KR102696955B1 - 무혈청 배지에서 부유배양이 가능한 신규한 Vero 세포주, 이의 제조 방법 및 상기 신규 세포주를 이용한 백신용 바이러스 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 WHO에서 분양받은 Vero (African Green Monkey Kidney Cell Line) 세포로부터 유도되고, 혈청성분 없이 부유 배양이 가능한 Vero 세포주, 세포주 sVERO 7C2 에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 Vero 세포를 성장시키는 배양 방법 및 상기 Vero 세포를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 무혈청 배지에서 부유배양이 가능한 Vero 유래 신규 세포주, 이의 제조 방법 및 상기 부유배양 세포를 이용하여 바이러스를 증식시키는 방법에 관한 것이다.
다양한 종류의 백신들의 상용화와 함께, 백신을 제조하는 방법 또한 다양하게 발전해왔다. 백신 제조의 전통적인 방법으로는, 대표적으로 유정란을 이용한 독감백신 생산을 예로 들 수 있다. 유정란을 사용하여 백신을 생산하는 경우, 유정란의 안정적인 공급의 어렵고 이에 따라 백신 생산량을 조정해야 하는 한계를 가진다. 또한 제품 생산에 적합한 닭을 무균 시설에서 사육해야 하며, 이를 위한 제반 시설 마련에 따른 비용증가 문제와 계란 단백질 유래성분 정제의 어려움으로 난단백 알러지를 가지고 있는 사람은 접종 받을 수 없다는 단점을 가지고 있다.
유정란을 이용한 백신 생산의 문제점을 극복하기 위한 방법으로 세포배양을 이용하여 백신을 제조하는 방법이 있다. 무한증식이 가능한 동물세포를 대량 배양한 후 바이러스를 접종하여 백신을 생산하기 때문에 단기간 대량생산을 통한 공급이 가능할 뿐 아니라 난단백 알러지를 가진 사람들도 접종이 가능한 장점을 가지고 있다.
이러한 동물세포는 일반적으로 부착형 세포로서 배양 시 소 태아 혈청(FBS)이 사용되는데, 이 경우 알 수 없는 동물유래 인자가 제품에 포함 될 가능성이 있으며 제품간 품질의 차이가 날 수 있다. 또한 소 태아 혈청은 고가이면서 프리온, 바이러스, 마이코플라스마와 같은 감염성 단백질에 의한 감염 위험성이 있어 제품 제조비용 증가와 안전성이 보장되지 않는 단점을 가지고 있다. 그러므로 백신의 생산에 있어서는 동물유래 혈청뿐만 아니라 동물유래 첨가물을 사용하지 않는 것이 바람직하다.
반면에, 세포배양의 또 다른 방식으로 세포를 부유 상태로 배양하는 방법은 부착형 세포배양 방식에 비해서 대량배양의 용이성, 계대 과정의 단순화, 인력의 감소, 공간활용성 등의 여러 장점이 있다. 이러한 이유로 무혈청의 부유세포 개발 및 이를 이용한 바이러스 증식에 대한 연구가 많이 이루어지는 추세이다.
Vero 세포주는 로타, 폴리오, 인플루엔자, 일본뇌염, 댕기열 바이러스 등 여러 바이러스에 대한 감수성이 높아 다양한 바이러스가 증식할 수 있는 확립 세포주이다. 그러나 Vero 세포주는 표면에 대한 부착성이 매우 강하기 때문에 대량 배양을 위해서는 매우 넓은 면적의 배양 용기나 담체(micro-carrier)가 필요하고 이로 인하여 백신 제조 과정에서 많은 비용이 발생한다. 또한 담체에 부착된 세포를 제거하는 단계가 필요한데, 이때 동물유래 트립신을 사용하게 되며 이로 인해 동물유래 성분의 사용과 함께 세포의 손실 및 손상 가능성이 있다.
이에 안전하고 효율적인 동물세포 배양을 통하여 백신을 제조하기 위해서 무혈청 배지에서 부유배양이 가능한 Vero 세포주가 필요했고, 본 발명자들은 무혈청 부유배양이 가능한 Vero 세포주를 연구하여 특허(한국 등록특허 제10-1831284호)를 등록하였다.
다만, 기 등록된 특허(한국 등록특허 제10-1831284호)의 부유 Vero 세포주인 Vero sky 7458은 세포증식 및 바이러스 감염능에서 일부 제한적인 효과를 보였다.
본 연구에서는 신규 세포 개발 과정에 있어서, 그 기능이 우수한 세포를 선별하는 과정을 통하여 기 등록 특허 세포주(Vero sky 7458) 대비 우수한 세포 증식, 세포 형태 및 바이러스 증식능을 가진 신규 부유 Vero 세포주를 확립하고자 하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 혈청의 사용 및 부착배양으로 발생하는 오염 또는 배양 시 효율성 문제를 해결하기 위하여 무혈청 배양 및 부유배양이 가능하며 백신용 바이러스 증식에 사용될 수 있는 Vero 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 기 등록된 특허 세포주(Vero sky 7458) 대비 세포 증식 또는 바이러스 증식 능력에서 우수한 효과의 세포주를 제공함으로써 보다 효율적인 바이러스 증식 및 백신 생산 방법을 제시하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 WHO에서 분양받은 Vero (African Green Monkey Kidney Cell Line) 세포로부터 유래된, 무혈청 배지에서 부유배양 될 수 있는 세포주로서, 기 등록 특허 세포주인 Vero sky 7458에 비해서 성장속도가 70~100%이상 향상되고 바이러스 감염능이 우수한 신규 부유 Vero 세포주(한국세포주연구재단 기탁번호: KCLRF-BP-00470)를 제공한다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
1) 부착형 Vero 세포주를 무혈청 배지에 적응시키는 단계;
2) 우수한 성장을 특징으로 하는 세포를 선별하는 단계;
3) 선별된 세포를 무혈청 배지에 부유배양 시키는 단계; 및
4) 상기 부유세포 중 세포 응집력이 낮고 증식능이 우수한 세포를 선별하고 지속적으로 계대 배양하는 단계를 포함하는 상기 신규 부유 Vero 세포주를 제조하는 방법을 제공한다.
아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 또 다른 측면은
1) 상기 본 발명의 신규 부유 Vero 세포주에 바이러스를 감염시키는 단계;
2) 상기 바이러스에 감염된 세포를 부유배양 하는 단계; 및
3) 세포의 배양물에서 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 백신의 제조 방법을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
1) 상기 신규 부유 Vero 세포주의 종양형성능을 확인하는 단계;
2) 상기 신규 부유 Vero 세포주의 유래를 확인하는 단계; 및
3) 상기 신규 부유 Vero 세포주의 장기 안정성을 확인하는 단계를 포함하는 신규 발명 세포주의 특성에 대한 결과를 제공한다.
본 발명은 무혈청 배양 및 부유배양이 가능하며 Vero sky 7458 세포주에 비해서 성장속도가 빠를 뿐 아니라, 바이러스 증식에 효율적으로 사용될 수 있는 신규 sVERO 7C2 세포주를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 세포주를 이용하여 바이러스 또는 백신을 생산하는데 유용하게 이용될 수 있다.
본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 125mL 스피너 플라스크에서 Vero sky 7458 및 본 발명의 신규 sVERO 7C2 세포주의 세포 증식을 나타낸 그래프이다.
도 2는 5L 생물반응기(bioreactor)에서 Vero sky 7458 및 본 발명의 신규 sVERO 7C2 세포주의 세포 증식을 나타낸 그래프이다
도 3는 Vero sky 7458 및 본 발명의 신규 sVERO 7C2 세포주 각각의 세포 모양을 촬영한 이미지이다.
도 4 및 5는 본 발명의 신규 sVERO 7C2 세포주의 장기 안정성을 확인하기 위한 세포증식패턴 및 세포대사산물의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 6 및 7은 Vero sky 7458 및 본 발명의 신규 sVERO 7C2 세포주에서의 바이러스 접종에 따른 바이러스 역가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 1은 125mL 스피너 플라스크에서 Vero sky 7458 및 본 발명의 신규 sVERO 7C2 세포주의 세포 증식을 나타낸 그래프이다.
도 2는 5L 생물반응기(bioreactor)에서 Vero sky 7458 및 본 발명의 신규 sVERO 7C2 세포주의 세포 증식을 나타낸 그래프이다
도 3는 Vero sky 7458 및 본 발명의 신규 sVERO 7C2 세포주 각각의 세포 모양을 촬영한 이미지이다.
도 4 및 5는 본 발명의 신규 sVERO 7C2 세포주의 장기 안정성을 확인하기 위한 세포증식패턴 및 세포대사산물의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 6 및 7은 Vero sky 7458 및 본 발명의 신규 sVERO 7C2 세포주에서의 바이러스 접종에 따른 바이러스 역가 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명의 신규 sVERO 7C2세포주는 WHO에서 분양 받은 Vero (African Green Monkey Kidney Cell Line) 세포로부터 유도되고, 세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며, 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유배양될 수 있다.
본 발명에 있어, 용어 "무혈청 배지"는 혈청이 실질적으로 첨가되지 않은, 본 발명에 따른 확립세포주가 배양될 수 있는 배지를 의미하며, 용어 "실질적으로 첨가되지 않은"은 혈청을 0.5 (v/v)% 이하 포함하는 것을 의미하며, 바람직하게는 0.1 (v/v)% 이하, 더욱 바람직하게는 0.01 (v/v)% 이하, 가장 바람직하게는 전혀 포함되지 않는 것을 의미한다.
상기 무혈청 배지는 Sky FM03(Lonza), SFM4CHO(Hyclone), ProVero1(Lonza), EX-CELL VERO(Sigma) 및 VP-SFM(Gibco)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 아니하며, 동물세포 배양 시 사용될 수 있는 무혈청 배지라면 제한 없이 본 발명에 적용할 수 있다.
상기 본 발명의 신규 sVERO 7C2 세포주는 Vero sky 7458 세포주에 비해서 70% 또는 100% 이상 향상된 세포 성장을 나타내는 것이 바람직하다. 이는 세포의 증식이 상대적으로 빠르고 세포 응집이 낮은 세포를 선택적으로 선별하는 일련의 단계를 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 세포 성장이 향상될수록 바이러스의 감염 대상 세포수가 많아져 바이러스나 백신을 대용량으로 생산하는데 유익하다.
뿐만 아니라, 무혈청 배지에서 부유배양이 가능한 본 발명의 sVERO 7C2 세포주는 Vero sky 7458 대비 높은 바이러스 역가를 나타내므로, 바이러스 생산능이 더욱 우수하다. 또한 종양원성시험(Test for tumorigenicity), 핵형분석(Karyotype analysis) 및 PCR을 이용한 종판별 시험(Species verification test) 결과는 본 발명의 신규 세포주가 높은 계대수(Passage No. 220)에서도 종양형성능이 없으며, 원숭이 세포로부터 유도된 것임을 확인함으로써 백신용 바이러스 생산에 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.
아울러, 상기 본 발명자들은 상기 Vero 세포로부터 신규 확립된 무혈청 및 부유배양이 가능한 세포주를 "sVERO 7C2"로 명명하여 2019년 9월 9일 한국세포주연구재단(KCLRF)에 기탁번호 KCLRF-BP-00470로 기탁하였다.
본 발명의 일 측면은 무혈청 부유배양이 가능한 신규 sVERO 7C2 세포주를 제공한다. 예들 들어 (a) 부착성 Vero(WHO) 세포를 해동한 후 혈청배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 단계 a)에서 수득한 세포를 혈청의 함량을 낮춰가면서 배양시켜 최종적으로 무혈청의 배지에서 배양하는 단계; (c) 상기 단계 b)에서 수득한 세포 중 세포 증식이 빠른 개체를 선별하는 단계; (d) 상기 단계 c)에서 수득한 세포를 40 내지 90 rpm으로 교반하는 방식으로 부유배양에 적응시키는 단계; (e) 상기 단계 d)에서 수득한 부유배양에 적응된 세포 중 세포 응집력이 낮고 증식능이 우수한 개체를 선별하는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 sVERO 7C2 세포주의 제조 방법을 구체적으로 설명한다.
단계 (a)
단계 (a)에서는, Vero(WHO) 세포를 해동시킨 후, 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 상기 후보 배지 군에서 37C 및 5% CO2 환경 하에서 배양한다.
단계 (b)
단계 (b)에서는, 단계 (a)에서 수득한 세포를 3-4일 후에 0.25% 트립신 EDTA를 이용하여 플라스크 바닥에서 현탁하여 수득한 후, 혈청의 함량을 낮춰가면서 부착상태로 계대 배양할 수 있다. 세포 배가시간이 48시간 이하일 때 혈청 비율을 낮추어 최종적으로 무혈청 배지로 교체한다.
단계 (c)
단계 (c)에서는, 단계 (b)에서 수득한 세포를 대상으로 single cell cloning을 수행하여 세포를 선별한다. 96-well plate에 1 cell/well의 농도로 세포를 접종하여 세포 증식 양상을 관찰한다. 구체적으로, 이는 무혈청 배지에 적응되어 배양이 가능한 세포 중 증식능이 우수한 하나의 세포를 선별하여 단일 세포에서 유래한 동종의(homogeneous) 세포주를 확보함으로써 추후 일관된 세포 증식능 또는 바이러스 감염능을 확보하기 위함이다. 본 발명에서는 상기 single cell cloning을 Vero(WHO) 세포의 무혈청 적응단계 (c)와 부유배양 적응단계 (e)에서 각각 수행하여, 총 2 round의 세포선별 과정을 거치며 신규 개발 세포의 homogeneity를 확보한다. 이는 기존의 부유배양이 가능한 Vero세포 선행 연구결과들과는 차별성을 가진다.
예컨데, 단일세포를 96-well plate에 접종하여 배양하는 것은 쉽지 않은데, 단일세포가 배양용기에 부착하더라도 세포가 증식 하기까지 4주 이상 오랜 기간이 필요하거나 또는 쉽게 성장하지 못하고 퇴화되기도 한다. 따라서 이를 극복하기 위해 상기 부유배양배지를 이용하여 single cell cloning을 수행하기에 적합한 배지를 제조하여 단일 세포를 배양한다. 이 과정을 거쳐 상대적으로 세포증식이 빠른 단일 개체를 선별한다.
단계 (d)
단계 (d)에서는, 상기 단계 (c)에서 수득한 세포를 스피너 플라스크에서 40 내지 90 rpm으로 교반하는 방식으로 부유배양에 적응 시킨다. 구체적으로, 단계 (c)의 세포를 1.0×105 내지 9.0×105 cells/mL의 접종농도, 바람직하게는 5.0×105 cells/mL의 접종 농도로 상기 무혈청 부유배양 배지에 접종한다. 40 내지 90rpm의 교반속도, 바람직하게는 60rpm의 교반속도, 약 6.5~7.5의 pH의 배양 조건을 유지하면서 상기 세포를 3-4일 간격으로 계대 배양하는 방식으로 부유배양에 적응 시킨다.
단계 (e)
단계 (e)에서는, 상기 단계 (d)에서 수득한 세포를 단계 (c)와 같이 single cell cloning을 수행하여 세포 응집력이 낮고 증식능이 우수한 개체를 선별하는 과정을 거친다. 이때, 배양 용기는 일반적인 부착 배양 용기가 아닌 Ultra-low attachment 96-well plate를 사용하여 부유 상태로 세포가 증식할 수 있게 유도한다. 두 번의 단일 세포를 선별하는 과정을 거쳐 선행 문헌의 부유 Vero에 비해 우수한 성능을 보이는 부유 Vero 세포주를 확립할 수 있고, 이를 "sVERO 7C2"로 명명한다. 또한 sVERO 7C2를 스피너 플라스크에서 지속적으로 계대 배양하며 세포주의 장기 안정성과 세포증식패턴을 확인하고, 종양원성시험 등의 특성분석을 수행한다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 sVERO 7C2 세포주를 이용하여 백신용 바이러스를 증식시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 sVERO 7C2 세포주를 이용하여 증식될 수 있는 바이러스는, 예를 들어, 황열바이러스, 지카바이러스, 로타 바이러스, 뎅기 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역바이러스, 일본뇌염바이러스, 이하선염바이러스, 풍진바이러스, 폴리오바이러스, HSV-1, HSV-2, 광견병바이러스, RS바이러스, 레오바이러스 3형, 파보바이러스, 콕사키바이러스, 아데노바이러스 1형 내지 47형, 라사바이러스, 수포성구내염바이러스 및 백시니아바이러스 등이 있으며, 본 발명에 따른 세포주는 이러한 바이러스들 중 황열바이러스 및 지카바이러스의 생산에 더욱 적합하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 무혈청 부유배양 Vero 세포주의 제조
1.1 부착성 Vero 세포 해동
동결보존된 부착성 Vero(WHO)를 해동하여 T-75 플라스크 내 10% 혈청을 포함한 EMEM 배지에서 37C, 5% CO2 조건 하에 배양하였다.
1.2 무혈청 적응 세포주 선별
상기 1.1에서 수득한 세포를 3~4일 간격으로 계대 배양 하였다. 계대를 수행할 때 마다 세포 수를 확인하여 세포 배가시간이 48시간 이하이면 배지 내의 혈청 비율을 줄여서 배양하였다. 배지 내의 혈청 비율은 10%, 5%, 2%, 1%로 낮춰주었으며 최종적으로 무혈청 배양이 가능 할 때까지 계대 배양을 반복하였다. 상기 무혈청 적응 세포에 대하여 96-well plate에 single cell cloning을 수행하였다. 주 1회 배지를 교환해주었고, 약 3~4주간 배양하며 현미경 관찰을 통해 세포증식이 상대적으로 빠른 군을 선별하였다. 상기 세포증식이 빠른 세포 군을 T-플라스크로 확장하여 배양하였다.
1.3 부유배양 적응 세포주 선별
상기 1.2에서 수득한 세포를 충분히 확장하여 스피너 플라스크로 옮겨 부유배양을 수행하였다. 교반속도는 60rpm이고 배양 온도 37℃, 5% CO2 조건에서 세포를 배양하였다. 배양 배지의 pH가 낮아지거나 세포가 일정 수준이상으로 자란 경우 배지교환을 해주거나 계대 배양을 해주었다. 2 개월의 부유 배양 적응을 거친 후 세포 농도가 약 1.5×106 cells/mL 수준이 되었다. 세포의 생존율은 90% 이상임을 확인하였다. 상기 부유배양 적응 세포 중 세포증식속도가 빠르고 세포 응집력이 낮은 단일세포를 확보하기 위하여 Ultra-low attachment 96-well plate에 single cell cloning을 수행하였다. 약 3~4주간 배양하며 현미경 관찰을 통해 세포증식이 상대적으로 빠른 군을 선별하였다. 상기 세포를 Ultra-low attachment T-플라스크로 확장하여 증식속도가 가장 빠른 하나의 군을 선택하였고, 이를 "sVERO 7C2"로 명명한다.
<실시예 2> 세포주의 증식능 및 특성분석
2.1 신규 세포주 증식능 평가
상기 sVERO 7C2 세포주를 스피너 플라스크 또는 5L 생물반응기에서 부유배양하여 그 증식능을 평가하였다. 대조군으로 Vero sky 7458 세포주를 사용하였다.
부유배양 시 개시 세포 농도는 5.0×105 cells/mL로 하고 스피너 플라스크의 경우 3일 내지 4일 경과 후 세포를 회수하여 1200rpm, 5분간 원심분리하고 5.0×105 cells/mL 로 계대 배양 한다.
본 발명에서 만들어진 sVERO 7C2 세포주는 Vero sky 7458 세포주와 비교했을 때 스피너 플라스크에서 약 1.7배, 생물반응기에서 약 2배 수준의 세포 증식율을 보였다.
2.2 신규 세포주의 장기 계대 안정성
상기 sVERO 7C2 세포주를 4 개월간 스피너 플라스크에서 계대 배양하며 세포 증식, 세포 생존율 및 세포대사산물을 분석함으로써 장기 계대에 대한 안정성을 확인하였다. 본 발명의 세포주는 4 개월 간의 배양 기간 동안 동등한 수준의 세포 증식률을 보였고 90%이상의 세포 생존율을 확인할 수 있었다. 더불어 유사한 패턴의 세포대사산물 농도를 확인할 수 있었다.
2.3 신규 세포주의 특성분석
상기 본 발명의 신규 sVERO 7C2 세포주에 대하여 종양원성 시험을 수행하였다. 유럽약전의 종양원성평가 가이드라인에 근거하여 비임상평가센터인 ㈜큐베스트바이오에서 시험을 수행하였고 임상병리 결과, 본 발명의 세포주는 높은 계대수(Passage No.220)에서도 종양형성능이 없음을 확인하였다.
뿐만 아니라, 핵형분석(Karyotype analysis) 및 종판별시험(PCR)을 수행하여 본 발명의 세포주가 원숭이 유래 세포임을 확인하였다.
아울러, 무균 및 마이코플라스마 부정시험을 수행함으로써 균에 오염되어 있지 않음을 확인 하였다.
<실시예 3> 바이러스 증식능 비교
본 발명의 신규 sVERO 7C2 세포주를 이용하여 부유배양 조건에서 바이러스를 증식시켰다. 대조군으로는 Vero sky 7458을 사용하여 바이러스 증식능을 비교하였다. 본 실험에 사용된 바이러스는 황열바이러스 및 지카바이러스였으며, 배양 조건은 하기와 같다.
세포 농도: 5.0×105 cells/mL
배양 규모: 125mL spinner flask
교반속도: 60 rpm
배양 조건: 37℃, 5% CO2, 습윤
배양 기간: 4일(황열바이러스), 6일(지카바이러스)
두 세포주간의 바이러스 증식능 비교를 위하여 동일한 개시 세포 농도 및 바이러스 접종농도로 바이러스 감염능 시험을 수행하였다. 접종 후 세포변성효과(cytopathic effect, CPE) 및 세포 생존율을 확인하면서 바이러스를 배양하였다. 황열바이러스는 4일간, 지카바이러스는 6일간 배양하였으며 배양 상층액을 회수하여 바이러스 역가(titer)를 측정하였다. 상기 두 바이러스의 역가 측정은 plaque assay를 수행하여 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 신규 세포주에서 증식된 바이러스 역가가 대조군으로 사용된 Vero sky 7458의 바이러스 역가보다 우수함을 보였다. 더욱이 sVERO 7C2는 Vero sky 7458 보다 세포증식능이 우수하기 때문에 바이러스 감염 시 감염대상 세포수가 많으므로 보다 효율적으로 대용량의 바이러스 제조가 가능함을 확인하였다.
Claims (9)
- 기탁번호 KCLRF-BP-00470의 베로(Vero) 세포주 sVERO 7C2.
- 제1항에 있어서, 상기 세포주는 WHO에서 분양받은 베로(Vero) 세포로부터 유도되고, 세포성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능한 것을 특징으로 하는 베로(Vero) 세포주 sVERO 7C2.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포주가 바이러스를 증식시키는 것을 특징으로 하는, 베로(Vero) 세포주 sVERO 7C2.
- 제1항 또는 제2항의 세포주를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 바이러스는 황열바이러스, 지카바이러스, 로타 바이러스, 뎅기 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역바이러스, 일본뇌염바이러스, 이하선염바이러스, 풍진바이러스, 폴리오바이러스, HSV-1, HSV-2, 광견병바이러스, RS바이러스, 레오바이러스 3형, 파보바이러스, 콕사키바이러스, 아데노바이러스 1형 내지 47형, 라사바이러스, 수포성구내염바이러스 및 백시니아바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 바이러스는 황열 또는 지카바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) WHO에서 분양받은 베로(Vero) 세포를 준비하는 단계;
(b) 상기 베로(Vero) 세포를 무혈청 배지에서 생장하도록 적응시키는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 선별한 부착성의 베로(Vero) 세포를 부착을 위한 담체 없이 부유상태에서 생장이 가능하도록 적응 시키는 단계
를 포함하는, 세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며, 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능한 청구항 1의 베로(Vero) 세포주 sVERO 7C2를 제조하는 방법. - (a) 제1항 또는 제2항의 베로(Vero) 세포주 sVERO 7C2를 이용하여 1×105 내지 9×105 cells/mL의 접종 농도로 무혈청 세포 배양 배지에 접종하는 단계;
(b) 40 내지 90 rpm의 교반 속도, 6.5-7.5의 pH 배양 조건을 유지 하면서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 스피너 플라스크에서 상기 Vero 세포를 5.0×105 내지 4.7×106개 수준 cells/mL의 세포 밀도로 증식시키는 단계;
(c) 상기 증식된 베로(Vero) 세포를 황열 또는 지카바이러스로 감염시키는 단계;
(d) 상기 감염된 증식 베로(Vero) 세포를 배양하는 단계; 및
(e) 세포 배양 조성물로부터 황열 또는 지카바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신용 바이러스를 생산하는 방법. - 제7항에 있어서, 상기 단계 (b) 동안에는 세포 배양물에 신선한 배지의 추가 또는 배지를 일부 제거하여 신선한 배지로 대체하는 것을 특징으로 하는 방법.
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2020
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