KR102654566B1 - 재조합 바이러스, 이를 포함하는 조성물 및 그 용도 - Google Patents

재조합 바이러스, 이를 포함하는 조성물 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

인플루엔자 A 바이러스에 함유될 수 있는 헤마글루티닌 (HA) 변이체 및/또는 뉴 라미니다아제 (NA) 변이체를 포함하는 면역원성 조성물, 및 인플루엔자 A 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 그의 용도이다.

Description

재조합 바이러스, 이를 포함하는 조성물 및 그 용도{RECOMBINANT VIRUS, COMPOSITION COMPRISING THE SAME, AND USES THEREOF}
본 출원은 2016 년 11 월 8 일자로 출원된 미국 가출원 제 62/418,800 호의 출원일의 이익을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 인용되어 있다.
인플루엔자 A 바이러스 (Influenza A Virus, IAV)는 오르토믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae) 계열에 속하며, 광범위하게 순환하며 종간 장벽을 넘을 수 있다. 지난 10 년 동안 인플루엔자 A 전염병이 유행했기 때문에 IAV 감염은 주요한 세계적 건강 위협 요인을 구성한다.
헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA)과 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA)는 IAV의 표면에 위치한 당 단백질이다. HA 및 NA 단백질의 항원 드리프트 및 이동은 IAV 감염에 대한 개선된 보호를 제공하는 백신의 개발을 필요로 한다. 따라서, 신속하게 진화하는 IAV 퇴치를 위한 백신 개발에 사용하기 위해, 개선된 면역원성을 가지는 HA 및 NA 변이형을 확인하는 것이 매우 중요하다.
본 발명은 어느 정도는, 변형된 N-글리코실화 패턴을 갖는 돌연변이 헤마글루티닌 (HA) 항원을 포함하거나 또는 결함 뉴라미니다아제 활성을 가지는 돌연변이 뉴라미니다아제 (NA)를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 (IAV)가 야생형 대조군에 비해 향상된 면역원성을 나타내는 예상하지 못한 발견에 기초한다.
따라서, 본원의 한 양태는 야생형 대응물과 비교하여 돌연변이 헤마글루티닌 (HA)을 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)를 특징으로 하고, 서열번호 1(또는 서열번호 3)의 잔기 142에 상응하는 위치에 Asn 잔기를 보유하며, 서열번호 1(또는 서열번호 3)의 잔기 285, 497 및 556에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이를 포함하며, 이 때, 상기 돌연변이 헤마글루티닌 (HA)는 서열번호 1(또는 서열번호 3)의 잔기 142에 상응하는 위치에서 N-글리코실화(N-glycosylated)되고 서열번호 1(또는 서열번호 3)의 잔기 285, 497 및 556에 대응하는 하나 이상의 돌연변이 위치에서 아글라이코실화(aglycosylated)되어 있다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 HA는 서열 번호 1의 잔기 27에 상응하는 위치에 Asn 잔기를 추가로 더 보유할 수 있고, 상기 돌연변이체 HA는 서열 번호 1의 잔기 27에 상응하는 위치에서 N- 글리코실화된다.
본원에 기술된 임의의 돌연변이 HA 항원은 서열 번호 1 (또는 서열 번호 3)과 적어도 85 % (예를 들어, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 %) 동일한 아미노산 서열을 포함 할 수 있다. 하나의 예에서, 상기 HA 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 돌연변이 HA 항원은 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 그의 야생형 대응물과 비교하여, (a) 하나 이상의 활성 부위에서의 돌연변이, (b) N-글리코실화 부위 중 하나 이상에서의 돌연변이, 또는 (a)와 (b)의 조합을 포함하는 돌연변이 뉴라미니다아제 (NA)를 포함하는, 재조합 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)를 제공하며; 이 때, 상기 돌연변이 NA는 뉴라미니다아제 활성에서 결함이 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 돌연변이 NA는 서열 번호 4의 44, 72 및 219 위치에 상응하는 하나 이상의 N- 글리코실화 부위에서의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 돌연변이 NA는 (1) 서열 번호 4에서 44에 상응하는 위치에서의 치환, (2) 서열 번호 4에서 72에 상응하는 위치에서의 치환, (3) 서열 번호 4의 44 및 72에 상응하는 위치에서의 치환, 또는 (4) 서열 번호 4의 44, 72 및 219에 상응하는 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 상기 돌연변이 NA는 서열 번호 4에서 102 및 135에 상응하는 위치일 수 있는, 하나 이상의 활성 부위에서의 치환을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 NA 돌연변이는 서열 번호 4와 적어도 85 % (예를 들어, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 %) 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 돌연변이 NA는 하나 이상의 N-글리코실화 부위, 하나 이상의 활성 부위 또는 둘 모두를 함유하는 하나 이상의 영역에서 결실을 포함 할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 N는 줄기 영역(stalk region)에서의 결실, 촉매 도메인(catalytic domain)에서의 결실, 또는 둘 모두를 포함 할 수 있다. 일 예시에서, 상기 돌연변이 NA는 결실된 전체 촉매 도메인을 가질 수 있다. 다른 예에서, 상기 돌연변이 NA는 결실된 촉매 도메인 및 줄기 영역 모두를 가질 수 있다. 하나의 특정 예에서, 돌연변이 NA는 서열 번호 2의 펩타이드이다.
본원에 개시된 임의의 NA 돌연변이체도 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 (i) 임의의 재조합 인플루엔자 A 바이러스 (IAV) 또는 본원에 기재된 임의의 HA 돌연변이 및 (ii) 아쥬번트일수 있는 약학 적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 대상에서 인플루엔자 A 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 유효량의 면역원성 조성물을 이를 필요로하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 대상은 인플루엔자 A 바이러스에 감염되거나, 감염이 의심되거나, 또는 감염될 위험이 있는 사람이다. 예시적인 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1 또는 H5N1 인플루엔자 A 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 면역원성 조성물은 경구 투여, 장관(enteral) 투여, 비강 투여, 국소 투여 또는 경점막(transmucosal) 투여를 통해 대상에게 투여될 수 있다. 일 예에서, 상기 면역원성 조성물은 비경구적으로 환자에게 투여될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 재조합 IAV, HA 변이체 또는 NA 변이체, 또는 치료를 필요로 하는 대상에서 인플루엔자 A 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것을 포함하는 면역원성 조성물, 또는 IAVs , HA 변이체, NA 변이체 또는 A형 인플루엔자 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제를 제조하기 위한 면역원성 조성물의 용도가 본 개시의 범위 내에 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시예의 세부 사항은 이하의 설명에서 설명된다. 본 발명의 다른 특징들 또는 장점들은 다음의 도면들 및 몇몇 실시예들의 상세한 설명, 그리고 첨부된 청구항들로부터 명백해질 것이다.
도 1a 내지 도 1d는 인플루엔자 A 바이러스 (IAV) 상에서 헤마글루티닌 (HA)의 면역 원성에 대한 글리코실화의 영향을 나타내는 도면을 포함한다. (A) : IAV 표면 단백질 HA 및 뉴라미니다아제 (NA)에서 글리코사이트 (Ψ)의 도식적 개요. CT: C- 말단 세포질 도메인. TM: 트랜스멤브레인 도메인. N: N- 말단 세포질 도메인. (B): MDCK 세포에서 상이한 글리코실화 패턴을 갖는 바이러스의 복제율의 비교를 나타내는 차트. (C) : 항-HA, 항-M1 및 항-β-액틴 항체를 사용하여, 지시된 바와 같이 IAV의 4 가지 변이체에 감염된 A549 세포의 웨스턴 블럿 분석을 나타내는 사진. (D) : 야생형 (WT) 및 142-G IAV 균주에서 글리칸(glycan) 배열의 HA 결합 패턴을 보여주는 다이어그램. (E): 지시된 대로 lAV 변이체의 혈구 응집(hemagglutinination)을 보여주는 사진. (F) : 탈글라이코실화된 HA를 갖는 WT 바이러스의 글리칸 어레이 분석을 나타내는 다이어그램. (G) : 면역화된 마우스로부터 수득한 혈청의 혈장 응집 억제 시험법(hemagglutination inhibition assay)을 사용하여, 비활성화된 바이러스로 면역화시킨, 마우스에 나타낸 바와 같은 WT IAV 및 IAV 변이체의 면역원성을 나타내는 다이어그램. (H) : 지정된 바이러스로 면역화시킨 후 이어서 치사량의 H5N1 바이러스를 투여한 마우스의 생존율을 보여주는 도표. 패널 (B), (D) 및 (F)에서, 3 개의 독립적인 실험에 대한 평균 ± 표준 오차 (SEM)가 도시되어 있다; 패널 (G)에서, 10 개의 독립적인 실험에 대한 평균 ± SEM이 도시된다; 패널 (H)에서, 10 개의 독립적인 실험이 도시된다. *: P < 0.001. **: P < 0.05.
도 2a 내지 도 2c는 IAV상의 뉴라미니다아제 (neuraminidase, NA)의 병독성(virulence) 및 구조에 대한 글리코실레이션의 영향을 나타내는 도면을 포함한다. (A) : A549 세포의 바이러스 복제율 비교를 보여주는 차트. (B) : 항-NA 항체를 사용하여 지시한대로 글리코실화 및 탈글리코실화된 NA 변이체의 분자량의 웨스턴 블럿 분석을 나타내는 사진. (C) : 지시한대로 상이한 유형의 NA의 원편광 이색성 스펙트럼(circular dichroism spectra)을 도시하는 차트. (D) : NA의 탈글리코실화된 변이체의 원편광 이색성 스펙트럼을 도시하는 차트. (E) : 4-MUNANA 분석법을 사용하여 측정된 IAV의 NA 활성을 나타내는 차트. 패널 B에서, 3 개의 독립적 인 실험에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다; 패널 E에서, 5 회의 독립적인 실험에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다. *: P < 0.001.
도 3a 내지 도 3c는 IAV에 대한 뉴라미니다아제 (NA)의 면역원성에 대한 글리코실화의 영향을 나타내는 도면을 포함한다. (A) : 상이한 글리코컨쥬게이트, 4-MuA-Neu5Ac, 6-SLN 및 3-SLN을 사용하여 NA 활성의 측정치를 나타내는 차트; NA 활성은 100 %로 지정된 각각의 WT 기질에 상대적으로 나타냄. (B) : LMH 세포에서 바이러스 생산의 비교를 나타내는 차트. 바이러스 역가는 48 hpi로 결정되었다. (C) : 6-SL과 상호 작용하는 바이러스 변이체의 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography)를 보여주는 사진. (D) : 4-MUNANA 분석법을 사용하여, 37 ℃ 및 55 ℃에서 44-72-G 바이러스, 탈글리코실화된 44-72-G 바이러스 및 44-72-219-G 바이러스의 NA 활성을 나타내는 차트. (E) : WT 바이러스에 대한 투과 전자 현미경을 사용하여 바이러스 형태를 보여주는 사진. (F) : 44-72-219-G 바이러스에 대한 패널 E와 같은 바이러스 형태를 나타내는 사진. (G) : WT IAV (WSN) 또는 표시된 NA 변이체를 함유한 IAV로 항원 투여된 마우스의 생존율을 나타내는 다이어그램. (H) : 패널 G에서와 같이 처리 된 마우스 바디를 보여주는 차트. 패널 A, B 및 D에서, 3 회의 독립적인 실험에 대한 평균 ± SEM; 패널 G에서, 5 개의 독립적인 실험이 도시된다; 패널 H에서 평균 ± SEM. 5 개의 독립적인 실험에 대한 결과가 도시된다. *: P < 0.001. **: P < 0.05.
도 4a 내지 도 4c는 살아있는 약독화 인플루엔자 백신 (LAIV)에 대한 NA의 면역 원성에 대한 절단(truncation)의 영향을 나타내는 도면을 포함한다. (A) : LAIV H1N1 A / WSN / 33 (WSN) -NA 디자인의 개략도임. 숫자는 cRNA의 5 '말단의 뉴클레오타이드 번호를 나타낸다. TGA는 정지 코돈이었다. (B): 면역화된 마우스로부터 얻은 혈청의 혈구 응집 억제 시험법을 사용하여, 비활성화된 바이러스로 면역화시킨 마우스에서 나타나는 WT IAV (WSN) 및 IAV 변이체의 면역원성을 나타내는 도면임. (C) : 표시된 바이러스로 처리한 후, 이어서 H5N1 바이러스로 처리한 마우스의 생존율을 나타내는 도표임. (D) : 표시된 대로 처리된 마우스의 폐에서 H5N1 바이러스 복제 동역학을 나타내는 도표임. (E) : 면역화된 마우스로부터 수득한 혈청의 혈구 응집 억제 시험법을 사용하여 마우스에서 지시된 바와 같은 WT IAV (WSN) 및 LAIV WSN-NA의 면역 원성을 나타내는 도표. (F) : WSN 바이러스 (+ 바이러스)를, 면역화된 마우스로부터 수득한 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)와 함께 배양 한 후 CD8 + T 세포에서 INF-γ 발현의 유세포 계측 분석을 사용하여, 바이러스 감염 시 CD8 + T 세포 활성화를 유도하는 LAIV WSN-NA의 능력을 나타내는 도면임. (G) : 지시된 에피토프를 면역화된 마우스로부터 수득한 PBMC와 함께 배양한 후, CD8 + T 세포에서 INF-γ 발현의 유세포 계측 분석을 사용하여 M1 및 NP 에피토프에 의한 자극시 CD8 + T 세포 활성화를 유도하는 LAIV WSN-NA 바이러스의 능력을 보여주는 도표. 패널 B, D 및 E에서, 10 개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM이 도시됨; 패널 C에서, 10 개의 독립적인 실험이 도시됨; 패널 F 및 G에서, 데이터는 3 개의 유사한 실험을 대표함. *: P < 0.001.
도 5a 내지 도 5d는 IAV상의 HA의 면역원성에 대한 HA 탈글리코실화의 영향을 나타내는 도면을 포함한다. (A) : HA에 상이한 글리코사이트가 있는 11 개의 IAV에 대한 개략도임; CT는 C-말단 세포질 도메인을 나타내고; TM은 트랜스멤브레인 도메인을 나타낸다. 모든 재조합 바이러스는 게놈 시퀀싱에 의해 확인되었다. (B) : 48 hpi에서 11 가지 바이러스 변이체로 감염된 A549 세포에서의 바이러스 생산 비교를 보여주는 도표임. (C) : 지시된대로 HA 변이체의 원편광 이색성 스펙트럼을 나타내는 차트임. (D) : 항-HA 및 항-M1 항체를 사용하여, 지시된 바와 같이 IAV의 4 가지 변이체의 동일한 농도의 웨스턴 블랏 분석을 나타내는 사진임. 필터는 항-HA 및 항-M1 모노클로날 항체로 프로빙되었다. (E) : MDCK 세포의 감염 후 바이러스 역가를 결정하기 위해 플라크 분석을 사용하여, 지시된 HA 변이체를 갖는 바이러스의 감염성을 나타내는 도표. (F) : 세포 결합 분석법을 사용하여 세포 수용체 결합능을 나타내는 도표. (G) : 48hpi로 감염된 LMH 세포에서 지시된 바이러스의 바이러스 생산 (바이러스 역가로 측정)의 비교를 보여주는 도표. (H) : 항-HA 항체를 사용하여 엔도 글리코시다아제 칵테일에 의한 탈글리코실화 후 IAV의 3 가지 변이체에 대한 웨스턴 블럿 분석을 나타내는 사진. (I) : 마우스를 글리코시다아제 칵테일로 처리된 바이러스의 치사량으로 시험한 후 마우스 생존율을 보여주는 도표. 패널 B, E, F 및 G에서, 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM이 도시됨; 패널 I에는 10 개의 독립적인 실험이 도시됨. *: P < 0.001
도 6a 내지 도 6c는 HA의 결합 특이성 및 결합력에 대한 글리코실화의 영향을 포함하는 도면이다. (A) : IAV 결합 연구를 위한 글리칸 어레이 상의 시알로 사이드 구조의 개요. AV 바인딩을 연구하기 위해, 이 합성 SA 글리칸 어레이는 다음의 시알로 사이드로 구성됨: 20 개의 α2,3- 글리칸 (1-20), 9 개의 α2,6- 글리 칸 (21-29), 10 개의 α2,8 및 α2,9 글리칸 (30-39) I 고안되었습니다. (B) : 지시된 4 가지 바이러스 변이체의 글리칸 어레이 분석을 보여주는 도표. (C) : 4 가지 HA 단백질 변이체의 글리칸 어레이 분석을 보여주는 도표. (D)는 탈글리코실화된 285-497-556-G HA IAV의 글리칸 어레이 분석을 도시하는 도면. (E) : 142-285-497-556-G HA IAV의 글리칸 어레이 분석을 보여주는 도표. 패널 B, C, D 및 E에서, 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타냄.
도 7a 및 도 7b는 IAV에 대한 NA의 활성에 대한 글리코실화의 영향을 포함하는 도면이다. (A) : NA에서 상이한 글리코실화 패턴을 갖는 8 개 IAV의 개략도. 글리코사이트가 표시됨. N은 N-말단 세포질 도메인을 나타내고; TM은 트랜스멤브레인 도메인을 나타낸다. 모든 재조합 바이러스는 게놈 시퀀싱에 의해 확인되었다. (B) : 지시된 바와 같이 8 가지 바이러스 변이체로 감염된 MDCK 세포에서 바이러스 생산의 비교를 나타내는 도표. (C) : 5 가지 유형의 NA 단백질의 겔 여과 분석을 나타내는 도면. (D) : 5 가지 유형의 탈글리코실화된 NA 단백질의 겔 여과 분석을 나타내는 도면. (E) : 항-NA 항체를 사용하여 엔도 글리코시다아제 칵테일로 처리한 후 바이러스의 웨스턴 블럿 분석을 나타내는 사진. (F) : 4-MUNANA 분석에 의한 탈글리코실화된 IAV에서의 NA 활성의 측정치를 나타내는 차트. 패널 B에서, 3 개의 독립적인 실험에 대한 평균 ± SEM이 도시됨; 패널 F에서, 5 회의 독립적인 실험에 대한 평균 ± SEM이 도시됨. *: P < 0.001
도 8a 및 도 8b는 NA의 열 안정성 및 IAV 형태에 대한 글리코실화의 영향을 나타내는 도면을 포함한다. (A) : 지시된 WSN NA 돌연변이가 3-SL을 절단 할 수 없음을 보여주는 사진. (B) : 4-MUNANA 분석법을 사용하여 바이러스의 NA 활성에 미치는 온도의 영향을 보여주는 도표. (C) : 항-NA 항체를 사용하여 엔도 글리코시다아제 칵테일 (F1, F2, F3 및 H)로 처리한 후 44-72-G 및 44-72-219-G 바이러스의 웨스턴 블럿 분석을 보여주는 사진. (D) : 투과 전자 현미경을 이용한 44-G NA 바이러스의 형태를 보여주는 사진. (E) : 전자 현미경을 사용하여 72-G 바이러스의 형태를 보여주는 사진. (F) : 전자 현미경을 사용하여 44-72-G 바이러스의 형태를 보여주는 사진. 패널 B에서, 5 회의 독립적인 실험에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다. *: P < 0.001.
도 9는 살아있는 약독화 인플루엔자 백신 (LAIV)에 대한 NA의 면역 원성에 대한 글리코실화의 영향을 나타내는 도면을 포함한다. (A) : 치사량의 H5N1 항원 투여 후 WSN, LAIV WSN-44-72-219-G 또는 PBS 처리 쥐의 생존율을 보여주는 차트. (B) : 면역화된 마우스로부터 수득한 혈청의 혈구 응집 억제 시험 법을 사용하여, 불활성화된 바이러스로 면역화시킨 마우스에서 나타낸 WT IAV 및 LAIV 변이체의 면역원성을 나타내는 도표. (C) : 뉴라미니다아제 억제 분석을 사용하여, 지시된 바와 같이 면역화된 마우스로부터의 NA 항체의 역가를 보여주는 도표. WSN 처리 마우스의 혈청 최대 억제 농도 (IC50)는 4.3 μg/ml이었고 LAIV WSN-44-72-219-G는 3.2 μg/ml이었다. 패널 A에는 5 개의 독립적인 실험이 표시되어 있다. 패널 B 및 C에서, 5 개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 10a 및 도 10b는 LAIV WSN-NA 바이러스가 병원성이 낮은 효과적인 백신임을 나타내는 도면을 포함한다. (A) : WT MDCK 및 NA 발현하는 MDCK에서(MDCK + NA) WSN 및 LAIV WSN-NA 바이러스에 의한 플라크 형성의 비교를 나타내는 도표. (B) : 항-NA 및 항-β-액틴 항체를 사용하여 MDCK + NA 세포에서 NA 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타내는 사진. (C) : A549 세포가 MOI 3에서 바이러스에 감염된 후 지시된 시간에 지시된 바이러스 역가를 나타내는 도표. (D) : 항-M1 항체 및 항-β-액틴 항체를 사용하여, 지시된 바이러스에 감염된 A549 세포에서 세포 내 바이러스 M1 단백질 수준의 웨스턴 블랏 분석을 나타내는 사진. (E) : WSN 또는 LAIV WSN-NA 바이러스에 감염된 마우스의 생존율을 나타낸 도표. (F) : 14일 동안 바이러스에 감염된 마우스의 체중을 보여주는 도표. 패널 C에서, 3 회의 독립적인 실험에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다. 패널 E에는 5 개의 독립적인 실험이 도시되어있다. 패널 F에서, 5 회의 독립적인 실험에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다. *: P <0.001.
도 11은 불활성화된 WSN 및 WSN-NA 바이러스에 대한 숙주 면역 반응을 비교하는 도면을 포함한다. (A) : 지시된 불활성화 바이러스로 면역화하고 이어서 치사량의 WSN 바이러스로 시험된 마우스의 생존율을 보여주는 차트. (B) : 지시된 바이러스로 면역화하고 치사량의 H5N1 바이러스로 시험된 마우스의 생존율을 보여주는 차트. (C) : 뉴라미니다아제 억제 분석을 사용하여, 지시된 바이러스로 면역화된 마우스로부터 NA 항체의 역가를 나타내는 차트. WSN 바이러스 처리 마우스의 혈청 IC50은 5.2㎍/ml이었고, WSN-NA 바이러스는 4.7㎍/ml이었다. 패널 A와 B에는 10 개의 독립적인 실험이 표시되어 있다; 패널 C에서, 10 개의 독립적 인 실험에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 12a 내지 도 12c는 LAIV WSN-NA 처리로부터의 교차 균주 보호(cross-strain protection)를 나타내는 도면을 포함한다. (A) : 마우스가 WSN, LAIV WSN-NA 또는 PBS로 처리하고 이어서 치사량의 WSN을 투여한 마우스의 생존율을 보여주는 차트. (B) : 감염 후 4 일 및 6 일에 지시된 바와 같이 처리된 쥐의 폐에서 WSN 바이러스 복제 동역학을 나타내는 차트. (C) : 마우스가 WSN, LAIV WSN-NA 또는 PBS로 처리되고 이어서 A/cal/07/2009 (H1N1)의 치사량으로 접종된 후 마우스 생존율을 나타내는 차트. (D) : 감염 후 4 일과 6 일에 처리된 마우스의 폐에서 A/cal/07/2009 바이러스 복제 동역학을 보여주는 차트. (E) : H5N1 및 WSN 접종 후 LAIV WSN-NA 처리량과 마우스 생존율 간의 관계를 보여주는 차트. (F) : 유세포 계측법을 사용하여 살아있는 WSN-, LAIV WSN-NA- 및 PBS- 처리 마우스의 CD8 + T 세포에서 INF-γ 발현에 대한 불활성화된 WSN 바이러스의 영향을 보여주는 차트. (G) : 항-그랜자임 B 및 항-β-액틴 항체를 사용하여, 살아있는 WSN 바이러스 (+ 바이러스), NP (+ NP) 또는 M1 (+ M1) 에피토프를 가지는 LAIV WSN-NA로 면역화된 마우스로부터의 CD8 + 세포의 그랜자임 B 발현 배양물의 웨스턴 블럿 분석을 나타내는 사진. 패널 A, C 및 E에서 10 개의 독립적인 실험이 표시된다. 패널 B, D에서 3 회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 보여준다. F, 데이터는 세 가지 유사한 실험을 대표한다. *: P < 0.001.
도 13은 IAV 복제에 대한 M2 글리코실화의 영향을 나타내는 도면을 포함한다. (A) : M2 도메인 구조의 도식 개요; 글리코사이트가 강조됨. M2 상의 글리코사이트 서열은 NDS였다. 역 유전학을 사용하여 N에서 G 또는 S를 I로 변경함. (B) : 감염 24 시간 후에 바이러스 역가를 결정하기 위한 플라크 분석을 사용하여, 0.01의 MOI에서 지시된 IAV 변이체에 감염된 MDCK 세포의 바이러스 복제율의 비교를 나타내는 차트. 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 보여준다.
도 14a 및 도 14b는 바이러스 방출에 대한 NA 활성의 영향을 나타내는 도면을 포함한다. (A) : NA 상에서 상이한 변형을 가지는 10 개의 IAV에 대한 개략적 개관. 글리코사이트가 표시됨. AS1 구조물은 활성 부위 1을 불활성화시키는 R102A 돌연변이를 포함하고; AS2 구조물은 활성 부위 2를 불활성화시키는 D135A 돌연변이를 포함하고; N은 N- 말단 세포질 도메인을 나타내고; TM은 트랜스멤브레인 도메인을 나타낸다. 모든 재조합 바이러스는 게놈 시퀀싱에 의해 확인되었다. (B) : 3의 MOI에서 지시된 바이러스 변이체로 감염시킨 후 A549 세포의 바이러스 역가를 나타내는 도표. 감염 후 8 및 24 시간에 배양액(Culture fluids)을 수집 하였다. (C) : 패널 B에서와 같이 감염된 A549 세포의 전체 세포 용 해물에서 세포 내 바이러스 RNA를 보여주는 차트. (D) : 항-NA, 항-NP, 항-M1 및 항-β-액틴 항체를 사용하여 패널 B와 같이 감염된 A549 세포의 전체 세포 용 해물에서 NA, N 및 M1 단백질 수준의 웨스턴 블럿 분석을 보여주는 사진 .패널 B 및 C에서, 세 번의 독립적인 실험에 대한 평균 ± SEM.
도 15a 및 도 15b는 LAIV WSN-NA 및 WSN-NA-AS1로 숙주 면역 반응을 비교하는 도면을 포함한다. 1 Х 106 pfu의 WSN, LAIV WSN-NA, WSN-NA-AS1 또는 WSN (WSN (UL)) 바이러스의 비치사량으로 마우스를 감염시킨 후, 생존율 (A)과 체중 (B)을 14일 동안 기록하였다. (C) 처리된 마우스의 혈청을 혈구 응집 억제 분석을 사용하여 분석 하였다. (D) 감염 후 4 일째에 표시된 바와 같이 상이한 IAV 구조물에 의해 처리된 마우스의 폐에서의 바이러스 복제 동역학. (E) 치사량의 H5N1 항원 투여 후 WSN (UL), LAIV WSN-NA, WSN-NA-AS1 또는 PBS 처리 마우스의 생존율 분석 (A, B 및 E). 10 개의 독립적인 실험이 표시됨(C와 D) 세 가지 독립적인 실험이 표시됨.
보편적인 인플루엔자 백신의 최근 개발은, 항원으로서 보존된 펩티드 또는 단백질을 상이한 아쥬번트 및 투여 방법으로 사용하는 것에 초점을 맞추어 면역 반응을 유도한다. 그러나, 보존된 펩티드 또는 단백질의 사용은 독성 바이러스를 유발하여 안전 문제를 일으키고/일으키거나 하나의 인플루엔자 균주에 대한 면역 반응을 제한할 수 있다. 본원 개시는, 부분적으로, 면역원성이 강화된 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다아제 (NA) 면역펩타이드 변이체의 개발을 통해 이러한 한계를 극복하는 것을 목표로 한다. 이러한 HA 및/또는 NA 변이체는 광범위한 인플루엔자 바이러스 균주의 광범위한 스펙트럼에 대해 면역 반응을 유도할 수 있으며, 보편적인 인플루엔자 백신 제조에 유용할 수 있다.
따라서, 본원은 향상된 면역원성을 갖는 HA 및 NA 변이체를 제공하고, 이러한 변이체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 입자, 인플루엔자 바이러스 입자 또는 HA / NA 변이체를 포함하는 면역 조성물, 그리고 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응 유도를 위한 이의 용도가 제공된다.
I. 헤마글루티닌 변이체(Hemagglutinin (HA) Variants)
헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA)는 인플루엔자 바이러스의 표면에서 발견되는 당단백질(glycoprotein)이다. HA는 세포막에 시알산(sialic acid)을 가지는, 호흡기 및 적혈구 세포에 바이러스를 결합시키는 역할을 한다. HA 단백질은 종종 Asn-Xaa-Ser/Thr(N-glycosylation)의 컨센서스 모티프(consensus motif)에 있는 다중 아스파라긴 잔기에 글리칸을 첨가하여 번역 후 변형된다. N-글리코실화가 일어나는 Asn 잔기는 본 명세서에서 글리코사이트 또는 N- 글리코실화 부위로 지칭된다.
예로서, 인플루엔자 A 바이러스 (A / WSN / 1933 (H1N1))는 이하 서열번호 3으로 제공된다. 이 야생형의 ha의 글리코사이트 (Asn 또는 N 잔기)는 굵게 표시되어 있다.
다른 야생형 HA 항원, 예를 들어, H1, H2 또는 H3 HA 항원은 당업계에 잘 공지되어 있으며 그들의 아미노산 서열은 공개적으로 이용 가능한 유전자 데이터베이스, 예를 들어 GenBank에서 찾을 수 있다. 특정 야생형 HA 서브타입(subtype)의 글리코사이트는 그의 아미노산 서열을 예시적인 서열, 상기 제공된 서열 번호 3과 비교함으로써 확인 될 수 있다.
본원에 기술된 HA 변이체는 당업계에 공지된 임의의 야생형 HA 서브타입, 예를 들어, H1, H2 또는 H3 HA 항원으로부터 유도될 수 있다. 야생형 대응물과 비교하여, 이러한 HA 변이체는 하나 이상의 글리코사이트를 유지하지만, N-글리코실화가 돌연변이된 부위에서 일어나지 않는(글리코실화 되지 않은) 하나 이상의 다른 글리코 사이트를 갖는다. 예를 들어, 본원에 기술된 상기 HA 변이체는 서열 번호 3의 잔기 142 (하기 서열 번호 1의 잔기 142와 동일)에 상응하는 위치에 Asn 잔기 (글리코사이트)를 보유할 수 있고, 서열 번호 3의 잔기 27에 상응하는 위치에 Asn 잔기를 보유하지만 (하기 서열 번호 1의 잔기 27과 동일 함), 반면에 서열 번호 3의 잔기 285, 497 및 556 (하기 서열 번호 1에서의 잔기 285, 497 및 556과 동일함)에 상응하는 위치에 Asn 잔기 중 하나 이상이 돌연변이 되었다. 그러므로, 본원에 기재된 상기 HA 변이체는 서열 번호 3 (또는 서열 번호 1)의 142번 위치 및 선택적으로 27번 위치에 상응하는 Asn 잔기에서 글리코실화될 수 있는 반면, 서열 번호 3 (또는 서열 번호 1)의 285, 497 및/또는 556 위치에 상응하는 돌연변이된 글리코사이트에서 글리코실화 되지 않는다(aglycosylated).
용어 "돌연변이된" 또는 "돌연변이"는 임의의 유형의 돌연변이, 예를 들어, 첨가, 결실 및 아미노산 치환을 지칭할 수 있다. 일부 경우, 서열 번호 3 또는 서열 번호 1의 285, 497 및 556 위치에 상응하는 하나 이상의 Asn 잔기가 결실될 수 있다. 다른 경우, 하나 이상의 이들 Asn 잔기는 다른 아미노산 잔기 (예를 들어, Ala 또는 Gly)로 치환될 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 HA 변이체는 돌연변이된 3 가지 글리코사이트 중 하나를 가질 수 있다. 다른 예에서, 상기 HA 변이체는 돌연변이된 3 개의 글리코사이트 중 2 개, 예를 들어 285 + 497, 285 + 556 또는 497 + 556을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 3 개의 글리코사이트 전부가 돌연변이(예를 들어, 치환) 된다.
"서열 Y의 위치 a에 상응하는 서열 X의 잔기"는, 당해 분야에 공지된 아미노산 정렬 도구, 예를 들어 BLAST®를 사용하여 서열 X 및 Y가 정렬될 때 서열 X의 대응 위치에서의 잔기를 지칭한다.
본원에 기재된 바와 같은 예시적인 HA 변이체의 아미노산 서열을 하기에 제공한다. 다른 예시적인 HA 변이체는 본 개시 내용의 다른 곳에서, 예를 들어, 하기 실시예에서 제공된다.
상기 HA 변이체는 야생형 HA 항원 (예: 서열 번호 3)과 적어도 85 % (예를 들어, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % 또는 99 %)와 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 위에서 언급한 바와 같이 글리코사이트 돌연변이를 포함할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같은 용어 "서열 동일성"은 서열 비교 (정렬)에 의해 결정된 바와 같은, 2개의 폴리펩타이드의 서열 간의 관계를 나타낸다. 당해 분야에서 동일성은 또한, 2 개 이상의 아미노산 잔기의 스트링 사이의 매치의 수에 의해 결정된 바와 같은 두 서열 간의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 동일성은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (예 : "알고리즘")에 의해 처리된 갭 정렬 (있는 경우)을 갖는 둘 이상의 서열 중 더 작은 것 사이의 동일한 매칭 퍼센트를 측정한다. 관련 펩티드의 동일성은 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 두 아미노산 서열의 "퍼센트 동일성"은 Karlin and Altschul Proc. (Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990)의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있고, Karlin and Altschul Proc. (Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993)에서처럼 변경될 수 있다. 이러한 알고리즘은 Altschul 등(J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)의 NBLAST® 및 XBLAST® 프로그램 (버전 2.0)에 통합되어 있다. BLAST® 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행되어 본 발명의 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 두 서열간에 갭이 존재하는 경우, Gapped BLAST®는 Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402, 1997)에 기재된 바대로 이용될 수 있다. BLAST® 및 Gapped BLAST® 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램 (예 : XBLAST® 및 NBLAST®)의 기본 매개 변수(default parameters)를 사용할 수 있다. 다른 인기 있는 로컬 정렬 기술은 Smith-Waterman algorithm (Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) "Identification of common molecular subsequences." J. Mol. Biol. 147:195-197)에 기반을 두고 있다. 동적 프로그래밍에 기초한 일반적인 글로벌 정렬 기술은 Needleman-Wunsch algorithm (Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins." J. Mol. Biol. 48:443-453)이다. 보다 최근에는 Needleman-Wunsch 알고리즘을 포함한, 다른 최적의 글로벌 정렬 방법보다 빠른 뉴클레오타이드 및 단백질 서열의 글로벌 정렬을 알려진대로 생성하는 FOGSAA (Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm)가 개발되었다.
본원에 기술된 글리코사이트 돌연변이에 더하여, 본원에 기재된 상기 HA 변이체는 그의 야생형 대응물에 대하여 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 당업자는 기능적으로 동등한 변이체, 즉 특정 HA 변이체의 기능적 능력을 보유하는 변이체를 제공하기 위해 보존적 아미노산 치환이 상기 HA 변이체에서 이루어질 수 있다는 것을 알 것이다. 본원에서 사용된 대로, "보존 적 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질의 상대적인 전하 또는 크기 특성을 변경시키지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 변이체는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 폴리펩타이드 서열을 변경시키는 방법에 따라 제조될 수 있는데, 예를 들어, 그러한 방법을 편집하는 참고 문헌에서 발견된다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. 아미노산의 보존적 치환은 다음 그룹 내의 아미노산 사이에서 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.
본원에 기재된 바와 같은 HA 변이체를 제조하기 위해, 관심있는 야생형 HA 서브타입 항원을 선택할 수 있고, 상기 언급된 것들에 상응하는 그 글리코사이트는 통상적인 아미노산 서열 정렬을 통해 확인될 수 있다. 그 다음, 서열 번호 3 또는 서열 번호 1의 285, 497 및 556 위치에 상응하는 하나 이상의 글리코사이트에서 야생형 HA의 코딩 서열 내에 돌연변이 (예를 들어, 아미노산 잔기 치환)를 도입하여 HA 변이체의 코딩 서열을 수득할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 HA 변이체의 코딩 서열은 통상적인 재조합 기술을 통해 HA 변이체를 생산하기 위한 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 HA 변이체의 코딩 서열은 HA 변이체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 입자를 생산하기 위한 바이러스 벡터 내로 삽입될 수 있다.
II. 뉴라미니다아제 변이체(Neuraminidase (NA) Variants)
뉴라미니다아제 (Neuraminidase, NA)는 인플루엔자 바이러스의 표면에서 발견되는 당 단백질이다. NA는 호흡기 및 적혈구 숙주 세포에서 효소적으로 시알 산을 절단하여 바이러스 입자의 방출을 촉진하고 추가 세포의 감염을 촉진한다.
NA 단백질은 N 말단 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 줄기 도메인(stalk domain) 및 촉매 도메인을 포함한다. HA 단백질과 유사하게, NA 단백질은 종종 글리코 사이트에서 N-글리코실화를 통해 번역 후 변형된다. NA 단백질은 또한 촉매 활성에 필요한 여러 "활성 부위(active site)" 잔기를 포함한다.
예로서, 인플루엔자 A 바이러스 균주 (A / WSN / 1933 (H1N1))로부터 야생형 NA의 아미노산 서열은 하기 서열 번호 4로서 제공된다.
상기 야생형 NA (서열 번호 4에 표시)의 잔기 44, 72 및 219는 글리코 사이트 (Asn 또는 N 잔기)이고 굵은체로 표시되어 있다. 잔기 102R, 135D, 262E, 277R, 352R, 386Y 및 409E (상기 서열 번호 4에 표시)는 예시적인 활성 부위이며, 굵은 글씨체로 표시되어 있다. 상기 N- 말단 및 트랜스멤브레인 도메인 (이하 제공되는 서열 번호 5)은 서열 번호 4에 이탤릭체로 표시되어 있다. 이 야생형 NA의 줄기 도메인 (이하 제공되는 서열 번호 6)은 서열번호 4에서 밑줄로 표시되어 있다. 상기 촉매 도메인 (이하 제공되는 서열 번호 7)은이 야생형 NA의 C- 말단에 위치한다.
다른 야생형 NA 서브타입, 예를 들어. N1, N2 또는 N3은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 그들의 아미노산 서열은 공개적으로 이용 가능한 유전자 데이터베이스, 예를 들어 GenBank에서 찾을 수 있다. 야생형 NA 단백질 및 상기 언급된 기능적 도메인 (예, N- 말단 및 트랜스멤브레인 도메인, 줄기 도메인 및 촉매 도메인)의 글리코사이트뿐만 아니라 상기 촉매 도메인의 활성 부위/잔기는 그의 아미노산 서열을 상기 제공된 서열 번호 4의 예시적인 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다.
본원에 기술된 NA 변이체는 당업계에 공지된 임의의 야생형 NA 서브타입, 예를 들어 N1, N2 또는 N3 서브타입으로부터 유래될 수 있다. 그러한 NA 변이체는 하나 이상의 활성 부위 및/또는 하나 이상의 N-글리코실화 부위에서 돌연변이 (예를 들어, 부가, 결실 또는 아미노산 치환)를 가질 수 있고, 상기 변이체는 야생형 대응물에 대하여 NA활성에 결함이 있다. 본원에 기술된 NA 변이체의 활성에 관한 "결함(Defective)"은 NA 변이체의 생물학적 활성이 야생형 대응물과 비교하여 실질적으로 감소됨을 의미하며, 예를 들어, NA 변이체의 활성은, 동일하거나 실질적으로 유사한 조건에서 동일하거나 실질적으로 유사한 분석에 의해 결정되는 바처럼 야생형 대응물의 활성에 비해 30 % 미만 (예를 들어, 20 % 미만, 10 % 미만 또는 5 % 미만) 일 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 기술된 NA 변이체의 생물학적 활성은 통상적인 분석 및/또는 본원에 기술된 분석에 의해 측정된 바와 같이 검출될 수 없는 수준일 수 있다.
NA 활성은 당업계에 공지된, 2- (4- 메틸움벨리페릴) -α-D-N- 아세틸뉴라민 산 (4-MUNANA) 형광(2-(4-methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid (4-MUNANA) fluorescence)에 기초한 분석법 (하기 실시예 2에 기재됨)으로 측정 될 수 있다. NA 활성의 다른 측정은 NA 기질 특이성을 결정하는 분석을 포함한다. 예를 들어, 4-MuA-NeuAc, 6'- 시알릴 -N- 아세틸락토사민 (6'-sialyl-N-acetyllactosamine, 6-SLN), 3'- 시알릴 -N- 아세틸락토사민 (3'-sialyl-N-acetyllactosamine, 3-SLN), 3'- 시알릴락토스 (3'-sialyllactose, 3-SL) 및 6'-시알릴락토스 (6'-sialyllactose, 6-SL)는 NA 기질 특이성을 결정하는데 사용될 수 있다. NA에 의한 기질의 효소적 절단의 동역학은 N- 아세틸만노사민 (N-acetylmannosamine, ManNAc) 탈수소 효소 및 시알산 알돌라제 (sialic acid aldolase)(하기 실시예 2에서 나타낸 바와 같음)와의 반응에 의해 결정될 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기술된 NA 변이체는 하나 이상의 N- 글리코실화 부위 (예를 들어, 본원에 언급된 것들)에서 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있으며, 이는 통상적인 방법을 통해 및/또는 본원에 개시된 바에 따라 확인될 수 있다. 예시적인 N- 글리코실화 부위는 서열 번호 4의 44, 72 및 219에 상응하는 위치 (Asn 잔기)를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 N- 글리코실화 부위 (예 : 44, 72 및/또는 219)가 결실될 수 있다. 다른 경우에, 이들 N- 글리코실화 부위 중 하나 이상은 또다른 아미노산 (예를 들어, Ala 또는 Gly)에 의해 치환될 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 NA 변이체는 하나의 글리코 사이트 (예 : 44, 72 또는 219)에서 치환을 가질 수 있다. 다른 예에서, NA 변이체는 2 개의 글리코 사이트 (예 : 44 + 72, 72 + 219 또는 44 + 219)에서 치환을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 3 개의 글리코 사이트 (예를 들어, 44 + 72 + 219)가 치환된다.
본원에 기재된 하나 이상의 돌연변이된 글리코 사이트를 갖는 예시적인 NA 변이체의 아미노산 서열을 하기에 제공한다. 야생형 대응물과 비교된 아미노산 치환은 굵은 글씨로 표시한다:
대안적으로 또는 부가적으로, 본원에 기술된 NA 변이체는 당업계에 공지 된 및/또는 본원에 기술된 바와 같이 활성 부위 중 하나 이상에서 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 결실, 첨가 또는 아미노산 치환)를 가질 수 있다. 예시적인 활성 부위는 서열 번호 4에서 102, 135, 262, 277, 352, 386 및 409에 상응하는 위치를 포함한다. 예를 들어, 상기 NA 변이체는 또 다른 아미노산 (예를 들어, Ala 또는 Gly)으로 치환된, 서열 번호 4의 잔기 102 및/또는 135에 상응하는 위치를 가질 수 있다.
돌연변이된 활성 부위를 갖는 2 개의 예시적인 NA 변이체의 아미노산 서열을 하기에 제공한다. 야생형 대응물과 비교하여 아미노산 치환은 굵은 글씨로 표시된다:
일부 예에서, 본원에 기재된 NA 변이체는 야생형 NA 단백질의 아미노산 서열, 예를 들어 서열번호 4와 적어도 85 % (예를 들어, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % 또는 99 %) 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 하나 이상의 글리코 사이트에서 하나 이상의 돌연변이 및/또는 본원에 기재된 하나 이상의 활성 부위에서의 하나 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다. 또한, 상기 NA 변이체는 적절한 위치, 예를 들어 서열 번호 4에서 388에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 보존적 아미노산 잔기 치환을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 NA 변이체는 줄기 영역 또는 그 일부, 촉매 도메인 또는 그 일부, 또는 둘 모두가 제거된 야생형 NA의 절단된 형태(truncated form) 일 수 있다. 다른 경우에, NA 변이체는 하나 이상의 활성 부위의 손실을 초래하는 줄기 영역에서 부분적으로 결실 및/또는 촉매 도메인에서의 부분 결실을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 상기 NA 변이체는 하나 이상의 글리코실화 부위의 손실을 초래하는, 줄기 영역에서 부분적으로 결실 및/또는 촉매 도메인에서 부분적 결실을 가질 수 있다. 일 예로, 상기 NA 변이체는 전체 촉매 도메인 (예를 들어, 서열 번호 4의 잔기 75 내지 잔기 453에 상응하는 영역)의 결실을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, NA 변이체는 촉매 도메인 및 줄기 영역 모두가 결실 될 수 있다 (예를 들어, 서열 번호 4의 잔기 30 내지 잔기 453에 상응하는 잔기의 손실).
본원에 기술된 두 가지 예시적인 절단된 NA 변이체의 아미노산 서열을 하기에 제공한다 :
본원에 기재된 바와 같은 임의의 NA 변이체를 제조하기 위해, 관심 있는 야생형 NA 서브타입 단백질을 선택할 수 있고, 상기 언급된 것들에 상응하는 글리코 사이트 및/또는 활성 부위는 통상의 아미노산 서열 정렬을 통해 동정될 수 있다. 돌연변이 (예를 들어, 아미노산 잔기 치환 또는 결실)는 하나 이상의 글리코 사이트 및/또는 활성 부위에서 야생형 NA의 코딩 서열 내에 도입 될 수 있다. 예를 들어, 부위-지정 돌연변이 유발 또는 CRISPR을 사용하여 관심 있는 돌연변이를 생성 할 수 있다. 또 다른 예에서, 종결 코돈은 본원에 기재된 절단 된 NA 변이체를 생성하기 위해, 목적하는 위치에서 NA 단백질의 코딩 서열 내에 통합될 수 있다.
본원에 기술된 임의의 NA 변이체의 코딩 서열은, 통상적인 기술을 통해 NA 변이체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 입자를 생산하기 위한 바이러스 벡터와 같은 벡터에 삽입될 수 있다.
III. 인플루엔자 바이러스성 입자(Influenza Viral Particles)
또한, 본원에 기재된 임의의 HA 변이체 및/또는 임의의 NA 변이체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스성 (IAV) 입자가 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 상기 IAV 입자는 임의의 인플루엔자 A 바이러스 서브타입일 수 있다. 이는 살아있는(생존 가능한) 약화된 바이러스이거나 결함이 있는 바이러스일 수 있다.
인플루엔자 A 바이러스 서브타입은 헤마글루티닌 (HA) 바이러스 표면 단백질을 특징으로 할 수 있으며, 따라서 H1, H3 및 H5와 같은 H 번호에 의해 표지된다. 또한, 상기 서브타입은, 예를 들어 N1 및 N2와 같은 N 번호로 표시되는 뉴라미니다아제 (NA) 바이러스 표면 단백질에 의해 추가로 특징지어질 수 있다. 따라서 서브타입은 예를 들어 H1N1, H5N1 및 H5N2와 같이 H 및 N 의 두 숫자로 참조될 수 있다. H1N1 IAV는 H1 HA 단백질과 N1 NA 단백질을 갖는 서브타입이다. 다른 예로서, H5N1 IAV는 H5 HA 단백질 및 N1 NA 단백질을 갖는 서브타입이다.
생 약독화 바이러스는 그 야생형 대응물에 비해 병독성이 덜한 방식(예를 들어, 유전적으로, 화학적으로 또는 물리적으로)으로 변형되는 바이러스를 지칭한다. 전형적으로, 생 약독화 바이러스는 적절한 숙주 세포에서 자가 복제 및 조립 능력이 있다. 예를 들어, 생 약독화 재조합 바이러스의 병독성은, 동일한 또는 실질적으로 유사한 조건 하에서 동일하거나 실질적으로 유사한 분석에 의해 결정되는 바와 같이 야생형 대응물의 50 % (예를 들어, 40%, 30%, 20%, 10% 이하) 일 수 있다. 일부 예에서, 생 약독화 바이러스는 완전히 불활성화될 수 있으며, 즉 그 병독성은 본원에 기술된 분석 또는 통상적인 분석에 의해 검출될 수 없다. 약독화(Attenuation )는 HA 항원 또는 NA 항원 중 어느 하나에 도입 된 하나 이상의 돌연변이로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 142에 상응하는 글리코 사이트 ( "142 글리코 사이트") 및 선택적으로 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 27 에 상응하는 위치의 글리코 사이트( "27 글리코 사이트")에서의 HA의 글리코실화는 HA의 생물 활성에 중요할 것이며, 이는 HA를 운반하는 IAV의 병독성에 기여할 수 있다. 따라서, 142 글리코 사이트 및 선택적으로 27 글리코 사이트에서 글리코실화되는 HA 분자를 운반하는 IAV는, 안전성 문제를 위해 통상적인 방법 (예를 들어, 당 업계에 공지된 및/또는 본원에 개시된 방법)을 통해 약독화되거나 또는 불활성화될 필요가 있을 수 있다. 이들 부위 중 하나 이상에서 글리코실화를 제거하기 위해 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 285, 497 및 556에 상응하는 위치에 있는 하나 이상의 글리코 사이트에서의 돌연변이는 그러한 IAV 입자의 면역원성을 향상시킬 수 있는데, 이는 숙주의 면역계에 HA의 보존된 영역의 향상된 노출이 원인일 수 있다. 그러나 이러한 글리코 사이트의 돌연변이는 바이러스 복제율에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다. 아래의 예와 Wu et al., (PNAS 114(2):280-285, 2017)을 참조하시오.
다른 실시 양태에서, 본원에 기재된 IAV 바이러스는, 복제 및/또는 바이러스 입자 조립을 위한 필수적 바이러스 구성요소 또는 헬퍼 바이러스(help virus)의 부재 하에 적합한 숙주 세포에서 자기-복제 및/또는 조립할 수 없는, 결함있는 바이러스일 수 있다. 예를 들어, 뉴라미니다아제 효소 활성이 부족한, 본원에 기재된 NA 변이체를 포함하는 IAV 입자는 적어도 바이러스 입자 조립에 결함이 있다. 그러한 NA 변이체를 포함하는 IAV 입자는 기능적 NA의 존재 하에 생산될 수 있다. 이러한 IAV 입자는 중화 항체(neutralizing antibodies)의 부재 하에 다양한 인플루엔자 바이러스 균주 및 서브타입을 인식 할 수 있는 IAV- 특이적 CD8 + T 세포를 활성화시킬 수 있기 때문에, 생 약독화된 인플루엔자 백신 조성물을 제조하는데 유리한 후보 물질이다. 아래 예와 Wu et al., 2017을 참조하시오.
바이러스성 병독성은 바이러스 복제율, 바이러스 진입 및/또는 바이러스 감염 후의 대상(숙주) 생존율에 의해 결정될 수 있다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, 바이러스 복제율은 바이러스 역가를 측정하는 플라크 분석을 사용하여 결정할 수 있다. 바이러스 진입은 감염성 분석 (실시예 1에 기재됨)으로 측정될 수 있다. 예시적인 숙주 생존 분석(host survival assay)은 실시예 1에 제공된다. 대상의 예는 인간, 마우스, 돼지, 소, 랫트, 개, 기니아 피그, 햄스터, 토끼, 고양이, 염소, 양, 원숭이, 말 또는 조류를 포함한다.
살아있는 약독화 바이러스는, 덜 병독성이 있는 균주를 확인하기 위해 조직 배양의 계대 또는 여러 세대의 에그(egg) 상에서 같은 당 업계에 잘 알려진 방법을 통해 생성될 수 있다. 생 약독화 바이러스는 또한 화학적 및/또는 물리적 치료를 통해 생성될 수 있다.
일부 예에서, 적절한 숙주 세포주 (예 : HEK293T, MDCK, A549, CHO 또는 Vero 세포)는 통상적인 실습에 따라 본원에서 IAV 입자를 생산하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 하나 이상의 HA 및 / 또는 NA 변이체를 포함하는 바이러스 성 구성요소(성분)를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터 (예: 바이러스 벡터)는 적당한 숙주 세포 내로 도입될 수 있으며, 적절한 숙주 세포는 이어서 적절한 조건 하에서 배양되어 IAV 입자를 생산할 수 있다. 필요한 경우, IAV 입자의 복제 및 / 또는 조립을 용이하게 하기 위해 헬퍼 바이러스를 사용할 수 있다. 대안적으로, 바이러스 게놈 복제 및/또는 바이러스 입자 재조립을 위한 하나 이상의 필수 바이러스 성분을 생성하는 숙주 세포주를 사용할 수 있다. 세포 배양물의 상청액을 수집하고 거기에 함유된 바이러스 입자를 통상적 방법으로 수집 할 수 있다. 이렇게 수득된 바이러스 입자는 당업계에 공지된 방법 또는 본원에 개시된 방법을 사용하여 적합한 숙주 (예를 들어, 숙주 세포 또는 SPF(Specific Pathogen-Free) 치킨 알과 같은 치킨 알)에서 추가 증식을 위해 사용될 수 있다.
일부 예에서, 상기 IAV 입자는 당업계에 공지된 화학적 또는 물리적 방법에 의해 추가로 약독화될 수 있다. 예를 들어, 포름 알데히드, 베타프로피오락톤(betapropiolactone, BPL), 바이너리 에틸렌이민 (binary ethylenimine, BEI), 멀티올레이트(merthiolate), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate) 또는 이들의 조합물을 포함하는 화학적 처리를 사용하여 바이러스는 불활성화될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 바이러스는 열, UV 조사, 극한 pH 및 동결-해동 사이클 또는 당업계에 널리 공지 된 다른 방법에 의해 불활성화될 수 있다.
선택적으로, 상기 재조합 IAV는 추가 사용을 위해 희석액 중에 현탁된다. 희석제의 비-한정적인 예로는 물, 식염수(saline), 덱스트로스, 프로판올, 에탄올, 만니톨, 소르비톨, 락토스, 전분, 락티톨, 말토덱스트린, 글리세롤, 자일리톨, 트레할로스, 미네랄 오일, 식물성 오일, 염화나트륨, 탄산나트륨, 인산이칼슘, 염화칼륨, 인산이칼슘, 탄산칼슘, 황산칼슘 탈수화물 및 탄산 마그네슘을 포함한다.
면역원성 조성물(Immunogenic Compositions)
일부 측면에서, 본 개시는 (i) 본원에 기재된 임의의 재조합 IAV 바이러스 또는 임의의 HA 및/또는 NA 변이체, 및 (ii) 약학 적으로 허용 가능한 담체, 이는 아쥬번트일 수 있는 담체를 포함하는 면역원성 조성물 (예: 백신)을 특징으로 한다. 본원에 사용된 바와 같이, "면역원성 조성물"은, 숙주에 접종될 때 숙주에서 면역 반응을 자극하는 효과를 가지고, 질병 (예를 들어, IAV 감염)으로부터 숙주를 완전히 또는 부분적으로 보호하며 증상(예를 들어, 발열, 충혈 및/또는 두통)을 감소시키는 효과를 가지는 조성물을 지칭할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 IAV 입자를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 HA 변이체 및/또는 NA 변이체를 포함한다. 이러한 면역원성 조성물은 현존하는 상태를 치료하기 위한 예방제 또는 치료제로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항원" 또는 "항원성 시약"은 달리 명시하지 않는 한, 면역능이 있는 인간 또는 동물에 도입될 때 체액성(humoral) 및/또는 세포성(cellular) 면역 반응을 자극하는 임의의 제제를 지칭할 수 있다. 상기 항원은 순수한 물질, 물질의 혼합물, 또는 특정 물질 또는 살아있는 약독화된 바이러스 일 수 있다. 적합한 항원의 예는 단백질, 당단백질, 폴리펩티드 및 바이러스를 포함한다.
본원에 기재된 면역원성 조성물에 의해 유발된 면역 반응은 통상적인 실습을 통해 모니터링 될 수 있다. 예를 들어, 항원-프로파일링 기술 (예: 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA), 효소 면역 측정법 (EIA) 또는 방사성 면역 분석법 (RIA), 세포 독성 T 림프구 분석 및/또는 당업계에 잘 알려진 다른 방법)을 사용하여, 항원에 대한 CD8 + T 세포 유도를 측정함으로써 면역 반응을 측정할 수 있다.
면역원성 조성물은 통상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 인산 완충 식염수, 중탄산염 용액(bicarbonate solution) 및/또는 아쥬번트를 포함한다. 상기 담체는 투여의 방식 및 경로, 및 표준 약학적 실습에 기초하여 선택될 수 있다. 적합한 약학적 담체 및 희석제뿐만 아니라, 이들의 사용을 위한 약학적 필요성은 Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa (1990)에 기술되어 있다. 상기 조성물은 또한 in vivo 전달을 용이하게 하는 폴리머를 포함할 수 있다. Audran R. et al. Vaccine 21 : 1250-5, 2003; 및 Denis-Mize et al. Cell Immunol., 225 : 12-20, 2003를 참조하시오.
본원에 사용된 바와 같이, "아쥬번트"는 항원에 대한 면역 반응 (예를 들어, 체액성 또는 세포성 면역 반응)을 강화, 증가, 상향 조절, 다변화 또는 촉진시키는 임의의 물질 또는 물질의 혼합물을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 아쥬번트는 완전 프로인트 아쥬번트 (Freund 's adjuvant, FA), 불완전 프로인트 아쥬번트 (incomplete Freund's adjuvant, IFA), 미네랄 겔 (예 : 수산화 알루미늄 또는 인산 알루미늄), 표면 활성 물질 (예 : 리조레시틴(lysolecithin)), 플루로닉 폴리올(pluronic polyol), 폴리음이온, (SL-CD) 및 펩타이드, 오일 에멀젼, 탄화수소 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 설포리포 - 사이클로 덱스트린 (SL-CD) 및 사포닌 (예 : Quil A)과 같은 물질을 포함 할 수 있다. 다른 예에서, 상기 아쥬번트는 필요하면, 콜레라 독소, 대장균 열-난분해성 장내 독소 (Escherichia coli heat-labile enterotoxin, LT), 리포좀, 면역-자극 복합체 (immune-stimulating complex, ISCOM), 또는 면역자극 서열 올리고 데옥시 뉴클레오타이드 (ISS-ODN) 일 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 면역원성 조성물은 pH 조절제를 추가로 포함 할 수 있고, 이는 아세트산, 붕산, 탄산, 크롬산, 시트르산, 락트산, 염산, 타르타르산, 프로피온산, 말산, 인산, 수산화 암모늄, 탄산 암모늄, 에틸 아민, 디메틸 아민, 글리신, 메틸 아민, 트리메틸 아민, 디에탄올아민, 중탄산 나트륨, 붕산 나트륨, 수산화 나트륨, 히드라진, 모노에탄올 아민, 수산화 칼륨, 인산 나트륨, 트롤 아민 또는 이들의 조합물일 수 있다.
일부 예에서, 본 면역원성 조성물은 방부제를 추가로 포함 할 수 있다. 방부제의 적절한 예는 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride), 벤즈알 코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 벤질 알코올, 클로르헥시딘(chlorhexidine), 이미다졸리디닐 우레아(imidazolidinyl urea), 페놀, 소르빈산 칼륨(potassium sorbate), 벤조산, 브로노폴(bronopol), 클로로크레졸(chlorocresol), 파라벤 에스테르(paraben esters), 페녹시에탄올(phenoxyethanol), 소르브산(sorbic acid), 알파 토코 페놀(alpha-tocophernol), 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 부틸화 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole), 부틸화 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene), 소듐 아스코르빈산(sodium ascorbate), 소듐 메타바이설파이트(sodium metabisulphite), 시트르산, 에데트산(edetic acid), 및 이들의 조합물을 포함한다.
백신과 같은 면역원성 조성물을 제조하는 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 미국 특허 제 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 및 4,596,792 호에 예시되어 있다. 백신은 주사제, 액상 용액 또는 유화액으로 준비할 수 있다. 본 발명의 재조합 바이러스 또는 HA 펩타이드는 선택적으로 생리학적으로 허용되고 양립가능한 부형제와 혼합될 수 있다. 부형제는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합물을 포함 할 수 있다. 상기 백신은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 또는 백신의 효과를 강화시키기 위한 아쥬번트와 같은 소량의 보조 물질을 포함 할 수 있다. 면역원성 조성물에 대한 아쥬번트 효과를 달성하는 방법은, 인산 완충 식염수에서 0.05 내지 0.1 % 용액으로 통상적으로 사용되는 수산화 알루미늄 또는 인산염 (명반)과 같은 제제의 사용을 포함한다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 통상적인 방법을 사용하여 상이한 투여 경로를 위한 복용 형태(dosage forms)로 제형화 될 수 있다. 예를 들어, 캡슐, 겔 밀봉 또는 경구 투여용 정제로 제제화 될 수 있다. 캡슐은 젤라틴 또는 셀룰로오스와 같은 임의의 표준 약학적으로 허용 가능한 물질을 함유할 수 있다. 정제는 고체 담체 및 윤활제로 조성물의 혼합물을 압축함으로써 통상적인 절차에 따라 제제화될 수 있다. 고형 담체의 예는 전분 및 슈가 벤토나이트를 포함한다. 상기 조성물은 또한 결합제, 예를 들어 락토오스 또는 만니톨, 통상적인 충전제 및 정제 화제를 함유하는 캡슐 또는 경질 쉘 정제의 형태로 투여 될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 비경구 경로를 통해 투여 될 수 있다. 비경구 복용 형태의 예로는 수용액, 활성제의 등장성 생리 식염수 또는 5 % 글루코스, 또는 기타 잘 공지된 약학적으로 허용 가능한 부형제가 포함된다. 시클로덱스트린, 또는 당 업계에 익숙한 사람들에게 잘 알려진 다른 가용화제는, 치료제의 전달을 위한 약학적 부형제로서 이용될 수 있다.
주사용 조성물은 식물성 오일, 디메틸락타마이드(dimethylactamide), 디메틸 포름아미드(dimethyformamide), 에틸 락테이트(ethyl lactate), 에틸 카보네이트(ethyl carbonate), 이소프로필 미리스테이트(isopropyl myristate), 에탄올 및 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)과 같은 다양한 담체를 함유할 수 있다. 정맥 내 주사의 경우, 수용성 항체는 드립 방법(drip method)에 의해 투여될 수 있으며, 이에 의해, IAV 입자 또는 HA 및/또는 NA 변이체 및 생리학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 약학 조성물이 주입된다. 생리적으로 허용가능한 부형제는 예를 들어, 5% 덱스트로스, 0.9% 식염수, 링거액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육 내 제제, 예를 들어 항체의 적합한 가용성 염 형태의 무균 제제는 주사용증류수(Water-for-Injection), 0.9% 식염수 또는 5% 글루코스 용액과 같은 약학적 부형제에 용해되어 투여될 수 있다.
치료적 적용
본원에 기술된 임의의 면역원성 조성물은 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하거나 또는 그러한 감염의 위험을 감소 시키는데 사용될 수 있다. 이론에 구속됨 없이, 본 방법에 의해 부여되는 보호는 상응하는 IAV 바이러스에 대한 IAV- 특이적 또는 HA / NA- 특이적 CD8 + T 세포 반응에 의해 부분적으로 매개 될 수 있으며, 이는 대상에서 계통간 교배(cross-strain) 및/또는 교차-서브타입 보호(cross-subtype protection)를 제공한다.
상기 구현예를 실시하기 위해, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 유효량을 적합한 경로를 통해 치료를 필요로 하는 대상에게 투여할 수 있다. 본원에 기술된 방법에 의해 치료될 대상은 A형 인플루엔자 바이러스 감염으로 어려움을 겪거나, 감염 의심 또는 감염 위험이 있는 포유류 (예를 들어, 인간, 마우스, 돼지, 소, 랫트, 개, 기니피그, 햄스터, 토끼, 고양이, 염소, 양, 원숭이, 말 또는 조류)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 조합하여 환자에게 치료 효과를 부여하는데 필요한 각 제제의 양을 지칭한다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 유효량은 투여 경로, 부형제 사용 및 다른 활성제와의 동시 사용에 따라 다양하다. 투여될 양은, 예를 들어, 항체를 합성하는 개인 면역계의 능력 및 세포-매개 면역 반응을 생성하는 데 필요한 경우를 포함하여, 치료 될 대상에 의존한다. 투여되는데 요구되는 활성 성분의 정확한 마운트는 의사의 판단에 달려 있다. 그러나, 적합한 투여량 범위는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 본 발명의 폴리펩티드의 마이크로 그램 정도일 수 있다. 초기 투여 및 부스터 투여에 대한 적절한 처치 또한 가변적이지만, 초기 투여 및 후속 투여를 포함 할 수 있다. 백신의 투여량은 또한 투여 경로에 따라 의존적일 수 있으며 숙주의 크기에 따라 다양하다.
본원에 기술된 면역원성 조성물은, 임의 유형의 A 형 인플루엔자 바이러스 (예 : H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1, H5N2, H7N2, H7N3, H7N7, H9N2 또는 H10N7)에 의해 유발될 수 있는, 인플루엔자 바이러스 감염 치료 또는 인플루엔자 바이러스 감염의 위험을 줄이기 위해(예방 치료) 대상(예 : 사람)에게 투여될 수 있다 , H1N2, H2N2, H3N2, H5N1, H5N2, H7N2, H7N3, H7N7, H9N2 또는 H10N7). 일부 실시 양태에서, 특정 인플루엔자 바이러스 서브타입으로부터 유래 된 IAV 또는 특정 유형의 바이러스로부터 유래 된 HA 및/또는 NA 변이체를 포함하는 면역원성 조성물은 특정 인플루엔자 바이러스 서브타입에 의해 야기된 감염의 위험을 치료 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "치료하는"은 인플루엔자 바이러스 감염, 감염의 증상 또는 감염에 대한 소인을 갖는 대상체에 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여를 의미하며, 감염, 감염의 증상 또는 감염 소인에 영향을 줄 수 있는 치유(cure), 힐링(heal), 완화, 경감, 변경, 치료(remedy), 개선(ameliorate), 향상(improve) 또는 영향을 주는 것을 목적으로 한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 방법에 의해 치료될 대상은 일상적인 의학적 관행으로 진단된 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 감염을 갖는 인간 환자 일 수 있다. 다른 구체예에서, 대상은 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상, 예를 들어 발열, 근육 통증, 오한 및 땀, 두통, 기침, 피로 및 약화, 비강 울혈 및/또는 인후통을 나타내는 인간 환자일 수 있다. 그러한 인간 환자는 IAV에 노출되었을 수 있다.
일부 실시 양태에서, 사람 대상이 감염의 위험이 있을 수 있다; 예를 들어, 상기 개인은 면역시스템이 약화된 (예 : HIV / AIDS, 천식, 만성 심장 질환, 만성 심장 또는 폐 질환으로 고통 받는) 노년 (예를 들어 65 세 이상)일 수 있고, 어린이 또는 유아(예를 들어, 5 세 미만)일 수 있고, 또는 감염된 개인과 아주 가까운 곳에서 일하거나 살 수도 있다.
본원에 기술된 임의의 면역원성 조성물은 적합한 경로, 예를 들어 비경구적으로, 피하 주사 또는 주입에 의해, 근육 내, 척수강 내(intrathecally), 복강 내(intraperitoneally), 피부 내(intracuteanously), 흉골 내(intrasternally), 관절 내(intraarticularlly), 두개 내(intracranially), 병변 내(intralesionally, 직장 내(intrarectually), 질 내(intravaginally), 비강 내(intranasally), 위 내(intragastically), 기관 내(intratracheally) 또는 폐 내(intrapulmonarily)로 치료가 필요한 대상에게 투여 될 수 있다 직장 내, 질내, 비내, 내막, 기관 내 또는 경막 내로 투여 될 수있다. 대안적으로, 좌제, 경구 제형, 장, 비강, 국소 또는 점막 투여를 포함하는 다른 투여 방식이 바람직할 수 있다. 좌제의 경우, 결합제 및 담체는 예를 들어, 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있다. 경구 제제는 통상적으로 적용되는 인시피언츠(incipients) 예를 들어, 약학적 등급의 사카린, 셀룰로스, 탄산 마그네슘 등을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐제, 서방형 제제 또는 분말의 형태를 취한다. 일부 예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 보편적인 인플루엔자 백신 (예를 들어, 교차 종(cross-species), 교차 균주(cross-strain) 및/또는 교차 계통 특이성(cross lineage specificity)을 갖는 인플루엔자 백신)으로서 기능하는 비강 투여를 통해 대상에게 투여될 수 있다.
위에서 언급했듯이, 필요한 투여량은 투여 경로; 제제의 성질; 대상의 질병의 성질; 대상의 종, 크기, 체중, 표면적, 연령, 및 성별; 투여되는 다른 약물; 그리고 의사의 판단의 선택에 달려있다. 적합한 투여량은 0.01 - 100.0 mg/kg 범위이다. 사용 가능한 조성물의 다양성 및 다양한 투여 경로의 상이한 효율의 관점에서, 필요한 투여량의 넓은 변화가 예상된다. 예를 들어, 경구 투여는 정맥 주사에 의한 투여보다 더 많은 투여량이 요구될 것으로 예상된다. 이러한 투여량 수준의 변화는 당해 기술 분야에서 잘 이해되는 최적화를 위한 표준 경험적 루틴(standard empirical routines)을 사용하여 조정될 수 있다. 적합한 전달 비히클 (예를 들어, 폴리머성 미립자 또는 이식 가능한 장치)에서 조성물의 캡슐화는 전달 효율, 특히 구강 전달 효율을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치 임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나 임의의 수치는 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로부터 반드시 발생하는 특정 오류를 포함한다. 또한, 본원에 사용된 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 10%, 5%, 1% 또는 0.5% 이내를 의미한다. 대안적으로, 상기 용어 "약"은 당업자가 고려할 때 평균의 허용 가능한 표준 오차 이내를 의미한다. 작동/작업 실시예의 경우를 제외하고 또는 달리 명시하지 않는 한, 재료의 양, 시간의 지속 시간, 온도, 작동 조건, 양의 비율 및 본원에 개시된 것들 등과 같은 모든 수치 범위, 양, 값 및 백분율에서, 모든 경우에 "약"이라는 용어로 변형된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 본 개시 및 첨부된 청구 범위에 기재된 수치 파라미터는 원하는 바에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도 각 수치 파라미터는 보고된 유효 자릿수의 수를 고려하고 일반적인 반올림 기법을 적용하여 해석해야 한다.
당업자는 동물 모델로부터 결정된 투여량에 기초하여 임의의 면역원성 조성물의 인간 등가 투여량 (human equivalent dose, HED)을 계산할 수 있다. 예를 들어, HA 변이체를 코딩하는 재조합 IAV를 포함하는 면역원성 조성물의 효과적인 HED는 인간에 대한 투여량 당 약 8.1 ng 내지 1.62 μg HA와 동일 할 수 있고; 바람직하게는 투여량 당 약 81 ng 내지 810 ng의 HA와 동일하다. 하나의 바람직한 예에서, 본 재조합 IAV의 효과적인 HED는 용량 당 약 468 ng HA와 동일하다.
투약 일정에 관해서는, 질병의 예방 또는 치료 과정에서 본원에 개시된 면역원성 조성물은 대상에게 적어도 2 회 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 더 많은 시간 동안) 투여될 수 있다. 예로서, 백신은 수일 내지 수년 간격으로 2 ~ 10 회 대상에게 투여 될 수 있다.
본원의 면역원성 조성물의 효능은 면역 반응의 정도를 결정하는 분석법을 사용하여 in vitro 및 in vivo 모두에서 평가될 수 있다(상기 기재 및 하기 실시예에 기재됨).
HA 또는 NA 변이체에 특이적인 항체
또한, 본원에 기재된 임의의 HA 또는 NA 변이체에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 이러한 항체는 본원에 기재된 바와 같은 HA 또는 NA 변이체는, 변이체의 야생형 대응물에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력, 보다 용이하게 및/또는 더 긴 지속 시간으로 결합할 수 있다. 일부 예에서, HA 또는 NA 변이체에 "특이적으로 결합하는" 항체는 통상적인 분석에 의해 결정된 바와 같이 야생형 대응물과 결합 할 수 없다(즉, 검출불가능한 결합 활성).
본원에 기재된 항체는 통상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 임의의 HA 또는 NA 변이체는, HA 또는 NA 변이체에 결합할 수 있는 항체를 생성하기 위해 적합한 동물 숙주 (예를 들어, 마우스, 토끼 또는 양)에 투여될 수 있다. 항체 분자의 이종(heterogeneous) 집단인 폴리클로날 항체가 면역화된 대상체의 혈청에 존재한다. 본원에 개시된 펩타이드 변이체에 대한 동종(homogeneous) 집단인 모노클로날 항체는 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어, Kohler et al. (1975) Nature 256, 495; Kohler et al. (1976) Eur. J. Immunol. 6, 511; Kohler et al. (1976) Eur J Immunol 6, 292; and Hammerling et al. (1981) Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.를 참조하시오) 특히, 모노클로날 항체는 Kohler et al. (1975) Nature 256, 495 및 U.S. Patent No. 4,376,110; 인간 B-cell 하이브리도마 기술 (Kosbor et al. (1983) Immunol Today 4, 72; Cole et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026, 및 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al. (1983) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) 에 기재된 바대로, 배양 중 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술에 의해 수득 될 수 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이들의 임의의 서브 클래스를 포함하는 임의의 면역 글로불린 클래스일 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이 브리도마는 in vitro 또는 in vivo 에서 배양 될 수 있다. in vivo 에서 모노클로날 항체의 높은 역가를 생산하는 능력은 특히 유용한 생산 방법이다.
모노클로날 항체를 생성하는 잠재적인 방법은 다음과 같다. 대상 (예를 들어, 마우스 또는 토끼)는 2 내지 5 주 연속 주간 단위로 본원에 기술된 임의의 면역원성 조성물을 피하, 근육 내 및/또는 비강 내 투여할 수 있다. 최종 면역화 후, 비장 세포 및 국소 림프절을 제거 할 수 있다. 혈액 샘플은 면역화 후 정기적으로 채취하여 원심 분리하여 혈청을 분리 할 수 있다. 생성된 혈청은 임의의 적합한 방법 (예 : ELISA 또는 RIA)에 의해 항체가(antibody titers)를 측정 할 수 있다. 이어서, 최종 면역화는 투여된 면역원성 조성물에 대해 높은 항체가를 나타내는 동물에게 주어질 수 있다. 항체-생산 세포는 면역화된 동물의 비장 세포 및 국소 림프절 등으로부터 제조될 수 있다. 항체 생산 세포의 제조에 있어서, 가능한 한 많은 조직 데브리스 및 적혈구를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 상용 적혈구 제거제가 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 완충 염화 암모늄 및 트리스가 제조되고 사용될 수 있다. 이렇게 제조된 항체 생산 세포는 골수종(myeloma) 세포와 같은 불멸 세포와 즉시 융합되어 하이브리도마 세포를 생산할 수 있고, 항체 생산 동안 반-영원히 계속하여 증식할 수 있다. 마우스와 같은 동물 유래의 통상적으로 이용 가능한 세포주를 사용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 바람직한 세포 균주는 하이폭산틴(hypoxanthine), 티미딘(thymidine) 및 아미노프테린(aminopterin)을 함유하는 HAT 선택 배지에서 생존해서는 안되고, 항체 생산 세포와 융합될 때에만 생존해야 한다. 골수종 세포의 예로는 마우스 골수종 세포주(예 : myeloma FO 세포) 및 인간 골수종 세포주 (예 : Karpas 707H)가 포함될 수 있다. 세포 융합은 비장 세포 또는 림프절 세포를, 약 200 내지 20,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 세포 융합 프로모터의 존재 하에 상업적으로 이용 가능한 골수종 세포와 혼합함으로써 수행할 수 있다. 선택적으로, 전기천공(electroporation)과 같은 전기 자극을 이용하는 상업적 세포 융합 장치에서 세포 융합이 수행될 수 있다. 융합 후, 생성된 세포를 희석시키고 HAT 배지에서 배양할 수 있다.
관심 있는 하이브리도마는 융합된 세포로부터 선택될 수 있다. HAT 배지에서 배양된 살아있는 융합 세포는 콜로니를 형성할 것이다. 이어서, 각 배양 웰의 상청액을 수집하고 면역원성 조성물에 대한 항체가의 존재 또는 부재 여부를 조사한다. 확인 방법으로는 ELISA, EIA 또는 RIA를 사용할 수 있다. 일단 항체-양성 웰이 확인되면, 세포는 아미노프테린(aminopterin)을 포함하지 않는 HT 배지에서 배양 될 수 있다. 잠시 동안 배양 한 후, 배양 상청액의 항체가가 다시 확인된다. 최종적으로 선택된 세포는 단일 세포를 얻기 위해 클로닝된다. 본 폴리 펩타이드에 대해 높은 특이성을 나타내는 클론을 선별하여 어느 정도 증식시켜 하이브리도마를 수립한다.
일부 예에서, 관심있는 HA 변이체에 대한 모노클로날 항체를 생성하는, 하나의 하이브리도마가 선택될 수 있다. 이와 같이 제조된 모노클로날 항체는 임의의 공지된 방법으로 분리 또는 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 혈청 농도가 낮은 배지에서 하이브리도마를 배양함으로써 얻은 배양 상청액으로부터 제조할 수 있다. 대안적으로, 하이브리도마는 동물의 복강 내로 주사될 수 있고, 결과로 생긴 복부 액적(abdominal dropsies)을 수집하여 항체를 제조 할 수 있다. 상기 항체는 친화성 칼럼, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등을 사용하는 방법에 의해 정제되거나 단리될 수 있다. 이들 공지된 방법 중 임의의 것을 적절하게 선택하거나 조합하여 사용할 수 있다.
이렇게 수득된 항체는 HA 또는 NA 변이체 대 야생형 대응물인 HA 또는 NA 항원에 대한 그들의 결합 능력을 특징으로 할 수 있다. 상기 변이체에 특이 적으로 결합하는 것들은 분리될 수 있다.
대안적으로, 본원에 기술된 HA 또는 NA 변이체에 특이적으로 결합하는 항체는 통상적인 실습에 따라 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리될 수 있다. 일부 예에서, 항체 라이브러리는 야생형 HA 또는 NA 항원에 대해 스크리닝되어 우선 야생형 항원에 결합할 수 있는 항체를 격감시킬 수 있다. 상기 결과물 서브-라이브러리는 HA 또는 NA 변이체에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 항체는 상이한 IAV 서브타입에 대한 결합 친화성과 특이성을 나타낼 수 있다. 이들 항체는 면역화된 대상에서 펩타이드 변이체를 검출하는데 사용되거나 면역 요법의 한 형태로서 투여 될 수 있다.
상기 실시예의 설명은 단지 예로서 주어지며, 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 실시예의 구조 및 사용에 대한 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 다양한 구현예가 어떤 수준의 독특함으로, 또는 하나 이상의 개별 구현 예를 참조하여 상술되었지만, 당업자는 본 발명의 의미 또는 범위를 벗어나지 않고 개시된 실시예에 대한 수많은 변형을 행할 수 있다.
추가 상세한 설명 없이, 당업자는 상기 설명에 기초하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있다고 믿어진다. 따라서, 하기의 특정 실시예는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 임의의 방식으로 본 개시의 나머지 부분을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 여기에 인용된 모든 출판물은 여기에 언급된 목적 또는 주제에 대한 참조로 포함된다.
실시예 1 : 면역원성에 대한 헤마글루티닌 (HA)의 글리코실화의 영향
재료 및 방법
세포주 및 바이러스
MDCK 세포(Madin-Darby canine kidney cells) 및 인간 배아 신장 세포 (HEK293T)를 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) (lnvitrogen, Rockville, MD)에서 유지하였다. A549 인간 선암의 폐포 기저 상피 세포(adenocarcinoma alveolar basal epithelial cells)를 F-12K 배지 (lnvitrogen, Rockville, MD)에 유지하고, LMH 닭 간세포 암종 세포(LMH chicken hepatocellular carcinoma cells)를 Waymouth의 MB 752/1 배지 (lnvitrogen, Rockville, MD)에서 배양하였다. 모든 배지에 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청 (PBS) (Thermo Scientific) 및 항생제 (100 U / ml 페니실린 G 및 100 gm / ml 스트렙토마이신)를 보충하였다. 상기 인플루엔자 A 바이러스 A / WSN / 33 균주가 연구에 사용되었다.
재조합 바이러스의 생성
A / WSN / 33 바이러스 게놈의 8 개의 단편을 RT-PCR로 증폭시켰다. sequon N-X-S/T 를 사용하여 HA 게놈의 글리코 사이트를 생성하거나 (상이한 아미노산을 N으로) 제거하는데(N에서 A로) 사용하였다. WT HA의 아미노산 서열은 상기 제공된 서열 번호 3이다. 285-497-556-G HA의 아미노산 서열은 상기 제공된 서열 번호 1이다. 142-G HA 및 142-285-497-556-G HA의 아미노산 서열은 하기와 같다:
바이러스성 cDNA를 pHW2000의 생성과 유사한 pol I 및 CMV 프로모터를 함유하는 pcDNA3.1에 삽입 하였다. 재조합 바이러스는 통상적인 방법에 따라 MDCK / 293T 세포 내로 8- 플라스미드 공동-트랜스펙션 방법에 의해 생성되었다. 상청액을 수집하여 적정하고 사용하기 전까지 -80 ℃에서 동결시켰다.
항체
마우스 모노클로날 항-HA 항체는 Sino Biological로부터 입수하였다. 마우스 모노클로날 항 - 액틴 항체는 Millipore로부터 구입하였다. 염소 폴리클로날 항 -M1 및 마우스 모노클로날 항-6xHis 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입 하였다. 랫트 모노클로날 항-INF 감마 항체는 ABcam으로부터 수득하였다. 토끼 폴리 클로날 항 - 그랜자임 B(granzyme B) 항체는 Aviva Systems Biology로부터 구입 하였다. 모든 상업용 항체는 웨스턴 블롯 (Western blot)을 통해 회사와 우리에 의해 특이성을 입증받았다.
바이러스 복제율(Virus replication rate)
12- 웰 디쉬에서 MDCK, A549 및 LMH 세포의 단일층(Monolayers) 배양액을 1x 인산염 완충 식염수 (PBS)로 2 회 세척하였다. 0.1 (0.01 for LMH) g/ml 의 L- (tosylamido-2-phenylethyl) chloromethyl ketone (TPCK) - trypsin (Pierce) 을 함유한 무 혈청 배지에서 각각 0.01, 0.1 및 1의 MOI로 변형된 인플루엔자 바이러스의 변이 체로 세포를 감염시키고 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이팅하였고; 세포를 1X PBS로 2 회 세척한 후 완전한 배지로 인큐베이션 하였다. 도면에 나타낸 시점에서, 상청액을 수집하여 MDCK 세포에서 플라크 분석을 수행하여 바이러스 역가를 결정하였다.
플라크 분석
6- 웰 디쉬에서 MDCK 세포의 단일층을 1X PBS로 2 회 세척 하였다. 그런 다음 0.5 μg/ml TPCK- 트립신이 함유된 무 혈청 배지에서 연속 10 배 희석액을 접종하고 37 ° C에서 1 시간 동안 배양했다. 그 후, 상기 세포를 세척하고, 0.5% 아가로오스(Lonza) 및 0.5gm/ml TPCK-트립신을 함유하는 MEM으로 중첩시켰다. 3 일 후, 세포를 10% 포름 알데히드로 고정시키고 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다.
단백질 발현 및 정제
분비성 HA를 코딩하는 플라스미드를 폴리에틸렌 이민을 사용하여 HEK293T 세포주에 트랜스펙션시키고 0.5 % BCS(bovine calf serum)가 보충된 Freestyle 293 발현 배지 (lnvitrogen)에서 배양 하였다. 상기 상청액을 트랜스펙션 후 72 시간에 수집하고 원심 분리로 제거하였다. 앞서 설명한대로 HA 단백질을 니켈-킬레이션 크로마토그래피로 정제하였다. 상기 정제된 단백질을 Millipore Amicon Ultra Filter로 농축하고 PBS 완충액으로 사전-평형화된 Superdex-200 겔 여과 컬럼 (GE) 상에 로딩하고 상이한 분획을 수집하였다.
글리칸 분석(Glycan array)
글리칸 마이크로 어레이는 실험실에서 준비된 펜틸 아민 테일(pentyl amine tail)이 있는 글리칸을 25 ℃ 및 60 % 습도의 로봇 핀 (SMP2B, TeleChem International)으로 NHS-활성화 유리 슬라이드 (Nexterion H)에 프린팅함으로써(AD3200, BioDot) 준비하였다. Nexterion H 슬라이드는 글리칸 1-29와 30-39의 용액으로 각 그리드에서 수평으로 3 회 반복하여 바닥에서 상단으로 100μM으로 발견되었고 진공 하 건조되었다. 상기 결과 이미지를 GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices)으로 분석하여 그리드 상의 모든 스팟의 형광 강도를 찾아서 정량화했다.
바이러스 결합 분석(Virus binding assay)
같은 양의 바이러스를 뉴라미니다아제 억제제 오셀타미비르 카르복실레이트(Oseltamivir carboxylate) (10 μM)가 함유된 완충액에서 불활 화시켰다. 오셀타미비르 카르복실레이트로 불활성화된 바이러스의 현탁액을 어레이 상에 겹쳐 놓고 실온에서 30분 동안 배양했다. 이어서, 슬라이드를 PBS-0.05% 트윈 (Tween), PBS 및 탈이온수에서 3 회 연속 세정하여 세척하였다. 결합된 바이러스는 항 -H1 항체를 사용하여 검출되었다. 상기 슬라이드를 60 분 동안 실온에서 부드럽게 흔들었다. 세척 단계를 반복한 후, 표지된 2차 항체로 중첩하여 결합을 검출하였다.
감염성 분석(Infectivity assay)
PEG 바이러스 침전 키트 (BioVision)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 바이러스를 농축하고, Western blot을 사용하여 바이러스 양을 결정했다. 동일한 양의 변이체 바이러스를 사용하여 0.5μg/ml TPCK-트립신을 함유한 F-12K 무 혈청 배지에서 A549 세포를 감염시키고 37 ℃에서 30분 동안 배양했다. 이어서, 세포를 2 회 세척하고 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청 (FBS) (Thermo Scientific) 및 항생제 (100 U/ml 페니실린 G 및 100 g/ml 스트렙토마이신)를 함유하는 F-12K 배지로 중첩시켰다. 10 hpi 후, 총 세포 용해물을 수집하고 분석 하였다. MDCK 세포를, 0.5gm/ml TPCK- 트립신을 함유하는 무 혈청 배지에 감염된 변이체 바이러스로 감염시키고 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 그런 다음, 플라크 분석 절차를 따랐다.
혈구 응집 분석(Hemagglutination assay)
동일한 양의 IAV 및 HA 단백질을 총 부피 100 μl에서 연속적으로 2 배로 희석시켰다. 다음으로, 2% (vol/vol) 터키 적혈구 용액(turkey erythrocyte solution)을 25㎕를 첨가하였다. 상기 바이러스와 적혈구를 부드럽게 섞고, 실온에서 60 분 동안 배양한 후 혈구 응집(hemagglutination)을 판독했다.
혈구 응집 억제 분석(Hemagglutination inhibition assay)
혈청 샘플을 96-웰 플레이트에서 2 배 연속 희석시킨 후, WT WSN의 4 가지 혈구 응집체 유닛 (hemagglutination units, HAU)을 실온에서 1 시간 동안 각 웰에 첨가 하였다. 배양 후, 25μl의 2% (vol/vol) 터키 적혈구 용액(turkey erythrocyte solution)을 첨가하여 125㎕의 총 부피를 제공하고, 실온에서 1 시간 동안 배양 하였다. 개별 혈청 샘플의 HAI 역가는 세포가 응집되지 않은 최종 희석액의 반대(inverse)인 것으로 결정되었다.
Cell binding assay 세포 결합 분석
터키 적혈구는 비브리오 콜레라 뉴라미니다아제(receptor destroying enzyme, RDE) (Sigma)를 37 ℃에서 60분 동안 다른 양 (0-60 μg/mL)으로 전처리 하였다. 그런 다음, 상기 적혈구를 PBS로 1 회 세척하고 PBS를 사용하여 2% (vol/vol) 적혈구 용액으로 만들었다. 각 2% 용액의 25 마이크로 리터를 IAV 및 HA 단백질의 동일한 양에 첨가하여 총 125㎕의 부피를 얻었다. IAV 및 RDE-처리된 적혈구를 실온에서 1 시간 동안 배양한 후 응집을 측정하였다. 데이터는 완전한 응집을 제공하는 RDE의 최대 농도로 표현되었다.
탈글리코실화(Deglycosylation)
소량의 바이러스 또는 단백질을 Sigma-Aldrich로부터 구입한 완충 용액에서 탈글리코실화시켰다. 초 원심분리 후, 바이러스 (1 x 107 pfu) 또는 정제 단백질을 함유한 감염 배지 200 μl를, 프로테아제 억제제 (Roche), 1 μg의 엔도글리코시다아제 F1, 1 μg의 엔도글리코시다아제 F2, 1 μg의 엔도 글리코시다아제 F3 및 1 μg 의 엔도글리코시다아제 H 또는 1 μg PNGase F 와 어두운 곳에서 37 ℃에서 24 시간 동안 혼합하였다. 상기 엔도클리코시다아제 칵테일 (엔도 F1, F2, F3 및 H) 또는 PNGase F는 모노-글리코실화된 샘플 또는 비- 글리코실화된 샘플을 개별적으로 생산하기 위해 모든 글리칸 구조를 단일 GlcNAc 잔기까지 트리밍 할 수 있다. 탈글리코실화 후, 샘플을 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
면역원성 테스트를 위한 IAV 준비
WT, 285-497-556-G 및 142-285-497-556-G HA 바이러스를 MDCK 세포에서 배양 하였다. 이들 바이러스는 24 시간 동안 상온에서 0.1 % BPL (Acros Organics, Geel, Belgium)을 사용하여 배양하고, HNE 완충액 (5mM HEPES, 150mM NaCl, 0.1mM EDTA, pH 7.4)에 대해 24 시간 투석한 후 MDCK 세포에 연속적으로 계대배양하여(serial passages) 테스트하였다. 6 ~ 8 주령의 암컷 C57Bl / 6 마우스에게 불활화된 바이러스 투여량 당 6μg의 HA를 근육주사로 동량으로 면역화시키고, 0일 및 21일째에 2 회 피하주사로 면역화시켰다. 부스터 면역 1 주 후에, 마우스를 두 그룹으로 나누었고 모든 그룹에는 10 마리의 마우스가 포함되었다. 한 그룹을 마취시키고 10 x LD50의 WSN / 33 또는 H5N1 바이러스로 비강 내 접종하고, 항혈청 생산 분석을 위해 다른 그룹의 혈청 샘플을 수집했다. 상기 마우스는 투여 후 14 일 동안 생존을 위해 매일 모니터링 하였다. 모든 동물 실험은 Academia Sinica의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 평가되고 승인되었다.
병독성 분석(Virulence assay)
재조합 바이러스의 병독성은 50 μl의 바이러스를 비강 내 접종 한 5마리의 암컷 4-6 주령 BALB / c 마우스 그룹을 사용하여 측정 하였다(도 3에서 WSN 및 LAIV 44-72-219-G 의 경우 5x105 PFU, 패널 G). 생존과 체중 변화는 감염 후 14 일 동안 매일 기록되었다.
결과
HA 구조와 활성에 미치는 N142- 글리코실화의 영향
HA의 여러 글리코실화 사이트(글리코사이트 27, 40, 176, 303 및 497)가 H1, H3 및 H5 서브타입 중에서 고도로 보존되어 있기 때문에, 야생형 H1N1 A/WSN/33 (WSN)을 모델로 사용하여 특정 글리코 사이트를 생성하거나 또는 제거할 수 있는데, 역 유전학(reverse genetics)을 사용하여 글리코실화 효과를 다룬다(도 1, 패널 A 및 도 5: 패널 A). 상기 바이러스는 글리코사이트-27 결실 (즉, 27-G로 명명된 N27A 변이)에서 살아남지 못했다. 유사하게, 40, 176 또는 303 위치에서 고도로 보존되고 잠재적인 글리코사이트가 복제에 대한 영향을 결정하기 위해 돌연변이되었다 (40 + G, 176 + G 및 303 + G로 표시됨). 그 결과는, 고도로 보존된 또는 잠재적인 글리코사이트 (40 + G, 176 + G, 303 + G, 또는 497-G) 및 WT에서 돌연변이를 갖는 변이체의 복제율은 유사하지만, 글리코사이트-142- 결실된 바이러스 (142-G 및 142-285-497-556-G 바이러스)의 복제율은 MDCK 및 A549 세포 모두에서 WT 바이러스보다 2 배 더 낮았으며, 이는 글리코사이트 142가 IAV 복제에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다 (도 1, 패널 B 및 도 5 : 패널 B). 원편광 이색성 연구(circular dichroism study)에서 글리코사이트 142의 글리칸은 HA의 2차 구조에 영향을 미치지 않았고 (도 5, 패널 C), 그리고 글리코 사이트-142 결실된 변이체 중 HA 대 M1의 비율은 유사하여, 이는 글리코사이트 142가 바이러스 조립 및/또는 성숙에 필수적이지 않다 (도 5, 패널 D).
글리코사이트 142가 바이러스 유입에 필요한데, 이는 바이러스 감염성 분석에서, 글리코사이트 142 결실 바이러스 (142-G 또는 142-285-497-556-G 바이러스)로 감염된 A549 세포에서 HA 및 M1의 매우 약한 신호가 검출 되었기 때문이다(도 1, 패널 C 및 도 5, 패널 E). 142-G 및 142-285-497-556-G는 위에서 제공되는 바와 같이, 각각 상기 서열 번호 16 및 17이다. 글리칸 어레이 분석은 글리코사이트-142-결실 바이러스가 WT 바이러스 (글리칸 8, 10, 11 및 15-18)보다 더 많은 시알로사이드(sialosides)와 상호 작용하고, 또한 동일한 결과가 상응하는 HA 단백질로부터 관찰됨으로써, 이는 글리코사이트 142에서 글리코실화는 HA의 수용체 결합 특이성에 영향을 미침을 시사한다 (도 1: 패널 D 및 도 6, 패널 A~C). 또한 글리코사이트-142-결실 바이러스는 글리칸 어레이 분석에서 더 낮은 형광 강도를 보였으며 혈구 응집과 세포 결합 능력이 더 낮기 때문에, 글리코사이트 142는 HA의 결합력을 조절한다 (도 1, D~E 및 도 5, 패널 F). 글리코사이트-142-결실 바이러스는 글리칸 어레이 분석에서 보다 많은 α2,3- 시알로사이드와 상호 작용할 수 있지만, LMH 세포주 (닭 간세포 암종)에서 142-G 또는 142-285-497-556-G 바이러스의 복제율은 WT 복제율보다 여전히 2 배 이상 더 낮았다 (도 5, 패널 G).
글리코사이트 142에서 글리코실화에 의해 영향을 분자 메커니즘의 효능 및 특이성이 추가로 연구되었으며, 효능 및 특이성 모두가 글리칸 조성물에 의해 조절된다는 것이 발견되었다. 엔도글리코시다아제(endoglycosidases) 칵테일 (Endo-F1, F2, F3 및 H)의 처리는 글리칸 어레이에서 WT 및 285-497-556-G 바이러스의 상호 작용 프로파일을 변경했으며, 상기 상호 작용 패턴은 142- G 및 142-285-497-556-G 바이러스와 유사하였다. HA 285-497-556-G는 서열 번호 1로 상기에 제공된다. 놀랍게도, 엔도글리코시다아제 칵테일로 처리한 후에, 글리칸 어레이상의 모노-글리코실화된 바이러스의 형광 강도는 증가되었지만, 모든 유형의 비-글리코실화된 변이체 (PNGase F 처리)에서는 감소하였다(도 1, 패널 F, 도 5, 패널 H 및 도 6, 패널 D-E).
마우스는 글리코사이트 142가 숙주 면역 반응에 관여하는지 여부를 결정하기 위해 H5N1로 시험하였다. 불활성화된 142-285-497-556-G 바이러스로 면역화된 마우스는 불활성화된 WT 바이러스로 면역화한 마우스와 비교하여 더 짧은 시간 동안 생존하고 더 적은 HA 항혈청 유도 하였고, 그리고 불활성화된 285-497-556-G 바이러스 면역화된 마우스는 동일한 양의 HA 항혈청을 유도했지만 더 길게 생존하고 면역원성 시험에서 WSN 시도 후에 모든 경우에 양호하게 생존했다(도 1, 패널 G-H 및 도 5, 패널 Ⅰ). 이 연구는 글리코사이트 142에서의 글리코실화가 IAV의 면역원성에 중요하다는 것을 시사하였다.
계절성 H1N1 균주에서, HA의 글리코사이트 142는 인간 면역 반응을 피하는 데 중요한 역할을 한다고 여겨지고 있으며, 인간 H3N2 IAV는 또한 긍정적인 선택을 통한 진화 과정에서 이 영역에서 글리코사이트를 얻는다(H3 번호 매김의 글리코사이트 144). 놀랍게도, IAV가 HA에서 글리코사이트 142를 획득한 후, 이 실시예의 결과는 HA-SA 상호 작용의 조절에 의해 바이러스 감염성의 효율이 촉진되고 숙주 면역 반응이 변경되었음을 시사한다. 따라서 글리코사이트 142는 인간 IAV에 대한 백신의 개발에 고려되어야 하는 중요한 요소일 수 있다.
실시예 2 : 뉴라미니다아제 (NA)의 글라이코실화가 면역원성에 미치는 영향
재료 및 방법
재조합 바이러스의 생성
위치 지정 돌연변이 유발을 제외하고 실시예 1에서 기술된 것과 동일한 방법을 사용하여 NA 게놈에 정지 코돈을 첨가하여 NA의 줄기 및 촉매 도메인을 제거하였다. NA 줄기 및 촉매 도메인 (LAIV WSN-NA, 서열 번호 2)이 없는 바이러스의 제조를 위해, NA를 안정적으로 발현하는 MDCK / 293T 세포주가 생성되어 바이러스를 구제(rescue), 유지 및 분석하였다. 간략하게는, 전장 NA (WSN 균주로부터, 서열 번호 4)를 cDNA 발현 렌티벡터(pLAS2w.Ppuro)에 클로닝 하였다. 그 다음, NA-발현 렌티바이러스를 National RNAi Core Facility, Academia Sinica, Taiwan (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw)에서 제공한 프로토콜을 사용하여 생성하였다. HEK293T 및 MDCK 세포를, 폴리브렌 (Sigma)의 존재 하에 최종 농도 8μg/ml에서 3배 다중 감염성(triple multiplicity of infection)을 갖는 NA-발현 렌티 바이러스로 감염시켰다. 세포를 퓨로마이신(3 μg / ml) (Invitrogen)을 함유하는 선택 배지로 배지를 대체하기 전에 24 시간 동안 바이러스와 함께 배양 하였다. 3 일 배양 후, 총 세포 용해물을 수집하여 웨스턴 블랏 분석에 의해 NA의 발현 효율을 확인하였다.
NA 활성
NA의 효소 활성은 설명한 바와 같이 pfu 및 단백질 샘플로 바이러스 샘플을 표준화함으로써 측정하였다. 소량의 바이러스를 1 x 106 pfu의 역가로 준비한 다음 4-MUNANA (Sigma)와 함께 37 ° C에서 배양했다. 30분 후, 0.14 M NaOH 및 83 % 에탄올로 반응을 정지시키고, 360 nm에서의 여기 및 450 nm에서의 방출로 NA 활성을 측정하였다. 기질의 최종 농도는 0 내지 1500 mM의 범위였다. 형광을 5 분마다 60 분 (12 회 측정)동안 모니터링하였다(4-MUNANA 분석). 비선형 회귀를 사용하여 Michaelis-Menten 방정식에 데이터를 적합시킴으로써 Prism 소프트웨어 (GraphPad)를 사용하여 NA의 Km (최대 속도의 절반을 산출하는 기질 농도) 및 Vmax (최대 속도)를 계산 하였다. 상이한 글리코콘쥬게이트 (4-MuA-Neu5Ac, 3-SLN, 6-SLN, 3-SL 및 6-SL, Sigma)의 효소적 절단의 동역학을 측정하기 위해, 상기 글리코콘쥬게이트로부터 방출 된 N-아세틸뉴라민산을 N-아세틸만노사민 (ManNAc) 탈수소 효소 및 시알산 알돌라제로 반응시킴으로써 결정하였다.
N- 아세틸뉴라민산의 알돌라제-절단 산물인 ManNAc를 ManNAc 탈수소 효소 및 NAD +와 상호 작용시켜 NADH 부산물을 형성시키고, 340/450 nm에서의 NADH의 형광 강도를 측정하였다. 상기 반응에서, 2 μg의 시알산 알돌라제 (Pasteurella multocida, 재조합), 3 μg ManNAc 탈수소 효소 (Flavobacterium sp. 141-8, 재조합), 50 mM MES 완충액, pH 6.5, 0.2 mM NAD + 및 적절한 양의 NA를 혼합하고, 글리코콘쥬게이트의 최종 농도를 0 내지 1500 mM의 범위로 조절 하였다. 형광을 5 분마다 30분 동안 측정 하였다 (6 번 측정).
LAIV WSN-44-72-219-G 및 LAIV WSN-NA로 처리된 마우스
LAIV WSN-NA 바이러스는 NA 발현이 있는 MDCK 세포에서 배양되었다. 마우스가 의식이 있고 바이러스가 하부 호흡 기관에 도달하지 않은 동안 25 ㎕의 LAIV WSN-44-72-219-G 또는 LAIV WSN-NA (WT WSN에 대한 비치명적 투여량) 를 0일 및 21일에 각각 비공에 도입하였다. NA 44-72-219는 상기 서열 번호 11로서 리스팅된다. 그런 다음 면역원성 시험 절차를 따랐다.
항체
항-NA 항체는 Sino Biological로부터 입수하였다.
단백질 발현 및 정제
NA는 상기 실시 예 1에 기재된 방법으로 제조하였다.
면역원성 시험을위한 IAV 준비
LAIV WSN-NA 바이러스는 상기 실시예 1에서 기술된 동일한 방법을 사용하여 NA를 발현하는 MDCK 세포에서 생산되었다.
투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy)
MDCK 세포는 1 일 동안 7.8-mil 두께 (E, M, S)의 ACLAR 삽입 필름에서 성장한 후 MOI가 5 인 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다. 18 hpi에서 바이러스 감염 세포를 0.1M 카코딜레이트 완충액으로 세정하고 4 ℃에서 0.1M 카코딜 레이트 완충액 중 2.5 % 글루타르알데하이드로 30 분간 고정시켰다. 그 후 세포를 0.1M 카코딜레이트 중 1% 오스뮴 삼중화물로 30분간 후고정시키고, 1% 우라닐 아세테이트 및 리드 시트르산으로 1 시간 동안 염색하고, 에탄올을 사용하여 탈수시킨 다음 수지로 포매시켰다. 베이킹 후, 상기 샘플을 울트라마이크로톰을 사용하여 80 나노미터 박판으로 절단했다. 최종적으로, Tecnai G2 Spirit TWIN (FEI Company)으로 샘플을 검사하였다.
병독성 분석
마우스는 상기 실시예 1에 제공된 설명에 따라 바이러스 50㎕ (도 12에서 나타낸 WSN 및 LAIV WSN-NA 에 대해 1x106 PFU, 패널 E)를 비 내 접종하였다.
뉴라미니다아제 억제 분석
뉴라미니다아제 억제 분석을 사용하여 NA 항체의 생성을 분석하였다. 여기서 NA-Fluor ?? Influenza Neuraminidase Assay Kit (Life Technologies)를 사용하여 이 실험을 수행했다. 간단히 말해, 상기 바이러스를 키트로부터 반응 완충액과 함께 배양한 다음, 혼합하고 열 비활성화시킨 후, 도면에 나타낸 바와 같이 상이한 농도로 연속 희석하여 형광을 모니터하였다. 뉴라미니다아제 억제 역가는 적어도 50 % 억제가 있는 가장 높은 희석의 상호가(the reciprocal of the highest dilution)로서 계산되었다.
IAV-specific CD8+ T cell analysis IAV- 특이 CD8 + T 세포 분석
PBS, WSN 또는 LAIV WSN-NA 처리된 마우스로부터 얻은 PBMC를, 0.5 μg/ml TPCK- 트립신을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 3의 MOI로 생존 또는 불 활성화된 WSN (UV 처리)과 함께 배양하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포를 2 번 세척하고 10% 열-불활성화된 FBS 및 항생제가 함유된 RPMI 1640 배지로 중첩시켰다. 24 시간 동안 배양한 후, Dynabeads Untouched Mouse CD8 Cells kit (Invitrogen)를 사용하여 회사의 절차에 따라 CD8 + T 세포를 분리하고, 유세포 분석 및 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 바이러스성 단백질 M1 및 NP 자극을 위해, GM-CSF-배양된 골수 유래 수지상 세포 (BMDC)를 완전한 RPMI 1640 배지에서 37 ℃에서 24시간 동안 100μM 바이러스 M1 및 NP 에피토프가 있거나 또는 에피토프가 없이 배양하고, 면역화된 마우스로부터의 PBMC를 1 : 1의 비율로 혼합하였다. 48시간 동안 배양 한 후, CD8 + T 세포를 분리하고, 유세포 계측법 및 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 상기 M1 에피토프는 GILGFVFTL (서열 번호 18), RLEDVFAGK (서열 번호 19) 및 ASCMGLIY (서열 번호 20)이었고, NP 에피토프는 CTELKLSDY (서열 번호 21), SRYWAIRTR (서열 번호 22) 및 LELRSRYWA (서열 번호 23) (Mission Biotech)이었다. 펩타이드를 5.0 mg/ml 디메틸 설폭사이드에 용해시키고, RPMI 1640에서 100 μM으로 희석하고, 20 ℃에서 보관하였다.
유세포 분석
세포를 수확하고 106 / mL의 밀도로 FACS 완충액 (PBS 중 2 % FBS)에 현탁시켰다. 이 연구에서 사용된 항체는 항 - INF 감마 항체였다. 세포 형광 강도는 FACSCanto (BD Biosciences) 및 FCS Express 3.0 소프트웨어로 분석하였다.
결과
N-44, N-72 및 N-219에서의 글리코실화는 NA의 2차 구조에 영향을 미침
NA 글리코실화가 IAV의 라이프 사이클에 관여 하는지를 이해하기 위해, A / WSN / 33과 동일한 바이러스 균주를 역 유전학을 사용하여 각 글리코사이트를 조사하기 위한 모델로 사용했다 (도 7, 패널 A). NA 44-G, NA 72-G, NA 44-72-G 및 NA 44-72-219-G의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 8-11로 제공된다. 글리코 사이트 44 및 72 (줄기 도메인에서)가 바이러스 복제에서 중요한 역할을 하고, 결실된 글리코사이트 44 및 72 (44-72-G 또는 44-72-219-G 바이러스)를 가지는 바이러스의 복제율은 MDCK와 A549 세포 모두에서 WT 바이러스보다 2 배 더 낮았다 (도 2, 패널 A 및 도 7, 패널 B). NA 상의 글리코사이트 44, 72 및 219는 글리코실화되어 상이한 분자량을 갖는 NA 단백질의 변이체를 형성하였지만, 이들 변이체는 웨스턴 블랏 분석 및 겔 여과에서 엔도글리코시다아제 칵테일 처리 후 유사한 분자량을 나타내었다. (도 2, 패널 B, 도 7, 패널 C-D). 흥미롭게도, 이러한 변이체의 2 차 구조는 약간 다르지만 탈-글리코실화 후에도 동일하게 나타났다 (도 2, 패널 C-D). 이러한 결과는 글리코사이트 44, 72 및 219에 부착된 글리칸이 이질적(heterogeneous)이며 NA의 2 차 구조에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
N-44 및 N-72에서의 글리코실화는 NA 활성 및 병독성에 영향을 미침
또한, 글리코사이트 44 및 72에서의 글리칸은 NA 활성에 중요하다는 것이 밝혀졌다. 글리코사이트 44 및 72가 없는 바이러스 (44-72-G 및 44-72-219-G)는, 기질로서 2- (4-메틸움벨리페릴) -α-DN-아세틸뉴라민 산(2-(4-methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid, 4-MUNANA) 을 사용한 분석에 기초하여, WT보다 유의하게 더 낮은 NA 활성을 보여주었다(도 2, 패널 E). 또한, WT 바이러스가 엔도 글리코시다아제 칵테일로 처리 된 후, 분자량 및 NA 활성은 처리되지 않은 바이러스의 것보다 낮았다 (도 7, 패널 E-F). 또한, WT 바이러스가 엔도글리코시다아제 칵테일로 처리된 후, 분자량 및 NA 활성은 처리되지 않은 바이러스의 것보다 더 낮았다 (도 7, 패널 E-F).
NA상의 글리칸은 상이한 기질에 대한 최대 속도 (Vmax) 및 친화성 값 (Km)이 변화함에 따라 효소 활성, 친화성 및 특이성에 영향을 미쳤다. 2 '(4- 메틸움벨리페릴) -α-DN- 아세틸뉴라민 산 (4-MuA-Neu5Ac) 및 6'- 시알릴 -N- 아세틸락토사민 (6-SLN)을 기질로 사용하는 경우, 상기 글리코사이트 44 및 72가 없는 NA 뉴라미니다아제 활성은 더 낮았지만 모든 돌연변이체의 Km 값은 비슷했다. 놀랍게도, 3-SLN을 기질로 사용하면 글리코사이트 44 또는 72가 제거 된 NA의 활성은 약 50 % 감소하지만 Km 값은 2 배 이상 증가했다 (도 3 : 패널 A 및 표 1). 흥미롭게도, LMH 세포에서 이러한 변이체의 바이러스 생성 속도는 조류 수용체인 3-SLN에 대한 NA 활성과 관련이 있었다 (도 3, 패널 B). 이러한 결과는 NA에 대한 글리코실화가 포유류 및 조류 세포에서 IAV 복제에 다르게 영향을 미친다는 것을 시사한다 (도 2, 패널 A 및 도 3, 패널 B).
또한, 글리코사이트 72 (72-G)가 없는 NA는 기질로서 6'-시알릴락토오스 (6-SL)와 상호 작용하지만, 어떠한 변이체도 3'- 시알릴락토스 (3-SL)와 상호 작용하지 않았다 (도 3, 패널 C 및 도 8, 패널 A). 흥미롭게도, 44-72-219-G의 활성은 25 내지 40 ° C에서 44-72-G (글리코사이트 219와)의 활성과 비슷했지만 더 높은 온도 (45, 50 및 55℃)에서는 더 낮았다 (도 8, 패널 B). 44-72-G를 엔도글리코시다아제 칵테일로 처리한 후, NA의 활성은 55 ℃에서 처리하지 않은 것보다 낮았고; 이러한 결과는 글리코사이트 219 (촉매 영역에서)의 글리칸이 NA의 열안정성(thermostability)에 영향을 미침을 시사한다 (도 3, 패널 D 및 도 8 : 패널 C).
글리코사이트 44 및 72는 또한, WT, 44-G 및 72-G 바이러스에 감염된 세포가 더 많은 구형 바이러스 입자를 방출했기 때문에 바이러스 방출과 형태 형성을 조절하지만, 44-72-G 또는 44- 72-219-G 바이러스는 WT 바이러스-감염 세포에서 관찰되지 않았던 주로 신장되고 필라멘트 모양의 입자를 생성했다 (도 3, 패널 E-F 및 도 8, 패널 D-F). 또한, NA (44-72-219-G 바이러스) 상에 임의의 글리칸이 없는 바이러스에 감염된 마우스는, 생존율이 20 %이고 상당한 체중 손실을 보이는 WT 감염 마우스와 비교하여 생존율 및 체중 변화가 덜 나타났다. 이러한 결과는 NA에서의 글리코실화가 병독성에 영향을 미침을 시사한다 (도 3, 패널 G-H).
NA의 줄기 및 촉매 도메인이 없는 약독화 생백신은 강력한 CD8 + T 세포 반응으로 광범위한 보호능을 보였다
비-글리코실화된 NA (44-72-219-G)를 가진 IAV는 살아있는 약독화된 인플루엔자 백신 (LAIV WSN-44-72-219-G)으로 사용하여 백신의 예방 가능성을 결정하였다. 비-글리코실화된 NA는 낮은 NA 활성 및 병독성을 가졌기 때문에 선택되었다. 그러나, 비-글리코실화된 NA 바이러스는 WT와 유사한 면역원성을 보였다 (도 9, 패널 A - C).
또한, NA 활성은 비활성 백신의 효율에 영향을 미치지 않았으며, 생산된 항체의 수준은 매우 낮았다. 그러므로, NA의 RNA 게놈 세그먼트에 정지 코돈을 첨가하여 NA의 면역원성을 증가시킴으로써, 바이러스가 NA (LAIV WSN-NA)의 줄기와 촉매 영역 없이 생성되었다 (도 4, 패널 A). LAIV WSN-NA 바이러스는 MDCK 세포에서 플라크를 형성하지 않으며 세포에서 WT NA를 발현시킴으로써 구제될 수 있음을 발견했다 (도 10, 패널 A-B). 24 hpi 후, LAIV WSN-NA 바이러스에 감염된 A549 세포는 상청액으로 방출된 바이러스가 적고 세포 내 바이러스 단백질 M1이 축적됨을 보여주었고; 이러한 결과는 LAIV WSN-NA 바이러스가 바이러스 방출에 결함이 있음을 시사한다 (도 10, 패널 C-D).
1X106 PFU의 WSN 바이러스에 감염된 마우스의 체중이 급격히 감소하였고, 감염 후 6 일째에 사망하였다. 반면에 경구 투여를 통해 1 Х 106 PFU의 LAIV WSN-NA 바이러스에 감염된 마우스들은 잘 생존했으며 체중 감소는 보이지 않았으며; 이러한 결과는 LAIV WSN-NA 바이러스가 낮은 병원성을 가지는 효과적인 LAIV이며, 세포에서 바이러스 약독화가 생백신의 효능에 필수적이라는 것을 보여 주었다 (도 10, 패널 E-F). 면역원성 시험에서, 불활성화된 WSN-NA 바이러스의 면역 원성은 불활성화된 WSN 바이러스의 면역원성과 유사하였다 (도 4, 패널 B 및 도 11, 패널 A - C).
상부 패널의 Km 및 Vmax는 NA 단백질로부터의 값이고, 하부 패널의 Km 및 Vmax는 바이러스 변이체로부터의 값이다.
그러나 LAIV WSN-NA 바이러스가 백신으로 사용되었을 때, 바이러스 챌린지 연구에서 WSN, A/Cal/07/2009 및 H5N1에 대한 교차-균주 및 교차 - 서브타입 보호를 보였고; 상기 LAIV WSN-NA 처리된 마우스는 잘 생존하였고 폐에서 바이러스를 제거했지만 주목할만한 항체 반응을 유도하지 못했다 (도 4 : 패널 C-E 및 도 12, 패널 A-D). 또한, LAIV WSN-NA의 보호 능력도 용량 의존적 반응을 보였다 (도 12 : 패널 E). 상기 바이러스가 LAIV WSN-NA 처리된 마우스로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 감염시킨 후, CD8 + T 세포가 IFN-γ 및 그랜자임 B 발현을 통해 특이적으로 활성화되었지만, 불활성 바이러스는 이러한 활성을 나타내지 않았고, 이는 LAIV WSN -NA는 바이러스 감염 시 CD8 + T 세포 활성화를 유도할 수 있음을 시사한다 (도 4, 패널 E 및 도 12, 패널 F-G). 또한, 고도로 보존된 바이러스성 에피토프 NP 및 M1은 또한 CD8+ T 세포 활성화를 자극하였다 (도 4, 패널 G 및 도 12, 패널 G). 이러한 결과는 NA가 CD8 + T 세포 활성화를 통해 숙주 면역 반응을 조절하는 데 핵심적인 역할을 하며 LAIV WSN-NA는 효과적인 백신임을 시사하였다.
마지막으로, M2 상의 하나의 글리코사이트는 바이러스 복제에 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다 (도 13).
여러 연구는 NA의 줄기 영역에서의 다양화는 오리에서 육상 기반의 가금류로의 IAV의 병독성 및 전염(transmission)에 관련이 있고, 이의 및 염기 서열의 결실 및 글리코사이트 변형을 포함한 진화적 과정을 통한 인간 중 확산과 관련이 있다고 제시되어왔다. 그러나, NA의 줄기 도메인의 구조적 및 기능적 역할은 지금까지 알려지지 않았으며, 이러한 정식 글리코사이트의 글리코실화에 대한 보고는 없었다. 이 실시예의 결과는 NA의 줄기 도메인에서 글리코 사이트가 글리코실화되어 NA의 활성, 친화성 및 특이성을 조절하여 IAV 복제를 조절함을 의미하고, 이는 NA의 줄기 도메인의 글리칸이 IAV의 병독성 및 전염 에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
실시예 3 : 저병독성 IAV에서 면역원성 NA 변이체의 확인
재료 및 방법
재조합 바이러스의 생성
부위 특이적 돌연변이 유발을 사용하여 본원에 기재된 NA 변이체를 생성시켰다. 촉매 도메인이 결실된 NA 변이체 (WSN-NA-CD, 서열 번호 15)를 제조하기 위해, NA 촉매 도메인의 제 1 코돈 위치에 종결 코돈을 사용하였다. R102를 A로 변경하여 활성 부위 1이 불활성화된 변이체 (상기에서 제공된 WSN-NA-AS1, 서열 번호 12)를 작제하였다. 활성 부위 2가 불활성화된 변이체 (상기 제공된 WSN-NA-AS2, 서열 번호 13)는 D135를 A로 변경시킴으로써 제작되었다. 아미노산 잔기 G388을 A388으로 대체하여 변이체 WSN-NA G388A (상기 제공된 서열 번호 14)를 작제하였다.
LAIV WSN-44-72-219-G, LAIV WSN-NA 및 WSN-NA-AS1으로 마우스 치료
LAIV WSN-NA 및 WSN-NA-AS1 바이러스는 NA 발현이 있는 MDCK 세포에서 배양되었다. 마우스가 의식이 있고 상기 바이러스가 하부 호흡 기관에 도달하지 않은 동안, 총 25 μL의 LAIV WSN-44-72-219-G, LAIV WSN-NA 및 WSN-NA-AS1와 비치사량의 WT WSN 를 각각 0일 및 21일에 비 내로 도입하였다. 그런 다음 면역원성 테스트 절차가 수행되었다.
병독성 분석
재조합 바이러스의 병독성은 50 μL의 바이러스를 비 내 주사 한 5 마리의 암컷 4-6 주령 BALB / c 마우스 그룹을 사용하여 측정 하였다(도 15에서 WSN, LAIV WSN-NA 및 WSN-NA-AS1에 대해 1 Х 106 PFU, 패널 A). 생존과 체중 변화는 감염 후 14 일 동안 매일 기록되었다.
결과
상기 언급 된 다양한 NA 변이체를 생성시켜 줄기 및 촉매 도메인의 어느 영역이 면역원성 및 병독성에 영향을 주는지를 결정하였다 (도 14, 패널 A). A549 세포가 NA 활성-결핍 바이러스 (LAIV WSN-NA, WSN-NA-CD, WSN-NA-AS1 및 WSN-NA-AS2)로 감염된 경우, 바이러스가 상청액으로 더 적게 방출되고, 세포 내 바이러스 RNA (vRNA) 및 바이러스 단백질 (NP와 M1)이 세포에 축적되고, 이는 NA 활성은 단백질 자체가 아니라 바이러스 방출의 키임을 시사한다 (도 14: 패널 B-D). NA 활성이 바이러스 방출의 중요한 역할을 하기 때문에, NA 활성 부위 돌연변이 바이러스 (WSN-NA-AS1)는 LAIV WSN-NA와 면역원성을 비교하기 위해 약독화 인플루엔자 생백신 (LAIV)으로 사용되었다.
경구 투여를 통해 WSN-NA-AS1 바이러스에 감염된 마우스의 시간에 따른 생존율 및 체중은 LAIV WSN-NA 또는 PBS로 감염된 마우스의 생존율 및 체중과 유사했다 (도 15 : 패널 A-B). LAIV WSN-NA와 마찬가지로, WSN-NA-AS1으로 백신접종은 또한 주목할만한 항체 반응을 유도하지 않았으며 (도 15, 패널 C), WSN-NA-AS1 바이러스의 복제율은 LAIV WSN-NA의 복제율과 비슷하였다 (도 15, 패널 D). WSN의 비치사량(unlethal dosage)과 비교하여 WSN-NA-AS1 바이러스의 병독성 감소에도 불구하고 (도 15, 패널 C 및 D), WSN-NA-AS1 바이러스에 대한 노출은 치사량의 H5N1로부터 마우스를 보호하였다 (도 15 , 패널 E).
WSN-NA-AS1 변이체로부터의 이러한 결과는 LAIV WSN-NA 의 것과 유사하였고(상기 실시예 2 참조), 이는 NA 활성이 숙주 면역 반응에 영향을 줄 것을 시사한다. IAV 백신에 노출된 바이러스성 단백질이 IAV- 특이적 CD8 + T 세포를 유도하는 중요한 방법이기 때문에, 결함있는 효소 활성을 갖는 NA 변이체를 가지는 IAV는 교차 - 서브 타입 보호 능력, 예를 들어, H1N1 및 H5N1 IAV 균주 모두에 대한 보호를 부여하는 능력을 가지는 것을 기대할 것이다.
바이러스 벡터 시스템을 사용하여 IAV 단백질의 보존 영역의 발현은 동물에서 치명적인 IAV 감염에 대해 CD8 + T 세포를 유도할 수 있다. 그러나 그러한 접근법은 하나의 표적에만 특이적인 면역 반응을 오직 유도 할 수 있다. 대안적으로, 인플루엔자 바이러스 백신 조성물을 만들기 위해 MVA-NP와 M1의 혼합물을 사용하는 것으로 보고되었다. 본원에 개시된 바와 같이, 결함있는 NA, 예컨대 줄기 및 촉매 도메인을 갖지 않는 절단된 버전을 포함하는 IAV 입자는 중화 항체의 부재 하에 IAV의 다양한 균주 및 상이한 서브타입을 인식하는 IAV- 특이적 CD8 + T 세포를 유의하게 유도하였다. 이 결과는 여기에 제공된 IAV가 보편적인 인플루엔자 백신 조성물을 제조하기 위한 유망한 접근 방법임을 의미한다.
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 이 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 위한 대안적인 특징으로 대체 될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각 특징은 동등하거나 유사한 특징의 일반적인 일련의 일례에 불과하다.
상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 쉽게 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 용도 및 조건에 적응시키기 위해 본 발명의 다양한 변경 및 변형을 할 수 있다. 따라서, 다른 실시예도 또한 청구 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Academia Sinica <120> RECOMBINANT VIRUS, COMPOSITION COMPRISING THE SAME, AND USES THEREOF <130> P2980-KR <140> PCT/US2017/060510 <141> 2017-11-08 <150> US 62/418,800 <151> 2016-11-08 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 565 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Met Lys Ala Phe Val Leu Val Leu Leu Tyr Ala Phe Val Ala Thr Asp 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Ile Phe Glu Lys Asn Val Ala Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Arg His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Thr Gly Trp Leu Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Asp Ser Leu Leu Pro Ala Arg Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Ala Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Leu 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 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Val Ala Thr Asp 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Ile Phe Glu Lys Asn Val Ala Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Arg His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Thr Gly Trp Leu Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Asp Ser Leu Leu Pro Ala Arg Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Ala Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Leu 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Ala His Thr 130 135 140 Phe Asn Gly Val Thr Val Ser Cys Ser His Arg Gly Lys Ser Ser Phe 145 150 155 160 Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Lys Lys Gly Asp Ser Tyr Pro Lys 165 170 175 Leu Thr Asn Ser Tyr Val Asn Asn Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu 180 185 190 Trp Gly Val His His Pro Ser Ser Ser Asp Glu Gln Gln Ser Leu Tyr 195 200 205 Ser Asn Gly Asn Ala Tyr Val Ser Val Ala Ser Ser Asn Tyr Asn Arg 210 215 220 Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Ala Arg Pro Lys Val Lys Asp Gln His 225 230 235 240 Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile 245 250 255 Ile Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala 260 265 270 Leu Ser Arg Gly Phe Glu Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser Met 275 280 285 His Glu Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ser Ile Asn Ser 290 295 300 Asn Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320 Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn 325 330 335 Ile Pro Ser Ile Gln Tyr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 340 345 350 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365 His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 370 375 380 Gln Asn Ala Ile Asn Arg Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu 385 390 395 400 Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu 405 410 415 Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu 420 425 430 Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445 Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Leu Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460 Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys 465 470 475 480 Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg 485 490 495 Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn 500 505 510 Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln 515 520 525 Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val 530 535 540 Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln 545 550 555 560 Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 17 <211> 565 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 17 Met Lys Ala Phe Val Leu Val Leu Leu Tyr Ala Phe Val Ala Thr Asp 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Ile Phe Glu Lys Asn Val Ala Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Arg His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Thr Gly Trp Leu Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Asp Ser Leu Leu Pro Ala Arg Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Ala Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Leu 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Ala His Thr 130 135 140 Phe Asn Gly Val Thr Val Ser Cys Ser His Arg Gly Lys Ser Ser Phe 145 150 155 160 Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Lys Lys Gly Asp Ser Tyr Pro Lys 165 170 175 Leu Thr Asn Ser Tyr Val Asn Asn Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu 180 185 190 Trp Gly Val His His Pro Ser Ser Ser Asp Glu Gln Gln Ser Leu Tyr 195 200 205 Ser Asn Gly Asn Ala Tyr Val Ser Val Ala Ser Ser Asn Tyr Asn Arg 210 215 220 Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Ala Arg Pro Lys Val Lys Asp Gln His 225 230 235 240 Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile 245 250 255 Ile Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala 260 265 270 Leu Ser Arg Gly Phe Glu Ser Gly Ile Ile Thr Ser Ala Ala Ser Met 275 280 285 His Glu Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ser Ile Asn Ser 290 295 300 Asn Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320 Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn 325 330 335 Ile Pro Ser Ile Gln Tyr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 340 345 350 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365 His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 370 375 380 Gln Asn Ala Ile Asn Arg Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu 385 390 395 400 Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu 405 410 415 Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu 420 425 430 Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445 Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Leu Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460 Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 22 Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 23 Leu Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala 1 5

Claims (21)

  1. 뉴라미니다아제(NA) 변이체를 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)로서,
    상기 뉴라미니다아제 변이체는 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성되고, 뉴라미니다아제 활성이 결핍된,
    재조합 인플루엔자 A 바이러스 (IAV).
  2. (i) 제1항의 재조합 인플루엔자 A 바이러스 (IAV); 및
    (ii) 약학적으로 허용 가능한 담체
    를 포함하는 면역원성 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체가 아쥬번트인 면역원성 조성물.
  4. 유효량의 제2항의 면역원성 조성물을 포함하는, 대상에서 인플루엔자 A 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 대상이 인간 대상인 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인간 대상이 인플루엔자 A 바이러스에 감염되었거나, 감염이 의심되거나, 감염 위험이 있는 것인 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스가 H1N1 또는 H5N1 인플루엔자 A 바이러스인 약학적 조성물.
  8. 제4항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 경구 투여, 장내 투여, 비강 투여, 국소 투여 및 경점막 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해 대상에게 투여되는 약학적 조성물.
  9. 제4항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 대상에게 비경구적으로 투여되는 약학적 조성물.
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