KR102655989B1 - 인간 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 51에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 엑손 스키핑을 유도하기 위하여 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 결합하는 치료용 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 DMD의 치료를 위한 이의 컨쥬게이트 및 조성물에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 7월 21일에 출원된 GB 1711809.2에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 엑손 스키핑(exon skipping)을 유도하기 위하여 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 결합하는 치료용 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 이의 컨쥬게이트(conjugate) 및 조성물에 관한 것이다. 발명은 추가로 근육 장애, 특히 듀시엔형 근이영양증(Duchenne Muscular Dystrophy)의 치료를 위한 방법 및 이를 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.
선택적 스플라이싱(alternative splicing)의 중단(disruption)은 많은 질환의 기저에 있으며, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 스플라이싱을 조절하는 것은 치료적 의미를 가질 수 있다. 스플라이스-스위칭 안티센스 올리고뉴클레오타이드(splice-switching antisense oligonucleotide, SSO)는 신경근육 질환에 대한 새로운 치료법으로, 현재 몇몇의 SSO가 척수성 근위축증(spinal muscular atrophy, SMA) 및 듀시엔형 근이영양증(DMD)과 같은 상태에 대해 임상 실험을 진행중에 있고, 여기에서 안티센스-매개성 엑손 스키핑은 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 복원하고, 비기능성 단백질 대신 부분적으로 또는 전체적으로 기능성인 단백질의 합성을 가능하게할 수 있다.
듀시엔형 근이영양증(DMD)은 전세계의 소년들에서 가장 흔한 치명적인 유전적 장애 중 하나로, 출생한 남아 3,600 내지 9,337명 중 대략 1명의 발생률을 가진다. DMD는 디스트로핀(DMD) 유전자의 돌연변이로 인한 디스트로핀 단백질의 부재에 의해 유발된다. 이 단백질을 암호화하는 유전자는 2백만 개 이상의 DNA의 뉴클레오타이드에 걸쳐 퍼져 있는 79개의 엑손을 함유한다. 엑손의 리딩 프레임을 변화시키거나, 또는 정지 코돈을 도입하거나, 또는 아웃 오브 프레임(out of frame) 엑손 또는 엑손들 전체 또는 하나 이상의 엑손의 중복(duplication)의 제거를 특징으로 하는 임의의 엑손성 돌연변이(exonic mutation)는 기능성 디스트로핀의 생성을 방해하여 DMD를 초래할 가능성이 있다. 덜 심각한 형태의 근이영양증인 베커형 근이영양증(Becker muscular dystrophy, BMD)은 돌연변이, 전형적으로 하나 이상의 엑손의 결실이 전체 디스트로핀 전사체(transcript)를 따라 정확한 리딩 프레임을 생성하여 mRNA의 단백질로의 번역이 조기에 종결되지 않는 경우에 발생하는 것으로 밝혀졌다. 돌연변이된 디스트로핀 전-mRNA의 프로세싱에서 상류 및 하류 엑손의 결합이 유전자의 정확한 리딩 프레임을 유지하는 경우, 결과는 일부 활성을 유지하는 짧은 내부 결실을 갖는 단백질을 코딩하는 mRNA가 베커 표현형을 초래한다. 디스트로핀 단백질의 리딩 프레임을 변경시키지 않는 엑손 또는 엑손들의 결실은 BMD 표현형을 발생시키는 반면, 프레임 이동(frame-shift)을 유발하는 엑손 결실은 DMD를 발생시킬 것이다(Monaco, Bertelson et al. 1988). 일반적으로, 리딩 프레임을 변화시켜 적절한 단백질 번역을 방해하는 점 돌연변이 및 엑손 결실을 포함하는 디스트로핀 돌연변이는 DMD를 야기한다.
현재 가장 유망한 치료 방안 중 하나는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide, AO)를 사용하는 엑손 스키핑이다. 엑손 스키핑은 DMD 전-mRNA로부터 돌연변이 엑손 및/또는 이의 플랭킹(flanking) 엑손(들)을 제거함으로써 리딩 프레임을 복원할 수 있으며, 절단되었지만 부분적으로 기능성인 디스트로핀 단백질의 생성을 가능하게 한다. 대부분의 DMD 환자는 결실 돌연변이를 가지고 있으며, 이들 중 20%는 엑손 51 스키핑이 가능하다.
2016년 9월, 미국 식품의약국(FDA)은 돌연변이체 DMD로부터 엑손 51을 배제하도록 개발된, 첫 번째 DMD 안티센스 약물인 에테플러센(eteplirsen, Exondys 51)을 조건부로 승인하였다. 에테플러센은 안전성 및 유효성의 관점에서 잘 확립되어 있는 안티센스 화학물질인, 포스포로다이아미데이트 모르폴리노 올리고머(모르폴리노 또는 PMO)로 변형된 AO이다. 그러나, 에테플러센은 디스트로핀 단백질을 치료적으로 유익한 수준으로 복구하며 임상 결과를 개선한다는 두 가지 관점에서 약물의 유효성을 지지하는 증거가 불충분하기 때문에, 여전히 논란이 많다. FDA는 DMD 엑손 51 스키핑에 대한 또 다른 약물 후보물질인 2'-O-메틸-포스포로티오에이트-기반 AO인 '드리사퍼센(drisapersen)'을 이전에는 승인하지 않았다. 치료제는 가장 적은 위험으로 가능한 최대의 이익을 보장해야 하지만, 드리사퍼센으로 치료할 때 근육 기능에서 유의한 개선이 입증되지 않았으며, 이의 사용은 안전성에 대한 우려로 이어졌다.
그러므로, 엑손 스키핑 치료법은 현재 많은 동물 연구에서 상당한 치료 효과가 입증되었다는 사실에도 불구하고, 환자에서 관찰된 이의 효능이 매우 낮다는 점에서 주요 도전에 직면하고 있다.
엑손 스키핑 효율은 AO 표적 서열에 크게 좌우된다: 그러나, 에테플러센 및 드리사퍼센에 의해 표적화된 서열이 엑손 스키핑 치료법에 대한 최적의 선택이 아닐 수도 있다는 토론이나 논의는 거의 없었다. 몇몇 그룹은 효과적인 AO 서열을 계산적으로 그리고 경험적으로 결정하기 위하여 대규모 AO 스크리닝 노력을 해왔다. 그러나, 설계된 AO의 엑손 스키핑 유효성은 정량적으로나 통계학적으로 평가되지 않았다. 이영양성 근육 기능을 개선하기 위해 디스트로핀 단백질 발현을 복구시키는 것이 필요하지만, AO가 디스트로핀 단백질 발현을 구제(rescue)하는 능력은 이전의 AO 스크리닝 연구에서 충분한 정량화 방법으로는 보고되지 않았다. 다른 연구는 일차 DMD 근육 세포로부터의 RT-PCR에 크게 의존하였다. 에테플러센 및 드리사퍼센의 AO 서열은 이런 맥락 내에서만 결정되었다는 것이 주목할만하다.
그러므로, 엑손 51 스키핑 치료법의 유효성은 보다 최적의 AO 서열을 선택하고, 임상 시험에서 앞으로 나아갈 최상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 검증하기 위해 보다 신뢰성 있고 직접적인 생물학적 척도 - 예컨대 DMD에서 구제된 디스트로핀 단백질 - 를 사용하여 보다 엄격한 AO 스크리닝을 수행함으로써 개선될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 양태의 목적은 당해 기술분야에서 하나 이상의 이러한 문제를 해결하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 제공되며, 여기에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 결합은 전적으로 전-mRNA 서열의 0 내지 +89의 영역 내에서 일어나고, 여기에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 27개 염기를 포함한다.
본 발명의 제2 양태에 따르면, 제1 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 담체를 포함하는 컨쥬게이트가 제공되며, 여기에서 담체는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 컨쥬게이션된다.
본 발명의 제3 양태에 따르면, 제2 양태의 컨쥬게이트가 로딩된 세포가 제공된다.
본 발명의 제4 양태에 따르면, 제1 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및/또는 제2 양태에 따른 컨쥬게이트, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 제5 양태에 따르면, 유효량의 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 근육 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 여기에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 결합은 전적으로 전-mRNA 서열의 0 내지 +89의 영역 내에서 일어나고, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 27개 염기를 포함한다.
본 발명의 제6 양태에 따르면, 대상체에서 근육 장애의 치료에 사용하기 위한, 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 제공되며, 여기에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 결합은 전적으로 전-mRNA 서열의 0 내지 +89의 영역 내에서 일어나고, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 27개 염기를 포함한다.
본 발명의 제7 양태에 따르면, 유효량의 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 인간 디스트로핀 단백질 발현을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 결합은 전적으로 전-mRNA 서열의 0 내지 +89의 영역 내에서 일어나고, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 27개 염기를 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 디스트로핀 전-mRNA 서열의 엑손 51의 0 내지 +89의 초기 영역(early region) 내에서 결합하는 일련의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 개발하였으며, 이는 적어도 27개 염기의 통상적인 길이보다 더 긴 길이를 가지며, 각각 현저한 효율 및 유효성을 갖는다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위하여, 본 발명자들은 인실리코(in silico), 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 테스트를 포함하는 체계적인 스크리닝 방법을 사용하여, 엑손 51 스키핑을 위한 모르폴리노-기반 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 유효성을 정량적으로 평가하는 연구를 수행하였다.
본 발명자들은 설계된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열의 엑손 스키핑 효율을 예측하기 위해 전산 분석에 이어서 불멸화된(immortalized) DMD 환자-유래 근육 세포주에서의 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 시험관 내 테스트를 사용하는 조합 스크리닝을 수행하였다. 이 연구는 인간 디스트로핀 엑손 51 서열의 시작이 엑손 스키핑을 유도하기에 매우 유망한 표적 영역, 특히 서열의 0 내지 +89의 영역임을 밝혀내었다. 이는 알려진 에테플러센 및 드리사퍼센 안티센스 치료법에 의해 표적화된 내부 영역과는 현저하게 상이하다.
이 영역으로부터 확인된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 근육 세포에서 디스트로핀 생산의 가장 효과적인 복원을 위해 최적화되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이를 포함하는, 다양한 인자가 조사되었다. 놀랍게도, 본 발명자들은 이 초기 영역에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 결합이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 엑손 51에 대해 다수의 공지된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열보다 길 때 보다 효과적이라는 것을 발견하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 27개 이상의 염기로부터 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이와 유효성의 연관성을 보여주는 상승 경향을 확인하였다. 본 발명자들은 단지 소수의 염기 차이가, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 현저하게 상이한 효율을 가지는 것을 의미한다는 것을 보여주었다. 본원에서 입증된 바와 같이, 30-mer의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 동일한 서열의 25-mer보다 최대 1.5배 작용한다(스키핑 효율에서 42% 대비 65%). 이론에 얽매이지 않고, 이는 서열기 길수록 표적 서열에 대해 더 특이적일 수 있고 오프 타겟(off-target) 효과를 유발할 가능성이 더 적기 때문일 수 있다.
이들 확인된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열의 본 발명자들의 최적화는 엑손 51 스키핑 및 디스트로핀 단백질 구제 효율을 산업 표준인 '에테플러센' 서열과 비교하여 각각 최대 12배 및 7배 이상 증가시킬 수 있는 것으로 본원에서 입증되었다. 나아가, 이들 시험관 내 스크리닝을 통해 확인된 가장 효과적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 통계학적으로 유의한 생체 내 엑손 51 스키핑이 인간 DMD 유전자를 가지는 형질전환 마우스를 사용하여 확인되었고, 이는 에테플러센 또는 드리사퍼센 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우 결코 나타나지 않았던 것이다. 따라서, 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 근육 장애, 특히 DMD의 치료를 위한 효과적인 치료법 및 치료를 제공하는 것으로 나타났다. 이들 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이러한 약물 중 하나만이 시장에 승인된 의약 분야에 대한 대체 요법을 제공할뿐만 아니라, 또한 디스트로핀 단백질 발현을 증가시키는데 몇배 더 효과적인 치료에 대한 개선된 옵션을 제공한다. 이것은 DMD 및 다른 근육 장애를 앓고 있는 사람들에게 치료법의 유효성을 뒷받침하는 강력한 증거로 치료를 위한 실행 가능한 옵션을 제공할 것으로 기대된다.
의심의 여지를 없애기 위하여, 그리고 본 개시가 해석되는 방식을 명확하게 하기 위하여, 본 발명에 따라 사용된 특정 용어가 이제 더 정의될 것이다.
본 발명은 양태 및 특징의 조합이 명확하게 허용되지 않거나 명백하게 회피되는 경우를 제외하고, 기술된 양태 및 특징의 임의의 조합을 포함한다.
발명의 양태는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 방법 또는 용도를 언급할 수 있는 경우, 이는 또한 본원에 정의된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 컨쥬게이트 또는 약학 조성물을 포함할 수 있음에 유의한다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 단지 조직적 목적을 위한 것이며, 기술된 주제를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드
본 발명은 근육 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있는, 0 내지 +89의 영역 내에서 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 결합하는 적어도 27개 염기의 길이를 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
적합하게는, '안티센스 올리고뉴클레오타이드'는 본원에서 'AO' 또는 '올리고(oligo)' 또는 '올리고머(oligomer)'로서 언급될 수 있다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 51의 스키핑을 유도한다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 51의 스키핑을 증가시킨다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 기능성 인간 디스트로핀 단백질의 발현을 가능하게 한다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 기능성 인간 디스트로핀 단백질의 발현을 증가시킨다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 28개 염기, 적합하게는 적어도 29개 염기, 적합하게는 적어도 30개 염기를 포함한다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 27 내지 30개 염기를 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 30개 염기를 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 30개 염기로 구성된다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 결합은 전적으로 전-mRNA 서열의 0 내지 +88, 0 내지 +87, 0 내지 +86, 0 내지 +85, 0 내지 +84, 0 내지 +83, 0 내지 +82, 0 내지 +81, 0 내지 +80, 0 내지 +79, 0 내지 +78의 영역 내에서 일어난다.
일 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 결합은 전적으로 전-mRNA 서열의 0 내지 +78의 영역 내에서 일어난다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나의 적어도 27개 염기를 포함한다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30) 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나의 적어도 28개 염기를 포함한다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30) 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나의 적어도 29개 염기를 포함한다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나의 적어도 27개의 연속적인 염기를 포함한다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나의 적어도 28개의 연속적인 염기를 포함한다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나의 적어도 29개의 연속적인 염기를 포함한다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성(identity)을 공유한다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나와 90% 내지 100% 동일성을 공유한다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성(homology)을 공유한다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나와 90% 내지 100% 상동성을 공유한다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 염기가 상이한 변이체 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나와 최대 3개 염기가 상이한 변이체 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나와 최대 2개 염기가 상이한 변이체 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나와 단일 염기가 상이한 변이체 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나를 포함한다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열 중 하나로 구성된다: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 또는 서열번호 5(Ac48).
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1(AcO) 또는 서열번호 5(Ac48)을 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1(AcO)을 포함한다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1(AcO) 또는 서열번호 55(Ac48)로 구성된다.
일 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1(AcO)로 구성된다.
본 발명은 표 3에 열거된 각각의 개별 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열, 즉 표 3에 열거된 임의의 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대한 양태를 추가로 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 발명의 제2 양태에 따르면, 표 3에 열거된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 컨쥬게이트가 구상된다. 또한, 표 3에 열거된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트를 포함하는, 본 발명의 제4 양태에 따른 약학 조성물이 구상된다. 또한, 근육 장애의 치료를 위한, 표 3에 열거된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 본 발명의 제5 양태에 따른 의학 용도가 구상된다. 또한, 표 3에 열거된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 제6 양태에 따른 치료 방법이 구상된다. 또한, 표 3에 열거된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 제7 양태에 따른 세포에서 인간 디스트로핀 단백질 발현을 증가시키는 방법이 구상된다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 합성이며, 비천연이다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 고상 합성의 잘 알려진 기법을 통해 관례적으로 만들어질 수 있다. 이러한 합성을 위한 장비는 예를 들어, Applied Biosystems(Foster City, Calif.)를 포함한 몇몇 제조사에 의해 판매된다. 변형된 고체 지지체 상에서 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위한 한 가지 방법은 미국 특허 제4,458,066호에 기술되어 있다. 당업계에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단이 추가적으로 또는 대안적으로 사용될 수 있다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 유사체(analogue)이다.
적합하게는, 용어 '올리고뉴클레오타이드 유사체' 및 '뉴클레오타이드 유사체'는 당업계에 공지된 올리고뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 각각의 임의의 변형된 합성 유사체를 지칭한다.
올리고뉴클레오타이드 유사체의 적합한 예로는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드, 포스포로다이티오에이트 올리고뉴클레오타이드, 알킬포스포네이트 올리고뉴클레오타이드, 아실포스포네이트 올리고뉴클레오타이드 및 포스포라미다이트 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 모르폴리노 서브유닛을 포함한다. 그러므로 적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인-함유 결합(phosphorus-containing linkage)에 의해 함께 연결된 모르폴리노 서브유닛을 포함한다. 그러므로 적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포라미데이트 또는 포스포로다이아미데이트 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
용어 '모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드' 또는 'PMO'(포스포라미데이트 또는 포스포로다이아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드)는 모르폴리노 서브유닛 구조로 구성된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 유사체를 지칭하며, 여기에서 (i) 구조는 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 인접한 서브유닛의 5' 고리외(exocycilc) 탄소에 결합시키는, 적합하게는 1 내지 3개 원자 길이, 적합하게는 2개 원자 길이 및 적합하게는 하전되지 않은(uncharged) 또는 양이온성인 인-함유 결합에 의해 함께 결합되며, (ii) 각각의 모르폴리노 고리는 염기 특이적 수소 결합에 의해 폴리뉴클레오타이드의 염기에 결합하기에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기-쌍 형성 모이어티(base-pairing moiety)를 포함한다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 인접한 서브유닛의 5' 고리외 탄소에 결합시키는 인-함유 서브유닛간 결합을 포함한다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 식 (I)에 따른 인-함유 서브유닛간 결합을 포함한다:
상기 식에서:
Y1은 -O-, -S-, -NH-, 또는 -CH2-이고;
Z는 O 또는 S이며;
Pj는 염기-특이적 수소 결합에 의해 폴리뉴클레오타이드의 염기에 결합하기에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기-쌍 형성 모이어티이고; 그리고
X는 플루오로, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 티오알콕시, 아미노, 선택적으로 치환된 알킬아미노, 또는 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴이다.
선택적으로, 변이는 변이가 결합 또는 활성을 간섭하지 않는 한 서브유닛간 결합에 대해 일어날 수 있다. 예를 들어, 인에 부착된 산소는 황으로 치환될 수 있다(티오포스포로다이아미데이트). 5' 산소는 아미노 또는 저급 알킬 치환된 아미노로 치환될 수 있다. 인에 부착된 펜던트 질소는 비치환, (선택적으로 치환된) 저급 알킬로 단일 치환되거나 또는 이중치환될 수 있다.
적합하게는, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드의 합성, 구조, 및 결합 특성은 미국 특허 제5,698,685호, 제5,217,866호, 제5,142,047호, 제5,034,506호, 제5,166,315호, 제5,521,063호 및 제5,506,337호, 및 PCT 출원 번호 PCT/US07/11435에 상세하게 설명되어 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 결합
본 발명은 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51의 0 내지 +89 영역 내에서 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
'결합할 수 있는'이란 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 언급된 영역에서 인간 디스트로핀 전-mRNA에 결합할 수 있는 서열을 포함하는 것을 의미한다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 언급된 영역에서 인간 디스트로핀 전-mRNA의 서열에 상보적이다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 언급된 영역에서 인간 디스트로핀 전-mRNA의 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51의 0 내지 +89 영역 내의 서열은 각각의 분자에서 충분한 수의 상응하는 위치가 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오타이드에 의해 점유되어 엑손 스키핑, 적합하게는 엑손 51의 엑손 스키핑을 야기할 때 서로 상보적이다. 그러므로, '혼성화할 수 있는(hybridisable)' 및 '상보적(complementary)'은 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51의 0 내지 +89 영역 내의 서열 사이에서 안정하고 특이적인 결합이 일어나도록 하는 충분한 정도의 상보성(complementarity) 또는 쌍형성(pairing)을 나타내기 위해 사용되는 용어이다. 적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 엑손 스키핑, 적합하게는 엑손 51의 엑손 스키핑을 유도하기 위해 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51의 0 내지 +89 영역 내의 서열에 대해 충분히 혼성화할 수 있고/있거나 이에 상보적이다. 적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51의 0 내지 +89 영역 내의 서열에 대해 100% 상보적이지 않을 수 있다. 그러나, 적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 비특이적 결합을 피하기 위해 충분히 상보적이다. 적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51의 0 내지 +89 영역 내의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 상보적이다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드가 결합할 수 있게 하기 위하여, 전체 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 인간 디스트로핀 전-mRNA에 결합할 필요는 없는 것으로 이해된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 일부, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 5' 또는 3' 말단은 인간 디스트로핀 전-mRNA에 결합하지 않을 수 있다는 것이 이해될 것이다. 그러나, 제1 양태에 따르면, 인간 디스트로핀 전-mRNA에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 일부는 엑손 51의 0 내지 +89 영역 내에 속해야 한다.
그러므로, 적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51의 0 내지 +89 영역 내의 서열에 혼성화할 수 있다. 적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 엑손 51의 엑손 스키핑을 유발하기 위하여 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51의 0 내지 +89 영역 내의 서열에 충분히 혼성화할 수 있다.
인간 디스트로핀
본 발명은 근육 장애, 특히 DMD와 같은 디스트로핀 장애의 치료에 사용하기 위한 치료용 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
디스트로핀은 막대 모양의 세포질성 단백질이고, 근육 섬유의 세포 골격을 세포막을 통해 주변의 세포외 기질에 연결시키는 단백질 복합체의 필수 부분이다.
디스트로핀 단백질은 다중 기능성 도메인을 함유한다. 디스트로핀 단백질을 암호화하는 DMD 유전자는 유전자좌 Xp21에 있는 2.3 메가염기(인간 게놈 중 0.08%)에 걸쳐 있는 가장 긴 공지된 인간 유전자 중 하나이다. 근육에서의 일차 전사체는 약 2,100 킬로염기로 측정되고, 전사하는 데 16시간이 걸리며; 성숙 mRNA는 14.0 킬로염기로 측정된다. 79-엑손 근육 전사체는 3685개 아미노산 잔기의 단백질을 코딩한다. 디스트로핀 단백질은 액틴 결합 도메인 및 중심 로드(rod) 도메인을 함유한다. 이 큰 중심 도메인은 약 109개 아미노산의 24 스펙트린-유사 삼중 나선 요소(24 spectrin-like triple-helical element)에 의해 형성되며, 이는 알파-액틴 및 스펙트린과 상동성을 가지고 있다. 반복부는 전형적으로, 힌지 영역(hinge region)으로도 지칭되는, 4개의 프롤린-풍부 비반복 분절(proline-rich non-repeat segment)에 의해 중단된다(interrupted). 각각의 반복부는 2개의 엑손에 의해 암호화되며, 전형적으로 알파-헬릭스 2의 제1 부분의 아미노산 47과 48 사이의 인트론에 의해 중단된다. 다른 인트론은 반복부의 상이한 위치에서 발견되며, 보통 헬릭스 3 위에 산재되어 있다(scattered). 디스트로핀은 또한 시스테인-풍부 분절을 포함하는 시스테인-풍부 도메인을 함유한다(즉, 280개 아미노산에 있는 15개의 시스테인).
정상적인 경우, 근섬유막에서 디스트로핀의 아미노 말단은 F-액틴에 결합하고, 카르복시 말단은 디스트로핀-관련 단백질 복합체(dystrophin-associated protein complex, DAPC)에 결합한다. DAPC는 디스트로글리칸, 사르코글리칸, 인테그린 및 카베올린을 포함하며, 이들 구성요소 중 어느 하나에서의 돌연변이는 상염색체로 유전된(autosomally inherited) 근이영양증을 일으킨다. 정상적인 골격근 조직은 소량의 디스트로핀(총 근육 단백질의 약 0.002%)만을 함유하지만, 이의 부재(또는 비정상적인 발현)는 궁극적으로 확연한 근섬유 괴사뿐만 아니라 점진적 근육 약화 및 피로를 유발하는 몇몇 잘못된(aberrant) 세포내 신호전달 경로에 의해 가장 쉽게 특성화되는 중증의 현재로서는 치료할 수 없는 증상의 발생으로 이어진다. DAPC는 디스트로핀이 없을 때 탈안정화되며, 이는 구성원 단백질 수준을 감소시키고, 결국 점진적 섬유 손상 및 막 누출로 이어진다. 다양한 형태의 근이영양증, 예컨대 듀시엔형 근이영양증(DMD) 및 베커형 근이영양증(BMD)에서, 근육 세포는 주로 부정확한 스플라이싱으로 이어지는 유전자 서열의 돌연변이로 인해, 변경되고 기능적으로 결함이 있는 형태의 디스트로핀을 생성하거나 또는 디스트로핀을 전혀 생성하지 못한다. 결함이 있는 디스트로핀 단백질의 우세한 발현, 또는 디스트로핀 또는 디스트로핀-유사 단백질의 완전한 결여(lack)는 근육 퇴행의 급속한 진행으로 이어진다.
근이영양증 환자에서 디스트로핀을 암호화하는 mRNA는 전형적으로 아웃 오브 프레임(out-of-frame) 돌연변이(예를 들어, 결실, 삽입 또는 스플라이스 부위 돌연변이)를 함유하고, 번역 과정의 프레임 이동 또는 조기 종결을 초래하여, 대부분의 근섬유에서 기능성 디스트로핀이 생성되지 않는다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 디스트로핀 mRNA의 리딩 프레임을 복구시키기 위해 엑손 스키핑을 촉발한다. 적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 디스트로핀 mRNA의 리딩 프레임을 복구시키기 위하여 엑손 51의 엑손 스키핑을 촉발한다. 적합하게는, 리딩 프레임의 복구는 부분적으로 기능성인 디스트로핀 단백질의 생성을 복구시킨다.
적합하게는, 부분적으로 기능성인 디스트로핀은 절단된(truncated) 디스트로핀 단백질이다.
적합하게는, 절단된 디스트로핀 단백질은 덜 심각한 근육 장애; BMD를 앓고 있는 환자에서 생성된 것과 동일한 디스트로핀 단백질이다.
근육 장애
본 발명은 근육 장애의 치료에 있어서의 치료용 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.
적합하게는, 근육 장애는 유전자 돌연변이로부터 유발되는 임의의 근육 장애로부터 선택된다.
적합하게는, 근육 장애는 근육 기능과 관련된 유전자의 유전자 돌연변이로부터 유발되는 임의의 근육 장애로부터 선택된다.
적합하게는, 근육 장애는 인간 디스트로핀 유전자의 유전자 돌연변이로부터 유발되는 임의의 근육 장애로부터 선택된다.
적합하게는, 근육 장애는 임의의 근이영양증 장애로부터 선택된다.
적합하게는, 근육 장애는 듀시엔형 근이영양증, 베커형 근이영양증, 선천성 근이영양증(congenital muscular dystrophy), 원위 근이영양증(Distal muscular dystrophy), 에머리 드라이푸스 근이영양증(Emery-Dreifuss dystrophy), 안면견갑상완형 근이영양증(Facioscapulohumeral dystrophy), 지대형 근이영양증(Limb-girdle dystrophy), 근긴장성 근이영양증(myotonic muscular dystrophy), 안인두 근이영양증(oculopharyngeal muscular dystrophy)으로부터 선택된다. 적합하게는, 근육 장애는 듀시엔형 근이영양증(DMD) 또는 베커형 근이영양증(BMD)이다.
일 구현예에서, 근육 장애는 DMD이다.
담체 및 컨쥬게이트
본 발명은 또한 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 담체의 컨쥬게이트에 관한 것이다.
적합하게는, 담체는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 표적 세포, 적합하게는 근육 세포로 수송하도록 작동 가능한(operable) 임의의 분자를 포함할 수 있다.
적합한 담체로는 펩타이드, 소분자 화학물질, 중합체, 나노입자, 지질, 리포솜, 엑소좀 등을 포함한다.
적합하게는, 담체는 펩타이드이다. 펩타이드는 예를 들어, VP22(헤르페스 바이러스 외피 단백질(tegument protein)로부터 유래됨)와 같은 바이러스 단백질, CyLOP-1(크로타민(crotamin)으로부터 유래됨)과 같은 뱀독 단백질, pVEC(쥣과의 혈관 내피-캐드헤린 단백질(endothelial-cadherin protein)로부터 유래됨)와 같은 세포 부착 당단백질, 페네트라틴(Penetratin)(안테나페디아 호메오도메인(Antennapedia homeodomain), Tat(인간 면역결핍 바이러스 트랜스활성화 조절 단백질) 또는 역(reverse) Tat로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, 펩타이드는 세포 침투 펩타이드(cell penetrating peptide)이다.
적합하게는, 펩타이드는 아르기닌-풍부 세포 침투 펩타이드이다.
아르기닌-풍부 펩타이드 담체의 사용이 특히 유용하다. 특정 아르기닌 기반 펩타이드 담체는 근육 세포를 포함한 일차 세포로의 안티센스 화합물의 전달에 매우 효과적인 것으로 나타났다(Marshall, Oda et al. 2007; Jearawiriyapaisarn, Moulton et al. 2008; Wu, Moulton et al. 2008). 나아가, 다른 펩타이드와 비교하여, 아르기닌 펩타이드 담체는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 컨쥬게이션될 때, 여러 유전자 전사체의 스플라이싱을 변경시키는 향상된 능력을 나타낸다(Marshall, Oda et al. 2007). 적합하게는, 아르기닌-풍부 세포 침투 펩타이드는 예를 들어, WO2015075747, WO2013030569, WO2009147368, US20120289457, 또는 US20160237426에 기술된 담체 펩타이드로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 아르기닌 풍부 세포 침투 펩타이드는 WO2013030569 또는 WO2009147368에 기술된 것으로부터 선택된다.
적합하게는, 담체는 주어진 세포 배양 집단의 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세포 침투를 유도하는 능력을 가진다. 적합하게는, 담체는 근육 세포 배양물의 근육 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세포 침투를 유도하는 능력을 가진다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대한 담체의 컨쥬게이션은 담체와 안티센스 올리고뉴클레오타이드 사이 또는 링커 모이어티와 안티센스 올리고뉴클레오타이드 사이에서 공유 결합을 형성하기에 적합한 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 담체의 컨쥬게이션은 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에서 일어날 수 있다. 대안적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대한 담체의 컨쥬게이션은 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에서 일어날 수 있다. 대안적으로, 담체는 임의의 서브유닛간 결합을 통해 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 컨쥬게이션될 수 있다.
적합하게는, 담체는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 3' 또는 5' 말단에 이의 N-말단 또는 C-말단 잔기에서 공유 결합된다.
적합하게는, 담체는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 이의 C-말단 잔기에서 결합된다.
선택적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 인-함유 서브유닛간 결합을 포함하고, 담체가 펩타이드인 경우, 펩타이드는 말단 결합 기의 인에 대한 공유 결합을 통해 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 컨쥬게이션될 수 있다.
대안적으로, 담체가 펩타이드이고, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 모르폴리노인 경우, 펩타이드는 올리고머의 3' 말단 모르폴리노 기의 질소 원자에 컨쥬게이션될 수 있다.
선택적으로, 담체는 링커 모이어티를 통해 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 컨쥬게이션될 수 있다. 선택적으로, 링커 모이어티는 선택적으로 치환된 피페라지닐 모이어티, 베타 알라닌, 글리신, 프롤린, 및/또는 6-아미노헥산산 잔기 중 하나 이상을 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
대안적으로, 담체는 링커 모이어티 없이 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 직접 컨쥬게이션될 수 있다.
적합하게는, 컨쥬게이트는 추가로 호밍 모이어티(homing moiety)를 포함할 수 있다.
적합하게는, 호밍 모이어티는 선택된 포유류 조직에 대해 선택적이다. 즉, 동일한 조직이 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화된다. 적합하게는, 호밍 모이어티는 근육 조직에 대해 선택적이다.
적합하게는, 호밍 모이어티는 호밍 펩타이드이다.
적합한 호밍 펩타이드는 예를 들어, 'Effective Dystrophyn Restoration by a Novel Muscle-Homing Peptide-Morpholino Conjugate in Dystrophin-Deficient mdx Mice' Gao et al. Mol Ther. 2014 Jul; 22(7): 1333-1341'에 개시되어 있다.
적합하게는, 담체 펩타이드 및 호밍 펩타이드는 키메라 융합 단백질로서 형성될 수 있다.
적합하게는, 컨쥬게이트는 세포 침투 펩타이드와 근육-특이적 호밍 펩타이드로부터 형성된 키메라 펩타이드를 포함할 수 있다.
선택적으로, 컨쥬게이트는 담체 펩타이드-호밍 펩타이드-안티센스 올리고뉴클레오타이드의 형태 또는 호밍 펩타이드-담체 펩타이드-안티센스 올리고뉴클레오타이드의 형태일 수 있다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용해도를 증가시키는 담체에 컨쥬게이션될 수 있다. 적합하게는, 용해도는 수성 매질에서이다. 적합하게는, 용해도를 증가시키는 담체는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 수송하기 위해 작동 가능한 담체 이외에 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 컨쥬게이션될 수 있다. 적합하게는, 용해도를 증가시키는 담체 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 수송하는 담체는 키메라 융합 단백질로서 형성될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용해도를 증가시키는 적합한 담체는 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 트라이에틸렌 글리콜이다.
약학적으로 허용 가능한 부형제
본 발명은 추가로 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트를 포함하고, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
적합하게는, 약학 조성물은 당업계에 공지된 방식(Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA(1985)에 기술되어 있는 것과 같음)으로 제조되며, 약학적으로 불활성의 무기 및/또는 유기 부형제가 사용된다. 용어 '약학적으로 허용 가능한'은 생리적으로 허용되며, 전형적으로 환자에게 투여될 때 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 일으키지 않는 분자 및 조성물을 지칭한다.
적합하게는, 약학 조성물은 환, 정제, 코팅 정제, 경질 젤라틴 캡슐, 연질 젤라틴 캡슐 및/또는 좌제, 용액 및/또는 시럽, 주사액, 마이크로캡슐, 임플란트 및/또는 로드 등으로서 제형화될 수 있다.
일 구현예에서, 약학 조성물은 주사 용액으로서 제형화될 수 있다.
적합하게는, 환, 정제, 코팅 정제 및 경질 젤라틴 캡슐을 제조하기 위한 약학적으로 허용 가능한 부형제는 락토오스, 옥수수 전분 및/또는 이의 유도체, 탈크, 스테아르산 및/또는 이의 염 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, 연질 젤라틴 캡슐 및/또는 좌제를 제조하기 위한 약학적으로 허용 가능한 부형제는 지방, 왁스, 반고체 및 액체 폴리올, 천연 및/또는 경화 오일 등으로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, 용액 및/또는 시럽을 제조하기 위한 약학적으로 허용 가능한 부형제는 물, 수크로오스, 전화당(invert sugar), 글루코오스, 폴리올 등으로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, 주사 용액을 제조하기 위한 약학적으로 허용 가능한 부형제는 물, 식염수, 알코올, 글리세롤, 폴리올, 식물성 오일 등으로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, 마이크로캡슐, 임플란트 및/또는 로드를 제조하기 위한 약학적으로 허용 가능한 부형제는 글리콜산 및 락트산 등과 같은 혼합 중합체로부터 선택될 수 있다.
또한, 약학 조성물은 N. Weiner 등(Drug Develop Ind Pharm 15(1989) 1523), "Liposome Dermatics"(Springer Verlag 1992) 및 Hayashi(Gene Therapy 3(1996) 878)에 기술된 리포솜 제형을 포함할 수 있다.
선택적으로, 약학 조성물은 둘 이상의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 선택적으로, 약학 조성물은 상이한 엑손, 적합하게는 인간 디스트로핀 전-mRNA의 상이한 엑손을 표적화하는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트를 추가로 포함할 수 있다. 선택적으로, 하나 이상의 추가의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트는 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 인접한 엑손, 예를 들어 엑손 50 또는 엑손 52를 표적으로 할 수 있다. 적합하게는, 인간 디스트로핀 전-mRNA의 상이한 엑손을 표적화하는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 함께, 디스트로핀 mRNA의 리딩 프레임을 복구시키기 위해 작동 가능하다.
선택적으로, 약학 조성물은 상이한 유전자를 표적화하는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 추가의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트는 미오스타틴(myostatin)을 표적화할 수 있다. 이러한 이중 표적화는 'Dual exon skipping in myostatin and dystrophin for Duchenne muscular dystrophy' Kemaladewi et al. BMC Med Genomics. 201 1 Apr 20;4:36에 기술되어 있다.
선택적으로, 하나 이상의 추가의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 제1 양태의 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 함께 결합되고/되거나 이에 결합될 수 있다.
선택적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및/또는 컨쥬게이트는 생리학적으로 허용되는 염으로서 약학 조성물에 존재할 수 있다. 적합하게는, 생리학적으로 허용되는 염은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및/또는 이의 컨쥬게이트의 원하는 생물학적 활성을 유지하며, 바람직하지 않은 독성 효과를 나타내지 않는다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우, 약학적으로 허용 가능한 염의 적합한 예로는 (a) 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예컨대 스퍼민 및 스퍼미딘 등과 같은 양이온으로 형성된 염; (b) 무기 산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등으로 형성된 산 부가 염; (c) 예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 석신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 타닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌설폰산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌다이설폰산, 폴리갈락투론산 등과 같은 유기 산으로 형성된 염; 및 (d) 염소, 브롬, 및 요오드와 같은 원소 음이온으로부터 형성된 염을 포함한다.
선택적으로, 약학 조성물은, 적어도 하나의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및/또는 컨쥬게이트 이외에, 하나 이상의 상이한 치료적 활성 성분을 포함할 수 있다. 하나 이상의 치료적 활성 성분은, 예를 들어 코르티코스테로이드, 우트로핀-상향조절제, TGF-베타 억제제, 및 미오스타틴 억제제로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, 활성 성분 및 부형제 이외에, 약학 조성물은 또한 첨가제, 예컨대 충전제, 증량제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 안정화제, 유화제, 보존제, 감미제, 염료, 풍미제 또는 방향제, 증점제, 희석제 또는 완충 물질, 및 더불어 용매 및/또는 가용화제 및/또는 서방(slow release) 효과를 달성하기 위한 작용제, 및 또한 삼투압을 변경시키기 위한 염, 코팅제 및/또는 항산화제를 포함할 수 있다. 적합한 첨가제로는 Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트, Tween 80, 폴리소르베이트 80, 아스코르브산, 메타중아황산 나트륨, 티메르솔, 벤질 알코올, 락토오스, 만니톨 등을 포함한다.
투여
본 발명은 치료용 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 대상체에게 투여하기 위한 치료용 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및/또는 약학 조성물은 국소용, 장용(enteral) 또는 비경구 투여용일 수 있다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및/또는 약학 조성물은 경구로, 경피로, 정맥내로, 척수강내로, 근육내로, 피하로, 비강으로, 경점막 등으로 투여하기 위한 것일 수 있다.
일 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및/또는 약학 조성물은 근육내 투여를 위한 것이다.
일 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및/또는 약학 조성물은 주사에 의한 근육내 투여를 위한 것이다.
'유효량' 또는 '치료학적 유효량'은 대상체에서 원하는 생리학적 반응 또는 치료 효과를 생성하기에 효과적인, 단일 용량으로서 또는 일련의 용량의 부분으로서 대상체에게 투여되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 양을 지칭한다.
적합하게는, 원하는 생리적 반응은 적합하게는 결함 디스트로핀 단백질을 함유하거나 디스트로핀을 함유하지 않는 근육 조직 또는 세포에서의 디스트로핀 단백질의 비교적 기능성이거나 생물학적으로 활성인 형태의 발현의 증가를 포함한다.
적합하게는, 원하는 치료 효과는 근육 장애의 증상 또는 병리의 개선, 근육 장애의 증상 또는 병리의 발병(onset)의 감소, 및 근육 장애의 증상 또는 병리의 발병의 둔화(slowing)를 포함한다. 이러한 증상의 예로는 피로, 정신 지체, 근육 약화, 운동 능력(예를 들어, 달리기, 호핑, 점프)의 어려움, 빈번한 넘어짐, 및 걷기의 어려움을 포함한다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트는 하루에 체중 1 kg당 약 0.0001 내지 약 100 mg의 범위의 용량으로 투여된다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트는 매일, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일마다 1회, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주마다 1회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월마다 1회 투여된다.
적합하게는, 투여 용량 및 빈도는 기능성 디스트로핀 단백질의 원하는 발현을 유지하기 위해, 필요에 따라, 의사에 의해 결정될 수 있다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트는 선택적으로 단위 투여 형태로, 하루 종일 적절한 간격으로 개별적으로, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 하위 용량으로 투여될 수 있다.
대상체
본 발명은 또한 치료학적 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 컨쥬게이트를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것에 의한 근육 장애의 치료에 관한 것이다.
적합하게는, 대상체는 상기 정의된 바와 같은 근육 장애를 가진다.
적합하게는, 대상체는 포유류이다. 적합하게 대상체는 인간이다.
적합하게는, 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 그러나, 적합하게는, 대상체는 남성이다.
적합하게는, 대상체는 임의의 연령대다. 그러나, 적합하게는 대상체는 1개월 내지 50세 사이, 적합하게는 1세 내지 30세 사이, 적합하게는 2세 내지 27세 사이, 적합하게는 4세 내지 25세 사이이다.
증가된 엑손 스키핑 및 디스트로핀 발현
본 발명은 기능성 디스트로핀 단백질 발현을 복구시키기 위해 인간 디스트로핀 전-mRNA에서 엑손 스키핑을 유도함으로써 근육 장애의 치료에 사용하기 위한, 치료용 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
적합하게는, '기능성' 디스트로핀 단백질은 DMD와 같은 근육 장애를 가진 대상체에 존재하는 디스트로핀 단백질의 결함 형태와 비교할 때, 근이영양증의 다른 특징인 근육 조직의 점진적인 분해를 감소시키기에 충분한 생물학적 활성을 가지는 디스트로핀 단백질을 지칭한다.
적합하게는, 기능성 디스트로핀 단백질은 야생형 디스트로핀의 시험관 내 또는 생체 내 생물학적 활성의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%를 가질 수 있다. 적합하게는, 기능성 디스트로핀 단백질은 야생형 디스트로핀의 시험관 내 또는 생체 내 생물학적 활성의 적어도 10% 내지 20%를 가진다.
적합하게는, 시험관 내 근육 배양물의 디스트로핀의 활성은 근관(myotube) 크기, 근섬유 조직화(myofibril orbanization), 수축성 활동(contractile activity), 및 아세틸콜린 수용체의 자발적 클러스터링에 따라 측정될 수 있다(예를 들어, Brown et al., Journal of Cell Science. 1 12:209-216, 1999 참조).
동물 모델 또한 질환의 병인을 연구하기 위한 귀중한 자원이며, 디스트로핀-관련 활성을 테스트하기 위한 수단을 제공한다. DMD 연구를 위해 가장 광범위하게 사용되는 동물 모델 중 두가지는 mdx 마우스 및 골든 리트리버 근이영양증(GRMD) 개이며, 둘 다 디스트로핀 음성이다(예를 들어, Collins & Morgan, Int J Exp Pathol 84: 165-172, 2003 참조). 이들 및 다른 동물 모델이 다양한 디스트로핀 단백질의 기능적 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
적합하게는, '엑손 스키핑'은 전체 엑손 또는 이의 일부가, 주어진 전처리된 RNA(전-mRNA)로부터 제거되어 단백질로 번역되는 성숙 RNA에 존재하지 않게 되는 과정을 지칭한다.
적합하게는, 스킵된 엑손에 의해 달리 암호화된 단백질의 부분은 단백질의 발현된 형태로 존재하지 않는다.
그러므로 적합하게는, 엑손 스키핑은 여전히 기능성이지만, 상기 정의된 바와 같은 단백질의 절단된 형태를 생성한다.
적합하게는, 스킵되는 엑손은 인간 디스트로핀 유전자로부터의 엑손이며, 그렇지 않으면 비정상적인(aberrant) 스플라이싱을 유발하는, 그 서열에서의 돌연변이 또는 다른 변경을 함유할 수 있다.
적합하게는, 스킵되는 엑손은 디스트로핀 유전자의 엑손 51이다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 디스트로핀 전-mRNA에서 엑손 스키핑을 유도하도록 작동 가능하다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 디스트로핀 전-mRNA에서 엑손 51의 엑손 스키핑을 유도하도록 작동 가능하다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 근육 조직에서 디스트로핀 단백질의 기능성 형태의 발현을 증가시키도록 작동 가능하며, 근육 조직의 근육 기능을 증가시키도록 작동 가능하다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 받지 않은(received) DMD와 같은 근육 장애를 가진 대상체에서의 근육 기능과 비교하여, 근육 기능을 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 증가시키도록 작동 가능하다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 받지 않은 DMD와 같은 근육 장애를 가진 대상체와 비교하여, 근육 섬유의 약 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%에서 기능성 디스트로핀 단백질을 발현하는 근육 섬유의 백분율을 증가시키도록 작동 가능하다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 야생형 세포 및/또는 대상체에서 디스트로핀 단백질 발현의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 25, 40, 45, 또는 50%의 수준으로 디스트로핀 단백질의 기능성 형태의 발현을 유도하도록 작동 가능하다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 야생형 세포 및/또는 대상체에서 디스트로핀 단백질 발현의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20%의 수준으로 디스트로핀 단백질의 기능성 형태의 발현을 유도하도록 작동 가능하다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 야생형 세포 및/또는 대상체에서 디스트로핀 단백질 발현의 적어도 10, 15, 또는 20%의 수준으로 디스트로핀 단백질의 기능성 형태의 발현을 유도하도록 작동 가능하다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 수준으로 디스트로핀 전-mRNA에서 엑손 51 스키핑을 유도하도록 작동 가능하다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 수준으로 디스트로핀 전-mRNA에서 엑손 51 스키핑을 유도하도록 작동 가능하다.
적합하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 60% 내지 80%의 수준으로 디스트로핀 전-mRNA에서 엑손 51 스키핑을 유도하도록 작동 가능하다.
'증가된(increased or enhanced)' 양은 동일한 환경하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드 화합물이 투여되지 않거나(작용제의 부재) 또는 대조군 화합물이 투여될 때 생성되는 양의 1.1배, 1.2배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 그 이상의 증가를 포함할 수 있다.
적합하게는, '증가된(increased or enhanced)' 양은 통계학적으로 유의한 양이다.
본 명세서의 설명 및 청구범위에서, 단어 "포함하다" 및 "함유하다" 및 이들의 변형은 "포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌" 것을 의미하고, 이는 다른 모이어티, 첨가제, 구성요소, 정수 또는 단계를 배제하는 것(및 배제하지 않는 것)으로 의도되지 않는다. 본 명세서의 설명 및 청구범위에서, 단수의 표현은 문맥상 달리 요구하지 않는 한 복수를 포함한다. 특히, 단수 형태로 사용되는 경우, 명세서는 문맥상 달리 요구하지 않는 한 단수만 아니라 복수의 것을 포함하는 것으로서 이해되어야 한다.
본 발명의 특정 양태, 구현예 또는 실시예와 관련하여 기술된 특징, 정수, 특성, 화합물, 화학적 모이어티 또는 기는 이와 양립할 수 없는 것이 아닌 한 본원에 기술된 임의의 다른 양태, 구현예 또는 실시예에 적용 가능한 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서(임의의 첨부되는 청구범위, 요약 및 도면을 포함함)에 개시된 모든 특징, 및/또는 이렇게 개시된 임의의 방법 또는 27개 과정의 단계는 전부는, 적어도 그러한 특징 및/또는 단계의 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고 임의의 조합으로 조합될 수 있다.
본 발명은 임의의 전술한 구현예의 상세한 내용으로 제한되지 않는다. 본 발명은 본 명세서(임의의 첨부되는 청구범위, 요약 및 도면을 포함함)에 개시된 특징 중 임의의 신규한 특징, 또는 임의의 신규한 조합, 또는 그렇게 개시된 임의의 방법 또는 과정의 단계의 임의의 신규한 단계, 또는 임의의 신규한 조합으로 확장된다. 독자의 관심은 본 출원과 관련된 본 명세서와 동시에 또는 이전에 출원되고 본 명세서로의 공개 검사에 대해 열려 있는 모든 논문 및 문서에 관련되며, 모든 그러한 논문 및 서류의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 특정 구현예는 이제 다음의 도면 및 표를 참조로 기술될 것이다:
도 1은 불멸화된 클론 엑손 52-결실 DMD 골격근 세포(KM571)에서, 10 μM의 에테플러센(aEte) 및 드리사퍼센(aDri)의 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AO) 및 유사체 AO의 시험관 내 스크리닝을 나타낸다. 분화된 근관은 형질감염 후 5일째에 수득되었다. (A) 원스텝 RT-PCR에 의해 측정된 엑손 51 스키핑의 효율. 대표적인 이미지를 나타내었다. M, 100 bp 마커; 블랭크, RNA 주형 없음. (B) 항-디스트로핀 C-말단 항체를 사용한 정량적 웨스턴 블롯팅에 의해 측정된 절단된 디스트로핀 단백질 유도의 효율. 구제된 디스트로핀 단백질 수준은 건강한 8220개 세포를 이용한보정 곡선을 사용하여 계산되었다. 데이터는 3 내지 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다. ** p<0.01 vs aEte,† p<0.05 및 †† p<0.01 vs aDri, §§ p < 0.01 vs (A)의 모든 AO 및 vs (B)의 AcO.
도 2는 5 μM의 에테플러센 및 드리사퍼센의 AcO, Ac48, 및 유사체 AO로 형질감염된 엑손 52-결실 DMD-KM571 세포주에서 디스트로핀 엑손 51 스키핑 및 단백질의 경시적 분석을 나타낸다. 샘플은 형질감염 후 2일 및 11일째에 수집되었다. (A) 엑손 51 스키핑의 RT-PCR 분석. M, 100 bp 마커; R, 복제 수; 블랭크, RNA 주형 없음. (B) 항-디스트로핀 C-말단 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의한 유도된 디스트로핀 단백질의 정량화. 3개의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 복제물을 나타낸다.
도 3은 원스텝 RT-PCR 및 정량적 웨스턴 블롯팅에 의해 측정된 불멸화된 DMD 골격근 세포에서 에테플러센 및 드리사퍼센의 AcO, Ac48, 및 유사체 AO의 용량 의존적 효과를 나타낸다. DMD 골격근 세포는 1, 3, 및 10 μM의 AO로 형질감염시키고, 형질감염 후 5일째에 수득되었다. (A) 및 (B)는 각각 엑손 52 결실 돌연변이(ID KM 571)를 갖는 DMD 근육 세포에서 구제된 디스트로핀 단백질의 엑손 51 스키핑 효율 및 발현 수준을 나타낸다. 엑손 51을 스키핑하고 디스트로핀 단백질 발현을 구제하는 효능은 각각 엑손 48 내지 50 결실 돌연변이를 가지는 DMD 근육 세포(ID 6594)에서 (C) 및 (D)로 나타낸다. 데이터는 KM571 세포주에서의 3 내지 7개의 독립적인 실험으로부터, 그리고 6594 세포주에서의 3 내지 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다. * p<0.05, ** p<0.01 vs aEte;† p<0.05 및 †† p<0.01 vs Ac48; § p<0.05, §§ p<0.01 vs 동일한 농도의 aDri, NS, 유의성 없음 vs 다음 용량의 AcO; ns, 유의성 없음 vs 10 μM의 AcO. (E) 회귀 모델에 의해 분석된 AO에 대한 용량-반응성. 스키핑 및 디스트로핀 단백질 생성에서의 회귀 방정식의 통계학적 타당성(statistical validity)은 각각 p<0.008 및 p<0.014였다. 플롯은 회귀 분석에서 예측된 엑손 스키핑 또는 디스트로핀 단백질 수준의 값을 나타낸다. 회귀 기울기 및 95% 신뢰 구간(CI)을 개별 AO로 나타난다.
도 4는 엑손 52(ID KM571) 및 엑손 48 내지 50 결실 돌연변이(ID 6594)를 가진 불멸화된 DMD 환자-유래 골격근 세포에서의 면역세포화학을 나타낸다. 10 μM의 AcO, Ac48, 및 유사체 에테플러센(aEte)으로 형질감염시킨 후 5일째에 세포를 항-디스트로핀 C-말단 항체로 염색하였다. 회색 선은 디스트로핀-양성 근관을 나타낸다. 백색 점은 DAPI로 대비 염색된 핵을 나타낸다. *는 배양 플레이트로부터의 수축 또는 분리로 인한 대표적인 위양성(false-positive) 근관을 나타낸다. 대표적인 이미지는 3개의 독립적인 실험으로부터 나타낸다. 축척 막대: 100 μm.
도 5는 AcO 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이 최적화를 나타낸다. 불멸화된 DMD 근육 세포를 25-, 26-, 27-, 28-, 29-, 및 30-mer 길이로 구성된 AcO 모르폴리노로 형질감염시켰다. 엑손 52 결실(KM571)을 갖는 DMD 근육 세포에서 1 μM(A 및 B) 및 3 μM(C 및 D)의 AcO 모르폴리노에 의해 유도된 엑손 51 스키핑의 대표적인 이미지 및 정량화는 RT-PCR에 의해 나타내었다. (E 내지 H)는 엑손 48 내지 50 결실을 가진 불멸화된 DMD 세포에서의 결과를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 나타낸다.
도 6은 일차 DMD 및 건강한 골격근 세포에서 에테플러센(aEte) 및 드리사퍼센(aDri)의 AcO, Ac48, 유사체 AO에 의해 유도된 엑손 51 스키핑 효율을 나타낸다. 분화된 근관을 10 μM의 AcO, Ac48, 및 유사체 에테플러센 및 드리사퍼센으로 형질감염시킨 후, 3일 후에 수득되었다. 원스텝 RT-PCR에 의해 나타낸 엑손 51 스키핑 효율은 엑손 45 내지 50의 결실 돌연변이(ID 4546)(A 및 B) 또는 엑손 49 내지 50의 결실 돌연변이(ID 4555)(C 및 D)를 갖는 일차 DMD 세포에서, 그리고 일차 건강한 근육 세포에서(E 및 F) 나타났다. 데이터는 각 조건에서 적어도 3개 한 벌(triplicate)의 웰로부터의 평균 ± SD를 나타낸다. M, 100 bp 마커. * p<0.05 및 ** p<0.01 vs Ac48,†† p<0.01 vs aEte, §§<0 01 vs aDri.
도 7은 hDMD/Dmd-널(null) 마우스 모델에서 30-mer AcO 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드의 생체 내 효능을 나타낸다. 엑손 스키핑 효능은 AcO 모르폴리노 또는 유사체 에테플러센, aEte(30 μL 식염수 중 50 μg)의 근육내 주사 후 2주째에 경골 전방 근육의 RT-PCR에 의해 분석되었다. (A) 마이크로칩-기반 모세관 전기영동 시스템에 의해 나타낸 엑손 51 스키핑의 밀도계 분석. (B) 엑손 51 스키핑 효율의 평균 백분율(평균±SE). N = 각 그룹에서 7마리. M, 마커; NT, 비처리 근육, UM, 상부 마커 염료; LM, 하부 마커 염료.
도 8은 hDMD/Dmd-널 마우스 모델에서 30-mer Ac48 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드의 생체 내 효능을 나타낸다. 엑손 스키핑 효능은 Ac48 모르폴리노 또는 유사체 드리사퍼센 aDri(30 μL 식염수 중 50 μg)의 근육내 주사 후 2주째에 경골 전방 근육의 RT-PCR에 의해 분석되었다. 마이크로칩-기반 모세관 전기영동 시스템에 의해 나타낸 엑손 51 스키핑의 밀도계 분석. M, 마커; NT, 비처리 근육, UM, 상부 마커 염료; LM, 하부 마커 염료.
도 1은 불멸화된 클론 엑손 52-결실 DMD 골격근 세포(KM571)에서, 10 μM의 에테플러센(aEte) 및 드리사퍼센(aDri)의 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AO) 및 유사체 AO의 시험관 내 스크리닝을 나타낸다. 분화된 근관은 형질감염 후 5일째에 수득되었다. (A) 원스텝 RT-PCR에 의해 측정된 엑손 51 스키핑의 효율. 대표적인 이미지를 나타내었다. M, 100 bp 마커; 블랭크, RNA 주형 없음. (B) 항-디스트로핀 C-말단 항체를 사용한 정량적 웨스턴 블롯팅에 의해 측정된 절단된 디스트로핀 단백질 유도의 효율. 구제된 디스트로핀 단백질 수준은 건강한 8220개 세포를 이용한보정 곡선을 사용하여 계산되었다. 데이터는 3 내지 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다. ** p<0.01 vs aEte,† p<0.05 및 †† p<0.01 vs aDri, §§ p < 0.01 vs (A)의 모든 AO 및 vs (B)의 AcO.
도 2는 5 μM의 에테플러센 및 드리사퍼센의 AcO, Ac48, 및 유사체 AO로 형질감염된 엑손 52-결실 DMD-KM571 세포주에서 디스트로핀 엑손 51 스키핑 및 단백질의 경시적 분석을 나타낸다. 샘플은 형질감염 후 2일 및 11일째에 수집되었다. (A) 엑손 51 스키핑의 RT-PCR 분석. M, 100 bp 마커; R, 복제 수; 블랭크, RNA 주형 없음. (B) 항-디스트로핀 C-말단 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의한 유도된 디스트로핀 단백질의 정량화. 3개의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 복제물을 나타낸다.
도 3은 원스텝 RT-PCR 및 정량적 웨스턴 블롯팅에 의해 측정된 불멸화된 DMD 골격근 세포에서 에테플러센 및 드리사퍼센의 AcO, Ac48, 및 유사체 AO의 용량 의존적 효과를 나타낸다. DMD 골격근 세포는 1, 3, 및 10 μM의 AO로 형질감염시키고, 형질감염 후 5일째에 수득되었다. (A) 및 (B)는 각각 엑손 52 결실 돌연변이(ID KM 571)를 갖는 DMD 근육 세포에서 구제된 디스트로핀 단백질의 엑손 51 스키핑 효율 및 발현 수준을 나타낸다. 엑손 51을 스키핑하고 디스트로핀 단백질 발현을 구제하는 효능은 각각 엑손 48 내지 50 결실 돌연변이를 가지는 DMD 근육 세포(ID 6594)에서 (C) 및 (D)로 나타낸다. 데이터는 KM571 세포주에서의 3 내지 7개의 독립적인 실험으로부터, 그리고 6594 세포주에서의 3 내지 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다. * p<0.05, ** p<0.01 vs aEte;† p<0.05 및 †† p<0.01 vs Ac48; § p<0.05, §§ p<0.01 vs 동일한 농도의 aDri, NS, 유의성 없음 vs 다음 용량의 AcO; ns, 유의성 없음 vs 10 μM의 AcO. (E) 회귀 모델에 의해 분석된 AO에 대한 용량-반응성. 스키핑 및 디스트로핀 단백질 생성에서의 회귀 방정식의 통계학적 타당성(statistical validity)은 각각 p<0.008 및 p<0.014였다. 플롯은 회귀 분석에서 예측된 엑손 스키핑 또는 디스트로핀 단백질 수준의 값을 나타낸다. 회귀 기울기 및 95% 신뢰 구간(CI)을 개별 AO로 나타난다.
도 4는 엑손 52(ID KM571) 및 엑손 48 내지 50 결실 돌연변이(ID 6594)를 가진 불멸화된 DMD 환자-유래 골격근 세포에서의 면역세포화학을 나타낸다. 10 μM의 AcO, Ac48, 및 유사체 에테플러센(aEte)으로 형질감염시킨 후 5일째에 세포를 항-디스트로핀 C-말단 항체로 염색하였다. 회색 선은 디스트로핀-양성 근관을 나타낸다. 백색 점은 DAPI로 대비 염색된 핵을 나타낸다. *는 배양 플레이트로부터의 수축 또는 분리로 인한 대표적인 위양성(false-positive) 근관을 나타낸다. 대표적인 이미지는 3개의 독립적인 실험으로부터 나타낸다. 축척 막대: 100 μm.
도 5는 AcO 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이 최적화를 나타낸다. 불멸화된 DMD 근육 세포를 25-, 26-, 27-, 28-, 29-, 및 30-mer 길이로 구성된 AcO 모르폴리노로 형질감염시켰다. 엑손 52 결실(KM571)을 갖는 DMD 근육 세포에서 1 μM(A 및 B) 및 3 μM(C 및 D)의 AcO 모르폴리노에 의해 유도된 엑손 51 스키핑의 대표적인 이미지 및 정량화는 RT-PCR에 의해 나타내었다. (E 내지 H)는 엑손 48 내지 50 결실을 가진 불멸화된 DMD 세포에서의 결과를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 나타낸다.
도 6은 일차 DMD 및 건강한 골격근 세포에서 에테플러센(aEte) 및 드리사퍼센(aDri)의 AcO, Ac48, 유사체 AO에 의해 유도된 엑손 51 스키핑 효율을 나타낸다. 분화된 근관을 10 μM의 AcO, Ac48, 및 유사체 에테플러센 및 드리사퍼센으로 형질감염시킨 후, 3일 후에 수득되었다. 원스텝 RT-PCR에 의해 나타낸 엑손 51 스키핑 효율은 엑손 45 내지 50의 결실 돌연변이(ID 4546)(A 및 B) 또는 엑손 49 내지 50의 결실 돌연변이(ID 4555)(C 및 D)를 갖는 일차 DMD 세포에서, 그리고 일차 건강한 근육 세포에서(E 및 F) 나타났다. 데이터는 각 조건에서 적어도 3개 한 벌(triplicate)의 웰로부터의 평균 ± SD를 나타낸다. M, 100 bp 마커. * p<0.05 및 ** p<0.01 vs Ac48,†† p<0.01 vs aEte, §§<0 01 vs aDri.
도 7은 hDMD/Dmd-널(null) 마우스 모델에서 30-mer AcO 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드의 생체 내 효능을 나타낸다. 엑손 스키핑 효능은 AcO 모르폴리노 또는 유사체 에테플러센, aEte(30 μL 식염수 중 50 μg)의 근육내 주사 후 2주째에 경골 전방 근육의 RT-PCR에 의해 분석되었다. (A) 마이크로칩-기반 모세관 전기영동 시스템에 의해 나타낸 엑손 51 스키핑의 밀도계 분석. (B) 엑손 51 스키핑 효율의 평균 백분율(평균±SE). N = 각 그룹에서 7마리. M, 마커; NT, 비처리 근육, UM, 상부 마커 염료; LM, 하부 마커 염료.
도 8은 hDMD/Dmd-널 마우스 모델에서 30-mer Ac48 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드의 생체 내 효능을 나타낸다. 엑손 스키핑 효능은 Ac48 모르폴리노 또는 유사체 드리사퍼센 aDri(30 μL 식염수 중 50 μg)의 근육내 주사 후 2주째에 경골 전방 근육의 RT-PCR에 의해 분석되었다. 마이크로칩-기반 모세관 전기영동 시스템에 의해 나타낸 엑손 51 스키핑의 밀도계 분석. M, 마커; NT, 비처리 근육, UM, 상부 마커 염료; LM, 하부 마커 염료.
실시예
1. 물질 및 방법
1.1 AO의 설계 및 인실리코 스크리닝
413개의 30-mer 및 25-mer AO 표적화 엑손 51을 본 발명자들이 최근에 개발한 AO 예측 알고리즘을 사용하여 설계하고 분석하였다(표 3 참조). 표 3은 컬럼의 좌측에서 우측으로 나타내며; 엑손 번호, 억셉터 스플라이스 부위로부터의 거리, AO 서열(5'에서 3'), 예측된 스키핑 %, 및 스크린 내에서의 순위를 나타낸다. 좌선성(left hand) AO는 30-mer이고, 우선성(right hand) AO는 25-mer이다. 예측된 엑손 스키핑 효율에 기초하여, 적어도 4개 염기만큼 떨어져 있는 8개의 AO를 시험관 내 스크리닝을 위해 선택하였다(표 2). 선택된 AO, 에테플러센, 및 드리사퍼센의 표적 서열 특이성을 미국 캘리포니아 대학, 산타 크루즈 게놈 브라우저(Santa Cruz Genome Browser)(http://genome.ucsc.edu/index.html)를 사용하여 분석하였으며, AO 서열이 이론적으로 100% 동일성을 갖는 임의의 비표적 RNA 서열에 결합하지 않는 것을 확인하였다.
1.2 안티센스 모르폴리노.
에테플러센 및 드리사퍼센의 유사체 AO를 포함하는 모든 안티센스 서열을 유전자 툴(Philomath, OR)에 의해 모르폴리노 화학을 이용하여 합성하였다.
1.3 세포.
3명의 건강한 대상체로부터 유래된 불멸화된 인간 골격근 세포(IDs 8220, CHQ, 및 KM 155) 및 DMD 유전자에 엑손 52의 결실 돌연변이(ID KM571) 및 엑손 48 내지 50의 결실 돌연변이(ID 6594)를 가지는 2명의 DMD 환자로부터 유래된 불멸화된 인간 골격근 세포를 각각 이전에 기술된 바와 같이, 근육학 연구소 인간 세포 불멸화 플랫폼에서 인간 텔로머라제-발현 및 사이클린-의존성 키나아제 4-발현 벡터로 형질도입하여 생성하였다. 3개의 불멸화된 건강한 근육 세포주를 특성화하고, 가장 높은 디스트로핀 발현을 보인 클론주 8220을 불멸화된 DMD 세포에서 구제된 디스트로핀 발현의 과대평가(overestimation)를 방지하기 위한 양성 대조군으로서 선택하였다. ex45-50의 결실 돌연변이(ID 4546) 및 ex49-50의 결실 돌연변이(ID 4555)를 가진 DMD 환자 및 건강한 대상체로부터 유래된 일차 골격근 세포를 골격근, 신경 조직, DNA 및 세포주의 바이오뱅크에 의해 제조되었다.
1.4 AO 형질감염
AO-매개성 엑손 스키핑 치료법의 생체 내 효과를 가능한 최대로 모방하기 위하여, 충분한 수준의 DMD mRNA를 발현하는 분화된 근관을 시험관 내 스크리닝에 사용하였다. 세포를 성장 배지(GM): 골격근 보충물 혼합물(Promocell, Heidelberg, Germany), 20% 소 태아 혈청(Life Technologies, Waltham, MA), 및 항생물질(50 유닛의 페니실린 및 50 μg/ml의 스트렙토마이신, Life Technologies, Waltham, MA)이 첨가된 DMEM/F12를 사용한 증식 조건에서 배양하였다. 불멸화된 일차 DMD 골격근 세포를 각각 1.7 × 104/cm2 및 2.2 × 104/cm2로 콜라겐 타입 1이 코팅된 12 또는 24-웰 배양 플레이트에 시딩하였다. 시딩 2일 후에, 대략 80 내지 90% 컨플루언스할 때, GM을 분화 배지(DM): 2% 말 혈청(GE Healthcare, Chicago, IL), 1× ITS 용액(Sigma, St. Louis, MO), 및 항생물질이 첨가된 DMEM/F12로 교체하였다. DM에서 3일 후에, 세포를 6 μM의 엔도-포터 형질감염 시약(Gene Tools, Philomath, OR)을 함유하는 1, 3, 5 또는 10 μM의 AO(1 mM의 농축된 AO를 65℃에서 10분 동안 항온처리한 후 바로 DM으로 희석함)로 형질감염시켰다. AO 형질감염 2일 후에, AO-함유 DM을 정규 DM으로 교체하였다. 세포를 AO 형질감염 후 2, 5, 또는 11일(분화 후 5, 8, 14일) 후에 수거하였다.
1.5 마우스.
동물 연구를 캐나나 알버타 대학의 동물실험윤리위원회, 국립 아동 의료 센터, 및 국립 신경 및 정신의학 센터(NCNP)에 의해 승인받았다. 4 내지 8주령의 C57BL/6J 배경을 가진 수컷 및 암컷 Dmd 엑손 52-결핍 mdx5242 및 야생형 마우스(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)를 준비하였다. 병든 마우스에서의 Dmd 돌연변이를 PCR을 사용한 유전형질분석(genotyping)에 의해 확인하였다. 인간 DMD 유전자를 가지며 마우스 Dmd 유전자는 결여된 형질전환 마우스 모델(hDMD/Dmd-널 마우스)을 수컷 hDMD 마우스(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)와 암컷 Dmd-널 마우스를 이종교배시킴으로써 생성하였다.
1.6 근육내 주사.
40 μL의 식염수 중 5 또는 20 μg의 AcO, Ac48, 에테플러센 또는 드리사퍼센의 마우스 버전 모르폴리노를 이전에 기술된 바와 같이 이소플루란을 이용한 흡입 마취 하에 경골 전방(tibialis anterior, TA) 근육에 근육내 주사하였다. 30 μL의 식염수 중 50 μg의 AcO 모르폴리노 및 유사체 에테플러센을 hDMD/Dmd-널 마우스의 TA 근육에 주사하였다. 모든 근육 샘플을 근육내 주사 후 2주 후에 수거하였다.
1.7 RT-PCR에 의한 엑손 스키핑 분석.
총 RNA를 이전에 기술된 바와 같이 트리졸(Invitrogen, Waltham, MA)로 추출하였다. 디스트로핀 mRNA를 검출하기 위한 RT-PCR을 Superscript III 원스텝 RT-PCR 시스템(Invitrogen, Waltham, MA) 및 각각 불멸화된 일차 골격근 세포에서 총 RNA의 200 ng 및 320 ng에 대해 0.2 μM의 전방향 및 역방향 프라이머(표 1 참조)를 사용하여 수행하였다. 프라이머를 Primer3Plus 소프트웨어를 사용하여 설계하였고, 이의 특이성을 건강한 인간 골격근 세포(세포주 8220)에서 확인하였다. RT-PCR 조건은 다음과 같았다: 5분 동안 50℃; 2분 동안 94℃; 94℃에서 15초, 60℃에서 30초, 및 68℃에서 35초를 35 사이클 반복; 및 5분 동안 68℃. PCR 생성물을 1.5% 아가로오스 겔에서 분리하였고, SYBR 세이프 DNA 겔 염색(Invitrogen, Waltham, MA)으로 시각화하였다. ImageJ 소프트웨어(NIH) 또는 MCE-202 MultiNA 시스템(Shimadzu, Kyoto, Japan)을 사용하여, 엑손 51 스키핑의 효율을 다음 식을 사용하여 계산하였다: 엑손 51-스킵된 전사체 세기 / (네이티브 + 중간물질 + 엑손 51-스킵된 전사체 세기) × 100(%) 
. 예상하지 못한 스플라이싱 사건으로 인해 발생할 수 있는, 네이티브 밴드 위의 알려지지 않은 상부 밴드를 스키핑 효율의 정량화에서 제외하였다. PCR 생성물의 서열을 빅 다이 터미네이터(Big Dye Terminator) v3.1(Applied Biosystems, Waltham, MA)로 확인하였다. GAPDH 또는 18S 리보좀 RNA를 내부 대조군으로서 사용하였다.
[표 1]
1.8 웨스턴 블롯팅
세포를 완전한, 최소의, EDTA를 포함하지 않는 프로테아제 억제제 칵테일(Roche, Basel, Switzerland)을 함유한 RIPA 완충액(Thermo Scientific, Waltham, MA)으로 수거한 후, 21-게이지 바늘을 10회 통과시킴으로써 균질화시켰다. 로딩 샘플로서의 상청액을 14,000 g에서 15분 동안 4℃에서의 원심분리에 의하여 준비하였다. 근육 조직으로부터의 단백질을 이전에 기술된 바와 같이 제조하였다. 증류수로 100배 희석한 상청액으로 Bradford 검정법을 사용하여 단백질 농도를 조정하였다. 10% SDS, 70 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5 mM EDTA, 20% 글리세롤, 0.004% 브로모페놀 블루 및 5% 2-메르캅토에탄올을 함유한 샘플 완충액 중 단백질을 70℃에서 10분 동안 가열하였다. 그런 다음 웨스탄 블롯팅을 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다. 32, 43, 44 세포 및 조직으로부터의 각각 12 μg 및 30 μg을 황산 도데실 나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 사용하였다. 블롯을 디스트로핀 C-말단에 대한 토끼 다클론성 항체(1:2500, ab15278, Abeam, Cambridge, United Kingdom)와 함께 차단 용액에서 또는 디스트로핀 로드 도메인에 대한 DYS1 항체(1:400, Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL)와 함께 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 일차 항체를 HRP-컨쥬게이션된 항-토끼 또는 마우스 IgG H+L 항체(1 :10,000, Bio-Rad, Hercules, CA)와 반응시켰다. AO에 의해 유도된 디스트로핀 단백질의 발현 수준을 ImageJ(NIH)를 사용하여, 비처리 DMD 세포, 또는 야생형 마우스로부터의 단백질로 희석된 건강한 8220 골격근 세포의 디스트로핀 단백질로부터의 보정 곡선(R2=0.93-0.99)을 사용하여 정량화하였다. 알파-튜불린을 로딩 대조군과 동일한 막에서 검출하였다. 이동 후 겔상의 미오신 중쇄(MyHC)를 로딩 대조군/분화 마커로서 쿠마시 브릴리언트 블루(Bio-Rad, Hercules, CA)로 염색하였다.
1.9 면역세포화학.
세포를 4% 파라포름알데하이드로 5분 동안 실온에서 고정시켰다. 0.01% Triton X-100을 함유한 PBS로 세척한 후에, 세포를 0.05% Triton X-100이 첨가된 PBS 중 10% 염소 혈청(Life Technologies, Waltham, MA)으로 20분 동안 차단한 후, 차단 용액으로 1:50 희석된 항-디스트로핀 C-말단(ab15278) 또는 로드 도메인(DYS1) 항체와 함께 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 디스트로핀 신호를 Alexa 488- 또는 594-컨쥬게이션된 2차 항체(1:500)로 검출하였다. 데스민(1:80, Abeam, Cambridge, United Kingdom) 및 MyHC-패스트 타입(1 :30, Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL)을 검출하여 세포의 근육 분화를 확인하였다. 세포를 DAPI(Invitrogen, Waltham, MA)와 함께 SlowFade Gold Antifade Mountant에 분석할 때까지 4℃에서 보관하였다.
1.10 면역조직화학.
비처리 및 처리된 mdx52 마우스의 TA 근육으로부터의 동결절편 상의 디스트로핀-양성 근육 섬유를 이전에 기술된 바와 같이 ab15278 항체로 검출하였다. 처리된 마우스에서 디스트로핀의 신호 세기를 신경 밀도 필터(Eclipse TE 2000-U, Nikon, Tokyo, Japan)를 사용하여 야생형에서의 신호 세기와 비교하였다.
1.11 통계학적 분석.
엑손 스키핑 및 디스트로핀 단백질 구제의 효율의 유의성을 측정하기 위하여, 불멸화된 세포에서 적어도 3개의 독립적인 실험, 일차 세포에서 3배수의(triplicate) 웰, 및 3 내지 7마리 마우스로부터 데이터 세트를 준비하였다. AO-처리 그룹간 통계학적 분석을 1원 변량분석(one-way ANOVA)하고, 사후(post hoc) Tukey-Kramer 다중 비교 테스트에 의해 수행하였다. 단순 선형 회귀 분석을 AO에 대한 용량 반응성에 대해 수행하였다. 통계학적 유의성을 모든 분석에 대해 p<0.05로 설정하였다.
2. 결과
2.1 엑손 51 스키핑에 대한 AO의 인실리코 스크리닝.
본 발명자들은 총 413개의 AO를 설계하였다: 각각 30-mer 및 25-mer 길이를 갖는 204개 및 209개 AO로, DMD 엑손 51의 모든 가능한 표적 부위를 포함한다(표 3 참조). 본 발명자들의 엑손 스키핑 효율 알고리즘('In Silico Screening Based on Predictive Algorithms as a Design Tool for Exon Skipping Oligonucleotides in Duchenne Muscular Dystrophy' Echigoya et al. PLOS ONE March 2015)은 엑손 51 스키핑에 대한 최고 효율이 엑손 51의 초기 5' 부위에서 30-mer AO에 대해 80.5%, 및 25-mer AO에 대해 41.2%인 것으로 예측하였다. 인실리코 스크리닝은 에테플러센에 의해 표적화된 30개-염기 영역에 대해 매우 낮은 엑손 스키핑 효율(23.7%)을 나타내었으며, 이는 테스트된 413개의 AO 후보 전부에서 92번째 순위였다. 드리사퍼센 표적 부위는 30-mer 에테플러센의 그것에 의해 완전히 포함되어 있음에 유의하여야 한다.
2.2 불멸화된 클론성 건강한 그리고 DMD 골격근 세포주의 특성화.
일차 DMD 근육 세포를 사용한 전임상 시험에서 중요한 문제는 낮은 순도의 근육 세포 및 불충분한 양의 디스트로핀 mRNA를 포함하며, 이는 AO 효능을 테스트하려고 할 때 문제를 일으킨다. 이들 장애를 극복하기 위하여, 본 발명자들은 3명의 건강한 대상체, 및 엑손 52(ex52) 및 ex48-50 결실(del.) 돌연변이(각각 ID KM571 및 6594)를 가진 2명의 DMD 환자로부터 불멸화된 클론 골격근 세포를 생성하였다. 테스트한 불멸화된 골격근 세포주 모두는 분화 유도 후 3일째부터 쉽게 검출 가능한 디스트로핀 mRNA를 발현하였다. DMD 세포에서 AO에 의해 유도된 디스트로핀 단백질 수준의 과대평가를 피하기 위하여, 본 발명자들은 3개의 불멸화된 건강한 골격근 세포주 중에서 웨스턴 블롯팅에 의해 측정된 가장 높은 수준의 디스트로핀 단백질을 가진 세포주(ID 8220)를 양성 대조군으로서 사용하도록 선택하였다. 8220 세포주에서 디스트로핀 단백질 발현을 또한 면역조직화학에 의해 확인하였다.
2.3 엑손 51 스키핑 AO의 시험관 내 스크리닝.
인실리코 스크리닝 결과에 기초하여, 본 발명자들은 시험관 내 스크리닝에 대해 서로 적어도 4개 염기만큼 떨어져 있는, 높은 순위 및 낮은 순위의 서열 두 개를 전부 포함하여, 8개의 30-mer AO를 선택하였다(표 2). 본 연구에서, 에테플러센 및 드리사퍼센 서열을 포함하는, 테스트된 모든 AO를 임상 시험에 등록된 환자에서 내약성이 좋은(well-tolerated) 것으로 입증된 모르폴리노 화학을 사용하여 합성하였다. 여기에서, 본 발명자들은 에테플러센 및 드리사퍼센(Gene Tools에 의해 제조됨)과 동일한 서열을 가지는 대조군 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드를 "유사체 에테플러센" 및 "유사체 드리사퍼센"으로서 명명하였다. RT-PCR에서, 10 μM의 본 발명자들의 모르폴리노 AO 중 5개(AcO, Ac5, Ac26, Ac30 및 Ac48)가 ex52 del.을 가지는 불멸화된 DMD 골격근 세포에서 유사체 에테플러센 및 드리사퍼센과 비교하여 상당히 더 높은 스키핑 효율을 나타냈다(도 1A). 테스트한 AO 중에서, 특히 AcO가 최대 72%에 달하는 가장 높은 스키핑 효율을 가졌고, 에테플러센 및 드리사퍼센의 유사체보다 각각 4배 및 25배 더 효율적이었다. 웨스턴 블롯팅에서, AcO는 또한 건강한 대조군 세포주에서의 수준의 16%에 달하는 최고 수준의 디스트로핀 단백질을 유도하였고, 그 다음 Ac48이 13%였다(도 1B). 흥미롭게도, 테스트했을 때 최고의 스키핑 효율을 가진 2개의 AO인 AcO 및 Ac48은 알고리즘으로부터 최상인 것으로 예측되었던 것들이 아니었다.
[표 2]
Ac, 억셉터 스플라이스 부위. 대문자로 쓰이지 않은 뉴클레오타이드는 인트론 서열을 나타낸다. a25-mer AO에서의 순위.
2.4 AcO, Ac48, 및 에테플러센 및 드리사퍼센의 유사체 AO를 이용한 시간 경시적(time-course) 분석.
5 μM의 AcO, Ac48, 및 에테플러센 및 드리사퍼센의 유사체의 지속적인 효과를 ex52 del. KM571 세포에서 조사하였다. 엑손 스키핑 효율 및 디스트로핀 단백질 구제와 관련하여, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 AcO 및 Ac48의 우월성을 에테플러센 및 드리사퍼센의 유사체 AO와 비교하여 형질감염 후 2일 및 11일 후에 관찰하였다(도 2).
2.5 AcO, Ac48, 및 유사체 에테플러센 및 드리사퍼센의 용량 의존적 효과.
RT-PCR은 10 μM의 최고 농도에서 AcO가 DMD KM571(ex52 del.) 및 6594 세포(ex48-50 del.)에서 각각 에테플러센 및 드리사퍼센의 유사체보다 상당히 더 높은 최대 74% 및 64%의 엑손 51 스키핑을 유도하였음을 보여주었다(도 3). 최저 농도(1 μM)에서, AcO는 KM571 및 6594 세포에서 유사체 에테플러센과 비교하여 각각 12배 및 10배 더 높은 엑손 스키핑 효율을 보였다. 흥미롭게도, 1 μM의 농도에서도 AcO는 10 μM 유사체 에테플러센보다 더 높은 수준의 엑손 51 스키핑을 유도하였다(각각, KM571에서 24% 효율 대 15%, 및 6594에서 24% 효율 대 21%). 정량적 웨스턴 블롯팅은 10 μM AcO는 DMD 세포주에서 디스트로핀 단백질 발현을 건강한 세포주 수준의 최대 21%로 구제하였음을 나타냈다(도 3A 내지 D). 1 μM에서도, AcO의 유사체 에테플러센에 대한 상대적인 비율은 KM571 및 6594 세포주에서 디스트로핀 단백질을 생성하는 데 있어 각각 7.1 및 3.3배 더 높은 효율을 나타냈다. 1 μM의 AcO는 10 μM의 유사체 에테플러센보다 5배 더 높은 또는 비슷한 수준에서 구제된 디스트로핀 단백질의 생성을 가능하게 하였고(각각 KM571에서 10% 대 6% 및 6594에서 11% 대 10%), AcO가 유사체 에테플러센 농도 방식과 비교하여 디스트로핀 단백질 생성에서 10배 이상 더 효과적인 것을 확인시켜준다. 유사체 드리사퍼센은 DMD 근육 세포주에서 엑손 스키핑 또는 디스트로핀 생성 중 어느 하나에 대해 효과적으로 작용하지 못하였다. AcO 및 Ac48에 대한 엑손 스키핑 반응은 유사체 에테플러센, 및 유사체 드리사퍼센 둘 다보다 큰 용량 의존적 방식으로 발생하였다(도 3A 및 C). 디스트로핀 단백질 생성과 관련하여 AcO의 용량 반응성 또한 두 DMD 세포주에서 대조군 유사체보다 높았다(도 3E).
2.6 디스트로핀 단백질 구제의 면역세포화학적 평가.
면역세포화학은 10 μM의 AcO 및 Ac48이 디스트로핀-양성 근관을 더 유발하였고, 유사체 에테플러센과 비교하여 ex52 및 ex48-50 del. 돌연변이를 가지는 DMD 골격근 세포주에서 더 강력한 신호 세기를 나타냈음을 보여주었다(도 4).
2.7 AcO 모르폴리노의 길이 최적화.
인실리코 및 시험관 내 스크리닝은 0과 +89 사이의 엑손 51의 초기 5' 영역이 엑손 51 스키핑에 영향을 미치기 위한 중요한 영역임을 보여주었다. 이 영역을 표적화하는 AcO의 서열 길이를 최적화하기 위하여, 본 발명자들은 상이한 길이(25- 내지 30-mer)의 AcO 모르폴리노의 스키핑 효율을 비교하였으며, 여기에서 5' 부위에서의 뉴클레오타이드는 한번에 하나씩 체계적으로 제거되었다(표 2 참조). 1 μM의 이들 AO로 처리된 불멸화된 DMD 근육 세포에서의 시험관 내 테스트는 25 내지 30-mer AcO 모르폴리노가 효율적인 엑손 스키핑(>20%)을 생성한 것을 보여주었고(도 5), 그 효과는 동일한 용량의 유사체 에테플러센, 및 유사체 드리사퍼센에서는 관찰되지 않았다(도 3). 그러나, AO의 길이가 증가함에 따라 엑손 스키핑의 효율은 증가하였다. 30-mer AcO의 통계학적으로 유의한 유효성을, 두 세포주에서 더 짧은 AcO 모르폴리노, 심지어 1개 또는 2개 염기만이 더 짧은 AO와 비교하여 1 및 3 μM 용량에서 확인하였다.
2.8 일차 DMD 환자-유래 골격근 세포에 대한 AcO, Ac48, 및 유사체 에테플러센 및 드리사퍼센의 영향.
본 발명자들은 또한 30-mer AcO의 우수한 효능이 다른 근육 세포 유형 및 결실 돌연변이 패턴과 일치하는지를 확인하기 위하여, 엑손 45-50(ID 4546) 또는 엑손 49-50 del. 돌연변이(ID 4555)를 가진 일차 DMD 골격근 세포에서 AO를 테스트하였다. RT-PCR은 AcO가 유사체 에테플러센, 또는 유사체 드리사퍼센과 비교하여 두 일차 DMD 근육 세포에서 상당히 더 높은 엑손 스키핑 효율을 달성하였음을 보여주었다(도 6A 내지 D): 유사체 에테플러센 및 드리사퍼센과 비교하여 각각 최대 5 및 7배 더 높은 효율이 관찰되었다. AcO-매개성 엑손 51 스키핑의 현저한 효율은 또한 일차의 건강한 골격근 세포에서도 확인되었다(도 6E 및 F). 흥미롭게도, 증가하는 엑손 51 스키핑 효율과 함께, 리딩 프레임을 파괴하지 않는 자발적 엑손 52 스키핑이 일차의 건강한 그리고 DMD 근육 세포, 및 ex48-50 del.(6594)를 가진 불멸화된 DMD 근육 세포주에서 관찰되었다.
2.10 hDMD/Dmd-널 마우스에서 AcO 모르폴리노 및 유사체 에테플러센의 생체 내 효능.
엑손 스키핑 치료법의 개발에 있어서 주요 장애물은 인간-특이적 AO가 언제나 적절한 동물 모델에서 테스트될 수는 없다는 것이다. 이것은 환자에 대해 설계된 AO의 생체 내 효과의 평가를 제한한다. 여기에서, 본 발명자들은 인간 AO의 생체 내 효능을 테스트하기 위하여, 전장 인간 DMD 유전자를 갖지만 전체 마우스 Dmd 유전자는 없는 새로운 마우스 모델(hDMD/Dmd-널)을 개발하였다. 이 마우스 모델을 사용하여 인간 서열과 마우스 서열 사이의 교차 반응을 회피하였으며(종래의 mdx 마우스는 여전히 마우스 디스트로핀 mRNA를 가지며, 그것은 인간-표적화 AO와 교차 반응할 수 있음에 유의하여야 함), hDMD mice34와 Dmd-널 mice35 사이의 이종 교배에 의해 얻었다. AcO, Ac48, 유사체 에테플러센 또는 유사체 드리사퍼센을 이들 마우스의 TA 근육에 주사하고, 생체 내 엑손 51 스키핑의 유효성을 주사 후 2주째에 분석하였다. 그 결과는 유사체 에테플러센과 비교하여 AcO로 처리된 마우스에서 상당히 더 큰 엑손 스키핑 효율을 나타냈다(도 7). 가시적인 엑손 51-스킵된 밴드가 Ac48-처리된 마우스에서 나타났으며, 이때 평균 엑손 스키핑 효율은 1.11%(± 0.46%, SE)였다. 다른 한편으로, 유사체 드리사퍼센으로 처리된 마우스에서 정량화 가능한 엑손 51-스킵된 밴드는 관찰되지 않았다(도 8).
서열
GTGTCACCAGAGTAACAGTCTGAGTAGGAG AcO(서열번호 1)
AGGTTGTGTCACCAGAGTAACAGTCTGAGT Ac5(서열번호 2)
GGCAGTTTCCTTAGTAACCACAGGTTGTGT Ac26(서열번호 3)
AGATGGCAGTTTCCTTAGTAACCACAGGTT Ac30(서열번호 4)
ATGGCATTTCTAGTTTGGAGATGGCAGTTT Ac48(서열번호 5)
CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG 에테플러센(서열번호 6)
TCAAGGAAGATGGCATTTCT 드리사퍼센(서열번호 7)
TGTCACCAGAGTAACAGTCTGAGTAGGAG hEx51_AcO-29mer(서열번호 8)
GTCACCAGAGTAACAGTCTGAGTAGGAG hEx51_AcO-28mer(서열번호 9)
TCACCAGAGTAACAGTCTGAGTAGGAG hEx51_AcO-27mer(서열번호 10)
CACCAGAGTAACAGTCTGAGTAGGAG hEx51_AcO-26mer(서열번호 11)
ACCAGAGTAACAGTCTGAGTAGGAG hEx51_AcO-25mer(서열번호 12)
CCACAGGTTGTGTCACCAGAGTAACAGTCT Ac9(서열번호 13)
TTATAACTTGATCAAGCAGAGAAAGCCAGT Ac141(서열번호 14)
atacCTTCTGCTTGATGATCATCTCGTTGA Ac207(서열번호 15)
CAGCCAGTGAAGAGGAAGTTAG Ex49/50_94-10_hDMD_Fwd(서열번호 16)
CCAGCCATTGTGTTGAATCC Ex53_80-99_hDMD_Rv(서열번호 17)
AGGACCCGTGCTTGTAAGTG Ex47_60-79_hDMD_Fwd(서열번호 18)
GATTGTTCTAGCCTCTTGATTGC Ex52_83-105_hDMD_Rv(서열번호 19)
GACAAGGGCGATTTGACAG Ex43/44_167-12_hDMD_Fwd(서열번호 20)
CAAGCACTCAGCCAGTGAAG mDmd_ex49_83-102_Fwd(서열번호 21)
TCCAGCCATTGTGTTGAATC 결실 mDmd_ex53_81-100_Rv(서열번호 22)
TCCCTGAGCTGAACGGGAAG hGAPDH_662-81_Fwd(서열번호 23)
TCCAGCCATTGTGTTGAATC 대조군 hGAPDH_860-79_Rv(서열번호 24)
TCGATGCTCTTAGCTGAGTGTCC h18S_760-82_Fwd(서열번호 25)
TGATCGTCTTCGAACCTCCG 대조군 h18S_1039-58_Rv(서열번호 26)
[표 3]
SEQUENCE LISTING
<110> THE GOVERNORS OF THE UNIVERSITY OF ALBERTA
<120> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE
<130> P20-017-INP-HGF
<140> PCT/CA2018/050881
<141> 2018-07-20
<150> GB 1711809.2
<151> 2017-07-21
<160> 440
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 1
gtgtcaccag agtaacagtc tgagtaggag 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 2
aggttgtgtc accagagtaa cagtctgagt 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 3
ggcagtttcc ttagtaacca caggttgtgt 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 4
agatggcagt ttccttagta accacaggtt 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 5
atggcatttc tagtttggag atggcagttt 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 6
ctccaacatc aaggaagatg gcatttctag 30
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 7
tcaaggaaga tggcatttct 20
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 8
tgtcaccaga gtaacagtct gagtaggag 29
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 9
gtcaccagag taacagtctg agtaggag 28
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 10
tcaccagagt aacagtctga gtaggag 27
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 11
caccagagta acagtctgag taggag 26
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 12
accagagtaa cagtctgagt aggag 25
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 13
ccacaggttg tgtcaccaga gtaacagtct 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 14
ttataacttg atcaagcaga gaaagccagt 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 15
ataccttctg cttgatgatc atctcgttga 30
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
cagccagtga agaggaagtt ag 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
ccagccattg tgttgaatcc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
aggacccgtg cttgtaagtg 20
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 19
gattgttcta gcctcttgat tgc 23
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 20
gacaagggcg atttgacag 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 21
caagcactca gccagtgaag 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
tccagccatt gtgttgaatc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 23
tccctgagct gaacgggaag 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
tccagccatt gtgttgaatc 20
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 25
tcgatgctct tagctgagtg tcc 23
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
tgatcgtctt cgaacctccg 20
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 27
ccacaggttg tgtcaccaga gtaacagtct 30
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gcaggtacct ccaacatcaa ggaagatggc 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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gatatcctca aggtcaccca ccatcaccct 30
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cctctgtgat tttataactt gatcaagcag 30
<210> 203
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 203
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ttgatatcct caaggtcacc caccatcacc 30
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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tgtgatttta taacttgatc aagcagagaa 30
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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gttgatatcc tcaaggtcac ccaccatcac 30
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<212> DNA
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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tcgttgatat cctcaaggtc acccaccatc 30
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<211> 30
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<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<211> 30
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<213> Artificial Sequence
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catctcgttg atatcctcaa ggtcacccac 30
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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tcatctcgtt gatatcctca aggtcaccca 30
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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atctcgttga tatcctcaag gtcacccacc 30
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<211> 30
<212> DNA
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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atcatctcgt tgatatcctc aaggtcaccc 30
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<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 219
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<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 285
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 290
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 292
agcccggttg aaatctgcca gagca 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 293
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 294
ccggttgaaa tctgccagag caggt 25
<210> 295
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 295
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 296
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 297
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<210> 298
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 298
tccaagcccg gttgaaatct gccag 25
<210> 299
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 299
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<212> DNA
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 300
ggagatggca gtttccttag taacc 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 301
atctgccaga gcaggtacct ccaac 25
<210> 302
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 302
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 303
ggttgaaatc tgccagagca ggtac 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 304
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<210> 305
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 305
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 307
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
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<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 309
cggttgaaat ctgccagagc aggta 25
<210> 310
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 310
gcagagaaag ccagtcggta agttc 25
<210> 311
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
<400> 311
gagcaggtac ctccaacatc aagga 25
<210> 312
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
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cagtcggtaa gttctgtcca agccc 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> morpholino antisense oligonucleotide
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accctctgtg attttataac ttgat 25
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gcttgatgat catctcgttg atatc 25
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accatcaccc tctgtgattt tataa 25
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tctgcttgat gatcatctcg ttgat 25
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cttctgcttg atgatcatct cgttg 25
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<223> Table 1. control hGAPDH_860 79_Rv
<400> 440
ggaggagtgg gtgtcgctgt 20
Claims (24)
- 인간 디스트로핀 전-mRNA(dystrophin pre-mRNA)의 엑손 51에 결합하고 엑손 스키핑을 유도할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)로서,
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 서열번호 5(Ac48), 서열번호 13(Ac9), 또는 서열번호 15(Ac207) 중 하나의 적어도 27개 뉴클레오타이드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드. - 제1항에 있어서,
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 28개 뉴클레오타이드, 적어도 29개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 30개 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 안티센스 올리고뉴클레오타이드. - 제1항에 있어서,
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 30개 뉴클레오타이드로 구성되는 것인 안티센스 올리고뉴클레오타이드. - 제1항에 있어서,
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드. - 제1항에 있어서,
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 유사체인 안티센스 올리고뉴클레오타이드. - 제1항에 있어서,
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 서열번호 5(Ac48), 서열번호 13(Ac9), 또는 서열번호 15(Ac207) 중 하나를 포함하는 것인 안티센스 올리고뉴클레오타이드. - 제1항에 있어서,
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 서열번호 5(Ac48), 서열번호 13(Ac9), 또는 서열번호 15(Ac207)로 구성되는 것인 안티센스 올리고뉴클레오타이드. - 제1항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 담체를 포함하는 컨쥬게이트로서,
담체가 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 컨쥬게이션되어 있는, 컨쥬게이트. - 제8항에 있어서,
담체는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 표적 세포로 수송하도록 작동 가능한(operable) 것인 컨쥬게이트. - 제8항에 있어서,
담체는 펩타이드, 소분자 화학물질, 중합체, 나노입자, 지질, 리포솜, 세포 침투 펩타이드, 아르기닌-풍부 세포 침투 펩타이드 또는 엑소좀으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트. - 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트가 로딩된 세포.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및/또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 근육 장애(muscular disorder)를 치료하기 위한 약학 조성물.
- 대상체에서 근육 장애(muscular disorder)의 치료에 사용하기 위한, 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 결합하여 엑손 스키핑을 유도할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로서,
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음 서열: 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30), 서열번호 5(Ac48), 서열번호 13(Ac9), 또는 서열번호 15(Ac207) 중 하나의 적어도 27개 뉴클레오타이드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드. - 제13항에 있어서,
근육 장애는 근육 기능과 관련된 유전자의 유전자 돌연변이로부터 유발되는 장애, 듀시엔형 근이영양증(Duchenne Muscular Dystrophy) 또는 베커형 근이영양증(Becker muscular dystrophy)인 것인 안티센스 올리고뉴클레오타이드. - 삭제
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| EP3978608A1 (en) * | 2020-10-05 | 2022-04-06 | SQY Therapeutics | Oligomeric compound for dystrophin rescue in dmd patients throughout skipping of exon-51 |
| US11638761B2 (en) | 2021-07-09 | 2023-05-02 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy |
| US11771776B2 (en) | 2021-07-09 | 2023-10-03 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies |
| MX2024002640A (es) | 2021-09-01 | 2024-07-19 | Entrada Therapeutics Inc | Compuestos y metodos para salto de exon 44 en la distrofia muscular de duchenne. |
| WO2023168427A1 (en) | 2022-03-03 | 2023-09-07 | Yale University | Compositions and methods for delivering therapeutic polynucleotides for exon skipping |
| CN115806984B (zh) * | 2022-10-18 | 2023-10-10 | 昆明理工大学 | 环状rna及载体和载体的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004083446A2 (en) * | 2003-03-21 | 2004-09-30 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure |
| WO2014197748A2 (en) * | 2013-06-05 | 2014-12-11 | Duke University | Rna-guided gene editing and gene regulation |
Family Cites Families (158)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
| US4694778A (en) | 1984-05-04 | 1987-09-22 | Anicon, Inc. | Chemical vapor deposition wafer boat |
| US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
| US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
| US5506337A (en) | 1985-03-15 | 1996-04-09 | Antivirals Inc. | Morpholino-subunit combinatorial library and method |
| US5166315A (en) | 1989-12-20 | 1992-11-24 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
| US5217866A (en) | 1985-03-15 | 1993-06-08 | Anti-Gene Development Group | Polynucleotide assay reagent and method |
| US5521063A (en) | 1985-03-15 | 1996-05-28 | Antivirals Inc. | Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use |
| ATE171185T1 (de) | 1985-03-15 | 1998-10-15 | Antivirals Inc | Immunotestmittel für polynukleotid und verfahren |
| US4828971A (en) | 1988-03-24 | 1989-05-09 | Eastman Kodak Company | Thermally processable element comprising a backing layer |
| CA1251835A (en) | 1988-04-05 | 1989-03-28 | Wai-Cheung Tang | Dielectric image-resonator multiplexer |
| WO1991004753A1 (en) | 1989-10-02 | 1991-04-18 | Cetus Corporation | Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof |
| EP0552178B1 (en) | 1990-10-12 | 1997-01-02 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Modified ribozymes |
| DE4216134A1 (de) | 1991-06-20 | 1992-12-24 | Europ Lab Molekularbiolog | Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen |
| US5652094A (en) | 1992-01-31 | 1997-07-29 | University Of Montreal | Nucleozymes |
| US5627053A (en) | 1994-03-29 | 1997-05-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid |
| CN1120156C (zh) | 1994-06-17 | 2003-09-03 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | N,n′－二(喹啉－4－基)－二胺衍生物、其制备及作为抗疟药的应用 |
| US5716824A (en) | 1995-04-20 | 1998-02-10 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-alkylthioalkyl and 2-C-alkylthioalkyl-containing enzymatic nucleic acids (ribozymes) |
| US5889136A (en) | 1995-06-09 | 1999-03-30 | The Regents Of The University Of Colorado | Orthoester protecting groups in RNA synthesis |
| WO1997026270A2 (en) | 1996-01-16 | 1997-07-24 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Synthesis of methoxy nucleosides and enzymatic nucleic acid molecules |
| EP0904107B1 (en) | 1996-03-18 | 2004-10-20 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobin-like domains with increased half lives |
| US5849902A (en) | 1996-09-26 | 1998-12-15 | Oligos Etc. Inc. | Three component chimeric antisense oligonucleotides |
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| US8273866B2 (en) | 2002-02-20 | 2012-09-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA) |
| US6784291B2 (en) | 2000-05-04 | 2004-08-31 | Avi Biopharma, Inc. | Splice-region antisense composition and method |
| EP1191097A1 (en) * | 2000-09-21 | 2002-03-27 | Leids Universitair Medisch Centrum | Induction of exon skipping in eukaryotic cells |
| US6884869B2 (en) | 2001-04-30 | 2005-04-26 | Seattle Genetics, Inc. | Pentapeptide compounds and uses related thereto |
| US9657294B2 (en) | 2002-02-20 | 2017-05-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
| AU2003207708A1 (en) | 2002-02-20 | 2003-09-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | Rna interference mediated inhibition of map kinase genes |
| US9181551B2 (en) | 2002-02-20 | 2015-11-10 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
| AU2002257333A1 (en) * | 2002-02-22 | 2003-09-09 | Linda L. Bambrick | Novel treatment of neurodegenerative diseases by altering levels of trkb isoforms and/or trkc isoforms |
| US20040023220A1 (en) | 2002-07-23 | 2004-02-05 | Lawrence Greenfield | Integrated method for PCR cleanup and oligonucleotide removal |
| SI3222724T1 (sl) | 2002-08-05 | 2019-03-29 | Silence Therapeutics Gmbh | Nadaljnje nove oblike molekul interferenčne RNA |
| US7956176B2 (en) | 2002-09-05 | 2011-06-07 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
| DK2284266T3 (da) | 2002-11-14 | 2014-01-13 | Thermo Fisher Scient Biosciences Inc | sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53 |
| US7250496B2 (en) | 2002-11-14 | 2007-07-31 | Rosetta Genomics Ltd. | Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof |
| ES2566632T3 (es) * | 2002-11-25 | 2016-04-14 | Masafumi Matsuo | Fármacos de ácido nucleico ENA que modifican el corte y empalme en precursores de ARNm |
| US8084582B2 (en) | 2003-03-03 | 2011-12-27 | Xencor, Inc. | Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants |
| BR122018071808B8 (pt) | 2003-11-06 | 2020-06-30 | Seattle Genetics Inc | conjugado |
| US7494925B2 (en) | 2004-02-23 | 2009-02-24 | Micron Technology, Inc. | Method for making through-hole conductors for semiconductor substrates |
| EP2206781B1 (en) | 2004-06-28 | 2015-12-02 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| FR2874384B1 (fr) * | 2004-08-17 | 2010-07-30 | Genethon | Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables |
| JP2008519863A (ja) | 2004-11-12 | 2008-06-12 | シアトル ジェネティクス インコーポレイティッド | Ｎ末端にアミノ安息香酸単位を有するオーリスタチン |
| US7429482B2 (en) | 2005-01-13 | 2008-09-30 | United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Screening tools for discovery of novel anabolic agents |
| WO2006112705A2 (en) * | 2005-04-22 | 2006-10-26 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the binding of sr proteins and by interfering with secondary rna structure. |
| US7736647B2 (en) | 2005-06-15 | 2010-06-15 | Monoclonal Antibodies Therapeutics | Anti-CD71 monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignant tumor cells |
| EP1937312B1 (en) | 2005-08-30 | 2016-06-29 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds for modulation of splicing |
| KR100699874B1 (ko) | 2005-11-08 | 2007-03-28 | 삼성전자주식회사 | 삽입형 연결부를 갖는 비. 지. 에이 패키지 그 제조방법 및이를 포함하는 보드 구조 |
| LT2024499T (lt) | 2006-05-10 | 2018-02-26 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Oligonukleotido analogai, turintys katijonines jungtis tarp subvienetų |
| EP1857548A1 (en) | 2006-05-19 | 2007-11-21 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Means and method for inducing exon-skipping |
| NZ574807A (en) | 2006-08-11 | 2011-01-28 | Prosensa Technologies Bv | Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders |
| US9063129B2 (en) | 2007-06-15 | 2015-06-23 | Idexx Laboratories, Inc. | Device, kit and method for hookworm antigen capture and detection |
| EP2170363B1 (en) * | 2007-06-29 | 2018-08-08 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Tissue specific peptide conjugates and methods |
| WO2009026933A1 (en) | 2007-08-29 | 2009-03-05 | Vestas Wind Systems A/S | Monopile foundation for offshore wind turbine |
| CN101896186A (zh) | 2007-10-26 | 2010-11-24 | 莱顿教学医院 | 对抗肌肉病症的方式和方法 |
| WO2009099991A2 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-13 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Treatment of cancer |
| US20110065774A1 (en) | 2008-01-31 | 2011-03-17 | Alnylam Pharmaceuticals | Chemically modified oligonucleotides and uses thereof |
| US8609105B2 (en) | 2008-03-18 | 2013-12-17 | Seattle Genetics, Inc. | Auristatin drug linker conjugates |
| AU2009234266B2 (en) | 2008-04-11 | 2015-08-06 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components |
| US8248352B2 (en) | 2008-04-25 | 2012-08-21 | Lg Display Co., Ltd. | Driving circuit of liquid crystal display |
| EP2119783A1 (en) | 2008-05-14 | 2009-11-18 | Prosensa Technologies B.V. | Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means |
| WO2009144481A2 (en) | 2008-05-30 | 2009-12-03 | Isis Innovation Limited | Conjugates for delivery of biologically active compounds |
| WO2009147368A1 (en) | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Medical Research Council | Peptides |
| US8084601B2 (en) | 2008-09-11 | 2011-12-27 | Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London | Oligomers |
| SI3133160T1 (sl) * | 2008-10-24 | 2019-05-31 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Sestavki, ki preskakujejo ekson za DMD |
| AU2013204838B2 (en) | 2008-10-24 | 2016-12-22 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Multiple exon skipping compositions for DMD |
| DK2607484T3 (en) | 2008-10-27 | 2016-03-07 | Biomarin Technologies B V | Methods and means for efficient skipping of exon 45 in Duchenne muscular dystrophy pre-MRNA |
| KR101602431B1 (ko) | 2008-11-05 | 2016-03-10 | 삼성전자 주식회사 | 냉장고 |
| CA2744987C (en) | 2008-12-02 | 2018-01-16 | Chiralgen, Ltd. | Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids |
| WO2010115033A2 (en) | 2009-04-02 | 2010-10-07 | Regents Of The University Of Minnesota | Nucleotide repeat expansion-associated polypeptides and uses thereof |
| US20120149756A1 (en) * | 2009-04-10 | 2012-06-14 | Associatin Institut de Myologie | Tricyclo-dna antisense oligonucleotides, compositions, and methods for the treatment of disease |
| ES2593836T3 (es) | 2009-04-24 | 2016-12-13 | Biomarin Technologies B.V. | Oligonucleótido que comprende una inosina para tratar la DMD |
| WO2010129666A1 (en) | 2009-05-05 | 2010-11-11 | Altermune Technologies, Llc | Chemically programmable immunity |
| US20110269665A1 (en) | 2009-06-26 | 2011-11-03 | Avi Biopharma, Inc. | Compound and method for treating myotonic dystrophy |
| US20120172415A1 (en) | 2009-08-31 | 2012-07-05 | Thomas Voit | Exon Skipping Therapy for Functional Amelioration of Semifunctional Dystrophin in Becker and Duchenne Muscular Dystrophy |
| TR201804897T4 (tr) | 2009-10-07 | 2018-06-21 | Macrogenics Inc | Fukosi̇lasyon ölçüsünün deği̇şi̇mleri̇nden dolayi geli̇şmi̇ş efektör i̇şlevi̇ sergi̇leyen fc bölgesi̇ni̇ i̇çeren poli̇pepti̇tler ve bunlarin kullanimlarina yöneli̇k yöntemler |
| ES2693459T3 (es) * | 2009-11-12 | 2018-12-11 | The University Of Western Australia | Moléculas antisentido y métodos para el tratamiento de patologías |
| WO2011078797A2 (en) * | 2009-12-22 | 2011-06-30 | Singapore Health Services Pte. Ltd | Antisense oligonucleotides and uses threreof |
| EP2558475A1 (en) | 2010-04-15 | 2013-02-20 | Spirogen Sàrl | Pyrrolobenzodiazepines used to treat proliferative diseases |
| US9242013B2 (en) | 2010-04-15 | 2016-01-26 | Seattle Genetics Inc. | Targeted pyrrolobenzodiazapine conjugates |
| TWI620756B (zh) | 2010-05-28 | 2018-04-11 | 薩羅塔治療公司 | 具有經修飾之單元間連結及／或末端基團之寡核苷酸類似物 |
| IT1400425B1 (it) | 2010-06-08 | 2013-05-31 | Amsterdam Molecular Therapeutics Bv | Modified snrnas for use in therapy. |
| WO2011154542A1 (en) | 2010-06-11 | 2011-12-15 | Artisense Pharma Gmbh | Method for selective oligonucleotide modification |
| WO2012012443A2 (en) | 2010-07-19 | 2012-01-26 | Bennett C Frank | Modulation of dystrophia myotonica-protein kinase (dmpk) expression |
| DK2632472T3 (en) | 2010-10-29 | 2018-03-19 | Sirna Therapeutics Inc | RNA INTERFERENCE-MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERRING NUCLEIC ACIDS (SINA) |
| US8501930B2 (en) * | 2010-12-17 | 2013-08-06 | Arrowhead Madison Inc. | Peptide-based in vivo siRNA delivery system |
| WO2012109296A1 (en) * | 2011-02-08 | 2012-08-16 | The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority D/B/A Carolinas Medical Center | Antisense oligonucleotides |
| HUE041335T2 (hu) | 2011-03-29 | 2019-05-28 | Roche Glycart Ag | Antitest FC-variánsok |
| WO2012138487A2 (en) | 2011-04-07 | 2012-10-11 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Oligonucleotide modulation of splicing |
| US9161948B2 (en) | 2011-05-05 | 2015-10-20 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Peptide oligonucleotide conjugates |
| US9598496B2 (en) | 2011-05-09 | 2017-03-21 | Perseus Proteomics Inc. | Antibody capable of specifically recognizing transferrin receptor |
| EP2732035A2 (en) | 2011-07-15 | 2014-05-21 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for manipulating translation of protein isoforms from alternative initiation start sites |
| SG10201700554VA (en) | 2011-07-19 | 2017-03-30 | Wave Life Sciences Pte Ltd | Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids |
| US9418216B2 (en) | 2011-07-21 | 2016-08-16 | Microsoft Technology Licensing, Llc | Cloud service authentication |
| US9302014B2 (en) | 2011-08-30 | 2016-04-05 | Medical Research Council | Cell-penetrating peptides having a central hydrophobic domain |
| US9526798B2 (en) | 2011-10-14 | 2016-12-27 | Seattle Genetics, Inc. | Pyrrolobenzodiazepines and targeted conjugates |
| KR102689177B1 (ko) | 2011-11-18 | 2024-07-30 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 변형된 ＲＮＡｉ 제제 |
| EP4043039A1 (en) | 2012-01-27 | 2022-08-17 | BioMarin Technologies B.V. | Rna modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of duchenne and becker muscular dystrophy |
| WO2013121175A1 (en) | 2012-02-16 | 2013-08-22 | Ucl Business Plc | Lysosome-cleavable linker |
| AR090905A1 (es) | 2012-05-02 | 2014-12-17 | Merck Sharp & Dohme | Conjugados que contienen tetragalnac y peptidos y procedimientos para la administracion de oligonucleotidos, composicion farmaceutica |
| CN104640572B (zh) | 2012-05-15 | 2018-04-27 | 索伦托医疗有限公司 | 药物偶联物，偶联方法，及其用途 |
| US9504756B2 (en) | 2012-05-15 | 2016-11-29 | Seattle Genetics, Inc. | Self-stabilizing linker conjugates |
| CA2877644A1 (en) * | 2012-07-03 | 2014-01-09 | Prosensa Technologies B.V. | Oligonucleotide for the treatment of muscular dystrophy patients |
| WO2014012081A2 (en) | 2012-07-13 | 2014-01-16 | Ontorii, Inc. | Chiral control |
| KR101819404B1 (ko) | 2012-10-12 | 2018-02-28 | 메디뮨 리미티드 | 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트 |
| WO2014080251A1 (en) | 2012-11-24 | 2014-05-30 | Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. | Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules |
| EP3885439A1 (en) | 2012-12-20 | 2021-09-29 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Improved exon skipping compositions for treating muscular dystrophy |
| SG10201705150RA (en) | 2012-12-21 | 2017-07-28 | Bioalliance Cv | Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof |
| US9481905B2 (en) | 2013-02-19 | 2016-11-01 | Orizhan Bioscience Limited | Method of using neutrilized DNA (N-DNA) as surface probe for high throughput detection platform |
| US9319764B2 (en) | 2013-03-08 | 2016-04-19 | Merry Electronics Co., Ltd. | MEMS microphone packaging structure |
| EP3633035A1 (en) | 2013-03-14 | 2020-04-08 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy |
| CN105188766B (zh) | 2013-03-15 | 2019-07-12 | 瑞泽恩制药公司 | 生物活性分子、其偶联物及治疗用途 |
| EP2777714A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-17 | NBE-Therapeutics LLC | Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme |
| BR112015022998A2 (pt) | 2013-03-15 | 2017-11-14 | Sarepta Therapeutics Inc | composições melhoradas para o tratamento de distrofia muscular |
| US9577459B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-02-21 | Sequana Medical Ag | Systems and methods for regulating inductive energy transfer to an implantable system |
| US9295731B2 (en) | 2013-04-01 | 2016-03-29 | Mark Quang Nguyen | Cleavable drug conjugates, compositions thereof and methods of use |
| US9849066B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-12-26 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| JP2016520574A (ja) | 2013-04-28 | 2016-07-14 | 秦剛 | 新規リンカー、その製造方法およびその応用 |
| PE20151926A1 (es) | 2013-05-20 | 2016-01-07 | Genentech Inc | Anticuerpos de receptores de antitransferrina y metodos de uso |
| WO2014190441A1 (en) | 2013-05-31 | 2014-12-04 | Zymeworks Inc. | Heteromultimers with reduced or silenced effector function |
| WO2014197854A1 (en) | 2013-06-06 | 2014-12-11 | Igenica Biotherapeutics, Inc. | Novel linkers for antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods of use |
| TW201536329A (zh) | 2013-08-09 | 2015-10-01 | Isis Pharmaceuticals Inc | 用於調節失養性肌強直蛋白質激酶(dmpk)表現之化合物及方法 |
| WO2015038426A1 (en) | 2013-09-13 | 2015-03-19 | Asana Biosciences, Llc | Self-immolative linkers containing mandelic acid derivatives, drug-ligand conjugates for targeted therapies and uses thereof |
| US9982260B2 (en) | 2013-09-30 | 2018-05-29 | The Regents Of The University Of California | Identification of structurally similar small molecules that enhance therapeutic exon skipping |
| WO2015057876A1 (en) | 2013-10-15 | 2015-04-23 | Sorrento Therapeutics Inc. | Drug-conjugates with a targeting molecule and two different drugs |
| EA201690780A1 (ru) | 2013-10-15 | 2016-08-31 | Сиэтл Дженетикс, Инк. | Пегилированные лекарственные средства-линкеры для улучшенной фармакокинетики конъюгатов лиганд-лекарственное средство |
| EP3065758B1 (en) | 2013-11-06 | 2019-09-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Peptide containing conjugates for dual molecular delivery of oligonucleotides |
| WO2015075747A1 (en) | 2013-11-19 | 2015-05-28 | Council Of Scientific And Industrial Research | Cell-penetrating peptide for biomolecule delivery |
| MX2016009290A (es) | 2014-01-16 | 2017-02-28 | Wave Life Sciences Ltd | Diseño quiral. |
| TR201901939T4 (tr) * | 2014-03-12 | 2019-03-21 | Nat Center Neurology & Psychiatry | Antisens nükleik asit. |
| MX2016016526A (es) | 2014-06-17 | 2017-04-04 | Nippon Shinyaku Co Ltd | Acidos nucleicos antisentido. |
| EP3286318A2 (en) | 2015-04-22 | 2018-02-28 | Mina Therapeutics Limited | Sarna compositions and methods of use |
| EP3297649B1 (en) | 2015-05-19 | 2023-10-11 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Peptide oligonucleotide conjugates |
| HUE057952T2 (hu) | 2015-06-24 | 2022-06-28 | Hoffmann La Roche | Anti-transzferrin receptor antitestek testreszabott affinitással |
| BR112018006445A2 (pt) * | 2015-09-30 | 2018-12-11 | Sarepta Therapeutics Inc | métodos para tratar distrofia muscular |
| GB2545898B (en) | 2015-12-21 | 2019-10-09 | Sutura Therapeutics Ltd | Improved drug delivery by conjugating oligonucleotides to stitched/stapled peptides |
| JP2019517991A (ja) | 2016-03-01 | 2019-06-27 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 低減したａｄｃｐを有するオビヌツズマブ及びリツキシマブ変異体 |
| MA45328A (fr) | 2016-04-01 | 2019-02-06 | Avidity Biosciences Llc | Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci |
| MA45290A (fr) | 2016-05-04 | 2019-03-13 | Wave Life Sciences Ltd | Procédés et compositions d'agents biologiquement actifs |
| US20190240346A1 (en) | 2016-06-20 | 2019-08-08 | Genahead Bio, Inc. | Antibody-drug conjugate |
| EP3478829A1 (en) | 2016-06-29 | 2019-05-08 | Crispr Therapeutics AG | Materials and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 (dm1) and other related disorders |
| DK3554553T3 (da) | 2016-12-19 | 2022-09-19 | Sarepta Therapeutics Inc | Exon-overspringnings-oligomerkonjugat til muskeldystrofi |
| SG11201906200WA (en) | 2017-01-06 | 2019-08-27 | Avidity Biosciences Llc | Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping |
| GB201711809D0 (en) | 2017-07-21 | 2017-09-06 | Governors Of The Univ Of Alberta | Antisense oligonucleotide |
| CN111770757A (zh) | 2017-09-22 | 2020-10-13 | 艾维迪提生物科学公司 | 诱导外显子跳读的核酸-多肽组合物和方法 |
| AU2018378812A1 (en) | 2017-12-06 | 2020-07-09 | Avidity Biosciences, Inc. | Compositions and methods of treating muscle atrophy and myotonic dystrophy |
| EP3898693A4 (en) | 2018-12-21 | 2022-09-21 | Avidity Biosciences, Inc. | ANTI-TRANSFERRIN RECEPTOR ANTIBODIES AND USES THEREOF |
| CA3137715A1 (en) | 2019-04-25 | 2020-10-29 | Avidity Biosciences, Inc. | Nucleic acid compositions and methods of multi-exon skipping |
| WO2021003573A1 (en) * | 2019-07-09 | 2021-01-14 | The Governors Of The University Of Alberta | Exons 45-55 skipping using mutation-tailored cocktails of antisense morpholinos in the dmd gene |
-
2017
- 2017-07-21 GB GBGB1711809.2A patent/GB201711809D0/en not_active Ceased
-
2018
- 2018-07-20 US US16/632,827 patent/US11142767B2/en active Active
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