL)의 혼합 용액에 넣고 2시간 환류하였다. 감압하에서 유기용매를 제거한 후 K₂CO₃포화 용액으로 pH를 10으로 맞춘 다음 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 용매를 감압 증류하여 제거하고 디클로로메탄/메탄올 (20/1)로 칼럼 크로마토그래피하여 표제의 화합물 12 mg (0.030 mmol, 수율 63%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 4.88 (s, 2H), 5.05 (s, 2H), 7.02-7.70 (m, 14H), 7.80-7.95 (m, 3H)

FAB MS : 400 (M+1)

실시예 3 4-(4-나프탈렌-1-일벤질)이미다졸의 제조

상기 제조예 2의 표제 화합물과 실시예 1의 (단계 1)의 표제 화합물을 실시예 1의 (단계 2)의 방법으로 반응시킨 다음 실시예 2의 방법으로 반응시켜 표제의 화합물을 35% 수율로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 4.90 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 6.09-7.65 (m, 9H), 7.82-7.94 (m, 3H)

FAB MS : 285 (M+1)

실시예 4 4-{5-[2-(4-나프탈렌-1-일페닐)에틸]이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴 의 제조

(단계 1) 4-브로모벤질트리페닐포스포늄브로마이드의 제조

4-브로모벤질브로마이드 4.45 g (20 mmol)을 디에틸에테르에 녹인 후 트리페닐포스핀 5.75 g (22 mmol)을 넣은 다음 12시간 동안 환류하였다. 이를 상온으로 냉각 시킨 후 고체를 여과하여 표제의 화합물 (19 mmol, 95 %)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 5.60 (d, 2H), 7.05 (d, 2H), 7.20 (d, 2H), 7.60 (m, 6H), 7.75 (m, 9H)

(단계 2) 4-{5-[2-(4-브로모페닐)비닐]이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴의 제조

실시예 4의 (단계 1) 의 화합물 306 mg (0.60 mmol)을 무수테트라하이드로퓨란에 녹인 후 t-부톡시 칼륨 (t-BuO-K⁺) 67.2mg (0.60 mmol)을 가하였다. 이 용액에 제조예 1의 (단계 6) 의 표제 화합물 112 mg (0.50 mmol)을 가하고 2시간 동안 교반하였다. 감압하에서 유기용매를 제거한 후 에틸아세테이트/헥산 (1/1)으로 칼럼 크로마토그래피하여 표제의 화합물 146 mg (0.40 mmol, 80 %, 시스-트랜스 혼합물)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 5.10 (s, 1H), 5.21 (s, 1H), 6.12 (d, 0.5H), 6.45 (d, 0.5H), 6.60 (d, 0.5H), 6.82 (d, 0.5H), 7.00 (s, 1H), 7.05-7.30 (m, 5H), 7.40-7.60 (m, 4H)

(단계 3) 4-{5-[2-(4-나프탈렌-1-일페닐)비닐]이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴의 제조

실시예 4의 (단계 2)의 표제의 화합물과 1-나프탈렌보론산으로부터 실시예 1의 (단계 1)의 방법을 사용하여 표제의 화합물을 83% 수율로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 5.10 (s, 1H), 5.30 (s, 1H), 6.12 (d, 0.5H), 6.47 (d, 0.5H), 6.61 (d, 0.5H), 6.70 (d, 0.5H), 7.00-7.70 (m, 15H), 7.90 (d, 2H)

(단계 4) 4-{5-[2-(4-나프탈렌-1-일페닐)에틸]이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴의 제조

실시예 4의 (단계 3)의 표제의 화합물 40 mg (0.097 mmol)을 메탄올 5 mL 에 녹인 후 Pd/C (10%) 5mg 을 넣고 수소 분위기 하에서 24 시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과하여 제거한 후 농축하고 에틸아세테이트로 칼럼 크로마토그래피하여 표제의 화합물 36 mg (0.087 mmol, 수율 90 %)을 얻었다 .

¹H NMR(CDCl₃) δ 5.05 (s, 1H), 7.05 (m, 3H), 7.15 (d, 2H), 7.25 (s, 1H), 7.30-7.72 (m, 9H), 7.90 (d, 2H)

FAB MS : 414 (M+1)

실시예 5 4-[5-(4-나프탈렌-1-일페녹시메틸)이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴의 제조

(단계 1) 4-[5-(4-브로모페녹시메틸)이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴의 제조

제조예 1의 (단계 5)의 표제 화합물 431 mg (2.02 mmol), 4-브로모페놀 349 mg (2.02 mmol)과 트리페닐포스핀 530 mg (2.02 mmol)을 무수테트라하이드로퓨란 5 mL 에 녹이고 주사기로 디에틸 아조디카르복실레이트 (DEAD) 0.32 mL (20.3 mmol)를 가하였다. 12시간 동안 교반하고 농축한 후 디클로로메탄/메탄올 (20/1)로 칼럼 크로마토그래피하여 표제의 화합물 220 mg (0.597 mmol, 수율 30%)을 얻었다

¹H NMR(CDCl₃) δ 4.82 (s, 2H), 5.26 (s, 2H), 6.64 (d, 2H), 7.15 (d, 2H), 7.25 (s, 1H), 7.35 (d, 2H), 7.59-7.70 (m, 3H)

(단계 2) 4-[5-(4-나프탈렌-1-일페녹시메틸)이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴의 제조

실시예 5의 (단계 1)의 표제 화합물과 1-나프탈렌보론산으로부터 실시예 1의 (단계 1)과 동일한 방법을 수행하여 표제의 화합물을 93% 수율로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 2.75 (t, 2H), 2.95 (t, 2H), 4.93 (s, 2H), 5.33 (s, 2H), 6.87 (d, 2H), 7.21 (d, 2H), 7.31-7.66 (m, 10H), 7.80-7.94 (m, 3H)

FAB MS : 416 (M+1)

실시예 6 4-{5-[히드록시-3-(나프탈렌-1-일옥시)페닐메틸]이미다졸-1-일메 틸}벤조니트릴의 제조

(단계 1) 4-브로모페녹시-1-나프탈렌의 제조

p-브로모플루오로벤젠 5.00 g (28.6 mmol), 1-나프톨 4.12 g (28.6 mmol), K₂CO₃7.70 g 을 디메틸포름아미드 30 mL 에 넣고 2일 동안 환류하였다. 감압하에서 용매를 제거하고 물 50 mL를 넣은 후 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 소금물과 물을 사용하여 차례로 씻어준 후 마그네슘설페이트로 건조하였다. 감압하에서 용매를 제거한 후 헥산으로 칼럼 크로마토그래피하여 표제의 화합물 1.80 g (6.02 mmol, 수율 21%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 6.97 (d, 1H), 7.03 (d, 1H), 7.15-7.32 (m, 4H), 7.43 (t, 1H), 7.47-7.56 (m, 2H), 7.69 (d, 1H), 7.90 (d, 1H), 8.11 (d, 1H)

(단계 2) 4-{5-[히드록시-3-(나프탈렌-1-일옥시)페닐메틸]이미다졸-1-일메틸} 벤조니트릴의 제조

상기 실시예 6의 (단계 1)의 표제 화합물과 제조예 1의 (단계 6)의 표제 화합물로부터 실시예 1의 (단계 2)의 방법과 동일하게 반응을 수행하여 표제의 화합물을 71% 수율로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 5.18 (q, 2H), 5.65 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.88-7.10 (m, 6H), 7.28 (s, 1H), 7.34-7.56 (m, 7H), 7.89 (d, 1H), 8.11 (d, 1H)

FAB MS : 432 (M+1)

본 발명의 화합물의 파네실 전이효소 억제능을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.

실험예 1 Ras 파네실 전이효소 억제능 분석

본 실험에서는 폼프리아노 (Pomplianoet al.,Biochemistry 1992,31, 3800) 등의 방법을 개선하여 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 Ras 파네실 전이효소를 사용하였으며, 기질은 H-Ras(H-Ras-CVLS)와 K-Ras의 카복시 말단 다염기성 라이신 도메인을 치환시킨 H-Ras와의 결합단백질(특허출원 제97-14409호)을 이미 보고된 방법(Chunget al.,Bichimica et Biophysica Acta,1992,1129, 278)에 의해 정제하여 사용하였다.

효소 반응은 25 mmol의 포타슘 클로라이드, 25 mmol의 마그네슘 클로라이드, 10mmol DTT 및 50 μmol의 징크 클로라이드를 함유한 50 ㎕의 50 mM 소디움 히피스 완충용액에서 수행하였으며, 1.5 μmol의 Ras 기질 단백질, 0.15 μmol의 트리튬-파네실 피로 포스페이트와 4.5 nmol의 파네실 전이효소가 사용되었다.

상세히 기술하면 파네실 전이효소를 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응을 지속시킨 후 1 M의 염산을 함유한 에탄올 용액(1 ㎖)를 첨가하여 반응을 중지시키고, 생성된 침전물을 필터바인딩을 위한 호퍼 하베스터(호퍼 #FH 225V)를 사용하여 GF/B 필터에 흡착시킨 후, 에탄올을 사용하여 세척하고, 건조시킨 필터를 LKB 베타 카운터를 사용, 방사능을 측정함으로 수행하였다. 효소 역가검정은 Ras 기질 단백질과 파네실 효소의 농도가 정량적 역가를 나타내는 기질 불포화 상태에서 측정되었으며, 합성된 화합물은 디메틸 설폭사이드(DMSO) 용매에 용해하여 전체 반응액의 5% 이내에서 첨가하여 효소 저해능을 평가하였다. 효소 저해능은 시료가 없는 상태에서 Ras 기질 단백질에 도입된 파네실에 대해 시료 존재하에서 측정된 파네실 도입량을 백분율로 표시하였으며, 50%의 효소활성을 저해하는 농도를 각 시료의 IC₅₀으로 결정하였다. 시료의 선택적 저해능을 평가하기 위한 제라닐제라닐 전이효소는, 샤버 등(Schaberet al.,J. Biol chem.,1990,265, 14701)의 방법을 변형하여 소뇌로부터 정제하여 사용하였으며, 파네실 전이효소 반응과 유사 조건에서 제라닐제라닐 전이 효소의 특이 기질인 제라닐제라닐 피로 포스페이트와 Ras-CVIL 기질 단백질을 사용하여 실험을 수행하였다.

실험예 2 세포내 Ras 파네실 전이효소의 억제효능 분석

본 실험에서는 돌연 변이에 의해 형질 전환 활성을 갖는 C-Harvey-Ras 단백질을 발현하는 Rat2 세포주와 K-Ras의 카복시 말단의 다염기성 라이신 도메인으로 치환한 H-Ras와 결합 단백질로 형질전환된 Rat2 세포주(특허출원 제97-14409호)를 사용하였으며, 실험 방법은 드크루 등 (Declue. J. E.et al.,Cancer Research,1991,51, 712)에 의해 보고된 방법을 변형하여 수행하였다. 하기에 실험을 상세히 기술하기로 한다.

형질 전환된 Rat2 피브로 블라스트 세포주를 60mm 세포 배양 디쉬에 3×10⁵세포를 분주하여 37℃ 세포 배양기에서 48시간 동안 배양하여 50% 이상 밀도로 자란후 시료를 처리한다. 이때 시료용매는 디메칠설폭사이드(DMSO)를 사용하였으며, 대조군 및 시험군 모두 1% 디메틸설폭사이드 농도를 사용하렸다. 시료를 처리한 뒤 4시간 후에 배지 1 ㎖ 당 150 μCi의 방사성 동위원소(³⁵S)로 표지된 메치오닌을 첨가하고 20시간 배양한 후 생리 식염수로 세포를 세척하였다. 세포 용해를 위해 1 ㎖의 차가운 세포 용해 완충 용액 (5 mmol의 마그네슘 클로라이드, 1 mmol의 DTT, 1% NP 40, 1 mmol의 EDTA, 1 mmol의 PMSF, 2 μmol의 루펩틴, 2 μmol의 펩스타틴에이 및 2 μmol의 안티페인을 포함하는 50 mM의 소디움 히피스 완충용액)을 사용하여, 세포가 용해된 상등액을 고속원심분리(12,000 g×5분)하여 얻었다. 상등액의 방사성 동이원소 표지량을 측정하여 면역 침전 반응시 정량적 결과를 얻을수 있도록 표준화한 후 Ras 단백질에 특이적 결합을 하는 단일클론 항체인 Y13-259 (Furth, M. E.et al.,J. Virol,1982,43, 294]를 넣어 4℃ 에서 15시간 반응시켰다. 이 용액에 다시 고트에서 유래된 쥐의 면역글로블린에 대한 항체가 결합된 프로테인 A(Protein A)-아가로즈 현탁액을 넣어 1시간 동안 4℃에서 반응시킨 후 면역 반응 침전물을 비특이적 결합물을 제거하기 위해 완충용액(50 mmol의 소디움 클로라이드, 0.5% 소디움디옥시콜레이트, 0.5% NP 40 및 0.1% SDS를 포함하는 50 mM 트리스 클로라이드 완충욕액)으로 세척한다. 침전물의 분석을 위해 전기영동 방법을 사용하며, 침전물을 전기영동 시료 완충액에 끓인 후 13.5퍼센트의 SDS 폴리아크릴아마이드젤을 사용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 젤을 고정하고 건조시킨 다음 X-ray 필름에 감광시킨 후 현상 인화하였다. 실험결과로부터 세포내 Ras 파네실 전이효소의 억제 효능은 Ras 단백질의 파네실이 결합된 밴드와 결합되지 않은 밴드의 강도를 측정하여 50%의 파네실 결합이 저해된 시료농도를 CIC₅₀로 결정하였다.

하기 표 1은 대표적인 화합물들의 억제 효능을 요약한 것이다.

실시예 번호	H-Ras IC50(μM)	H-Ras CIC50(μM)	K-Ras IC50(μM)	K-Ras CIC50(μM)
1	0.01∼0.1	2	0.01∼1	1∼30
2	0.001∼0.01	1	0.01∼1	1∼30
3	0.001∼0.01	1	0.001∼0.1	1∼30
4	0.001∼0.01	1	0.01∼1	1∼30
5	0.01∼0.1	2	0.01∼1	1∼30
6	0.01∼0.1	2	0.01∼1	1∼30

기존의 파네실 전이효소 억제제가 H-Ras 또는 N-Ras 에 의해 형질전환된 세포의 성장을 저해하는 효력보다는 K-Ras 활성화에 의해 형질전환된 세포의 성장을 저해하는 효력이 떨어지는데 비하여, 본 발명의 화합물은 H-Ras 및 N-Ras 기질의 파네실화를 저해할 뿐만 아니라 K-Ras 의 활성도 효과적으로 저해함으로써 Ras 단백질의 작용을 억제하는 화합물이다.

즉, 본 발명의 화합물은 우수한 파네실 전이효소 억제능을 가짐으로써 항암제로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (9)

1. 하기 화학식 1로 표현되는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물.

   화학식 1

   상기 화학식 1에서

   1) A 는 수소 및 저급알킬 중에서 선택되거나 하기 화학식 2로 표현된다.

   화학식 2

   화학식 2에서 R₁은 할로겐, CN, NO₂, N₃, COOH, 아미드, 티오아미드, 페녹시, 페닐, 저급 알킬 및 질소, 황 또는 산소를 포함하는 5환 또는 6환의 헤테로고리 화합물 중에서 선택된다. X 는 방향족 및 질소, 황 또는 산소를 포함하는 5환 또는 6환의 헤테로고리 화합물 중에서 선택된다.

   2) B 는 산소 (-O-) 및 황 (-S-) 중에서 선택되어지거나 하기 화학식 3으로 표현된다.

   화학식 3

   화학식 3에서 R₂는 수소, 저급 알킬, 히드록시, 저급 알콕시 및 방향족이 치환된 저급 알킬 중에서 선택된다.

   3) R 은 히드록시, 저급 알콕시를 나타내거나 3환 방향족 유도체 또는 화학식 4 및 화학식 5 로 표현되는 치환기 중에서 선택된다.

   화학식 4

   화학식 5

   상기 화학식 4에서 R₃및 R₄는 각각 수소, 저급 알킬, 할로겐, 히드록시, CN, NO₂, NH₂, COOH, 아미드, 티오아미드, 저급 알콕시, 페녹시, 방향족, 및 방향족이 치환된 저급 알킬 중에서 선택되어지며, R₅는 수소, 저급 알킬, 방향족, 방향족이 치환된 저급 알킬 및 5환 또는 6환의 헤테로고리 화합물 중에서 선택되어진다.

   상기 화학식 5에서 E 는 산소 (-O-) 및 황 (-S-) 중에서 선택되고, F 는 3환 방향족 유도체 또는 화학식 4 로 표현되는 2환 방향족 중에서 선택되어진다.

   4) n 은 0 내지 2 중에서 선택된다.
2. 제 1항에 있어서,

   4-{5-[히드록시(4-나프탈렌-1-일페닐)메틸]이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴,

   4-[5-(4-나프탈렌-1-일벤질)이미다졸-1-일메틸]벤조니트릴,

   4-(4-나프탈렌-1-일벤질)이미다졸,

   4-{5-[2-(4-나프탈렌-1-일페닐)에틸]이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴,

   4-[5-(4-나프탈렌-1-일페녹시메틸)이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴 또는

   4-{5-[히드록시-3-(나프탈렌-1-일옥시)페닐메틸]이미다졸-1-일메틸}벤조니트릴인 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 용매화물.
3. 1) p-디브로모벤젠과 나프탈렌보론산을 스즈끼 커플링 (Suzuki coupling)하는 단계 (제 1단계) 및

   2) 상기 제 1단계에서 얻은 화합물에 그리냐르 반응 (Grignard reaction)을 수행하여 적절한 치환기 (화학식 1의 A)를 가지는 이미다졸 화합물을 도입하는 단계 (제 2단계)

   로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제 1항의 화합물의 제조방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 제조방법에 더하여 제 2단계에서 얻은 화합물을 환원 반응시키는 단계 (제 3단계)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1항의 화합물의 제조방법.
5. 1) p-브로모벤질브로마이드를 염화반응시키는 단계 (제 1단계);

   2) 상기 제 1단계에서 얻은 화합물을 위티그 반응 (Wittig reaction)시켜 적절한 치환기 (화학식 1의 A)를 가지는 이미다졸 화합물을 도입하는 단계 (제 2단계);

   3) 상기 제 2단계에서 얻은 화합물을 스즈끼 커플링시켜 적절한 2원환 또는 3원환의 화합물을 도입시키는 단계 (제 3단계) 및

   4) 상기 제 3단계에서 얻은 화합물을 환원반응시키는 단계 (제 4단계)

   로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제 1항의 화합물의 제조방법.
6. 1) 적절한 치환기 (A)를 가지는 히드록시 이미다졸 화합물과 브로모페놀을 미쯔노브 반응 (Mitsunob reaction)시키는 단계 (제 1단계) 및

   2) 상기 제 1단계에서 얻은 화합물을 스즈끼 커플링시켜 적절한 2원환 또는 3원환의 화합물을 도입시키는 단계 (제 2단계)

   로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제 1항의 화합물의 제조방법.
7. 1) p-브로모플루오르벤젠과 1-나프톨을 치환반응시키는 단계 (제 1단계) 및

   2) 상기 제 1단계에서 얻은 화합물에 그리냐르 반응을 수행하여 적절한 치환기를 가지는 이미다졸 화합물을 도입하는 단계 (제 2단계)

   로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제 1항의 화합물의 제조방법.
8. 파네실 전이효소 저해제용 제 1항의 화합물.
9. 제 1항의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약제학적 조성물.