CN111108201A - 结合至人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的反义寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗DMD的治疗性反义寡核苷酸及其缀合物和组合物，所述治疗性反义寡核苷酸结合至人类肌养蛋白(dystrophin)前体mRNA的外显子51以诱导外显子跳跃。

Description

结合至人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的反义寡核苷酸
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年7月21日提交的GB 1711809.2的优先权，在此将GB 1711809.2的内容通过引用并入。
技术领域
本发明涉及治疗性反义寡核苷酸及其缀合物和组合物，所述治疗性反义寡核苷酸结合至人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51以诱导外显子跳跃(exon skipping)。本发明还涉及所述反义寡核苷酸用于治疗肌肉紊乱(muscular disorder)特别是杜氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy)的方法和用途。
背景
可变剪接(alternative splicing)的破坏是许多疾病的基础，而使用反义寡核苷酸调控剪接可以具有治疗意义。剪接转换反义寡核苷酸(splice-switching antisenseoligonucleotide；SSO)是用于神经肌肉疾病的新兴治疗，目前若干种SSO正在进行临床试验以用于诸如脊髓性肌萎缩症(SMA)和杜氏肌营养不良症(DMD)的状况，其中反义介导的外显子跳跃可以恢复开放阅读框，并允许具有部分或全部功能的蛋白而不是无功能的蛋白的合成。
杜氏肌营养不良症(DMD)是世界范围内的男童中最普遍的致死性遗传紊乱之一，发病率为约3,600-9,337名活产男性中有1名。DMD是由肌养蛋白(DMD)基因中的突变导致的肌养蛋白缺乏引起的。编码该蛋白的基因包含79个外显子，分布在多于200万个核苷酸的DNA上。任何改变外显子阅读框或引入终止密码子、或者特征为使一个或更多个外显子完全移出阅读框或一个或更多个外显子的重复的外显子突变，都有可能破坏功能性肌养蛋白的产生，导致DMD。一种不太严重的肌营养不良症形式，贝克肌营养不良症(Becker musculardystrophy；BMD)已经被发现在以下情况下出现：突变(通常是一个或更多个外显子的缺失)导致沿着整个肌养蛋白转录物的正确阅读框，使得mRNA到蛋白的翻译不会过早终止。如果在突变的肌养蛋白前体mRNA的加工中上游和下游外显子的连接维持了基因的正确阅读框，则结果是mRNA编码具有短的内部缺失的蛋白，该蛋白保留一些活性，导致贝克表型。不改变肌养蛋白的阅读框的一个或更多个外显子的缺失导致BMD表型，而引起阅读框移位(frame-shift)的外显子缺失将导致DMD(Monaco,Bertelson等人，1988)。通常，肌养蛋白突变包括点突变和外显子缺失，它们改变了阅读框，并且因此中断了正确的蛋白翻译，导致DMD。
目前最有前景的治疗途径之一是使用反义寡核苷酸(AO)的外显子跳跃。外显子跳跃可以通过从DMD前体mRNA中去除突变外显子和/或其侧翼外显子来恢复阅读框，使得能够产生截短但具有部分功能的肌养蛋白。大多数DMD患者存在缺失突变，并且其中20％属于外显子51跳跃。
在2016年9月，美国食品和药物管理局(FDA)有条件地批准了第一种DMD反义药物eteplirsen(Exondys 51)，其被开发以从突变DMD中排除外显子51。eteplirsen是一种用磷二酰胺吗啉代寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer)(吗啉代或PMO)修饰的AO，其是一种在其安全性和有效性方面已经被良好确认的反义化学物质。然而，eteplirsen仍然有争议，因为在使肌养蛋白恢复到治疗上有益的水平和改善临床结果两个方面仅有较弱证据支持该药物的有效性。FDA先前已经驳回了另一种用于DMD外显子51跳跃的候选药物：基于2'-O-甲基-硫代磷酸酯的AO“drisapersen”。尽管治疗剂必须确保最低风险量的最高可能益处，但是在用drisapersen治疗后未显示出肌肉功能的显著改善，而其使用导致的担忧超过了安全性。
因此，外显子跳跃疗法目前面临重大挑战，原因在于尽管存在在许多动物研究中已经显示出显著的治疗效果的事实，但它们在患者中观察到的疗效非常低。
外显子跳跃效率主要取决于AO靶序列；然而，关于eteplirsen和drisapersen所靶向的序列对于外显子跳跃疗法可能不是最佳选择几乎没有争论或讨论。若干小组已经进行了大规模AO筛选工作，以在计算上和凭经验地确定有效的AO序列。然而，设计的AO的外显子跳跃有效性尚未被定量地和在统计上评估。尽管恢复肌养蛋白表达对于改善营养不良性(dystrophic)肌肉功能是必要的，但在先前的AO筛选研究中，尚未以足够的定量方法报道AO挽救肌养蛋白表达的能力。其他研究高度依赖于来自原代DMD肌细胞的RT-PCR。值得注意的是，eteplirsen和drisapersen的AO序列是仅在这种情况下被确定的。
因此，通过选择更佳的AO序列，并且通过使用更可靠和直接的生物学测量——诸如在DMD中经挽救的肌养蛋白——进行更严格的AO筛选以验证临床试验中待采用的最佳反义寡核苷酸，可以提高外显子51跳跃疗法的有效性。
本发明的一个或更多个方面的目的是解决本领域中的一个或更多个这样的问题。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了能够结合至人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的结合完全发生在前体mRNA序列的0和+89之间的区域内，并且其中反义寡核苷酸包含至少27个碱基。
根据本发明的第二方面，提供了包含根据第一方面的反义寡核苷酸和载体的缀合物，其中载体缀合至反义寡核苷酸。
根据本发明的第三方面，提供了装载有第二方面的缀合物的细胞。
根据本发明的第四方面，提供了药物组合物，其包含根据第一方面的反义寡核苷酸和/或根据第二方面的缀合物以及药学上可接受的赋形剂。
根据本发明的第五方面，提供了治疗受试者的肌肉紊乱的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的能够结合至人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的结合完全发生在前体mRNA序列的0和+89之间的区域内，并且其中反义寡核苷酸包含至少27个碱基。
根据本发明的第六方面，提供了能够结合至人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸用于治疗受试者的肌肉紊乱，其中反义寡核苷酸的结合完全发生在前体mRNA序列的0和+89之间的区域内，并且其中反义寡核苷酸包含至少27个碱基。
根据本发明的第七方面，提供了增加细胞中人类肌养蛋白表达的方法，所述方法包括使细胞与有效量的能够结合至人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的反义寡核苷酸接触，其中反义寡核苷酸的结合完全发生在前体mRNA序列的0和+89之间的区域内，并且其中反义寡核苷酸包含至少27个碱基。
发明详述
本发明人已经开发了一系列反义寡核苷酸，其在肌养蛋白前体mRNA序列的外显子51的0至+89处的早期区域内结合，并且所述反义寡核苷酸具有比通常长度更长的至少27个碱基，每个反义寡核苷酸都具有显著的效率和有效性。
为了产生所述反义寡核苷酸，本发明人进行了一项研究，该研究使用系统性筛选方法，包括计算机模拟、体外和体内测试，定量评估了基于吗啉代的反义寡核苷酸用于外显子51跳跃的有效性。
本发明人进行了组合筛选，使用计算分析来预测设计的反义寡核苷酸序列的外显子跳跃效率，随后在永生化的DMD患者来源的肌细胞系中进行吗啉代反义寡核苷酸的体外测试。该研究揭示了，人类肌养蛋白外显子51序列的起始区是非常有前景的诱导外显子跳跃的靶区域，特别是该序列的0至+89的区域。这与已知的eteplirsen和drisapersen反义疗法靶向的内部区域明显不同。
然后对从该区域鉴定的反义寡核苷酸进行优化，以便最有效地恢复肌细胞中的肌养蛋白产生。研究了多种因素，包括反义寡核苷酸的长度。令人惊讶的是，本发明人发现，当在该早期区域中结合的反义寡核苷酸比许多已知的针对外显子51的反义寡核苷酸序列更长时，所述在该早期区域中结合的反义寡核苷酸更有效。特别地，本发明人鉴定出了将有效性与从27个碱基和更长的反义寡核苷酸长度相关联的上升趋势。本发明人已经证明，仅仅几个碱基差异意味着反义寡核苷酸具有显著不同的效率。如本文证明的，30-mer反义寡核苷酸的效果为25-mer的相同序列的1.5倍(跳跃效率42％对比65％)。不希望受理论束缚，这可能是因为较长的序列对靶序列可以更具特异性且较不可能引起脱靶效应。
本文证明，本发明人对这些鉴定的反义寡核苷酸序列的优化使得外显子51跳跃的效率和挽救肌养蛋白的效率与行业标准“eteplirsen”序列相比分别增加多达多于12倍和7倍。此外，使用具有人类DMD基因的转基因小鼠证实，通过这些体外筛选鉴定的最有效的反义寡核苷酸诱导了统计上显著的体内外显子51跳跃，这对于eteplirsen或drisapersen反义寡核苷酸从未显示过。相应地，证明了本文描述的反义寡核苷酸提供了用于肌肉紊乱的有效疗法和治疗，尤其是用于治疗DMD。这些反义寡核苷酸不仅为医药领域提供了替代疗法，在医药领域仅有一种这样的药物被批准上市。它们还提供了改进的治疗选择，其在增加肌养蛋白表达方面有效若干倍。这预期为罹患DMD和其他肌肉紊乱的患者提供可行的治疗选择，存在强有力的证据支持该疗法的有效性。
为了避免疑问，并且为了阐明解释本公开内容的方式，现在将进一步定义根据本发明使用的某些术语。
本发明包括所描述的方面和特征的任何组合，除非这种组合是明显不被允许的或明确被避免的。
应注意，当本发明的方面可能涉及包括反义寡核苷酸的方法或用途的情况下，其也可以包括包含如本文定义的反义寡核苷酸的缀合物或药物组合物。
本文使用的章节标题仅用于组织的目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。
反义寡核苷酸
本发明涉及具有至少27个碱基的长度的反义寡核苷酸，其结合至人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的0至+89的区域内，其可以用于治疗肌肉紊乱。
合适地，“反义寡核苷酸”在本文中可以被称为“AO”或“寡核苷酸(oligo)”或“寡聚物(oligomer)”。
合适地，反义寡核苷酸诱导人类肌养蛋白基因的外显子51的跳跃。
合适地，反义寡核苷酸增强人类肌养蛋白基因的外显子51的跳跃。
合适地，反义寡核苷酸允许功能性人类肌养蛋白的表达。
合适地，反义寡核苷酸增强功能性人类肌养蛋白的表达。
合适地，反义寡核苷酸包含至少28个碱基，合适地至少29个碱基，合适地至少30个碱基。
合适地，反义寡核苷酸包含27和30个之间的碱基。
在一种实施方案中，反义寡核苷酸包含30个碱基。
在一种实施方案中，反义寡核苷酸由30个碱基组成。
合适地，反义寡核苷酸的结合完全发生在前体mRNA序列的0和+88之间、0和+87之间、0和+86之间、0和+85之间、0和+84之间、0和+83之间、0和+82之间、0和+81之间、0和+80之间、0和+79之间、或0和+78之间的区域内。
在一种实施方案中，反义寡核苷酸的结合完全发生在前体mRNA序列的0和+78之间的区域内。
合适地，反义寡核苷酸包含以下序列之一的至少27个碱基：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸包含以下序列之一的至少28个碱基：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸包含以下序列之一的至少29个碱基：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸包含以下序列之一的至少27个连续碱基：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸包含以下序列之一的至少28个连续碱基：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸包含以下序列之一的至少29个连续碱基：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸与以下序列之一共有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸与下列序列之一共有90％和100％之间的同一性：SEQ IDNO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸与以下序列之一共有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸与下列序列之一共有90％和100％之间的同源性：SEQ IDNO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸可以包含与以下序列之一相差1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碱基的变体反义寡核苷酸：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸可以包含与以下序列之一相差多达3个碱基的变体反义寡核苷酸：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸可以包含与以下序列之一相差多达2个碱基的变体反义寡核苷酸：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸可以包含与以下序列之一相差单个碱基的变体反义寡核苷酸：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸包含以下序列之一：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸由以下序列之一组成：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
合适地，反义寡核苷酸包含SEQ ID NO.1(Ac0)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
在一种实施方案中，反义寡核苷酸包含SEQ ID NO.1(Ac0)。
合适地，反义寡核苷酸由SEQ ID NO.1(Ac0)或SEQ ID NO.5(Ac48)组成。
在一种实施方案中，反义寡核苷酸由SEQ ID NO.1(Ac0)组成。
应当理解，本发明还可以包括针对表3中列出的每个个体反义寡核苷酸序列的方面，即包含或由表3中列出的任何序列组成的反义寡核苷酸。此外，根据本发明的第二方面，设想了包含如表3中列出的反义寡核苷酸的缀合物。此外，根据本发明的第四方面，设想了药物组合物，其包含如表3中列出的反义寡核苷酸或其缀合物。此外，根据本发明的第五方面，设想了医疗用途，其包含如表3中列出的反义寡核苷酸用于治疗肌肉紊乱。此外，根据第六方面，设想了治疗方法，其包含如表3中列出的反义寡核苷酸。此外，根据第七方面，设想了增加细胞中人类肌养蛋白表达的方法，该方法包括如表3中列出的反义寡核苷酸。
合适地，反义寡核苷酸是合成的，而非天然的。
合适地，可以通过熟知的固相合成技术常规制备反义寡核苷酸。用于此类合成的设备由若干供应商出售，包括，例如，Applied Biosystems(Foster City,Calif.)。美国专利第4,458,066号中描述了一种用于在修饰的固体支持物上合成寡核苷酸的方法。可以另外地或可选地采用本领域已知的任何其他用于此类合成的手段。
合适地，反义寡核苷酸是反义寡核苷酸类似物。
合适地，术语“寡核苷酸类似物”和“核苷酸类似物”分别指本领域已知的寡核苷酸或核苷酸的任何修饰的合成类似物。
寡核苷酸类似物的合适实例包括肽核酸(PNA)、吗啉代寡核苷酸、硫代磷酸酯(phosphorothioate)寡核苷酸、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)寡核苷酸、烷基膦酸酯(alkylphosphonate)寡核苷酸、酰基膦酸酯(acylphosphonate)寡核苷酸和亚磷酰胺寡核苷酸。
合适地，反义寡核苷酸包含吗啉代亚基。因此，合适地，反义寡核苷酸是吗啉代反义寡核苷酸。
合适地，反义寡核苷酸包含通过含磷键(linkage)连接在一起的吗啉代亚基。因此，合适地，反义寡核苷酸是亚磷酰胺或磷二酰胺吗啉代反义寡核苷酸。
术语“吗啉代反义寡核苷酸”或“PMO”(亚磷酰胺或磷二酰胺吗啉代寡核苷酸)是指包含吗啉代亚基结构的反义寡核苷酸类似物，其中(i)这些结构通过含磷键连接在一起，所述含磷键合适地长度为1个至3个原子，合适地长度为2个原子，并且合适地不带电荷或为阳离子性的，将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5'环外碳连接，以及(ii)每个吗啉代环具有嘌呤或嘧啶碱基配对部分，该部分通过碱基特异性氢键与多核苷酸中的碱基有效结合。
合适地，反义寡核苷酸包含将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5'环外碳连接的含磷亚基间键。
合适地，反义寡核苷酸包含根据以下结构(I)的含磷亚基间键：
Figure BDA0002419965060000101
其中：
Y1是-O-、-S-、-NH-或-CH2-；
Z是O或S；
Pj是嘌呤或嘧啶碱基配对部分，该部分通过碱基特异性氢键与多核苷酸中的碱基有效结合；以及
X是氟、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的硫代烷氧基、氨基、任选地经取代的烷基氨基或任选地经取代的杂环基。
任选地，可以对亚基间键进行改变，条件是该改变不干扰结合或活性。例如，附接至磷的氧可以被硫取代(硫代磷二酰胺)。5'氧可以被氨基或经低级烷基取代的氨基取代。附接至磷的悬垂氮可以是未取代的、被(任选地经取代的)低级烷基单取代的或二取代的。
合适地，吗啉代寡核苷酸的合成、结构和结合特征在以下中详细描述：美国专利第5,698,685号、第5,217,866号、第5,142,047号、第5,034,506号、第5,166,315号、第5,521,063号和第5,506,337号、以及PCT申请第PCT/US07/11435号。
反义寡核苷酸的结合
本发明涉及能够结合至人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的0至+89区域内的反义寡核苷酸。
“能够结合”意指，反义寡核苷酸包含能够结合至人类肌养蛋白前体mRNA的所述区域中的序列。
合适地，反义寡核苷酸与人类肌养蛋白前体mRNA的所述区域中的序列互补。
合适地，反义寡核苷酸包含与人类肌养蛋白前体mRNA的所述区域中的序列互补的序列。
当每个分子中足够数目的相应位置被核苷酸占据时，反义寡核苷酸和人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的0至+89区域内的序列彼此互补，两者可以彼此氢键键合并且从而引起外显子跳跃，合适地为外显子51的外显子跳跃。因此，“可杂交”和“互补”是这样的术语，其被用来表示足够程度的互补性或配对，使得反义寡核苷酸与人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的0至+89区域内的序列之间发生稳定且特异性的结合。合适地，反义寡核苷酸与人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的0至+89区域内的序列足够地可杂交和/或互补，以诱导外显子跳跃，合适地为外显子51的外显子跳跃。
合适地，反义寡核苷酸可以不与人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的0至+89区域内的序列100％互补。然而，合适地，反义寡核苷酸足够互补以避免非特异性结合。
合适地，反义寡核苷酸与人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的0至+89区域内的序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％至少99％互补。
应理解，为了使反义寡核苷酸能够结合，不要求反义寡核苷酸的整个长度都与人类肌养蛋白前体mRNA结合。应当理解，反义寡核苷酸的一部分可以不与人类肌养蛋白前体mRNA结合，例如反义寡核苷酸的5'或3'末端。然而，根据第一方面，与人类肌养蛋白前体mRNA结合的反义寡核苷酸的部分必须落入外显子51的0至+89的区域内。
因此，合适地，反义寡核苷酸可与人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的0至+89的区域内的序列杂交。合适地，反义寡核苷酸可与人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的0至+89的区域内的序列充分杂交，以引起外显子51的外显子跳跃。
人类肌养蛋白
本发明涉及治疗性反义寡核苷酸，用于治疗肌肉紊乱，特别是肌养蛋白紊乱诸如DMD。
肌养蛋白是一种杆状细胞质蛋白，并且是蛋白复合物的重要部分，蛋白复合物通过细胞膜将肌肉纤维的细胞骨架与周围的细胞外基质连接。
肌养蛋白包含多个功能结构域。编码肌养蛋白的DMD基因是已知最长的人类基因之一，在Xp21基因座处覆盖2.3兆碱基(人类基因组的0.08％)。肌肉中的初级转录物长度为约2,100千碱基，并且花费16小时来转录；成熟的mRNA长度为14.0千碱基。79个外显子的肌肉转录物编码3685个氨基酸残基的蛋白。肌养蛋白包含一个肌动蛋白结合结构域和一个中心杆状结构域(rod domain)。这个大的中心结构域由24个约109个氨基酸的血影蛋白样三螺旋元件组成，它们与α-肌动蛋白和血影蛋白具有同源性。重复序列通常被四个也被称为铰链区的富含脯氨酸的非重复区段中断。每个重复序列由两个外显子编码，典型的是在α-螺旋2的第一部分的氨基酸47和48之间由一个内含子中断。另一个内含子见于重复序列中的不同位置处，通常分散在螺旋3上。肌养蛋白还含有一个富含半胱氨酸的结构域，包含一个富含半胱氨酸的区段(即，280个氨基酸中有15个半胱氨酸)。
在正常情况下，肌养蛋白的氨基末端与F-肌动蛋白结合，而羧基末端与肌膜处的肌养蛋白相关蛋白复合物(DAPC)结合。DAPC包含肌养蛋白聚糖(dystroglycans)、肌聚糖、整联蛋白和陷窝蛋白，而这些组分中的任一种的突变都会引起常染色体遗传的肌营养不良症。正常的骨骼肌组织只含有少量的肌养蛋白(总肌肉蛋白的约0.002％)，但其缺乏(或异常表达)会导致严重且目前无法治愈的症状的发展，这些症状最容易表征为若干异常的细胞内信号传导途径，最终产生明显的肌纤维坏死以及进行性肌无力和易疲劳性。当缺少肌养蛋白时，DAPC变得不稳定，这导致成员蛋白水平降低，并且进而导致进行性纤维受损和膜渗漏。在多种形式的肌营养不良症，诸如杜氏肌营养不良症(DMD)和贝克肌营养不良症(BMD)中，肌细胞产生改变的和功能缺陷形式的肌养蛋白，或者根本不产生肌养蛋白，这主要由于基因序列中的突变导致非正确剪接。缺陷型肌养蛋白的优势表达，或肌养蛋白或肌养蛋白样蛋白的完全缺乏，导致肌肉退化的快速进展。
肌营养不良症患者中编码肌养蛋白的mRNA通常包含阅读框外突变(例如缺失、插入或剪接位点突变)，导致阅读框移位或翻译过程提前终止，因此在大多数肌纤维中不产生功能性肌养蛋白。
合适地，反义寡核苷酸触发外显子跳跃以恢复肌养蛋白mRNA的阅读框。合适地，反义寡核苷酸触发外显子51的外显子跳跃，以恢复肌养蛋白mRNA的阅读框。合适地，阅读框的恢复恢复了部分功能性肌养蛋白的产生。
合适地，部分功能性肌养蛋白是截短的肌养蛋白。
合适地，截短的肌养蛋白是在罹患不太严重的肌肉紊乱BMD的患者中产生的相同的肌养蛋白。
肌肉紊乱
本发明涉及治疗性反义寡核苷酸在治疗肌肉紊乱中的用途。
合适地，肌肉紊乱选自由基因突变导致的任何肌肉紊乱。
合适地，肌肉紊乱选自由与肌肉功能相关的基因中的基因突变导致的任何肌肉紊乱。
合适地，肌肉紊乱选自由人类肌养蛋白基因中的基因突变导致的任何肌肉紊乱。
合适地，肌肉紊乱选自任何肌营养不良紊乱。
合适地，肌肉紊乱选自杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症、先天性肌营养不良症、远端肌营养不良症、Emery-Dreifuss肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、强直性肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症。
合适地，肌肉紊乱是杜氏肌营养不良症(DMD)或贝克肌营养不良症(BMD)。
在一种实施方案中，肌肉紊乱是DMD。
载体和缀合物
本发明还涉及反义寡核苷酸与载体的缀合物。
合适地，载体可以包含将反义寡核苷酸转运到靶细胞中、合适地肌细胞中的任何可操作的分子。
合适的载体可以包括：肽、小分子化学物质、聚合物、纳米颗粒、脂质、脂质体、外泌体等。
合适地，载体是肽。肽可以选自，例如，病毒蛋白诸如VP22(来源于疱疹病毒被膜蛋白)、蛇毒蛋白诸如CyLOP-1(来源于crotamin)、细胞粘附糖蛋白诸如pVEC(来源于鼠血管内皮钙粘着蛋白)、穿膜肽(Penetratin，触角足同源异形域)、Tat(人类免疫缺陷病毒反式激活调控蛋白)或反向Tat。
合适地，肽是细胞穿透肽。
合适地，肽是富含精氨酸的细胞穿透肽。
富含精氨酸的肽载体的用途特别有用。已经证明某些基于精氨酸的肽载体在将反义化合物递送到包括肌细胞在内的原代细胞方面高度有效(Marshall,Oda等人，2007；Jearawiriyapaisarn,Moulton等人，2008；Wu,Moulton等人，2008)。此外，与其他肽相比，精氨酸肽载体在缀合至反义寡核苷酸时，显示出增强的改变若干基因转录物剪接的能力(Marshall,Oda等人，2007)。
合适地，富含精氨酸的细胞穿透肽可以选自，例如，WO2015075747、WO2013030569、WO2009147368、US20120289457或US20160237426中描述的那些载体肽。
在一种实施方案中，富含精氨酸的细胞穿透肽选自WO2013030569或WO2009147368中描述的那些。
合适地，载体具有在特定细胞培养物群体的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的细胞内诱导反义寡核苷酸的细胞穿透的能力。合适地，载体具有在肌细胞培养物的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的肌细胞内诱导反义寡核苷酸的细胞穿透的能力。
合适地，载体与反义寡核苷酸的缀合可以位于适于在载体与反义寡核苷酸之间或在接头部分与反义寡核苷酸之间形成共价键的任何位置。例如，载体的缀合可以位于反义寡核苷酸的3'端。可选地，载体与反义寡核苷酸的缀合可以位于寡核苷酸的5'端。可选地，可以通过任何亚基间键将载体缀合至反义寡核苷酸。
合适地，将载体在其N-末端或C-末端残基处共价偶联至反义寡核苷酸的3'或5'端。
合适地，将载体在其C-末端残基处偶联至反义寡核苷酸的5'端。
任选地，在反义寡核苷酸包含含磷亚基间键且载体是肽的情况下，可以通过与末端连接基团的磷的共价键将肽缀合至反义寡核苷酸。
可选地，当载体是肽且反义寡核苷酸是吗啉代时，可以将肽缀合至寡聚物的3'末端吗啉代基团的氮原子。
任选地，可以通过接头部分将载体缀合至反义寡核苷酸。任选地，接头部分可以包含以下中的一种或更多种：以任何组合的任选地经取代的哌嗪基部分、β丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸和/或6-氨基己酸残基。
可选地，可以将载体直接缀合至反义寡核苷酸，而没有接头部分。
合适地，缀合物还可以包含归巢部分。
合适地，归巢部分对于选定的哺乳动物组织有选择性，即，被反义寡核苷酸靶向的相同组织。合适地，归巢部分对肌肉组织有选择性。
合适地，归巢部分是归巢肽。
在例如“Effective Dystrophin Restoration by a Novel Muscle-HomingPeptide-Morpholino Conjugate in Dystrophin-Deficient mdx Mice”Gao等人.MolTher.2014 Jul；22(7):1333-1341中公开了合适的归巢肽。
合适地，载体肽和归巢肽可以形成为嵌合融合蛋白。
合适地，缀合物可以包含由细胞穿透肽和肌肉特异性归巢肽形成的嵌合肽。
任选地，缀合物可以呈以下形式：载体肽-归巢肽-反义寡核苷酸，或以下形式：归巢肽-载体肽-反义寡核苷酸。
合适地，可以将反义寡核苷酸缀合至增强反义寡核苷酸溶解度的载体，合适地是在水性介质中的溶解度。合适地，除了可操作以转运反义寡核苷酸的载体之外，还可以将增强溶解度的载体缀合至反义寡核苷酸。合适地，增强溶解度的载体和转运反义寡核苷酸的载体可以形成为嵌合融合蛋白。
增强反义寡核苷酸溶解度的合适载体是聚合物，诸如聚乙二醇或三乙二醇。
药学上可接受的赋形剂
本发明还涉及包含本发明的反义寡核苷酸或其缀合物，还包含一种或更多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
合适地，使用药学上惰性的无机和/或有机赋形剂，以本领域已知的方法制备药物组合物(如Remingtons Pharmaceutical Sciences,Mack Publ.Co.,Easton,PA(1985)中描述的)。术语“药学上可接受的”是指生理上可耐受、并且当向患者施用时通常不产生过敏或类似不良反应的分子和组合物。
合适地，药物组合物可以被制备为丸剂、片剂、包衣片剂、硬明胶胶囊、软明胶胶囊和/或栓剂、溶液和/或糖浆、注射溶液、微胶囊、植入物和/或杆状物(rod)等。
在一种实施方案中，药物组合物可以被配制为注射溶液。
合适地，用于制备丸剂、片剂、包衣片剂和硬明胶胶囊的药学上可接受的赋形剂可以选自以下任何一种：乳糖、玉米淀粉和/或其衍生物、滑石、硬脂酸和/或其盐等。
合适地，用于制备软明胶胶囊和/或栓剂的药学上可接受的赋形剂可以选自脂肪类、蜡类、半固体和液体多元醇类、天然和/或硬化油类等。
合适地，用于制备溶液和/或糖浆的药学上可接受的赋形剂可以选自水、蔗糖、转化糖、葡萄糖、多元醇类等。
合适地，用于制备注射溶液的药学上可接受的赋形剂可以选自水、盐水、醇类、甘油、多元醇类、植物油类等。
合适地，用于制备微胶囊、植入物和/或杆状物的药学上可接受的赋形剂可以选自混合的聚合物诸如乙醇酸和乳酸等。
另外，药物组合物可以包含脂质体制剂，其被描述于N.Weiner(Drug Develop IndPharm 15(1989)1523)、“Liposome Dermatics”(Springer Verlag 1992)和Hayashi(GeneTherapy 3(1996)878)。
任选地，药物组合物可以包含两种或更多种不同的反义寡核苷酸或其缀合物。任选地，药物组合物还可以包含靶向不同外显子的一种或更多种反义寡核苷酸或其缀合物，合适地为人类肌养蛋白前体mRNA的不同外显子。任选地，一种或更多种另外的反义寡核苷酸或其缀合物可以靶向与人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51相邻的外显子，例如，外显子50或外显子52。合适地，靶向人类肌养蛋白前体mRNA的不同外显子的一种或更多种反义寡核苷酸或其缀合物可与本发明的反义寡核苷酸一起操作，以恢复肌养蛋白mRNA的阅读框。
任选地，药物组合物还可以包含靶向不同基因的一种或更多种反义寡核苷酸或其缀合物。例如，一种或更多种另外的反义寡核苷酸或其缀合物可以靶向肌生成抑制蛋白。这样的双重靶向被描述于“Dual exon skipping in myostatin and dystrophin forDuchenne muscular dystrophy”Kemaladewi等人，BMC Med Genomics.2011 Apr 20；4:36。
任选地，可以将所述一种或更多种另外的反义寡核苷酸连接在一起和/或连接至第一方面的反义寡核苷酸。
任选地，反义寡核苷酸和/或缀合物可以作为生理上可耐受的盐存在于药物组合物中。合适地，生理上可耐受的盐保留反义寡核苷酸和/或其缀合物的期望的生物活性，并且不赋予不期望的毒性作用。对于反义寡核苷酸，药学上可接受的盐的合适实例包括(a)与以下阳离子形成的盐：诸如钠、钾、铵、镁、钙、多胺诸如精胺和亚精胺等；(b)与以下无机酸形成的酸加成盐：例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；(c)与有以下机酸形成的盐：诸如例如，乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；以及(d)由元素阴离子诸如氯、溴和碘形成的盐。
任选地，除了至少一种反义寡核苷酸和/或缀合物之外，药物组合物可以包含一种或更多种不同的治疗活性成分。所述一种或更多种治疗活性成分可以选自，例如：皮质类固醇、肌营养相关蛋白(utrophin)上调物、TGF-β抑制剂和肌生成抑制蛋白抑制物。
合适地，除了活性成分和赋形剂之外，药物组合物还可以包含添加剂，诸如填充剂、增量剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、湿润剂、稳定剂、乳化剂、防腐剂、甜味剂、染料、调味剂或芳香剂、增稠剂、稀释剂或缓冲物质、并且另外地、溶剂和/或增溶剂和/或用于实现缓释效果的剂，还以及用于改变渗透压的盐、包衣剂和/或抗氧化剂。合适的添加剂可以包括Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐、Tween 80、聚山梨醇酯80、抗坏血酸、焦亚硫酸钠、硫柳汞、苯甲醇、乳糖、甘露醇等。
施用
本发明涉及治疗性反义寡核苷酸和用于向受试者施用的包含该治疗性反义寡核苷酸的药物组合物。
合适地，反义寡核苷酸和/或药物组合物可以用于局部、肠内或肠胃外施用。
合适地，反义寡核苷酸和/或药物组合物可以用于口服、透皮、静脉内、鞘内、肌内、皮下、鼻内、透粘膜等施用。
在一种实施方案中，反义寡核苷酸和/或药物组合物用于肌内施用。
在一种实施方案中，反义寡核苷酸和/或药物组合物用于通过注射进行肌内施用。
“有效量”或“治疗有效量”是指作为单个剂量或作为一系列剂量的一部分向受试者施用的反义寡核苷酸的量，其在受试者中有效地产生期望的生理反应或治疗效果。
合适地，期望的生理反应包括相对功能性或生物活性形式的肌养蛋白的表达增加，合适地在含有缺陷型肌养蛋白或不含肌养蛋白的肌肉组织或细胞中。
合适地，期望的治疗效果包括改善肌肉紊乱的症状或病理，减少肌肉紊乱的症状或病理的进展，以及减缓肌肉紊乱的症状或病理的发作。这些症状的实例包括疲劳、智力迟滞、肌无力、运动技能(例如，跑步、单足跳跃、跳跃)困难、频繁跌倒和行走困难。
合适地，反义寡核苷酸或其缀合物以每天每千克体重从约0.0001mg至约100mg范围的剂量被施用。
合适地，反义寡核苷酸或其缀合物被每天施用，每2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天一次，每1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周一次，或每1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月一次。
合适地，施用的剂量和频率可以由医师根据需要来决定，以维持功能性肌养蛋白的期望表达。
合适地，反义寡核苷酸或其缀合物可以作为2个、3个、4个、5个、6个或更多个亚剂量、任选地以单位剂型、在每天中以适当的间隔被分别施用。
受试者
本发明还涉及通过向有相应需要的受试者施用治疗有效量的反义寡核苷酸或其缀合物来治疗肌肉紊乱。
合适地，如上文定义的，受试者患有肌肉紊乱。
合适地，受试者是哺乳动物。合适地，受试者是人类。
合适地，受试者可以是雄性或雌性。然而，合适地，受试者是雄性。
合适地，受试者是任何年龄。然而，合适地，受试者年龄在1个月龄至50岁年龄之间，合适地年龄在1岁年龄和30岁年龄之间，合适地年龄在2岁年龄至27岁年龄之间，合适地年龄在4岁年龄至25岁年龄之间。
增加的外显子跳跃和肌养蛋白表达
本发明涉及治疗性反义寡核苷酸，所述治疗性反义寡核苷酸通过诱导人类肌养蛋白前体mRNA中的外显子跳跃来恢复功能性肌养蛋白表达以用于治疗肌肉紊乱。
合适地，“功能性”肌养蛋白是指具有足够生物活性的肌养蛋白，该蛋白在与患有肌肉紊乱诸如DMD的受试者中存在的缺陷型肌养蛋白相比时，减少肌肉组织的进行性降解，该降解原本是肌营养不良症的特征。
合适地，功能性肌养蛋白可以具有野生型肌养蛋白的体外或体内生物活性的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
合适地，功能性肌养蛋白具有野生型肌养蛋白的体外或体内生物活性的至少10％至20％。
合适地，肌养蛋白在体外肌肉培养物中的活性可以根据肌管尺寸、肌原纤维组织、收缩活性和乙酰胆碱受体的自发聚集来测量(参见，例如，Brown等人，Journal of CellScience.112:209-216,1999)。
动物模型也是用于研究疾病发病机制的宝贵资源，并且提供了测试肌养蛋白相关活性的手段。用于DMD研究的两种最广泛使用的动物模型是mdx小鼠和金毛猎犬肌营养不良症(GRMD)犬，两者都是肌养蛋白阴性的(参见，例如，Collins&Morgan,Int J Exp Pathol84:165-172,2003)。这些和其他动物模型可以用于测量多种肌养蛋白的功能活性。
合适地，“外显子跳跃”是指从特定的加工前RNA(前体RNA)中去除整个外显子或其一部分，并且从而排除其在翻译成蛋白的成熟RNA中的存在的过程。
合适地，原本由跳跃的外显子编码的蛋白部分不存在于蛋白的表达形式中。
因此，合适地，外显子跳跃产生如上文定义的蛋白的截短的、但仍然是功能性的形式。
适当地，被跳跃的外显子是来自人类肌养蛋白基因的外显子，其序列中可能含有原本会引起异常剪接的突变或其他改变。
合适地，被跳跃的外显子是肌养蛋白基因的外显子51。
合适地，反义寡核苷酸是可操作的，以在肌养蛋白前体mRNA中诱导外显子跳跃。
合适地，反义寡核苷酸是可操作的，以在肌养蛋白前体mRNA中诱导外显子51的外显子跳跃。
合适地，反义寡核苷酸是可操作的，以增加肌肉组织中肌养蛋白的功能性形式的表达，并且是可操作的以增加肌肉组织中的肌肉功能。
合适地，反义寡核苷酸是可操作的，以使肌肉功能与未接受反义寡核苷酸的患有肌肉紊乱诸如DMD的受试者的肌肉功能相比，增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
合适地，反义寡核苷酸是可操作的，以便与未接受反义寡核苷酸的患有肌肉紊乱诸如DMD的受试者相比，使约至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的肌纤维中表达功能性肌养蛋白的肌纤维的百分比增加。
合适地，反义寡核苷酸是可操作的，以诱导肌养蛋白的功能性形式的表达达到野生型细胞和/或受试者中肌养蛋白的表达的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的水平。
合适地，反义寡核苷酸是可操作的，以诱导肌养蛋白的功能性形式的表达达到野生型细胞和/或受试者中肌养蛋白的表达的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的水平。
合适地，反义寡核苷酸是可操作的，以诱导肌养蛋白的功能性形式的表达达到野生型细胞和/或受试者中肌养蛋白的表达的至少10％、15％或20％的水平。
合适地，反义寡核苷酸是可操作的，以在肌养蛋白前体mRNA中诱导达到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的水平的外显子51跳跃。
合适地，反义寡核苷酸是可操作的，以在肌养蛋白前体mRNA中诱导达到至少60％、70％、80％、90％或100％的水平的外显子51跳跃。
合适地，反义寡核苷酸是可操作的，以在肌养蛋白前体mRNA中诱导达到60％至80％之间的水平的外显子51跳跃。
“增加的”或“增强的”量可以包括在相同情况下不施用反义寡核苷酸化合物(不存在剂)或施用对照化合物时产生的量的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多倍的增加。
适当地，“增加的”或“增强的”量是统计上显著的量。
附图简述
现在将参考以下附图和表格来描述本发明的某些实施方案，其中：
图1：示出了在永生化克隆外显子52缺失的DMD骨骼肌细胞(KM571)中，以10μM对反义寡核苷酸(AO)和eteplirsen(aEte)和drisapersen(aDri)的AO类似物进行的体外筛选。转染后第5天收获分化的肌管，(A)如通过一步法RT-PCR测量的外显子51跳跃的效率。示出了代表性图像。M，100bp标志物；空白，无RNA模板。(B)如通过用抗肌养蛋白C-末端抗体进行定量蛋白印迹测量的诱导截短的肌养蛋白的效率。使用健康8220细胞的校准曲线计算挽救的肌养蛋白水平。数据代表来自3-4次独立实验的平均值±SD。**p<0.01，相比于aEte；
Figure BDA0002419965060000231
和
Figure BDA0002419965060000232
相比于aDri；§§p<0.01，在(A)中与所有AO相比以及在(B)中与Ac0相比。
图2：示出了用5μM的Ac0、Ac48以及eteplirsen的AO类似物和drisapersen的AO类似物转染的外显子52缺失的DMD-KM571细胞系中肌养蛋白外显子51跳跃和蛋白的时间进程分析。在转染后2天和11天收集样品，(A)外显子51跳跃的RT-PCR分析。M，100bp标志物；R，重复样品编号；空白，无RNA模板。(B)通过用抗肌养蛋白C-末端抗体进行蛋白印迹来定量诱导的肌养蛋白。示出了来自3次独立实验的代表性重复样品。
图3：示出了Ac0、Ac48以及eteplirsen的AO类似物和drisapersen的AO类似物在永生化DMD骨骼肌细胞中的剂量依赖性效应，如通过一步法RT-PCR和定量蛋白印迹测量的。用1μM、3μM和10μM的AO转染DMD骨骼肌细胞，并且在转染后第5天收获。(A)和(B)分别示出了在具有外显子52缺失突变的DMD肌细胞(ID KM 571)中，外显子51跳跃的效率和挽救的肌养蛋白的表达水平。在(C)和(D)中分别示出了在具有外显子48-50缺失突变的DMD肌细胞(ID6594)中，跳跃外显子51和挽救肌养蛋白表达的效力。数据表示来自在KM571细胞系中进行的3-7次独立实验和来自在6594细胞系中进行的3-4次独立实验的平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01，相比于aEte；
Figure BDA0002419965060000233
和
Figure BDA0002419965060000234
相比于Ac48；§p<0.05，§§p<0.01，相比于aDri(以相同的浓度)，NS，与下一剂量的Ac0相比无显著性；ns，与10μM的Ac0相比无显著性。(E)通过回归模型分析对AO的剂量响应性。跳跃和产生肌养蛋白的回归方程的统计有效性分别为p<0.008和p<0.014。图表示在回归分析中预测的外显子跳跃或肌养蛋白水平的值。示出了个体AO的回归斜率和95％置信区间(CI)。
图4：示出了具有外显子52缺失突变(ID KM571)和外显子48-50缺失突变(ID6594)的永生化的DMD患者来源的骨骼肌细胞中的免疫细胞化学。将用10μM Ac0、Ac48和eteplirsen类似物(aEte)转染后第5天的细胞用抗肌养蛋白C-末端抗体染色。灰色线表示肌养蛋白阳性肌管。白色点表示用DAPI复染色的细胞核。*表示由于其收缩或从培养板脱离导致的代表性假阳性肌管。示出了来自3次独立实验的代表性图像。比例尺：100μm。
图5：示出了对Ac0吗啉代反义寡核苷酸的长度优化。用包含长度为25-mer、26-mer、27-mer、28-mer、29-mer和30-mer的Ac0吗啉代转染永生化DMD肌细胞。示出了在具有外显子52缺失的DMD肌细胞(KM571)中，由1μM(A和B)和3μM(C和D)的Ac0吗啉代诱导的外显子51跳跃的代表性图像和定量，如通过RT-PCR呈现的。(E-H)表示具有外显子48-50缺失的永生化DMD细胞的结果。示出了来自3次独立实验的数据。
图6：示出了原代DMD和健康骨骼肌细胞中由Ac0、Ac48、eteplirsen的AO类似物(aEte)和drisapersen的AO类似物(aDri)诱导的外显子51跳跃效率。用10μM的Ac0、Ac48以及eteplirsen类似物和drisapersen类似物转染分化的肌管，并且然后在3天后收获。示出了在具有外显子45-50缺失突变(ID 4546)(A和B)或外显子49-50缺失突变(ID 4555)(C和D)的原代DMD细胞以及原代健康肌细胞(E和F)中的外显子51跳跃效率，如通过一步法RT-PCR呈现的。数据代表来自每种条件下至少一式三份的孔的平均值±SD。M，100bp标志物。*p<0.05和**p<0.01，相比于Ac48；
Figure BDA0002419965060000241
相比于aEte；§§p<0.01，相比于aDri。
图7：示出了30-mer Ac0反义吗啉代寡核苷酸在hDMD/无Dmd小鼠模型(hDMD/Dmd-null mouse model)中的体内效力。在肌内注射Ac0吗啉代或eteplirsen类似物aEte(30μL盐水中的50μg)后2周，通过用胫骨前肌进行RT-PCR分析外显子跳跃效力。(A)外显子51跳跃的密度测定法分析，如通过基于微芯片的毛细管电泳系统呈现的。(B)外显子51跳跃效率的平均百分比(平均值±SE)。每组中N＝7。M，标志物；NT，未处理的肌肉；UM，上部标志物染料；LM，下部标志物染料。
图8：示出了30-mer Ac48反义吗啉代寡核苷酸在hDMD/无Dmd小鼠模型中的体内效力。在肌内注射Ac48吗啉代或drisapersen类似物aDri(30μL盐水中的50μg)后2周，通过用胫骨前肌进行RT-PCR分析外显子跳跃效力。外显子51跳跃的密度测定法分析，如通过基于微芯片的毛细管电泳系统呈现的。M，标志物；NT，未处理的肌肉；UM，上部标志物染料；LM，下部标志物染料。
贯穿本说明书的描述和权利要求，词语“包含/包括/含有(comprise)”和“包含/包括/含有(contain)”及它们的变体意指“包括但不限于”，并且它们不意图(并且不)排除其他部分、添加物、组分、整数或步骤。贯穿本说明书的描述和权利要求，单数涵盖复数，除非上下文另有要求。特别地，在使用不定冠词的情况下，本说明书应被理解为设想多于一个以及单个，除非上下文另有要求。
结合本发明的特定方面、实施方案或实例所描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为可应用于本文所描述的任何其他方面、实施方案或实例，除非与该方面、实施方案或实例不相容。在本说明书中公开的所有特征(包括任何随附的权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任何组合来组合，除了其中此类特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合之外。
本发明不局限于任何前述实施方案的细节。本发明扩展至在本说明书(包括任何附随的权利要求、摘要和附图)中公开的特征的任何新颖特征或任何新颖组合，或如此公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖步骤或任何新颖组合。读者的注意力被引导到与本说明书同时或此前提交的与本申请有关的、并且随着本说明书向公众开放供查阅的所有论文和文献，并且将所有此类论文和文献的内容通过引用并入本文。
实施例
1.材料与方法
1.1 AO的设计和计算机模拟筛选.
使用我们最近开发的AO预测算法设计并分析了413个靶向外显子51的30-mer和25-mer的AO(参见表3)。表3在从左到右的列中示出了：外显子编号、与受体剪接位点的距离、AO序列(5'到3')、预测的跳跃％、以及在筛选中的排名。左侧AO为30-mer，而右侧AO为25-mer。基于预测的外显子跳跃效率，选择以至少4个碱基间隔开的8种AO进行体外筛选(表2)。使用The University of California,Santa Cruz Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/index.html)分析选择的AO、eteplirsen和drisapersen的靶序列特异性，证实这些AO序列理论上不结合任何具有100％同一性的非靶RNA序列。
1.2反义吗啉代.
所有反义序列，包括eteplirsen的AO类似物和drisapersen的AO类似物，都是由Gene Tools(Philomath，OR)通过吗啉代化学合成的。
1.3细胞.
如先前描述的，源自三名健康受试者(ID 8220、CHQ和KM155)和两名DMD患者的永生化的人类骨骼肌细胞通过在Institute of Myology人类细胞永生化平台中用人类端粒酶表达载体和细胞周期蛋白依赖性激酶4表达载体转导来产生，这两名DMD患者在DMD基因中分别具有外显子52缺失突变(ID KM571)和外显子48-50缺失突变(ID 6594)。33对三种永生化的健康肌细胞系进行了表征，并选择显示出最高的肌养蛋白表达的克隆系8220作为阳性对照，以防止高估在永生化DMD细胞中挽救的肌养蛋白表达。源自具有外显子45-50(ID4546)和外显子49-50(ID 4555)缺失突变的DMD患者和健康受试者的原代骨骼肌细胞由BioBank of Skeletal Muscle,Nerve Tissue,DNA and Cell Lines制备。
1.4 AO转染.
为了尽可能接近地模拟AO介导的外显子跳跃疗法的体内效应，使用表达足够水平的DMD mRNA的成熟、分化的肌管进行体外筛选。用生长培养基(GM)：具有骨骼肌补充混合物(Promocell,Heidelberg,Germany)、20％胎牛血清(Life Technologies,Waltham,MA)和抗生素(50单位青霉素和50μg/ml链霉素，Life Technologies,Waltham,MA)的DMEM/F12，以增殖条件培养细胞。将永生化的和原代的DMD骨骼肌细胞分别以1.7x104/cm2和2.2x104/cm2接种在I型胶原涂覆的12孔或24孔培养板中。接种后两天，在约80％-90％汇合时，用分化培养基(DM)：具有2％马血清(GE Healthcare,Chicago,IL)、1x ITS溶液(Sigma,St.Louis,MO)和抗生素的DMEM/F12替代GM。在DM中3天后，用含有6μM Endo-porter转染试剂(GeneTools,Philomath,OR)的1μM、3μM、5μM或10μM的AO转染细胞(就在用DM稀释之前，将1mM的浓缩AO在65℃孵育10min)。在AO转染后两天，用常规DM替代含AO的DM。在AO转染后第2天、第5天或第11天(分化后的第5天、第8天或第14天)收获细胞。
1.5小鼠.
动物研究由艾伯塔大学(University of Alberta)动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee)、国家儿童医学中心(Children's National MedicalCenter)和国家神经病学和精神病学中心(National Center of Neurology andPsychiatry；NCNP)批准。制备4-8周龄的具有C57BL/6J背景的雄性和雌性Dmd外显子52缺陷型mdx52 42和野生型小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。通过用PCR进行基因分型，证实了受影响的小鼠中的Dmd突变。通过将雄性hDMD小鼠(Jackson Laboratory,BarHarbor,ME)与雌性无Dmd小鼠(Dmd-null mouse)杂交，产生了具有人类DMD基因且缺乏小鼠Dmd基因的转基因小鼠模型(hDMD/无Dmd小鼠)。
1.6肌内注射.
如先前描述的，在用异氟烷吸入麻醉的情况下，将40μL盐水中的5μg或20μg的小鼠形式的吗啉代Ac0、Ac48、eteplirsen或drisapersen肌内注射到胫骨前肌(TA)肌肉中。43将30μL盐水中的50μg Ac0吗啉代和eteplirsen类似物注射到hDMD/无Dmd的小鼠的TA肌肉中。在肌内注射后2周，收获所有肌肉样品。
1.7通过RT-PCR进行外显子跳跃分析.
如先前描述的，用Trizol(Invitrogen,Waltham,MA)提取总RNA。用SuperScriptIII One-Step RT-PCR系统(Invitrogen,Waltham，MA)和0.2μM正向和反向引物(参见表1)对永生化的和原代的骨骼肌细胞中的200ng和320ng的总RNA分别进行RT-PCR，以检测肌养蛋白mRNA。使用Primer3Plus软件设计引物，并且在健康人类骨骼肌细胞(系8220)中证实其特异性。RT-PCR条件如下：50℃持续5分钟；94℃持续2分钟；94℃持续15秒、60℃持续30秒和68℃持续35秒的35个循环；以及68℃持续5分钟。在1.5％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并且通过SYBR Safe DNA Gel Stain(Invitrogen,Waltham,MA)可视化。使用ImageJ软件(NIH)或MCE-202 MultiNA系统(Shimadzu，Kyoto，Japan)，使用下式计算外显子51跳跃的效率
Figure BDA0002419965060000281
Figure BDA0002419965060000282
天然条带以上的未知的顶部条带(可能来自意外的剪接事件)被排除在跳跃效率的定量之外。用Big Dye Terminatorv3.1(Applied Biosystems,Waltham,MA)证实了PCR产物的序列。使用GAPDH或18S核糖体RNA作为内部对照。
表1：
Figure BDA0002419965060000291
1.8蛋白印迹
用含有cOmplete,Mini,无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Basel，Switzerland)的RIPA缓冲液(Thermo Scientific，Waltham，MA)收获细胞，并且然后通过21号针头10次来匀浆化。通过在4℃以14,000g离心15min来制备上清液作为上样样品。如先前描述的制备来自肌肉组织的蛋白。使用Bradford测定来调整蛋白浓度，将上清液用蒸馏水稀释100倍。将在样品缓冲液中的蛋白在70℃加热10min，所述样品缓冲液含有10％SDS、70mM Tris-HCl、pH 6.8、5mM EDTA、20％甘油、0.004％溴酚蓝和5％2-巯基乙醇。然后如先前描述的进行蛋白印迹。32,43,44分别使用来自细胞和组织的12μg和30μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将印迹在封闭溶液中与抗肌养蛋白C-末端的兔多克隆抗体(1:2500，ab15278，Abcam,Cambridge,United Kingdom)或抗肌养蛋白杆状结构域的DYS1抗体(1:400，Leica Biosystems，Buffalo Grove，IL)一起在室温孵育1小时。使一抗与HRP缀合的抗兔或小鼠IgG H+L抗体反应(1:10,000，Bio-Rad，Hercules，CA)。使用ImageJ(NIH)，使用校准曲线(R2＝0.93-0.99)定量由AO诱导的肌养蛋白的表达水平，所述校准曲线来自用来自未处理的DMD细胞或野生型小鼠的蛋白稀释的健康8220骨骼肌细胞的肌养蛋白。检测同一膜上的α微管蛋白作为上样对照。用考马斯亮蓝(Bio-Rad，Hercules，CA)对转移后的凝胶上的肌球蛋白重链(MyHC)染色，作为上样对照/分化标志物。
1.9免疫细胞化学.
将细胞用4％多聚甲醛在室温固定5min。在用含有0.01％Triton X-100的PBS洗涤后，将细胞用具有0.05％Triton X-100的PBS中的10％山羊血清(Life Technologies，Waltham，MA)封闭20min，并且然后在封闭溶液中与以1:50稀释的抗肌养蛋白C-末端抗体(ab15278)或杆状结构域抗体(DYS1)在4℃孵育过夜。用Alexa 488-缀合的或Alexa 594-缀合的二抗(1:500)检测肌养蛋白信号。检测结蛋白(desmin)(1:80，Abcam,Cambridge,United Kingdom)和快速型MyHC(1:30，Leica Biosystems,Buffalo Grove,IL)以证实细胞的肌源性分化。将细胞在4℃保存于具有DAPI的SlowFade Gold Antifade Mountant(Invitrogen,Waltham,MA)中，直到分析。
1.10免疫组织化学.
如先前描述的，用ab15278抗体检测来自未处理和处理的mdx52小鼠的TA肌肉的冷冻切片上的肌养蛋白阳性的肌纤维。使用中性密度滤光片(Eclipse TE 2000-U，Nikon,Tokyo,Japan)将经处理的小鼠的肌养蛋白的信号强度与野生型小鼠的肌养蛋白的信号强度进行比较。
1.11统计分析
为了确定外显子跳跃和肌养蛋白挽救的效率显著性，从在永生化细胞、原代细胞的一式三份的孔、和3-7只小鼠中进行的至少三次独立实验制备数据集。通过单因素ANOVA、随后为事后Tukey-Kramer多重比较检验进行AO处理组之间的统计分析。进行简单线性回归分析以确定对AO的剂量响应性。将所有分析的统计显著性设定为p<0.05。
2.结果
2.1计算机模拟筛选用于外显子51跳跃的AO.
我们设计了总计413个AO：分别具有30-mer和25-mer长度的204个和209个AO，它们覆盖了DMD外显子51中所有可能的靶位点(参见表3)。我们的外显子跳跃效率算法(“InSilico Screening Based on Predictive Algorithms as a Design Tool for ExonSkipping Oligonucleotides in Duchenne Muscular Dystrophy”Echigoya等人，PLOSONE March 2015)预测，在外显子51的起始5'位点中，30-mer AO的外显子51跳跃的最高效率为80.5％，而25-mer AO为41.2％。计算机模拟筛选表明eteplirsen所靶向的30个碱基的区域的外显子跳跃效率非常低(23.7％)，其在测试的所有413个候选AO中排名第92。注意到30-mer eteplirsen的靶位点完全涵盖了drisapersen靶位点。
2.2永生化的克隆健康骨骼肌细胞系和DMD骨骼肌细胞系的表征
用原代DMD肌细胞进行临床前测试的重要问题包括肌细胞纯度低以及突变体肌养蛋白mRNA的量不足，这在试图测试AO效力时构成问题。为了克服这些障碍，我们从3名健康受试者和具有外显子52(ex52)和ex48-50缺失(del.)突变的2名DMD患者(ID分别为KM571和6594)产生了永生化的克隆骨骼肌细胞。所有测试的永生化骨骼肌细胞系从诱导分化后的第3天起都表达可容易检测到的肌养蛋白mRNA。为了避免高估在DMD细胞中由AO诱导的肌养蛋白水平，我们在三种永生化健康骨骼肌细胞系中选择了具有最高水平的(如通过蛋白印迹确定的)肌养蛋白的细胞系(ID 8220)作为阳性对照。通过免疫细胞化学也证实了8220细胞系中的肌养蛋白表达。
2.3体外筛选外显子51跳跃AO
基于计算机模拟筛选结果，我们选择了8种30-mer AO序列，包括高排名和低排名的序列，彼此以至少4个碱基间隔开，以进行体外筛选(表2)。在本研究中，所有测试的AO，包括eteplirsen和drisapersen序列，都是使用吗啉代化学合成的，其已经被证明在参与临床试验的患者中具有良好的耐受性。在此，我们将与eteplirsen和drisapersen具有相同序列的对照吗啉代寡核苷酸(由Gene Tools产生)称为“eteplirsen类似物”和“drisapersen类似物”。在RT-PCR中，10μM的5种我们的吗啉代AO(Ac0、Ac5、Ac26、Ac30和Ac48)与eteplirsen类似物和drisapersen类似物相比在具有外显子52缺失的永生化DMD骨骼肌细胞中显示出显著更高的跳跃效率(图1A)。在测试的AO中，特别地Ac0具有最高的跳跃效率，高达72％，这分别是eteplirsen类似物和drisapersen类似物的4倍和25倍。在蛋白印迹中，Ac0也诱导了最高水平的肌养蛋白，高达健康对照细胞系水平的16％，其次是Ac48，为13％(图1B)。有趣的是，在测试时具有最高跳跃效率的这两种AO，Ac0和Ac48，并不是由算法预测为最佳的AO。
表2：
Figure BDA0002419965060000321
Ac，受体剪接位点(acceptor splice site)。非大写的核苷酸表示内含子序列。a在25-mer AO中的排名。
2.4对Ac0、Ac48以及eteplirsen的AO类似物和drisapersen的AO类似物的时间进程分析
在外显子52缺失的KM571细胞中检查了5μM的Ac0、Ac48以及eteplirsen类似物和drisapersen类似物的持续效应。在转染后第2天和第11天观察到本发明的寡核苷酸Ac0和Ac48与eteplirsen的AO类似物和drisapersen的AO类似物相比在外显子跳跃效率和肌养蛋白挽救方面的优势(图2)。
2.5 Ac0、Ac48以及eteplirsen类似物和drisapersen类似物的剂量依赖性效应
RT-PCR显示，10μM的最高浓度的Ac0在DMD KM571细胞(外显子52缺失)和6594细胞(外显子48-50缺失)中分别诱导了高达74％和64％的外显子51跳跃，这显著高于eteplirsen类似物和drisapersen类似物(图3)。在最低浓度(1μM)，Ac0与eteplirsen类似物相比在KM571和6594细胞中分别显示出12倍和10倍高的外显子跳跃效率。有趣的是，即使1μM浓度的Ac0也比10μM eteplirsen类似物诱导了更高水平的外显子51跳跃(分别地，在KM571中为24％的效率对比15％，以及在6594中为24％的效率对比21％)。定量蛋白印迹揭示，10μM Ac0在DMD细胞系中挽救的肌养蛋白表达高达健康细胞系水平的21％(图3A至D)。即使在1μM，在KM571和6594细胞系中产生肌养蛋白方面，Ac0与eteplirsen类似物的相对比率分别呈现为7.1倍和3.3倍高的效率。1μM的Ac0能够以高于10μM的eteplirsen类似物的水平或与10μM的eteplirsen类似物相当的水平产生挽救的肌养蛋白(分别地，在KM571中为10％对比6％，以及在6594中为11％对比10％)，证实了就浓度来说(concentration-wise)，Ac0与eteplirsen类似物相比在产生肌养蛋白方面多于10倍有效。在DMD肌细胞系中，drisapersen类似物对于外显子跳跃和肌养蛋白产生都未有效起作用。对Ac0和Ac48的外显子跳跃响应以剂量依赖性的方式发生，其程度比eteplirsen类似物和drisapersen类似物都大(图3A和C)。在两种DMD细胞系中，对于肌养蛋白产生，Ac0的剂量响应性也高于对照类似物(图3E)。
2.6对肌养蛋白挽救的免疫细胞化学评估
免疫细胞化学揭示，在具有外显子52和外显子48-50缺失突变的DMD骨骼肌细胞系中，10μM的Ac0和Ac48与eteplirsen类似物相比产生了更多肌养蛋白阳性的肌管并且显示出更强的信号强度(图4)。
2.7对Ac0吗啉代的长度优化
计算机模拟和体外筛选揭示，外显子51的在0和+89之间的起始5'区域是影响外显子51跳跃的重要区域。为了优化靶向该区域的Ac0的序列长度，我们比较了不同长度(25-mer至30-mer)的Ac0吗啉代的跳跃效率，其中将5'位点处的核苷酸系统性地一次去除一个(参见表2)。用1μM的这些AO处理永生化DMD肌细胞的体外测试显示，25-mer至30-mer Ac0吗啉代产生了有效的外显子跳跃(>20％)(图5)，这是一种对相同剂量的eteplirsen类似物和drisapersen类似物没有观察到的效应(图3)。然而，外显子跳跃的效率随着AO长度的增加而增加。在两种细胞系中，在1μM和3μM的剂量，证实了30-mer Ac0与较短的Ac0吗啉代，甚至是那些仅短1个或2个碱基的AO相比的统计显著的有效性。
2.8 Ac0、Ac48以及eteplirsen类似物和drisapersen类似物对原代DMD患者来源的骨骼肌细胞的作用
我们还在具有外显子45-50缺失突变(ID 4546)或外显子49-50缺失突变(ID4555)的原代DMD骨骼肌细胞中测试了AO，以验证30-mer Ac0的优越效力对于其他肌细胞类型和缺失突变模式是否一致。RT-PCR示出了，在两种原代DMD肌细胞中，Ac0与eteplirsen类似物或drisapersen类似物相比实现了显著更高的外显子跳跃效率(图6A至D)：观察到与eteplirsen类似物和drisapersen类似物相比分别高达5倍和7倍高的效率。在原代健康骨骼肌细胞中也证实了Ac0介导的外显子51跳跃的显著效率(图6E和F)。有趣的是，随着外显子51跳跃效率的增加，在原代健康肌细胞和DMD肌细胞以及具有外显子48-50缺失的永生化DMD肌细胞系(6594)中观察到不破坏阅读框的自发的外显子52跳跃。
2.10 Ac0吗啉代和eteplirsen类似物在hDMD/无Dmd小鼠中的体内效力
在外显子跳跃疗法开发中的一个主要障碍是，无法总是在适当的动物模型中测试人类特异性AO。这限制了对设计用于患者的AO的体内效果的评估。在此，我们开发了一种新的小鼠模型，其具有全长人类DMD基因，但缺乏整个小鼠Dmd基因(hDMD/无Dmd)，以测试人类AO的体内效力。该小鼠模型用于避免人类序列和小鼠序列之间的交叉反应(注意，常规mdx小鼠仍然具有小鼠肌养蛋白mRNA，其可以与人类靶向AO交叉反应)，并且通过使hDMD小鼠34与无Dmd小鼠35之间的杂交繁育获得。将Ac0、Ac48、eteplirsen类似物或drisapersen类似物注射到这些小鼠的TA肌肉中，并且在注射后2周分析体内外显子51跳跃的有效性。结果显示，与eteplirsen类似物相比，用Ac0处理的小鼠的外显子跳跃效率显著更高(图7)。在Ac48处理的小鼠中发现可见的外显子51跳跃的条带，平均外显子跳跃效率为1.11％(±0.46％，SE)。另一方面，在用drisapersen类似物处理的小鼠中未观察到可定量的外显子51跳跃的条带(图8)。
序列
Figure BDA0002419965060000361
表3：
Figure BDA0002419965060000371
Figure BDA0002419965060000381
Figure BDA0002419965060000391

Claims (24)

1.一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸能够结合至人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51，其中所述反义寡核苷酸的结合完全发生在所述前体mRNA序列的0和+89之间的区域内，并且其中所述反义寡核苷酸包含至少27个碱基。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含至少28个碱基、至少29个碱基或至少30个碱基。
3.根据权利要求1或2所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸由30个碱基组成。
4.根据任一前述权利要求所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的结合完全发生在人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的0和+88之间、0和+87之间、0和+86之间、0和+85之间、0和+84之间、0和+83之间、0和+82之间、0和+81之间、0和+80之间、0和+79之间、或0和+78之间的区域内。
5.根据任一前述权利要求所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的结合完全发生在所述前体mRNA序列的0和+78之间的区域内。
6.根据任一前述权利要求所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸与人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的落入所述区域内的序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％至少99％互补。
7.根据任一前述权利要求所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸能够与人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的落入所述区域内的序列杂交。
8.根据任一前述权利要求所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含以下序列之一的至少27个碱基：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ IDNO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
9.根据任一前述权利要求所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸与以下序列之一共有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性和/或同源性：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
10.根据任一前述权利要求所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含以下序列之一：SEQ ID NO.1(Ac0)、SEQ ID NO.2(Ac5)、SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
11.根据任一前述权利要求所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含SEQ IDNO.1(Ac0)或SEQ ID NO.5(Ac48)。
12.一种缀合物，所述缀合物包含根据权利要求1-11中任一项所述的反义寡核苷酸和载体，其中所述载体缀合至所述反义寡核苷酸。
13.根据权利要求12所述的缀合物，其中所述载体是可操作的，以将所述反义寡核苷酸转运到靶细胞中。
14.根据权利要求12或13所述的缀合物，其中所述载体选自肽、小分子化学物质、聚合物、纳米颗粒、脂质、脂质体或外泌体。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的缀合物，其中所述载体是细胞穿透肽。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的缀合物，其中所述载体是富含精氨酸的细胞穿透肽。
17.一种细胞，所述细胞装载有根据权利要求13-16中任一项所述的缀合物。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-11中任一项所述的反义寡核苷酸和/或根据权利要求12-16中任一项所述的缀合物，以及药学上可接受的赋形剂。
19.一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸能够结合至人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51，所述反义寡核苷酸用于在治疗受试者的肌肉紊乱中使用，其中所述反义寡核苷酸的结合完全发生在所述前体mRNA序列的0和+89之间的区域内，并且其中所述反义寡核苷酸包含至少27个碱基。
20.根据权利要求19所述的用于使用的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含任一权利要求1-11中定义的特征。
21.根据权利要求19或20所述的用于使用的反义寡核苷酸，其中所述肌肉紊乱是由与肌肉功能相关的基因中的基因突变导致的紊乱。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的用于使用的反义寡核苷酸，其中所述肌肉紊乱是杜氏肌营养不良症或贝克肌营养不良症。
23.一种增加细胞中人类肌养蛋白表达的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的能够结合至人类肌养蛋白前体mRNA的外显子51的反义寡核苷酸接触，其中所述反义寡核苷酸的结合完全发生在所述前体mRNA序列的0和+89之间的区域内，并且其中所述反义寡核苷酸包含至少27个碱基。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述反义寡核苷酸包含任一权利要求1-11中定义的特征。
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