TWI793547B

TWI793547B - 重組病毒、包含該重組病毒之組合物以及其用途

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Publication number: TWI793547B
Application number: TW110109141A
Authority: TW
Inventors: 翁啟惠; 吳俊毅
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2023-02-21
Also published as: TWI725253B; JP6975233B2; CA3016943C; IL293502A; KR102527547B1; CN117925539A; TW201819626A; KR20230008912A; KR20190059330A; TW202124713A; CN110191949A; JP2020501520A; KR20210130823A; IL266526A; WO2018089407A1; US11480391B2; KR102654566B1; CA3016943A1; US20180128545A1; TW202342738A

Abstract

本揭示內容揭示一免疫組合物，包含一可內含於A型流行性感冒病毒中的血球凝集素變異體及／或神經胺酸酶變異體，以及其引發對抗A型流行性感冒病毒之免疫反應的用途。

Description

重組病毒、包含該重組病毒之組合物以及其用途

本揭示內容是有關於治療疾病的領域。更具體來說，本揭示內容是關於一種新穎之重組病毒，以及其於預防A型流行性感冒的醫藥用途。

A型流行性感冒病毒（Influenza A virus，IAV）屬於正黏液病毒科（Orthomyxoviridae family），能夠廣泛地傳播並跨越族群間的障礙。鑒於過去十年間A型流行性感冒盛行，IAV感染仍為一種重大的全球性健康威脅。

血球凝集素（hemagglutinin，HA）及神經胺酸酶（neuraminidase，NA）係位於IAV表面的醣蛋白。HA及NA之抗原漂變及抗原移型致使有必要發展對A型流行性感冒有較佳保護力的疫苗。因此，找出具有較佳免疫力（immunogenicity）的HA及NA變異體將有極大的益處，其能協助開發疫苗以對抗快速演變的IAV。

本揭示內容至少有一部分係基於發明人意外地發現一種重組IAV，其相較於野生型（wild type，WT）IAV，具有強化免疫反應的功效，其中該重組IAV包含一種修飾過的（modified）N-醣化修飾型態的突變HA抗原，或一種神經胺酸酶活性缺損的突變NA。

本揭示內容的一態樣係有關一種重組IAV，包含一突變HA，其相較於野生型HA，在相當於序列編號：1（或序列編號：3）之第142殘基位置保留一天冬醯胺（asparagine，Asn）殘基，且在相當於序列編號：1（或序列編號：3）之第285、497及556殘基位置包含一或多個突變，其中該突變HA在相當於序列編號：1（或序列編號：3）之第142殘基位置具有N-醣化修飾，且在相當於序列編號：1之第285、497及556殘基位置不具醣化修飾（aglycosylated）。

在某些實施方式中，該突變HA在相當於序列編號：1之第27殘基位置更保留一Asn殘基，且其中該HA變異體在相當於序列編號：1之第27殘基位置具有N-醣化修飾。

任一種本揭示內容所述之突變HA可包含一胺基酸序列，其與序列編號：1（或序列編號：3）具有至少85％（例如90％、95％、98％或99％）的序列相似度。在一實施例中，該突變HA包含序列編號：1的胺基酸序列。

本揭示內容亦包含任一種本發明所述之突變HA抗原。

本揭示內容的另一態樣係有關一種包含一突變NA的重組IAV，其中相較於野生型NA，該突變NA包含（a）一位於一或多個活性位置（active site）的突變，（b）一位於一或多個N-醣化修飾的突變，或（a）及（b）的組合；其中該突變NA的NA活性有缺損。

在某些實施方式中，該突變NA在相當於序列編號：4之第44、72及219殘基位置的一或多個N-醣化修飾位點包含一置換（substitution）。舉例而言，該突變NA：（1）在相當於序列編號：4之第44殘基位置包含一置換，（2）在相當於序列編號：4之第72殘基位置包含一置換，（3）在相當於序列編號：4之第44及72殘基位置包含複數個置換，或（4）在相當於序列編號：4之第44、72及219殘基位置包含複數個置換。或是或除此外，該突變NA於一或多個活性位置包含一置換，其中該活性位置可為相當於序列編號：4之第102及135殘基位置。任一種本揭示內容所述之該突變NA包含一胺基酸序列，其與序列編號：4具有至少85％（例如90％、95％、98％或99％）的序列相似度。

在某些實施方式中，該突變NA可於一或多個區域包含一缺失（deletion），其中該一或多個區域為含有一或多個N-醣化修飾位點、一或多個活性位置，或二者兼具的區域。舉例而言，該突變NA可於莖柄域（domain）包含一缺失、可於催化域包含一缺失，或二者兼具。在一實施例中，該突變NA係缺失全部的催化域。在其他實施例中，該突變NA係缺失全部的催化域及莖柄域二者。在一特殊的實施例中，該突變NA為序列編號：2的胺基酸序列。

本揭示內容亦包含任一種本發明所述之突變NA。

在另一態樣中，本揭示內容提供一種免疫組合物，包含：（i）任一種本發明所述之重組IAV或任一種本發明所述之HA變異體，以及（ii）一藥學上可接受的載體，其中該載體可為一佐劑。

在再另一態樣中，本揭示內容提供一種使一個體引發免疫反應以對抗IAV的方法，該方法包含投予一有效劑量之任一種本揭示內容所述之免疫組合物。在某些實施方式中，該個體係人類，其可為IAV感染、疑似IAV感染，或有IAV感染之風險。例示性的IAV包括但不限於，H1N1或H5N1之IAV。免疫組合物可經由口服（oral administration）、腸內投予（enteral administration）、鼻腔投予（nasal administration）、局部投予（topical administration）及經黏膜投予（transmucosal administration）等路徑投予至個體體內。在一實施例中，免疫組合物係可經非口服投予（parenterally）路徑至個體體內。

本揭示內容亦包含本發明所述之重組IAV、HA變異體或NA變異體，或包含該重組IAV、HA變異體或NA變異體之免疫組合物於治療或預防IAV感染的用途，或重組IAV、HA變異體、NA變異體，或其免疫組合物於製備藥物以治療或預防IAV感染的用途。

以下闡述本揭示內容之一或多個實施方式的相關細節。本揭示內容的其他特徵或優點，在參閱圖式、數個實施方式的詳細說明及申請專利範圍後，當可輕易瞭解。

現今萬用流行性感冒疫苗發展多專注於使用保守序列的多肽或蛋白作為抗原，並混和不同的佐劑及投予方法以引發免疫反應。然而，使用保守序列的多肽或蛋白，經常因殘存致病性病毒而有安全性的顧慮，及／或僅能對抗單一種流行性感冒株系而侷限了所誘發的免疫反應。本揭示內容目的在於克服這些限制，其至少一部份可經由開發具有強化免疫力的HA及NA免疫胜肽變異體來達成。這類的HA及／或NA變異體能引發廣效地對抗各種流行性感冒病毒株的免疫反應，而有益於製備萬用流行性感冒疫苗。

因此，本揭示內容提供了具有強化免疫力的HA及NA變異體、含該變異體的流行性感冒病毒顆粒、包含該流行性感冒病毒顆粒或HA/NA變異體的免疫組合物，以及其於引發免疫反應以對抗流行性感冒病毒的用途。

I. 血球凝集素（Hemagglutinin，HA）變異體

HA係一種發現於流行性感冒病毒表面的醣蛋白。HA負責使病毒結合至呼吸道及紅血球細胞上，該細胞的細胞膜具有唾液酸。HA蛋白經常受到後轉譯修飾（post-translationally modification），例如附加（addition）多醣至位於Asn-Xaa-Ser/Thr的共有基序（consensus motif）的多個Asn殘基上（即，N-醣化修飾）。此具有N-醣化修飾的Asn殘基，在此稱為醣化位點或N-醣化修飾位點。

舉例而言，A型流行性感冒病毒 A/WSN/1933（H1N1）之野生型HA具有如序列編號：3所示之胺基酸序列。以粗體標示該野生型HA之醣化位點（Asn或N殘基）。

序列編號：3 MKAFVLVLLY AFVATDADTI CIGYHA N NST DTVDTIFEKN VAVTHSVNLL EDRHNGKLCK 27 LKGIAPLQLG KCNITGWLLG NPECDSLLPA RSWSYIVETP NSENGACYPG DFIDYEELRE QLSSVSSLER FEIFPKESSW P N HTFNGVTV SCSHRGKSSF YRNLLWLTKK GDSYPKLTNS 142 YVNNKGKEVL VLWGVHHPSS SDEQQSLYSN GNAYVSVASS NYNRRFTPEI AARPKVKDQH GRMNYYWTLL EPGDTIIFEA TGNLIAPWYA FALSRGFESG IITS N ASMHE CNTKCQTPQG 285 SINSNLPFQN IHPVTIGECP KYVRSTKLRM VTGLRNIPSI QYRGLFGAIA GFIEGGWTGM IDGWYGYHHQ NEQGSGYAAD QKSTQNAINR ITNKVNSVIE KMNTQFTAVG KEFNNLEKRM ENLNKKVDDG FLDIWTYNAE LLVLLENERT LDFHDLNVKN LYEKVKSQLK NNAKEIGNGC FEFYHKCDNE CMESVR N GTY DYPKYSEESK LNREKIDGVK LESMGVYQIL AIYSTVASSL 497 VLLVSLGAIS FWMCS N GSLQ CRICI 556

本領域技術人員熟知其他野生型HA抗原，例如H1、H2或H3等HA抗原，且可自公開的基因資料庫（例如GenBank）獲得其胺基酸序列。可經由比對其胺基酸序列與上文提供為例示的序列（序列編號：3）而辨識出特定的野生型 HA亞型的醣化位點。

本揭示內容所述之HA變異體可衍生自任一種本領域技術人員所熟知的野生型HA亞型，例如H1、H2或H3等HA抗原。這類的HA變異體保有一或多個醣化位點，惟相較於野生型HA，該些HA變異體具有一或多個醣化位點突變，致使無N-醣化修飾發生於該突變位點上（aglycosylated）。舉例而言，本揭示內容所述之HA變異體在相當於序列編號：3之第142殘基位置（下同序列編號：1之第142殘基位置）保有該Asn殘基（即醣化位點），且非必要地在相當於序列編號：3之第27殘基位置（下同序列編號：1之第27殘基位置）保有該Asn殘基，而在相當於序列編號：3之第285、497及556殘基位置（下同序列編號：1之第285、497及556殘基位置）的一或多個Asn殘基發生突變。因此，本揭示內容所述之HA變異體可在相當於序列編號：3（或序列編號：1）之第142殘基位置，及非必要地於第27殘基位置的Asn殘基上具醣化修飾，而在相當於序列編號：3（或序列編號：1）之第285、497及／或556殘基位置的突變醣化位點則不具醣化修飾。

「突變的」（mutated）或「突變」（mutation）一詞，係指任一種類的突變，例如附加（addition）、缺失（deletion）或胺基酸置換（substitution）。在某些實例中，在相當於序列編號：3或序列編號：1之第285、497及556殘基位置可缺失一或多個Asn殘基。在其他實例中，可置換該一或多個Asn殘基成其他胺基酸殘基（例如Ala或Gly）。在某些實施例中，本揭示內容所述之HA變異體的三個醣化位點中，其一可突變。在其他實施例中，該HA變異體的三個醣化位點中，其二可突變，例如285+497、285+556或497+556。在另一實施例中，三個醣化位點全部突變（例如置換）。

「一個序列X之殘基在相當於序列Y之第a殘基位置」（A residue in sequence X corresponding to position a in sequence Y）一詞，係指當序列X及Y利用本領域技術人員所熟知的比對工具（例如BLAST®）排列後，該殘基位於序列X的相對位置a。

以下為本揭示內容例示性之HA變異體的胺基酸序列。其他例示性的HA變異體在本揭示內容的別處亦有提供，例如在下文的實施例中。

序列編號：1（HA 285-497-556-G） mkafvlvlly afvatdadti cigyha n nst dtvdtifekn vavthsvnll edrhngklck 27 lkgiaplqlg kcnitgwllg npecdsllpa rswsyivetp nsengacypg dfidyeelre qlssvssler feifpkessw p n htfngvtv scshrgkssf yrnllwltkk gdsypkltns 142 yvnnkgkevl vlwgvhhpss sdeqqslysn gnayvsvass nynrrftpei aarpkvkdqh grmnyywtll epgdtiifea tgnliapwya falsrgfesg iits a asmhe cntkcqtpqg 285 sinsnlpfqn ihpvtigecp kyvrstklrm vtglrnipsi qyrglfgaia gfieggwtgm idgwygyhhq neqgsgyaad qkstqnainr itnkvnsvie kmntqftavg kefnnlekrm enlnkkvddg fldiwtynae llvllenert ldfhdlnvkn lyekvksqlk nnakeigngc fefyhkcdne cmesvr a gty dypkyseesk lnrekidgvk lesmgvyqil aiystvassl 497 vllvslgais fwmcs a gslq crici 556

HA變異體包含一胺基酸序列，其與野生型HA抗原（例如序列編號：3）具有至少85％（例如90％、95％、97％、98％或99％）的序列相似度，且含有上文所述之突變醣化位點。如本領域技術人員所熟知的，「序列相似度」（sequence identity）一詞係指經序列比對（即排列）後，二個多肽之間的關聯性。在本領域中，相似度亦表示為二個序列之間的序列關聯程度，其係取決於一連串二個或二個以上彼此吻合的胺基酸殘基數量。相似度為衡量二個或二個以上較小的序列之間一致相符的百分比，其係經由特殊的數學運算模式或電腦軟體（例如演算法，algorithms）進行間隙排列（若有需要時）計算結果。亦可輕易地使用已知的方法計算關聯胜肽的相似度。可用發表於Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990的演算法檢測二個胺基酸序列的「相似度百分比」（percent identity），其中該演算法進一步於Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993發表修正版本。發表於Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990的NBLAST®及XBLAST®程式（第二版）採用該演算法。可用XBLAST程式執行BLAST®蛋白搜尋，條件設定為比分=50、字長=3，以獲得與本揭示內容之蛋白分子同源的胺基酸序列。二條序列之間存在間隙時，可用Gapped BLAST®，其詳細說明在Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997。當使用BLAST®及Gapped BLAST®程式時，能利用各自程式（例如XBLAST®及NBLAST®）的預設參數。基於Smith–Waterman演算法（Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) “Identification of common molecular subsequences.” J. Mol. Biol. 147:195-197）的排列方法為另一種熱門的局部排列方法。基於動態程式設計的一般全域排列方法，為Needleman–Wunsch演算法（Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) “A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.” J. Mol. Biol. 48:443-453）。更進期地，已發展快速最適全域序列比對演算法（Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm，FOGSAA），據信其相較於其他包含Needleman–Wunsch演算法在內的最適性全域排列方法，能更快地給出全域核苷酸及蛋白序列比對結果。

除本揭示內容所述之醣化位點突變之外，本揭示內容所述之HA變異體相較於野生型HA，可包含一或多個保守胺基酸置換。本領域技術人員能理解HA變異體之保守胺基酸置換，可令其成為功能均等的變異體，例如該變異體仍保有該特定HA變異體的功能能力。在此所述之「保守胺基酸置換」（conservative amino acid substitution）一詞，係指一種胺基酸置換，其不改變具有該胺基酸置換之蛋白的相對電荷或大小等特徵。可依照本領域技術人員所熟知的改變多肽序列的方法製備各樣的變異體，其中該方法可見於彙編這類方法的參考資料中，例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989或Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York。胺基酸的保守置換，包含下列群組之各組內的胺基酸置換：(a) M、I、L、V；(b) F、Y、W；(c) K、R、H；(d) A、G；(e) S、T；(f) Q、N及(g) E、D。

為製備本揭示內容所述之HA變異體，可選擇特定野生型HA亞型抗原，並經由常規的胺基酸序列排列而得出其上相當於上文標註的各醣化位點。接著，可引進各種突變（例如置換胺基酸殘基）至該野生型HA編碼序列中一或多個相當於序列編號：3或序列編號：1之第285、497及556殘基位置的醣化位點，以獲得該HA變異體。

可經由常規的重組技術將任一種本揭示內容所述之HA變異體編碼序列併入一表現載體中以製備該HA變異體。在某些實例中，可將該HA變異體編碼序列嵌入病毒載體以製造含該HA變異體的A型流行性感冒病毒顆粒。

II. 神經胺酸酶（NA）變異體

神經胺酸酶（NA）係一種發現於流行性感冒病毒表面的醣蛋白。NA酶切宿主呼吸道及紅血球細胞之唾液酸，以利病毒顆粒釋出而促進感染周遭細胞。

NA蛋白包含一N端域、一穿膜域、一莖柄域及一催化域。與HA蛋白相類似的是，NA蛋白經常受到後轉譯修飾，將其醣化位點進行N-醣化修飾。NA蛋白亦包含數個「活性位置」（active site）殘基，該活性位置係執行催化活性所必須。

舉例而言，A型流行性感冒病毒株A/WSN/1933（H1N1）的野生型NA具有如序列編號：4所述之胺基酸序列。

序列編號：4MNPNQKIITI GSICMVVGII SLILQIGNI I SIWISHSIQT GNQ N HTGICN QGSITYKVVA 44GQDSTSVILT G N SS LCPIRG WAIHSKDNGI RIGSKGDVFV I R EPFISCSH LECRTFFLTQ 72 102 GALLNDKHSR GTFK D RSPYR ALMSCPVGEA PSPYNSRFES VAWSASACHD GMGWLTIGIS 135 GPDDGAVAVL KYNGIITETI KSWRKNILRT QESECTCVN G SCFTIMTDGP SDGLASYKIF 219 KIEKGKVTKS IELNAPNSHY E E CSCYPDTG KVMCVC R DNW HGSNRPWVSF DQNLDYKIGY 262 277 ICSGVFGDNP RPKDGTGSCG PVSADGANGV KGFSYKYGNG VWIGRTKSDS S R HGFEMIWD 352 PNGWTETDSR FSMRQDVVAM TDRSG Y SGSF VQHPELTGLD CMRPCFWV E L IRGLPEENAI 386 409 WTSGSIISFC GVNSDTVDWS WPDGAELPFT IDK

野生型NA的第44、72及219殘基位置（如序列編號：4中所示）係醣化位點（Asn或N殘基），並以粗體標示之。第102R、135D、262E、277R、352R、386Y及409E殘基位置（如序列編號：4中所示）係例示性的活性位置，並以粗體標示之。N端及穿膜域（提供於以下序列編號：5中）同序列編號：4中以斜體標示的部分。野生型NA之莖柄域（提供於以下序列編號：6中）同序列編號：4中以底線標示的部分。催化域（提供於以下序列編號：7中）位於野生型NA之C端。

N端–穿膜域（序列編號：5）： MNPNQKIITI GSICMVVGII SLILQIGNI

莖柄域（序列編號：6）： I SIWISHSIQT GNQNHTGICN QGSITYKVVA GQDSTSVILT GNSS

催化域（序列編號：7；以粗體標示活性位置殘基）： LCPIRG WAIHSKDNGI RIGSKGDVFV I R EPFISCSH LECRTFFLTQ GALLNDKHSR GTFK D RSPYR ALMSCPVGEA PSPYNSRFES VAWSASACHD GMGWLTIGIS GPDDGAVAVL KYNGIITETI KSWRKNILRT QESECTCVNG SCFTIMTDGP SDGLASYKIF KIEKGKVTKS IELNAPNSHY E E CSCYPDTG KVMCVC R DNW HGSNRPWVSF DQNLDYKIGY ICSGVFGDNP RPKDGTGSCG PVSADGANGV KGFSYKYGNG VWIGRTKSDS S R HGFEMIWD PNGWTETDSR FSMRQDVVAM TDRSG Y SGSF VQHPELTGLD CMRPCFWV E L IRGLPEENAI WTSGSIISFC GVNSDTVDWS WPDGAELPFT IDK

本領域技術人員熟知其他野生型NA亞型（例如N1、N2或N3等），可自公開的基因資料庫（例如GenBank）獲得其胺基酸序列。可經由比對其胺基酸序列與上文提供為例示的序列（序列編號：4）而辨識出上文所述之野生型NA蛋白的醣化位點及功能域（例如N端及穿膜域、莖柄域及催化域），以及位於催化域的活性位置／殘基等。

本揭示內容所述之NA變異體可衍生自任一種本領域技術人員所熟知的野生型NA亞型，例如N1、N2或N3等NA亞型。這類的NA變異體在一或多個活性位置及／或一或多個N-醣化修飾位點可具有突變（例如附加、缺失或胺基酸置換），致使相較於野生型NA而言，該變異體之NA活性有缺損。有關本揭示內容所述之NA變異體活性「有缺損」（defective）一詞，係指NA變異體的生物活性相較於野生型NA而言，發生實質性減損。舉例而言，利用相同的或實質相仿的分析方法，在相同的或實質相仿的條件下檢測時， NA變異體的活性低於野生型NA活性的30％（例如，少於20％、少於10％或少於5％）。在某些實施例中，本揭示內容所述之NA變異體的生物活性係使用常規分析方法，及／或本揭示內容所述之分析方法也無法偵測的程度。

可利用諸如2-(4-甲基傘形酮)-α-D-N-乙醯神經胺酸（2-(4-methylumbelliferyl)-α-D- N-acetylneuraminic acid，4-MUNANA）螢光分析法檢測（如下文實施例2所示）等本領域技術人員所熟知的測量方法來檢測NA的活性。其他測量NA活性的方法，包括訂定NA基質專一性的分析方法。舉例而言，可利用4-甲基傘型酮-N-乙醯神經胺酸（4-methylumbelliferyl-N-acetylneuraminic acid，4-Muα-NeuAc）、6’-唾液酸-N-乳糖胺（6’-sialyl-N-acetyllactosamine，6-SLN）、3’-唾液酸-N-乳糖胺（3’-sialyl-N-acetyllactosamine，3-SLN）、 3’-唾液乳糖（3’-sialyllactose，3-SL）及6’-唾液乳糖（6’-sialyllactose，6-SL）訂定NA基質專一性。NA酶切基質的動態變化，可用與N-乙醯甘露糖胺（N-acetylmannosamine，ManNAc）去氫酶及唾液酸醛縮酶作用來訂定（如下文實施例2所示）。

在某些實例中，本揭示內容所述之NA變異體於一或多個N-醣化修飾位點（例如本揭示內容所述之位點）具有一或多個突變，並可經由常規的方法及／或以下本揭示內容所述之方法辨識出該些突變。例示性的N-醣化修飾位點包含相當於序列編號：4之第44、72及219殘基位置（Asn殘基）。舉例而言，可缺失一或多個N-醣化修飾位點（例如第44、72及／或219殘基位置）。在其他實例中，可將一或多個這類的N-醣化修飾位點置換成其他胺基酸（例如Ala或Gly）。在某些實施例中，本揭示內容所述之NA變異體的數個醣化位點中（例如44、72或219），其一可置換。在其他實施例中，該NA變異體的數個醣化位點中，其二可置換（例如44+72、72+219或44+219）。在另一實施例中，三個醣化位點全部置換（例如44+72+219）。

以下為本揭示內容例示性的，具有一或多個醣化位點突變之NA變異體的胺基酸序列。相較於野生型NA，以粗體標示胺基酸置換位置：

NA 44-G（序列編號：8，以粗體標示第44殘基位置之置換）： MNPNQKIITI GSICMVVGII SLILQIGNII SIWISHSIQT GNQA HTGICN QGSITYKVVA 44 GQDSTSVILT GNSSLCPIRG WAIHSKDNGI RIGSKGDVFV IREPFISCSH LECRTFFLTQ GALLNDKHSR GTFKDRSPYR ALMSCPVGEA PSPYNSRFES VAWSASACHD GMGWLTIGIS GPDDGAVAVL KYNGIITETI KSWRKNILRT QESECTCVNG SCFTIMTDGP SDGLASYKIF KIEKGKVTKS IELNAPNSHY EECSCYPDTG KVMCVCRDNW HGSNRPWVSF DQNLDYKIGY ICSGVFGDNP RPKDGTGSCG PVSADGANGV KGFSYKYGNG VWIGRTKSDS SRHGFEMIWD PNGWTETDSR FSMRQDVVAM TDRSGYSGSF VQHPELTGLD CMRPCFWVEL IRGLPEENAI WTSGSIISFC GVNSDTVDWS WPDGAELPFT IDK

NA 72-G（序列編號：9，以粗體標示第72殘基位置之置換）： MNPNQKIITI GSICMVVGII SLILQIGNII SIWISHSIQT GNQNHTGICN QGSITYKVVAGQDSTSVILT G A SS LCPIRG WAIHSKDNGI RIGSKGDVFV IR EPFISCSH LECRTFFLTQ 72 GALLNDKHSR GTFKDRSPYR ALMSCPVGEA PSPYNSRFES VAWSASACHD GMGWLTIGIS GPDDGAVAVL KYNGIITETI KSWRKNILRT QESECTCVNG SCFTIMTDGP SDGLASYKIF KIEKGKVTKS IELNAPNSHY EECSCYPDTG KVMCVCRDNW HGSNRPWVSF DQNLDYKIGY ICSGVFGDNP RPKDGTGSCG PVSADGANGV KGFSYKYGNG VWIGRTKSDS SRHGFEMIWD PNGWTETDSR FSMRQDVVAM TDRSGYSGSF VQHPELTGLD CMRPCFWVEL IRGLPEENAI WTSGSIISFC GVNSDTVDWS WPDGAELPFT IDK

NA 44-72-G（序列編號：10，以粗體標示第44及72殘基位置之置換）： MNPNQKIITI GSICMVVGII SLILQIGNII SIWISHSIQT GNQ A HTGICN QGSITYKVVA 44GQDSTSVILT G A SS LCPIRG WAIHSKDNGI RIGSKGDVFV IR EPFISCSH LECRTFFLTQ 72 GALLNDKHSR GTFKDRSPYR ALMSCPVGEA PSPYNSRFES VAWSASACHD GMGWLTIGIS GPDDGAVAVL KYNGIITETI KSWRKNILRT QESECTCVNG SCFTIMTDGP SDGLASYKIF KIEKGKVTKS IELNAPNSHY EECSCYPDTG KVMCVCRDNW HGSNRPWVSF DQNLDYKIGY ICSGVFGDNP RPKDGTGSCG PVSADGANGV KGFSYKYGNG VWIGRTKSDS SRHGFEMIWD PNGWTETDSR FSMRQDVVAM TDRSGYSGSF VQHPELTGLD CMRPCFWVEL IRGLPEENAI WTSGSIISFC GVNSDTVDWS WPDGAELPFT IDK

NA 44-72-219-G（序列編號：11，以粗體標示第44、72及219殘基位置之置換）： MNPNQKIITI GSICMVVGII SLILQIGNII SIWISHSIQT GNQ A HTGICN QGSITYKVVA 44 GQDSTSVILT G A SSLCPIRG WAIHSKDNGI RIGSKGDVFV IREPFISCSH LECRTFFLTQ 72 GALLNDKHSR GTFKDRSPYR ALMSCPVGEA PSPYNSRFES VAWSASACHD GMGWLTIGIS GPDDGAVAVL KYNGIITETI KSWRKNILRT QESECTCV A G SCFTIMTDGP SDGLASYKIF 219 KIEKGKVTKS IELNAPNSHY EECSCYPDTG KVMCVCRDNW HGSNRPWVSF DQNLDYKIGY ICSGVFGDNP RPKDGTGSCG PVSADGANGV KGFSYKYGNG VWIGRTKSDS SRHGFEMIWD PNGWTETDSR FSMRQDVVAM TDRSGYSGSF VQHPELTGLD CMRPCFWVEL IRGLPEENAI WTSGSIISFC GVNSDTVDWS WPDGAELPFT IDK

或是或除此外，本揭示內容所述之NA變異體可於一或多個本領域技術人員所熟知及／或本揭示內容所述之活性位置，包含一或多個突變（例如缺失、附加或胺基酸置換）。例示性的活性位置，包括相當於序列編號：4之第102、135、262、277、352、386及409殘基位置。舉例而言，可置換NA變異體相當於序列編號：4之第102及／或135殘基位置成其他胺基酸（例如Ala或Gly）。

以下為二例示性之具有活性位置突變之NA變異體的胺基酸序列。相較於野生型NA，以粗體標示胺基酸置換位置：

WSN-NA AS1（序列編號：12，以粗體標示第102殘基位置之置換）： mnpnqkiiti gsicmvvgii slilqignii siwishsiqt gnqnhtgicn qgsitykvva gqdstsvilt gnsslcpirg waihskdngi rigskgdvfv i a epfiscsh lecrtffltq 102 gallndkhsr gtfkdrspyr almscpvgea pspynsrfes vawsasachd gmgwltigis gpddgavavl kyngiiteti kswrknilrt qesectcvng scftimtdgp sdglasykif kiekgkvtks ielnapnshy eecscypdtg kvmcvcrdnw hgsnrpwvsf dqnldykigy icsgvfgdnp rpkdgtgscg pvsadgangv kgfsykygng vwigrtksds srhgfemiwd pngwtetdsr fsmrqdvvam tdrsgysgsf vqhpeltgld cmrpcfwvel irglpeenai wtsgsiisfc gvnsdtvdws wpdgaelpft idk

WSN-NA AS2（序列編號：13，以粗體標示第135殘基位置之置換）： mnpnqkiiti gsicmvvgii slilqignii siwishsiqt gnqnhtgicn qgsitykvva gqdstsvilt gnsslcpirg waihskdngi rigskgdvfv irepfiscsh lecrtffltq gallndkhsr gtfk a rspyr almscpvgea pspynsrfes vawsasachd gmgwltigis 135 gpddgavavl kyngiiteti kswrknilrt qesectcvng scftimtdgp sdglasykif kiekgkvtks ielnapnshy eecscypdtg kvmcvcrdnw hgsnrpwvsf dqnldykigy icsgvfgdnp rpkdgtgscg pvsadgangv kgfsykygng vwigrtksds srhgfemiwd pngwtetdsr fsmrqdvvam tdrsgysgsf vqhpeltgld cmrpcfwvel irglpeenai wtsgsiisfc gvnsdtvdws wpdgaelpft idk

WSN-NA-G388A（序列編號：14，以粗體標示第388殘基位置之置換）： mnpnqkiiti gsicmvvgii slilqignii siwishsiqt gnqnhtgicn qgsitykvva gqdstsvilt gnsslcpirg waihskdngi rigskgdvfv irepfiscsh lecrtffltq gallndkhsr gtfkdrspyr almscpvgea pspynsrfes vawsasachd gmgwltigis gpddgavavl kyngiiteti kswrknilrt qesectcvng scftimtdgp sdglasykif kiekgkvtks ielnapnshy eecscypdtg kvmcvcrdnw hgsnrpwvsf dqnldykigy icsgvfgdnp rpkdgtgscg pvsadgangv kgfsykygng vwigrtksds srhgfemiwd pngwtetdsr fsmrqdvvam tdrsgys a sf vqhpeltgld cmrpcfwvel irglpeenai 388 wtsgsiisfc gvnsdtvdws wpdgaelpft idk

在某些實施例中，本揭示內容所述之NA變異體可包含一胺基酸序列，其與野生型NA蛋白（例如，序列編號：4）具有至少85％（例如90％、95％、97％、98％或99％）的序列相似度。這類的變異體可於本揭示內容所述之一或多個醣化位點及／或於一或多個活性位置包含一或多個突變。此外，該NA變異體可更包含一或多個胺基酸置換，舉例而言，於適當位點（例如相當於序列編號：4之第388殘基位置）置換保守胺基酸殘基。

在某些實施方式中，本揭示內容所述之NA變異體可為一種野生型NA之截斷形式，其具有莖柄域或其部分、催化域或其部分，或二者皆缺失。在其他實例中，該NA變異體可缺失一部分之莖柄域，及／或缺失一部分之催化域，致使其喪失一或多個活性位置。或是或除此外，該NA變異體可缺失一部分之莖柄域，及／或缺失一部分之催化域，致使其喪失一或多個醣化修飾位點。在一實施例中，該NA變異體可缺失全部的催化域（例如相當於序列編號：4之第75殘基位置至第453殘基位置的區域）。在另一實施例中，該NA變異體可缺失全部之催化域及莖柄域二者（例如相當於序列編號：4之第30殘基位置至第453殘基位置的區域）。

以下為本揭示內容所述之二例示性之NA變異體之截斷形式的胺基酸序列：

LAIV WSN-NA（序列編號：2；缺失全部之莖柄域及催化域二者）： mnpnqkiiti gsicmvvgii slilqignii

WSN-NA-CD（序列編號：15；缺失全部之催化域）： MNPNQKIITI GSICMVVGII SLILQIGNII SIWISHSIQT GNQNHTGICN QGSITYKVVA GQDSTSVILT GNSS

為製備本揭示內容所述之NA變異體，可選擇特定野生型NA亞型蛋白，可經由常規的胺基酸序列排列而找出其對應於上文標註之醣化位點及／或活性位置。可引進各種突變（例如置換胺基酸殘基或缺失）至野生型NA編碼序列中之一或多個醣化位點及／或活性位置。舉例而言，使用定點突變技術或CRISPR基因剪輯系統方法，在特定序列上產生突變。在另一實施例中，可引進終止密碼至NA蛋白編碼序列之特定位置，據以製備本揭示內容所述之NA變異體之截斷型。

可經由常規技術將任一種本揭示內容所述之NA變異體編碼序列嵌入一表現載體，如病毒載體，以製備包含該NA變異體的A型流行性感冒病毒顆粒。

III. 流行性感冒病毒顆粒

本揭示內容係有關於A型流行性感冒病毒（Influenza A virus，IAV）顆粒，其包含任一種本揭示內容所述之HA變異體及／或NA變異體。本揭示內容所述之IAV顆粒可為任一種A型流行性感冒病毒亞型，其可為活性（live，viable）減毒病毒或有缺損的病毒。

可藉由病毒表面的蛋白：血球凝集素（Hemagglutinin，HA）特徵化（characterized）A型流行性感冒病毒亞型，並以H數字標示，例如H1、H3和H5等。另外，可更藉由另一種病毒表面的蛋白：神經胺酸酶（Neuraminidase，NA）特徵化該亞型，以N數字標示，例如N1及N2等。如此，可用H及N數字指稱一種亞型，例如H1N1、H5N1及H5N2等。H1N1 IAV即為一株具有HA蛋白H1及NA蛋白N1的亞型。如在另一實施例中，H5N1 IAV即為一株具有HA蛋白H5及NA蛋白N1的亞型。

活性減毒病毒係指一種修飾過的（modified）的病毒（例如基因性修飾、化學性修飾或物理性修飾），藉此使其相較於野生型病毒呈現較少的毒力。一般而言，活性減毒病毒於適當的宿主中仍保有自我複製及組裝的能力。舉例而言，利用相同的或實質相仿的分析方法，在相同的或實質相仿的條件下檢測時，重組的活性減毒病毒毒力低於野生型病毒的50％（例如40％、30％、20％、10％或更少）。在某些實施例中，該活性減毒病毒可為完全失活，例如其毒力係使用常規分析方法或本揭示內容所述之分析方法也無法偵測。可肇因於引進一或多個突變至HA抗原或NA抗原而造成病毒毒力減低。舉例而言，相當於序列編號：1或序列編號：3之第142殘基位置（醣化位點142）之HA醣化位點上，或非必要地相當於序列編號：1或序列編號：3之第27殘基位置（醣化位點27）之HA醣化位點上的醣化修飾對HA的生物活性很重要，有助於使帶有這類HA的IAV具有致病性。因此，HA之醣化位點142或醣化位點27有醣化修飾的IAV，為安全上的考量，可能需要經減毒或滅活處理，該處理可經由常規方法（例如本領域技術人員所熟知之方法，及／或本揭示內容所述之方法）進行。一或多個突變在相當於序列編號：1或序列編號：3之第285、497及556殘基位置等醣化位點，從而消除一或多個其上的醣化修飾，有助於強化這類IAV顆粒的免疫力，其可肇因於有更多的HA保守區域暴露於宿主的免疫系統所造成。然而，在這些醣化位點上的突變對病毒複製率鮮少造成影響或甚至沒有影響。可參照下文實施例或Wu et al., PNAS 114(2)：280-285, 2017。

在其他實施方式中，本揭示內容所述之IAV病毒可為有缺損的病毒，在缺乏輔助病毒或對複製及／或病毒顆粒組裝必要的病毒組件下，其於適當的宿主中仍無法自我複製及／或組裝。舉例而言，包含本揭示內容所述之NA變異體的IAV顆粒缺乏神經胺酸酶酵素活性，該病毒顆粒至少在組裝上有缺損。包含這類NA變異體的IAV顆粒，可在有功能的NA存在下製備。這些IAV顆粒為製備活性減毒流行性感冒疫苗組合物之優越的候選物，因其在缺乏中和性抗體下，可活化IAV專一性CD8+T細胞，而可辨識各種流行性感冒病毒株及其亞型。可參照下方實施例或Wu et al., 2017。

可經由病毒複製率、病毒進入宿主，及／或個體（宿主）感染病毒後的存活率檢測病毒毒力。如實施例1中所述，可利用溶菌斑檢定分析法測定病毒複製率，其係測量病毒效價。可藉由感染分析法測定（如實施例1中所述）病毒進入宿主之情形。實施例1提供一例示性的宿主存活率分析結果。個體的實例包含人類（human）、小鼠（mouse）、豬（pig）、牛（cow）、大鼠（rat）、狗（dog）、豚鼠（guinea pig）、倉鼠（hamster）、兔（rabbit）、貓（cat）、山羊（goat）、綿羊（sheep）、猴子（monkey）、馬（horse）或鳥（bird）。

可藉由本領域技術人員所熟知之方法來製備活性減毒病毒，諸如於組織培養或雞蛋中將病毒過繼至數代而找出毒力較低的株系。亦可藉由化學或物理處理方式來製備活性減毒病毒。

在某些實例中，可依照常規步驟，並利用適當的宿主細胞株（例如HEK293T、MDCK、A549、CHO或Vero細胞）來製備本揭示內容所述之IAV顆粒。可將一或多個譯碼病毒組件之表現載體（例如病毒載體）引進至適當的宿主細胞，在適當的條件下培養據以製備IAV顆粒，其中該病毒組件包括一或多個本揭示內容所述之HA及／或NA變異體等。必要時，可利用輔助病毒來協助IAV顆粒的複製及／或組裝。或者，可利用宿主細胞株製備一或多個必要病毒組件（essential viral components）以利病毒基因體複製及／或病毒顆粒組裝。可藉由常規方法收集細胞培養之上清液中的病毒顆粒。依此取得的病毒顆粒可藉由本領域技術人員所熟知之方法或本揭示內容所述之方法，以適當宿主（例如宿主細胞或無特定病原體（Specific Pathogen-Free，SPF）的雞蛋）進一步擴增。

在某些實施例中，可進一步利用本領域技術人員所熟知之化學或物理方法對IAV顆粒進行減毒處理。舉例而言，可利用化學處理方式將病毒滅活，包含但不限於甲醛（formaldehyde）、β-丙內酯（betapropiolactone，BPL）、二元乙烯亞胺（binary ethylenimine，BEI）、硫柳汞（merthiolate）、戊二醛（glutaraldehyde）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate）或其組合。或是或除此外，可利用熱力（heat）、UV照射（UV irradiation）、極端pH值（extreme pH），和冷凍-解凍循環（freeze-thaw cycles）或本領域技術人員所熟知之其他方法將病毒滅活。

可選擇性地將重組IAV懸浮在稀釋液中以利後續使用。例示性之稀釋液包含：水（water）、生理食鹽水（saline）、葡萄糖（dextrose）、丙醇（propanol）、乙醇（ethanol）、甘露醇（mannitol）、山梨糖醇（sorbitol）、乳糖（lactose）、澱粉（starch）、乳糖醇（lactitol）、麥芽糊精（maltodextrin）、甘油（glycerol）、木糖醇（xylitol）、海藻糖（trehalose）、礦物油（mineral oil）、植物油（vegetable oil）、氯化鈉（sodium chloride）、碳酸鈉（sodium carbonate）、碳酸氫鈉（sodium bicarbonate）、氯化鉀（potassium chloride）、磷酸氫鈣（dicalcium phosphate）、碳酸鈣（calcium carbonate）、硫酸鈣二水合物（calcium sulphate dehydrate）和碳酸鎂（magnesium carbonate）。

免疫組合物

在某些態樣中，本揭示內容中提供一種免疫組合物（例如疫苗），其係包含：(i)任一種本揭示內容所述之重組IAV病毒、HA及／或NA變異體，以及(ii)一藥學上可接受的載體，其中該載體可為一佐劑。在本揭示內容中，「免疫組合物」（immunogenic composition）一詞，可指當接種宿主後，具有激發該宿主免疫反應之組合物，其能完全地或部分地保護該宿主對抗一種疾病（例如IAV感染），或減少其症狀（例如發燒、充血及／或頭痛）。在某些實施方式中，本揭示內容所述之免疫組合物包含本揭示內容所述之IAV顆粒。在其他實施方式中，本揭示內容所述之免疫組合物包含任一種本揭示內容所述之HA變異體及／或NA變異體。這類的免疫組合物可作為預防性或治療性藥劑，以治療特定病狀。

除非本說明書另有定義，否則在本揭示內容中，「抗原」（antigen）或「抗原性介質」（antigenic agent）一詞是指任一種在導入免疫健全的人類或動物體後，可以激發體液免疫或細胞免疫反應的介質。抗原可為純物質、混合物、特定材料或活的、減毒的病毒。例示性之適當抗原包括：蛋白（protein）、醣蛋白（glycoprotein）、多肽（polypeptide）和病毒（virus）。

可藉由常規步驟來偵測由本揭示內容所述之免疫組合物所激發的免疫反應。舉例而言，可利用抗體-圖譜相關技術分析（例如酵素免疫分析法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、酵素免疫分析（Enzyme Immunoassay，EIA）、放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA））、毒殺性T淋巴細胞活性分析（cytotoxic T-lymphocyte assays）及／或本領域技術人員所熟知之其他方法來決定CD8+T細胞受到激發對抗抗原的程度，進而檢測受到激發的免疫反應。

可經由常規方法來製備免疫組合物。例示性之藥學上可接受之載體包含：生理食鹽水、碳酸氫鈉溶液及／或佐劑。可依藥物投予模式及路徑，以及正規的藥學步驟等因素選擇載體。適當的藥學上之載體及稀釋液，及藥學上使用藥物的必要性，詳述在Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa (1990)。該組合物亦包含可在活體內傳輸藥物之聚合物。可參照Audran R. et al. Vaccine 21:1250-5, 2003; and Denis-Mize et al. Cell Immunol., 225:12-20, 2003。

在本揭示內容中之「佐劑」（adjuvant）一詞，是指任一種物質或物質的混合物，其可強化（enhances）、增加（increases）、上調（upwardly modulates）或多樣化（diversifies）對抗一抗原之免疫反應（例如體液免疫或細胞免疫反應）。舉例而言，佐劑可包括弗氏完全佐劑（complete Freund’s adjuvant ，FA）、弗氏不完全佐劑（incomplete Freund’s adjuvant ，IFA）、礦物凝膠（mineral gel）（例如氫氧化鋁（aluminum hydroxide）或磷化鋁（aluminum phosphate））、表面活性物質（surface active substance，例如溶血卵磷脂）、復合多元醇（pluronic polyol）、多聚陰離子（polyanion）、胜肽（peptide）、油乳化劑（oil emulsion）、烴乳化劑（hydrocarbon emulsion）、鑰孔血藍素（keyhole limpet hemocyanin）、硫脂環糊精（sulfolipo-cyclodextrin，SL-CD）及皂素（例如Quil A，奎爾A）。在其他實施例中，必要時，佐劑可為霍亂毒素（cholera toxin）、大腸桿菌熱不穩定腸毒素（heat-labile enterotoxin，LT）、脂質體（liposome）、免疫-激發複合物（immune-stimulating complex，ISCOM），或免疫激發序列寡去氧核苷酸（immunostimulatory sequences oligodeoxynucleotides，ISS-ODN）。

如本領域技術人員所熟知的，免疫組合物可更包含pH調節物，其可為醋酸（acetic acid）、硼酸（boric acid）、碳酸（carbonic acid）、鉻酸（chromic acid）、檸檬酸（citric acid）、乳酸（lactic acid）、鹽酸（hydrochloric acid）、酒石酸（tartaric acid）、丙酸（propionic acid）、蘋果酸（malic acid）、磷酸（phosphoric acid）、氫氧化銨（ammonium hydroxide）、碳酸銨（ammonium carbonate）、乙胺（ethylamine）、二甲胺（dimethylamine）、甘氨酸（giycine）、甲胺（methylamine）、三甲胺（trimethylamine）、二乙醇胺（diethanolamine）、碳酸氫鈉（sodium bicarbonate）、硼酸鈉（sodium borate）、氫氧化鈉（sodium hydroxide）、肼（hydrazine）、單乙醇胺（monoethanolamine）、氫氧化鉀（potassium hydroxide）、磷酸鈉（sodium phosphate）、三乙醇胺（trolamine），或其組合。

在某些實施例中，本揭示內容之免疫組合物可更包含防腐劑。適當的例示性防腐劑包括氯化十六烷吡啶（cetylpyridinium chloride）、苯扎氯銨（benzalkonium chloride）、苯甲醇（benzyl alcohol）、氯己定（chlorhexidine）、咪唑烷基脲（imidazolidinyl urea）、苯酚（phenol）、山梨酸鉀（potassium sorbate）、苯甲酸（benzoic acid）、溴硝丙二醇（bronopol）、氯甲酚（chlorocresol）、對羥基苯甲酸酯（paraben esters）、苯氧乙醇（phenoxyethanol）、山梨酸（sorbic acid）、alpha-生育酚（alpha-tocophernol）、抗壞血酸（ascorbic acid）、抗壞血酸棕櫚酸酯（ascorbyl palmitate）、丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole）、丁基化羥基甲苯（butylated hydroxytoluene）、抗壞血酸鈉（sodium ascorbate）、焦亞硫酸鈉（sodium metabisulphite）、檸檬酸（citric acid）、乙二胺四乙酸（edetic acid）及其組合。

本領域技術人員所熟知之製備免疫組合物（如疫苗）的方法，如例示於U.S. Patents 4,601,903、4,599,231、4,599,230及4,596,792等文獻。可將疫苗製備成注射針劑（injectables），如水溶液（liquid solutions）或乳化劑（emulsions）。本揭示內容之重組病毒或HA胜肽可選擇性地與生理上可接受及可相容的賦形劑混和。賦形劑包括水（water）、生理食鹽水（saline）、葡萄糖（dextrose）、甘油（glycerol）、乙醇（ethanol）及其組合。疫苗可包含少量添加物，例如潤濕劑（wetting agents）或乳化劑（emulsifying agents），pH緩衝劑（pH buffering agents），或可強化疫苗效力的佐劑。用以使免疫組合物產生佐劑功效的方法包括，使用諸如氫氧化鋁（aluminum hydroxide）或磷酸鹽（礬）（phosphate）（alum）等藥劑，以生理食鹽水配製成一般使用濃度0.05至0.1％。

可將本揭示內容所述之藥學組合物（pharmaceutical compositions）配製成不同劑型，以用於各種常規投藥路徑。舉例而言，可製成膠囊（capsule）、膠封（gel seal）或錠劑（seal）以利口服。膠囊可包含任何常規藥學上可接受的物質諸如明膠（gelatin）或纖維素（cellulose）等。可藉由組合物之壓縮混合物（compressing mixtures of the composition）、固型載體（solid carrier）及滑潤劑（lubricant）等常規製程來配製錠劑。例示性之固型載體包括澱粉（starch）及糖膨潤土（sugar bentonite）等。可藉由硬殼錠劑（hard shell tablet）或包含粘合劑（binder，如乳糖（lactose）或甘露醇（mannitol）、常規填料（conventional filler）及制錠藥劑（tableting agent）等）的膠囊形式投予該組合物。可經由非口服路徑投予該藥學組合物。例示性之非口服劑型包括水溶液（aqueous solutions）、等滲性生理食鹽水（isotonic saline）或含5％葡萄糖之活性劑（5% glucose of the active agent）或其他常見的藥學上可接受的賦形劑。可利用環糊精（cyclodextrins）或其他本領域技術人員所熟知的增溶劑作為藥學上的賦形劑，藉以傳輸治療藥劑。

針劑組合物（injectable compositions）可包含各樣的載體，諸如植物油（vegetable oils）、二甲基乙醯胺（dimethylactamide）、二甲基甲醯胺（dimethyformamide）、乳酸乙酯（ethyl lactate）、碳酸乙酯（ethyl carbonate）、肉荳蔻酸異丙酯（isopropyl myristate）、乙醇（ethanol），及多元醇（polyols）（甘油（glycerol）、丙二醇（propylene glycol）、液態聚乙二醇（liquid polyethylene glycol）及其類似物）等。就靜脈注射而言，可藉由點滴方式投予水溶性抗體，其同時灌注包含IAV顆粒或HA及／或NA變異體及生理上可接受的賦形劑之藥學組合物。生理上可接受的賦形劑可包括例如5％葡萄糖溶液（5％ dextrose）、0.9％生理食鹽水（0.9％ saline）、林格氏注射液（Ringer’s solution）或其他適當的賦形劑。可將肌肉內注射針劑（例如抗體之無菌可溶鹽類形式）溶解並投予在諸如注射用水溶液、0.9％生理食鹽水或5％葡萄糖溶液等藥學上的賦形劑中。

治療上的應用

可利用任一種本揭示內容所述之免疫組合物來治療流行性感冒病毒感染或減少感染風險。不囿於學說理論，對抗相應IAV病毒的IAV專一性或HA/NA專一性CD8+T細胞反應，可部分調介本發明的方法所提供的保護力，因而提供個體跨株系，及／或跨亞型保護力。

為實踐本揭示內容的實施方式，可經由適當路徑投予一有效劑量（an effective amount）的本揭示內容所述之免疫組合物至一有需要治療之個體。接受本揭示內容所述之方法治療之個體可為A型流行性感冒病毒感染、疑似A型流行性感冒病毒感染、或有A型流行性感冒病毒感染之風險的哺乳動物（例如人類、小鼠、豬、牛、大鼠、狗、豚鼠、倉鼠、兔、貓、山羊、綿羊、猴子、馬或鳥）。

本揭示內容中「有效劑量」（an effective amount）一詞，係指無論單獨使用或合併一或多種活性劑使用，可授予個體療效之每種活性劑所需劑量。有效劑量各自不同，如本領域技術人員所認可的，視投予路徑、賦形劑之使用，及同時使用其他活性劑等因素決定。投予劑量取決於擬受治療的個體而定，包括例如該個體免疫系統合成抗體的能力，及視需要產生細胞調介之免疫反應等因素。確切的活性成分注射劑量視從業人員的專業判斷決定。然而，適當的劑量範圍對本領域技術人員是容易確定的，且本揭示內容所述之胜肽的使用量可介於微克間。含初始的注射劑量及助推劑量（booster doses）之適當療程亦各自不同，但可包括初始注射後，再跟進後續的注射。疫苗的劑量亦取決於投予路徑及個體大小而有所不同。

可將本揭示內容所述之免疫組合物投予至一個體（例如人類），以減少該個體受到流行性感冒病毒感染的風險（預防性治療），或治療流行性感冒病毒感染，其中該病毒感染可由A型流行性感冒病毒（例如H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H5N2、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2或H10N7）所引起。在某些實施方式中，可利用包含一種衍生自特殊的流行性感冒病毒亞型的IAV，或衍生自特殊病毒類型之HA及／或NA變異體的免疫組合物，來治療或減少由特定的流行性感冒病毒亞型所引起的感染風險。在本揭示內容中「治療」（treating）一詞，係指對一個體運用或投予一種包含一或多種活性劑的組合物，其中該個體有流行性感冒病毒感染、有感染症狀，或有感染之傾向；其目的在於治癒（cure）、瘉合（heal）、緩和（alleviate）、緩解（relieve）、改變（alter）、補救（remedy）、改善（ameliorate）、改進（improve），或影響（affect）感染情形、感染症狀，或有感染之傾向。

在某些實施方式中，接受本揭示內容所述之方法進行治療的個體，可為經由常規的醫療行為確診為流行性感冒病毒感染的人類病患。在其他實施方式中，該個體可為呈現一或多種流行性感冒病毒感染症狀的人類病患，例如，發燒（fever）、肌肉痠痛（aching muscles）、畏寒（chills）及盜汗（sweats）、頭痛（headache）、咳嗽（cough）、倦怠（fatigue）及虛弱（weakness）、鼻塞（nasal congestion），及／或喉嚨痛（sore throat）。這類的人類病患可能暴露於IAV。

在某些實例中，人類個體可能有感染的風險，舉例而言，該個體可為免疫功能低下（immunocompromised）（例如受到HIV/AIDS感染者（suffer from HIV/AIDS）、哮喘（asthma）、慢性心臟疾病（chronic heart disease）、慢性心臟或肺部疾病（chronic heart or lung disease））、可為年長者（例如65歲以上）、可為幼兒或嬰兒（例如少於5歲），或與已感染者共事／共同生活。

可經由適當的路徑對一有需要治療之個體投予任一種本揭示內容中所述之免疫組合物，舉例來說，非口服投予（parenterally）、皮下注射（injection subcutaneously）或皮下植入（implantation subcutaneously）、肌肉注射（intramuscularly）、脊髓腔內注射（intrathecally）、腹膜内注射（intraperitoneally）、皮內注射（intracuteanously）、胸骨注射（intrasternally）、關節內注射（intraarticularlly）、顱內注射（intracranially）、病灶內注射（intralesionally）、直腸內注射（intrarectually）、陰道內注射（intravaginally）、鼻内注射（intranasally）、腸胃注射（intragastically）、氣管內注射（intratracheally），或肺內注射（intrapulmonarily）等投予路徑。或者，亦可經由其他方式投予任一種本揭示內容中所述之免疫組合物，包括栓劑（suppositories）、口服劑型（oral formulations）、腸內投予（enteral）、鼻腔投予（nasal）、局部投予（topical）或經黏膜投予（transmucosal）等。就栓劑、粘合劑及載體部分，可包括例如聚亞烷基二醇（polyalkalene glycols）或三酸甘油酯（triglycerides）等。口服劑型可包括常用成分，例如醫藥級糖精（pharmaceutical grades of saccharine）、纖維素（cellulose）、碳酸鎂（magnesium carbonate）及其類似物。這類組合物係以水溶液（solutions）、懸浮液（suspensions）、錠劑（tablets）、丸劑（pills）、膠囊（capsules）、長效劑型（sustained release formulations）或粉劑（powders）等形式呈現。在某些實例中，可以鼻腔投予的方式將本揭示內容所述之免疫組合物投予至個體體內，據以作為萬用流行性感冒疫苗（例如跨種族（cross-species）、跨株系（cross-strain），及／或跨世系（cross lineage）專一性之流行性感冒疫苗）。

如上文所述的，所需劑量取決於投予路徑的選擇（the route of administration）；劑型本質（the nature of the formulation）；個體病症本質（the nature of the subject's illness）；個體種族（species）、體型大小（size）、體重（weight）、表面積（surface area）、年齡（age）及性別（sex）；與其他藥物併用（other drugs being administered）；以及從業人員的專業判斷（the judgment of the practitioner）等。適當的劑量範圍介於每公斤0.01毫克至100.0毫克。亦可預期大範圍地調整所需劑量，其視多樣化的組合物及各樣的投予路徑所致不同效力而定。舉例而言，相較於靜脈注射，預期口服需要較高的劑量。本領域技術人員可完全理解經由常規經驗法則調整劑量變化。尤其對口服藥而言，封裝組合物至適當的載體（例如聚合物微粒或植入式裝置）中可增加藥物傳輸效率。

雖然用以界定本揭示內容較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」（about）一詞通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10％、5％、1％或0.5％之內。或者，在此使用之「約」（about）一詞，代表實際數值落在平均值的可接受標準差之內，視本揭示內容所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解本揭示內容所述之所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除另有指示外，本揭示內容與附隨的申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少，應將這些數值參數理解為，所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

本領域技術人員可基於實驗動物模式取得的劑量換算成任一種本揭示內容所述之免疫組合物的人體等效劑量（human equivalent dose，HED）。舉例而言，一種包含可表現HA變異體之重組IAV的免疫組合物，對於人類的有效HED，可等同每劑約8.1奈克至1.62微克的HA；較佳地，可等同每劑約81奈克至810奈克。在一較佳實施例中，本發明重組IAV的有效HED為每劑約468奈克的HA。

就投藥時程而言，在預防性療程中或治療疾病時，可對一個體投予至少2次（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多次）本揭示內容所述之免疫組合物。例如，可對一個體投予2至10次疫苗，其間隔為數天至數年。

可利用測量免疫反應程度的方法（如上文及以下實施例所述），於活體外（in vitro）及活體內（in vivo）來評估本揭示內容所述之免疫組合物的功效。

對HA或NA變異體具有專一性之抗體

本揭示內容亦提供可專一結合至任一種本揭示內容所述之HA或NA變異體的抗體。這類可結合至本揭示內容所述之HA或NA變異體的抗體，相較於其結合至野生型HA或NA，具有較強的親和力（affinity）、總結合力（avidity）、更輕易地結合（more readily），及／或持續更久（with greater duration）。在某些實施例中，一種「專一結合至」（specifically binds）HA或NA變異體之抗體，當利用常規分析方法檢測時，可能不會結合至野生型HA或NA（例如無法偵測其結合活性）。

可經由常規方法來製備本揭示內容所述之抗體。舉例而言，可投予任一種本揭示內容所述之HA或NA變異體至適當的動物宿主（例如小鼠、兔或綿羊），以製備可結合至HA或NA變異體之抗體。多株抗體（polyclonal antibodies），或謂抗體分子混群（heterogeneous populations of antibody molecules）可呈現在經免疫後的個體的血清中。可藉由常規融合瘤技術（例如參照Kohler et al. (1975) Nature 256, 495；Kohler et al. (1976) Eur. J. Immunol. 6, 511；Kohler et al. (1976) Eur J Immunol 6, 292；及Hammerling et al. (1981) Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.）製備對抗本揭示內容所述之胜肽變異體的單株抗體（monoclonal antibodies），或謂均質性抗體群（homogeneous populations of antibodies）。具體而言，可自任一種可持續培養的細胞株生產抗體分子之技術製備單株抗體，諸如在Kohler et al. (1975) Nature 256, 495及U.S. Patent No. 4,376,110；the human B-cell hybridoma technique (Kosbor et al. (1983) Immunol Today 4, 72；Cole et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026，及the EBV-hybridoma technique（Cole et al. (1983) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）等文獻中所述。這類抗體可為任一種免疫球蛋白類型（class），包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD，及其任一亞型。可在活體外或活體內培養用以製備本發明單株抗體的融合瘤。活體內可生產高效價的單株抗體的能力，使其成為特別有用的單株抗體生產方法。

以下闡述一種可用以製備單株抗體的方法。每週以皮下、肌肉及／或鼻腔投予方式對一個體（例如小鼠或兔）投予任一種本揭示內容所述之免疫組合物，連續投予2至5週。在最後一次投予後，取出脾臟細胞及周邊淋巴結。可於免疫後定期收集血液樣本，並離心分離血清。可利用任一種適當的方法（例如ELISA或RIA）測量血清中的抗體效價。之後，可對那些對該免疫組合物產生高抗體效價的實驗動物進行最後一劑投予。可自免疫後的實驗動物之脾臟細胞及周邊淋巴結或其類似物而製備生產抗體的細胞。在製備抗體生產細胞時，最好能盡量清除組織殘骸及紅血球。可用市面上有紅血球清除劑來達成此目的。或者，可製備及使用氯化銨（ammonium chloride）及三羥基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）緩衝液。可立即將不死的細胞株（如骨髓瘤細胞株）與該預備完成的抗體生產細胞融合，以製備融合瘤細胞，該融合瘤細胞當生產抗體時能持續半永久地增殖。一般可用的實驗動物細胞株，可用來自小鼠的細胞株。本揭示內容中所需使用的較佳細胞株，無法存活於HAT選擇性培養液（包含次黃嘌呤（hypoxanthine）、胸苷（thymidine）及氨喋呤（aminopterin））；唯有當該細胞株與生產抗體的細胞融合後，方可存活該HAT選擇性培養液中。例示性之骨髓瘤細胞可包括，小鼠骨髓瘤細胞株（例如骨髓瘤FO細胞）及人類骨髓瘤細胞株（例如Karpas 707H）。可將脾臟細胞或淋巴結細胞與市面上有的骨髓瘤細胞混和在細胞融合促進劑中進行細胞融合，其中該促進劑可為平均分子量介於200至20,000道爾頓（daltons）的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）。或者，亦可利用市面上利用電穿孔等電刺激方式的細胞融合裝置進行細胞融合。融合完成後，可稀釋所得到的細胞並在HAT培養液中培養。

可自融合細胞篩選特定的融合瘤。融合細胞可於HAT培養液中存活並形成群落（colonies）。可收集每個培養孔內的上清液，並檢測其存在或不存在對抗免疫組合物的抗體效價。可利用諸如ELISA、EIA或RIA等方法來檢測確認。一旦確認呈現抗體陽性的培養孔，可在HT培養液（不包含氨喋呤）中培養其內的細胞。經一段時間培養後，需再度確認上清液中的抗體效價。選殖最後篩選出的細胞，以獲取單個細胞。篩選對特定胜肽呈現高專一性的選植株，並增殖到一定程度以建立融合瘤。

在某些實施例中，可篩選出用以製備對抗特定HA變異體的單株抗體的融合瘤。可經由任一種已知方法分離或製備所獲得的單株抗體。舉例而言，可自培養融合瘤的低血清濃度上清液中製備該抗體。或者，可注射融合瘤至實驗動物腹腔內，收集該動物產生的腹水用以製備抗體。可採用親和力管柱層析法（affinity column chromatography）、凝膠過濾層析法（gel filtration chromatography）、離子交換層析法（ion exchange chromatography）或其類似方法，進行純化或分離抗體。可適當地選用或與其他方法並用任一種這些已知方法。

可分析抗體對HA或NA變異體或野生型HA或NA抗原之結合能力。可分離該些可專一結合至變異體的抗體。

或者，可藉由常規操作自抗體庫篩選可專一結合至本揭示內容所述之HA或NA變異體的抗體。在某些實施例中，可先以野生型HA或NA抗原來篩選抗體庫，以去除可結合至該野生型抗原之抗體。之後利用所獲得之子抗體庫來確認可專一結合至HA或NA變異體之抗體。

本揭示內容所述之抗體可對不同IAV亞型展現結合親和力及專一性。可用這些抗體來偵測免疫化之個體體內的胜肽變異體，或是以免疫療法形式投予至個體體內。

上文就實施方式提出了說明性的描述，應理解為僅作為例示性的作用，本領域技術人員能對其進行各樣的調整。上文的說明書、實施例及實驗數據對本揭示內容作為例示性的實施方式中的結構及使用方式做了完整的描述。儘管上文已描述本揭示內容中各樣的實施方式有一定程度的特性，或參照一或多個各別的實施方式，本領域技術人員仍能在不悖離本揭示內容精神及範圍情形下，對已揭示的實施方式進行眾多修改。

在不需過度解讀的情形下，本領域技術人員當可在閱讀了本揭示內容後，完整利用並實踐本發明。因此，下文具體實施方式應解讀為僅作為例示性的作用，而不應將其視為對本揭示內容之可能的其他實施方式之限制。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本揭示內容的一部分。

實施例1：血球凝集素（Hemagglutinin，HA）之醣化修飾對免疫力的影響

材料與方法

細胞株及病毒株

將馬丁–達比犬類腎臟細胞（Madin-Darby canine kidney cells，MDCK）及人類胚胎腎臟細胞（human embryonic kidney cells，HEK293T）培養在DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）培養液（Invitrogen, Rockville, MD）。將人類肺泡基底上皮腺癌細胞株A549培養在F-12K培養液（Invitrogen, Rockville, MD）；將禽類肝細胞癌細胞株LMH培養在Waymouth’s MB 752/1培養液（Invitrogen, Rockville, MD）。所有的培養液皆添加10％經熱滅活後的胎牛血清（Thermo Scientiﬁc）及抗生素（青黴素G每毫升100單位及鏈黴素每毫升100克）。本研究使用A型流行性感冒病毒株A/WSN/33。

製備重組病毒

利用RT-PCR技術擴增8個A/WSN/33病毒基因體片段。利用擬定的序列組（Sequon）N-X-S/T以改造（將不同胺基酸改成N）或刪除（將N改成A）HA基因體中的醣化位點。野生型HA的胺基酸序列為如上文提供的序列編號：3。285-497-556-G HA的胺基酸序列為如上文提供的序列編號：1。142-G HA及142-285-497-556-G HA的胺基酸序列提供如下：

142-G HA（序列編號：16，以粗體標示第142殘基位置之置換）： MKAFVLVLLY AFVATDADTI CIGYHANNST DTVDTIFEKN VAVTHSVNLL EDRHNGKLCK LKGIAPLQLG KCNITGWLLG NPECDSLLPA RSWSYIVETP NSENGACYPG DFIDYEELRE QLSSVSSLER FEIFPKESSW P A HTFNGVTV SCSHRGKSSF YRNLLWLTKK GDSYPKLTNS 142 YVNNKGKEVL VLWGVHHPSS SDEQQSLYSN GNAYVSVASS NYNRRFTPEI AARPKVKDQH GRMNYYWTLL EPGDTIIFEA TGNLIAPWYA FALSRGFESG IITSNASMHE CNTKCQTPQG SINSNLPFQN IHPVTIGECP KYVRSTKLRM VTGLRNIPSI QYRGLFGAIA GFIEGGWTGM IDGWYGYHHQ NEQGSGYAAD QKSTQNAINR ITNKVNSVIE KMNTQFTAVG KEFNNLEKRM ENLNKKVDDG FLDIWTYNAE LLVLLENERT LDFHDLNVKN LYEKVKSQLK NNAKEIGNGC FEFYHKCDNE CMESVRNGTY DYPKYSEESK LNREKIDGVK LESMGVYQIL AIYSTVASSL VLLVSLGAIS FWMCSNGSLQ CRICI

142-G HA（序列編號：17，以粗體標示第142、285、497及556殘基位置之置換）： MKAFVLVLLY AFVATDADTI CIGYHANNST DTVDTIFEKN VAVTHSVNLL EDRHNGKLCK LKGIAPLQLG KCNITGWLLG NPECDSLLPA RSWSYIVETP NSENGACYPG DFIDYEELRE QLSSVSSLER FEIFPKESSW P A HTFNGVTV SCSHRGKSSF YRNLLWLTKK GDSYPKLTNS 142 YVNNKGKEVL VLWGVHHPSS SDEQQSLYSN GNAYVSVASS NYNRRFTPEI AARPKVKDQH GRMNYYWTLL EPGDTIIFEA TGNLIAPWYA FALSRGFESG IITS A ASMHE CNTKCQTPQG 285 SINSNLPFQN IHPVTIGECP KYVRSTKLRM VTGLRNIPSI QYRGLFGAIA GFIEGGWTGM IDGWYGYHHQ NEQGSGYAAD QKSTQNAINR ITNKVNSVIE KMNTQFTAVG KEFNNLEKRM ENLNKKVDDG FLDIWTYNAE LLVLLENERT LDFHDLNVKN LYEKVKSQLK NNAKEIGNGC FEFYHKCDNE CMESVR A GTY DYPKYSEESK LNREKIDGVK LESMGVYQIL AIYSTVASSL 497 VLLVSLGAIS FWMCS A GSLQ CRICI 556

相似於製備pHW2000的方法，將病毒cDNAs插入至含有pol I及CMV啟動子的pcDNA3.1。以常規方法將8個質體共轉染至MDCK/293T細胞中，以製備重組病毒。收集培養細胞的上清液並測量病毒效價，隨後保存於-80°C備用。

抗體

自Sino Biological購得抗-HA的小鼠單株抗體。自Millipore購得抗-肌動蛋白的小鼠單株抗體。自Santa Cruz Biotechnology購得抗-M1的山羊多株抗體及抗-6×His的小鼠單株抗體。自ABcam購得抗-INF gamma的大鼠單株抗體抗體。自Aviva Systems Biology購得抗-顆粒酶B的兔多株抗體。所有市面上的抗體皆經廠商及發明人團隊以西方墨點法驗證其專一性。

病毒複製率

利用12孔培養盤培養單層MDCK、A549及LMH細胞，以1倍磷酸緩衝生理食鹽水（Phosphate-Buffered Saline，PBS）沖洗二次。在包含每毫升0.1（LMH則為0.01）克之L-（甲苯磺醯-2-苯乙醇）氯甲基酮（L-(tosylamido-2- phenylethyl) chloromethyl ketone，TPCK）-胰蛋白酶（Pierce）的無血清培養液中，以修飾過的流行性感冒病毒變異株感染細胞，感染病毒量MOI分別為0.01、0.1及1，之後於37°C下培養1小時；隨後以1倍PBS 沖洗該細胞二次後，再以完全培養液培養。在特定時間點收集上清液，並以溶菌斑檢定分析法測定MDCK細胞中的病毒效價。

溶菌斑檢定分析

利用6孔培養盤培養的單層MDCK細胞，以1倍PBS沖洗二次。之後在包含每毫升0.5微克之TPCK-胰蛋白酶的無血清培養液中，以10倍序列稀釋之病毒感染細胞，並於37°C下培養1小時。之後，沖洗該細胞，並以包含0.5％瓊脂糖（Lonza）及每毫升0.5微克之TPCK-胰蛋白酶的MEM培養液覆蓋。三天後，以10％甲醛固定該細胞，並以0.1％結晶紫溶液進行染色。

蛋白表現及純化

利用聚乙烯亞胺將用以編碼分泌型HA的質體轉染至HEK293T細胞株中，並將該細胞培養於包含0.5％胎牛血清之Freestyle 293表現培養液（Invitrogen）中。於轉染後72小時收集上清液，並離心除去雜質。依先前所述的鎳離子螯合層析法純化HA蛋白。利用Millipore Amicon超濾管柱濃縮純化後的蛋白，並將該蛋白裝載至預先以PBS平衡過的Superdex-200凝膠過濾管柱（GE），並收集不同的餾分（fractions）。

醣類陣列

於25°C，濕度60％下，使用機械手臂（SMP2B，TeleChem International）將戊胺尾端（pentyl amine tail）的醣類（預先於實驗室內以NHS活化）列印（AD3200，BioDot）至載玻片（Nexterion H）上，以製備醣類陣列。自底部到頂部每格內有水平式3重複排列，將每升100微莫耳之醣類1至29及30至39的溶液點滿在Nexterion H載玻片上，而後利用真空法乾燥。利用GenePix Pro 6.0（Molecular Devices）軟體分析所得到的影像，以利定位及定量格子內每點的螢光強度。

病毒結合力分析

利用含神經胺酸酶抑制劑奧司他韋羧酸鹽（Oseltamivir carboxylate）（每升10 微莫耳）的緩衝液滅活相同量的病毒。將懸浮於奧司他韋羧酸鹽之失活病毒覆蓋至醣類陣列載玻片上，並於室溫下作用30分鐘。隨後依序以PBS-0.05％ Tween、PBS及去離子水為一循環，漂洗3次該載玻片。利用抗-H1抗體偵測有結合的病毒。於室溫下溫和搖晃該載玻片60分鐘。重複清洗步驟完成後，以經標記的二級抗體來偵測病毒之結合。

感染力分析

依使用操作說明，利用PEG病毒沉澱套組（BioVision）來濃縮病毒，並以西方墨點法分析病毒量。在包含每毫升0.5微克之TPCK-胰蛋白酶的無血清F-12K培養液中，以相同量之變異病毒株感染A549細胞，之後於37°C下作用30分鐘。隨後，清洗該細胞二次，並覆蓋於含10％經熱滅活後的胎牛血清（Thermo Scientiﬁc）及抗生素（青黴素G每毫升100單位及鏈黴素每毫升100克）的F-12K培養液中。於10 hpi，收集全細胞溶胞物並進行分析。在含有每毫升0.5微克之TPCK-胰蛋白酶的無血清培養液中，以變異病毒株感染MDCK細胞，並於37°C下作用30分鐘。隨後，進行溶菌斑檢定分析。

血球凝集試驗分析

將相同量的IAV及HA蛋白進行2倍序列稀釋成總體積為100微升。接著，加入25微升的2％（體積／體積）火雞紅血球溶液。於室溫下，溫和地混和病毒與紅血球並作用60分鐘，隨後讀取血球凝集結果。

血球凝集抑制試驗分析

於96孔培養盤中2倍序列稀釋血清樣本後，於室溫下，將4個血球凝集單位（hemagglutination units，HAU）的WT WSN加入各孔，並作用1小時。作用完成後，加入25微升的2％（體積／體積）火雞紅血球溶液，每孔總體積為125微升，再於室溫下作用1小時。以最後一個未產生血球凝集的血清濃度逆值來決定各血清樣本的血球凝集抑制（hemagglutination inhibition，HAI）效價。

細胞結合力分析

於37°C 下，以不同量（每毫升0至60微克）的霍亂弧菌神經胺酸酶（receptor destroying enzyme，RDE）（Sigma）作用60分鐘預先處理火雞紅血球。之後，以PBS沖洗紅血球一次，並以PBS製成2％（體積／體積）紅血球溶液。將25微升之上述2％溶液加入相同量之IAV及HA 蛋白中，總體積為125微升。於室溫下，使IAV及RDE-處理的紅血球作用1小時，之後測量其凝集程度。以RDE仍呈現完全凝集的最高濃度訂定結合數值。

去醣化修飾

於購自Sigma-Aldrich的緩衝液中進行一等分的病毒或蛋白去醣化修飾。在超高速離心後，將200微升內含病毒（1×10⁷ PFU）或純化蛋白的感染液與蛋白酶抑制劑（Roche）、1微克糖苷内切酶F1、1微克糖苷内切酶F2、1微克糖苷内切酶F3及1微克糖苷内切酶H，或1微克PNGase F混和，並於37°C下避光作用24小時。糖苷内切酶混合物（Endo-F1、F2、F3及H）或PNGase F可剪裁所有的醣類結構，成為單一GlcNAc殘基，而各別產生單醣化修飾（mono-glycosylated）或未醣化修飾（non-glycosylated）的樣本。在去醣化修飾後，利用西方墨點法分析確認所得的樣本。

製備IAV用於免疫力分析

將WT、285-497-556-G及142-285-497-556-G HA 病毒與MDCK細胞共同培養。利用0.1％ BPL（Acros Organics，Geel，Belgium）於室溫下作用24小時，接續以HNE緩衝液（每升5毫莫耳之HEPES，每升150毫莫耳之NaCl，每升0.1毫莫耳之EDTA，pH 7.4）透析24小時等步驟滅活這些病毒，之後以MDCK細胞進行序列繼代以進行測試。以肌肉注射方式對C57Bl/6母鼠（週齡介於6至8週）投予每劑等同6微克HA的失活病毒量，並於第0天及第21天皮下投予二次。在皮下投予一週後，將小鼠分成二組，每組10隻小鼠。其中一組經麻醉後，以鼻腔接種方式投予（intranasally inoculated）10倍LD50的WSN/33或H5N1病毒，並收集另一組的血清樣本，以分析其抗血清生產情形。接種後14日內，每日監測該小鼠存活情形。中央研究院動物實驗管理小組皆評估及核准所有的動物實驗。

病毒毒力分析

利用週齡4至6週之BALB/c母鼠（每組5隻）測試重組病毒之毒力，其中該些母鼠是分別以鼻腔接種方式投予50微升的病毒（5×10⁵ PFU的WSN及LAIV 44-72-219-G病毒，第3圖之圖G）。感染後14日內，每日記錄其存活情形及體重變化。

實驗結果

N142-醣化修飾對HA結構及活性之影響

因H1、H3及H5亞型之HA上數個醣化修飾位點（醣化位點27、40、176、303及497）具有高度保守性，本研究使用野生型H1N1 A/WSN/33（WSN）作為改造或刪除特定醣化位點的模版，以逆向遺傳學來說明醣化修飾的效應（第1圖之圖A及第5圖之圖A）。病毒於醣化位點-27缺失時無法存活（例如N27A突變標示為27-G）。同樣地，將高度保守之潛在醣化位點在第40、176或303殘基位置（標示為40+G、176+G及303+G）予以突變，以檢測其對複製能力的效應。實驗結果顯示，在高度保守或潛在醣化位點（40+G、176+G、303+G或497-G）具有突變的變異株，其複製率與WT相類似；惟有醣化位點-142-缺失的病毒（142-G及142-285-497-556-G病毒），當其感染MDCK及A549細胞二者時，其複製率2倍低於WT病毒，意味著醣化位點142對IAV複製能力扮演重要的角色（第1圖之圖B及第5圖之圖B）。在圓二色性研究中，醣類並不影響HA之二級結構（第5圖之圖C），且在醣化位點142缺失的變異株間之HA對M1之比例相類似，意味著醣化位點142對病毒組裝及／或成熟並非必要（第5圖之圖D）。

醣化位點142對病毒進入細胞而言是必要的。因在病毒感染力分析實驗中，醣化位點142缺失的病毒（142-G或142-285-497-556-G病毒）感染A549細胞後，該細胞之HA及M1訊號非常微弱（第1圖之圖C及第5圖之圖E）。如上所述，142-G及142-285-497-556-G的序列分別為序列編號：16及17。醣類陣列分析顯示，相較於WT病毒，醣化位點142缺失的病毒會與較多唾液酸苷相互作用（醣類8、10、11及15至18），相同結果亦可見於相應的HA蛋白，意味著醣化位點142之醣化修飾會影響HA的受體結合專一性（第1圖之圖D及第6圖之圖A至C）。此外，基於在醣類陣列分析中，醣化位點142缺失的病毒顯示較低的螢光強度，且具有較低的血球凝集能力及細胞結合能力，醣化位點142可調節HA的總結合力（第1圖之圖D至E及第5圖之圖F）。由142-G或142-285-497-556-G病毒在LMH細胞株（禽類肝細胞癌細胞株）的複製率仍2倍低於WT（第5圖之圖G）的結果可知，儘管在醣類陣列分析中，醣化位點142缺失的病毒可與較多的α2,3-唾液酸苷相互作用，然而，其與人類及／或禽類對WSN HA的採用無關。

進一步探討醣化位點142之醣化修飾影響總結合力及結合專一性的分子機制後發現，醣類組合物皆調節該總結合力及該結合專一性二者。投予糖苷内切酶混合物（Endo-F1、F2、F3及H）會改變WT及285-497-556-G病毒在醣類陣列上的交互作用圖譜，且此交互作用圖樣相似於142-G及142-285-497-556-G病毒的圖樣。如上所述，HA 285-497-556-G的序列為序列編號：1。令人訝異的是，糖苷内切酶混合物處理會增加單醣化修飾的病毒在醣類陣列上的螢光強度，而會減少未醣化修飾（PNGase F處理）的所有各類變異株的螢光強度（第1圖之圖F、第5圖之圖H及第6圖之圖D至E）。

以H5N1接種小鼠來檢測醣化位點142是否涉及宿主的免疫反應。相較於以失活之WT病毒免疫化的小鼠，以失活之142-285-497-556-G病毒免疫化的小鼠存活時間較短，且會引發較低的HA抗血清；而以失活之285-497-556-G病毒免疫化的小鼠則會引發相同量的HA抗血清，但存活較久的時間；而在免疫力測試實驗中，以WSN接種後的各組小鼠皆存活良好（第1圖之圖G至H及第5圖之圖I）。本研究指出，醣化位點142之醣化修飾對IAV的免疫力相當重要。

在季節性的H1N1病毒株中， HA的醣化位點142在躲避人類免疫反應上扮演重要的角色，且人類H3N2 IAV在演化過程中藉由正向選汰，在此區域亦增添了醣化位點（在H3之醣化位點為144）。令人訝異的是，在IAV獲取HA之醣化位點142後，由本實施例的結果可說明，調控HA–SA交互作用會提升病毒感染的效率，且改變宿主免疫反應。因此，對於開發人類IAV疫苗而言，醣化位點142可作為一項值得參考的重要因素。

實施例2：神經胺酸酶（Neuraminidase，NA）的醣化修飾對免疫力的影響

材料與方法

製備重組病毒

在實施例1中已敘述相同方法，除了在定點突變技術中，加入一個終止密碼至NA基因體中，以去除NA之莖柄及催化域。為製備無NA之莖柄及催化域的病毒（LAIV WSN-NA，序列編號：2），利用會穩定表現NA的MDCK／293T細胞株來保全病毒生長、維持培養及分析該病毒。簡言之，將全長的NA（取自WSN病毒株，序列編號：4）選殖至一cDNA表現慢病毒載體（pLAS2w.Ppuro）。之後，依臺灣中央研究院國家型核醣核酸干擾設施平台所提供的操作說明（http：//rnai.genmed.sinica.edu.tw）製備會表現NA的慢病毒。在包含最終濃度為每毫升8微克之凝聚胺（Polybrene，Sigma）的環境中，以會表現NA的慢病毒重複感染三次HEK293T及MDCK細胞。使細胞與病毒作用24小時後，置換成含有puromycin（每毫升3微克）（Invitrogen）的選擇性培養液培養。培養三天後，收集全細胞溶胞物並以西方墨點法分析確認NA表現效率。

NA酵素活性

藉由將病毒樣本對PFU及本揭示內容所述之蛋白樣本標準化來檢測NA酵素活性。以效價1×10⁶ PFU的病毒製備病毒等分，並於37°C下與4-MUNANA （Sigma）作用。30分鐘後，利用0.14 M NaOH及83％乙醇終止反應，並以激發波長360奈米及放射波長450奈米測量NA酵素活性。基質的最終濃度範圍為每升0至1500毫莫耳。每5分鐘偵測1次螢光強度，持續60分鐘（共偵測12次）（4-MUNANA分析）。利用Prism軟體（GraphPad）計算NA之Km（半最高反應速率的基質濃度）及Vmax（最高反應速率），其係利用非線性回歸將實驗數據套入Michaelis–Menten方程式。為測量酵素對不同的醣共軛分子（4-Muα-Neu5Ac、3-SLN、6-SLN、3-SL及6-SL 購自Sigma）的剪切動力學，使N-乙醯甘露糖胺（ManNAc）去氫酶及唾液酸醛縮酶作用後，檢測自醣共軛分子中釋出的N-乙醯神經胺酸量。ManNAc去氫酶及NAD+與ManNAc（醛縮酶剪裁N-乙醯神經胺酸後的產物）作用後，產生副產物NADH，並利用波長340／450奈米測量該副產物NADH的螢光強度。在進行反應時，將唾液酸醛縮酶（Pasteurella multocida，重組蛋白）2微克、ManNAc去氫酶（Flavobacterium sp. 141-8，重組蛋白）3微克、MES緩衝液每升50毫莫耳、pH 6.5、NAD+每升0.2毫莫耳及一適當量的NA混和，並調整醣共軛分子的最終濃度至每升0至1500毫莫耳範圍內。每5分鐘偵測1次螢光強度，持續30分鐘（共偵測6次）。

以LAIV WSN-44-72-219-G及LAIV WSN-NA免疫化小鼠

在會表現NA的MDCK細胞中培養LAIV WSN-NA病毒。在第0天及第21天，以鼻腔接種方式投予25微升的LAIV WSN-44-72-219-G或LAIV WSN-NA（非致死劑量的WT WSN）至有意識的小鼠，且該病毒並未接觸下呼吸道。如上所述，NA 44-72-219的序列為序列編號：11。之後進行免疫力測試步驟。

抗體

自Sino Biological購得抗-NA抗體。

蛋白表現及純化

以實施例1所述方式來製備NA。

製備IAV用於免疫力測試

以實施例1所述方式，利用會表現NA的MDCK細胞製備LAIV WSN- NA病毒。

穿透式電子顯微鏡

將MDCK細胞種植在厚度為7.8-密耳（mil，千分之一吋）的ACLAR包埋膜片（E,M,S）一天後，後續以MOI為5的流行性感冒病毒感染該細胞。於18 hpi，利用0.1M二甲基胂緩衝液（cacodylate buffer）漂洗該病毒感染的細胞，並於4°C下，以0.1 M二甲基胂緩衝液製成2.5％戊二醛（glutaraldehyde）固定30分鐘。之後，再以0.1 M二甲基胂製成1％四氧化鋨（osmium tetroxide）後綴（postfixed）該細胞30分鐘、以1％醋酸鈾醯（uranyl acetate）及鉛檸檬酸鹽（lead citrate）進行染色1小時、以乙醇進行脫水，及以樹脂進行包埋。在烘乾後，利用超薄切片機（ultramicrotome）將樣本切成厚度為80奈米的薄片。最後，利用型號為Tecnai G2 Spirit TWIN（FEI Company）的穿透式電子顯微鏡檢視樣本。

毒力分析

依上文實施例1中所述方法，以鼻腔接種方式投予50微升的病毒（WSN及LAIV WSN-NA 各1×10⁶ PFU，第12圖之圖E）至小鼠。

神經胺酸酶抑制分析法

利用神經胺酸酶抑制分析法來分析NA 抗體的生成。本發明利用NA-Fluor™ 流行性感冒神經胺酸酶分析套組（NA-Fluor™ Influenza Neuraminidase Assay Kit，Life Technologies）來進行分析。簡單來說，將病毒與套組內的反應溶液作用後，混和及進行熱滅活，接著將病毒混合液序列稀釋為圖式所述之不同濃度，並偵測螢光。以具有至少50％抑制能力之最高稀釋倍數的倒數來計算神經胺酸酶抑制效價。

分析對IAV具有專一性的CD8+T細胞

由以PBS、WSN或LAIV WSN-NA免疫化後的小鼠收集其PBMC，在含有每毫升0.5微克之TPCK-胰蛋白酶的RPMI 1640培養液中，將該PBMC與病毒量MOI為3之活的或失活的WSN（經UV處理）於37°C下作用1小時。之後，沖洗該細胞二次並將其培養於含10％熱滅活的FBS的RPMI 1640培養液中。24小時後，依使用操作說明，利用Dynabeads Untouched Mouse CD8 Cells kit（Invitrogen）分離CD8+T細胞，並以流式細胞儀及西方墨點法進行分析。為進行病毒蛋白M1及NP刺激實驗，於37°C下，將以GM-CSF培養的骨隨衍生樹狀細胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDC）與加入或未加入每升100微莫耳之病毒M1及NP抗原決定位的RPMI 1640完全培養液作用24小時，之後與免疫化後的小鼠PBMC以1 :1的比例進行混和。經48小時培養後，分離CD8+T細胞，並以流式細胞儀及西方墨點法分析。M1抗原決定位為GILGFVFTL（序列編號：18）、RLEDVFAGK（序列編號：19）及ASCMGLIY（序列編號：20），而NP抗原決定位為CTELKLSDY（序列編號：21）、SRYWAIRTR （序列編號：22）及LELRSRYWA（序列編號：23）（Mission Biotech）。將上述胜肽溶於每毫升5.0毫克之二甲基亞碸，並以RPMI 1640稀釋至濃度每升100微莫耳，之後保存於-20°C。

流式細胞儀

收集細胞後，以FACS緩衝液（含2％FBS之PBS）來懸浮細胞，使其濃度為每毫升10⁶ 個細胞。本研究使用抗-INF-γ抗體。利用FACSCanto（BD Biosciences）分析儀及軟體FCS Express 3.0來分析細胞螢光強度。

實驗結果

N-44、N-72及N-219位點之醣化修飾影響NA的二級結構

為瞭解醣化修飾是否會影響IAV的生命週期，利用逆向遺傳學方式，以相同的病毒株A/WSN/33作為模版來研究各醣化位點（第7圖之圖A）。如上所述，NA 44-G、NA 72-G、NA 44-72-G及NA 44-72-219-G的胺基酸序列分別為序列編號：8至11。研究結果顯示，醣化位點44及72（位於莖柄域）對於病毒複製扮演重要角色；在MDCK及A549細胞二者中，醣化位點44及72缺失的病毒（44-72-G或44-72-219-G病毒）之複製率皆2倍低於WT病毒（第2圖之圖A及第7圖之圖B）。將NA之醣化位點44、72及219進行醣化修飾以成為具有不同的分子量的NA蛋白變異體；西方墨點法及凝膠過濾層析法分析結果顯示，以糖苷内切酶混合物處理該些變異體後，該些變異體具有相類似的分子量（第2圖之圖B及第7圖之圖C至D）。有趣的是，該些變異體原先具有些微不同的二級結構，經去醣化修飾後則具有相同的二級結構（第2圖之圖C至D）。這些實驗結果指出，醣化位點44、72及219上的醣類為異質性的，且會影響NA的二級結構。

N-44及N-72位點之醣化修飾影響NA活性及毒力

研究結果顯示，醣化位點44及72上的醣類對NA活性相當重要。2-(4-甲基傘形酮)-α-D-N-乙醯神經胺酸（2-(4-methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid ，4-MUNANA）分析結果指出，相較於WT，不具醣化位點44及72的病毒（44-72-G或44-72-219-G病毒）具有較低的NA活性（第2圖之圖E）。此外，相較於未處理過的病毒，以糖苷内切酶混合物處理的WT病毒具有較低的分子量及NA活性（第7圖之圖E至F）。

基於對不同基質的最高反應速率（Vmax）及親和值（Km）的改變可知，NA上的醣類會影響酵素活性、親和力及專一性。當使用2’（4-甲基傘型酮）-α-D-N-乙醯神經胺酸（4-Muα-Neu5Ac）及6’-唾液酸-N-乳糖胺（6-SLN）作為基質時，不具醣化位點44及72的NA有較低的神經胺酸酶活性，但所有變異體卻具有相似的Km值。令人訝異的是，當使用3-SLN作為基質時，醣化位點44及72缺失之NA的活性降低了50％，但Km值增加2倍以上（第3圖之圖A及表1）。有趣的是，這些病毒變異株在LMH細胞中的複製率與NA對3-SLN（一種禽類的受器）的活性有關（第3圖之圖B）。這些實驗結果指出，NA上的醣化修飾會不同程度地影響IAV在動物及禽類細胞中的複製能力（第2圖之圖A及第3圖之圖B）。

此外，不具醣化位點72的NA（72-G）雖可與基質6’-唾液乳糖（6’-sialyllactose，6-SL）作用，該些變異體皆無法與3’-唾液乳糖（3’-sialyllactose，3-SL）作用（第3圖之圖C及第8圖之圖A）。有趣的是，在25至40°C下，44-72-219-G與44-72-G（具醣化位點219）具有相似的活性，但在較高溫度（45、50及55°C）時，44-72-219-G則具有較低的活性（第8圖之圖B）。相較於未經處理之對照組，經糖苷内切酶混合物處理之44-72-G在55°C的溫度下，具有較低的NA活性；這些實驗結果指出，醣化位點219（位於催化域）上的醣類會影響NA的熱穩定性（第3圖之圖D及第8圖之圖C）。

醣化位點44及72亦調節了病毒的釋出及形態生成，因以WT、44-G及72-G等病毒感染的細胞，釋出較多圓型的病毒顆粒，但以44-72-G或44-72-219-G等病毒感染的細胞主要釋出伸長型的絲狀病毒顆粒，其未見於以WT病毒感染的細胞（第3圖之圖E至F及第8圖之圖D至F）。此外，相較於以WT感染的小鼠僅有20％存活率及相當程度的體重減輕，以不具任何醣類之NA的病毒（44-72-219-G病毒）感染的小鼠，其於存活率及體重上顯示較少劇烈變化。這些實驗結果指出，NA上的醣化修飾會影響病毒毒力（第3圖之圖G至H）。

不具NA之莖柄及催化域的活性減毒疫苗展現具有強烈的CD8+T細胞反應之廣泛的保護力

利用去醣化修飾之NA的IAV（44-72-219-G）作為活性減毒流行性感冒疫苗（LAIV WSN-44-72-219-G），以檢測疫苗預防疾病的潛力。基於較低的NA活性及毒力，選用去醣化修飾的NA來進行實驗。然而，去醣化修飾之NA的病毒與WT具有相似的免疫力（第9圖之圖A至C）。

此外，NA活性不會影響失活疫苗的效力，且產生的抗體量極低。因此，藉由將一終止密碼引入至NA的RNA基因體片段來製備一種NA之莖柄及催化域皆缺失的病毒（LAIV WSN-NA），據以強化NA的免疫力（第4圖之圖A）。研究結果顯示，LAIV WSN-NA病毒不會在MDCK細胞形成溶菌斑，並可在會表現WT NA之細胞中回復形成溶菌斑（第10圖之圖A至B）。於24 hpi，以LAIV WSN-NA病毒感染的A549細胞具有較少的病毒釋出至懸浮液中，且會累積細胞內的病毒蛋白M1；這些實驗結果指出， LAIV WSN-NA病毒在病毒釋出方面有缺損（第10圖之圖C至D）。以1×10⁶ PFU的WSN病毒感染小鼠後，小鼠的體重會急速下降，且於感染後6天死亡。另一方面，經口部投予1×10⁶ PFU的LAIV WSN-NA病毒的小鼠，存活良好且無體重損失；這些實驗結果指出，LAIV WSN-NA病毒為一有效的低致病性LAIV，且病毒在細胞中毒性減低對活性疫苗的功效而言是有必要的（第10圖之圖E至F）。在免疫力測試中，失活的WSN-NA病毒與失活的WSN病毒具有相似的免疫力（第4圖之圖B及第11圖之圖A至C）。

表1 NA蛋白及病毒變異株的Km及Vmax

蛋白	WT	44-G	72-G	44-72-G	44-72-219-G	單位
4-Muα-Neu5Ac
Vmax	5.025	4.95	4.45	1.15	1.2	每升奈莫耳/秒
Kcat	514.3	468.5	426.8	100.3	105.8	/秒
Km	585.4	595.2	591	588.1	596.7	每升微莫耳
3-SLN
Vmax	7.04	4.09	3.89	1.46	1.48	每升奈莫耳/秒
Kcat	688.2	389.8	364.4	136.4	139.1	/秒
Km	125.3	295.2	288.7	296.3	299.1	每升微莫耳
6-SLN
Vmax	1.07	0.92	0.85	0.24	0.21	每升奈莫耳/秒
Kcat	104.2	90.6	83.6	19.8	20.7	/秒
Km	678.7	684	688	679	675	每升微莫耳


病毒	WT	44-G	72-G	44-72-G	44-72-219-G	單位
4-Muα-Neu5Ac
專一性	9.7	7.78	7.37	2.3	2.42	奈莫耳/秒/毫克
Km	487	508	485	429	415	每升微莫耳
3-SLN
專一性	14.9	9	8.35	2.92	2.96	奈莫耳/秒/毫克
Km	115	274	268	285	281	每升微莫耳
6-SLN
專一性	2.25	1.88	1.78	0.48	0.42	奈莫耳/秒/毫克
Km	534	525	540	521	515	每升微莫耳

上欄的Km及Vmax係來自NA蛋白，下欄則來自病毒變異株。

然而在病毒接種研究中，當使用LAIV WSN-NA病毒作為疫苗時，其對WSN、A/Cal/07/2009及H5N1展現跨株系及跨亞型的保護力；以LAIV WSN-NA免疫化後的小鼠存活情形良好，且其肺部已清除病毒，但未引發任何顯著的抗體反應（第4圖之圖C至E及第12圖之圖A至D）。此外，LAIV WSN-NA保護力亦呈現劑量依賴性反應（第12圖之圖E）。病毒感染以LAIV WSN-NA免疫化後的小鼠PBMC後，IFN-γ及顆粒酶B專一地活化CD8+T細胞，但失活的病毒則未展現此活性，意味著當病毒感染時，LAIV WSN-NA能引發CD8+T細胞活化（第4圖之圖F及第12圖之圖F至G）。此外，高度保守的病毒抗原決定位NP及M1亦能激發CD8+T細胞活化（第4圖之圖G及第12圖之圖G）。這些實驗結果指出，NA在活化CD8+T-細胞而調節宿主免疫反應上扮演關鍵角色，且LAIV WSN-NA可作為一種有效的疫苗。

最後，觀察到在M2上的醣化位點並不影響病毒複製能力（第13圖）。

一些研究顯示，NA之莖柄域的分歧度與病毒毒力及IAV自鴨子傳染至陸地上的禽類有關，且其經由演化而在人群中散播，該演化包含序列缺失及醣化位點修飾。然而， NA之莖柄域的結構性及功能性角色至今仍舊未知，且未有關於醣化修飾在這些典型的醣化位點上的相關報導。本實施例的實驗結果指出，醣化位點在NA之莖柄域係受到醣化修飾而調節NA活性、親和力及專一性，進而調節IAV複製能力，意味著NA之莖柄域上的醣類在病毒毒力及IAV傳染能力上扮演重要角色。

實施例3：鑑定低致病性IAV上具有免疫力的NA變異體

材料與方法

製備重組病毒

利用定點突變技術製備本揭示內容所述之NA變異體。為製備具有催化域缺失的NA變異體（WSN-NA-CD，序列編號：15，已在上文提供），利用一終止密碼取代原NA催化域的第一組密碼。將R102改成A以構築活性位置1失活的變異體（WSN-NA-AS1，序列編號：12，已在上文提供）。將D135改成A以構築活性位置2失活的變異體（WSN-NA-AS2，序列編號：13，已在上文提供）。將胺基酸殘基G388置換成A388以構築變異體WSN-NA G388A（序列編號：14，已在上文提供）。

以LAIV WSN-44-72-219-G、LAIV WSN-NA及 WSN-NA-AS1免疫化小鼠

在會表現NA的MDCK細胞中培養LAIV WSN-NA及WSN-NA-AS1病毒。於第0天及第21天，以鼻腔接種方式投予總量為25微升的LAIV WSN-44-72-219-G、LAIV WSN-NA、WSN-NA-AS1及非致死劑量的WT WSN至有意識的小鼠，且該病毒並未接觸下呼吸道。之後進行免疫力測試步驟。

病毒毒力分析

利用週齡4至6週之BALB/c母鼠（每組5隻）測試重組病毒之毒力，其中該些母鼠是分別以鼻腔接種方式投予50微升的病毒（1×10⁶ PFU的WSN、LAIV WSN-NA及WSN-NA-AS1病毒，第15圖之圖A）。感染後14日內，每日記錄其存活情形及體重變化。

實驗結果

製備上文所述之不同NA變異體以測試其莖柄及催化域中何者會影響免疫力及病毒毒力（第14圖之圖A）。當以NA活性有缺損的病毒（LAIV WSN-NA、 WSN-NA-CD、WSN-NA-AS1及WSN-NA-AS2）感染A549細胞時，細胞會釋出較少的病毒至懸浮液中，且積累細胞內的病毒RNA（vRNA）及病毒蛋白（NP及M1），該結果指出NA活性（而非蛋白本身）係病毒釋出的關鍵（第14圖之圖B至D）。基於NA活性對病毒釋出扮演著重要角色，利用NA活性位置突變的病毒（WSN-NA-AS1）作為活性減毒流行性感冒疫苗，並與LAIV WSN-NA的免疫力進行分析比對。藉由口部投予方式以WSN-NA-AS1病毒感染小鼠後，可發現小鼠的存活率及體重與經LAIV WSN-NA或PBS感染的小鼠相似（第15圖之圖A至B）。相似於LAIV WSN-NA，疫苗接種（vaccination）WSN-NA-AS1亦未引發任何顯著的抗體反應（第15圖之圖C），且WSN-NA-AS1病毒之複製率相當於LAIV WSN-NA（第15圖之圖D）。儘管相較於非致死劑量的WSN而言，WSN-NA-AS1病毒毒力減低（第15圖之圖C及D），但暴露於WSN-NA-AS1病毒下可保護小鼠不受到致死劑量的H5N1影響（第15圖之圖E）。

這些得自WSN-NA-AS1變異株的實驗結果與LAIV WSN-NA相類似（參照上文實施例2），意味著NA活性會影響宿主免疫反應。因暴露在IAV疫苗上的病毒蛋白為一種引發IAV專一性CD8+T細胞作用的重要途徑，而推測帶有NA之酵素功能缺陷的變異體的IAV具有跨亞型的保護力，例如對H1N1 IAV及H5N1 IAV二者提供保護力。

利用病毒載體系統表現IAV蛋白上的保守區域，可引發動物體CD8+T細胞對抗致命的IAV感染。然而，這類方式僅可引發針對特定一種標的的免疫反應。或者，有文獻指出可利用MVA-NP及M1混合物製備流行性感冒病毒疫苗組合物。如本揭示內容所述的，含有缺損之NA的IAV顆粒，諸如不具莖柄及催化域的截斷版，在沒有中和性抗體的情形下，可顯著地引發IAV專一性CD8+T細胞以辨認各類病毒株及不同的IAV亞型。這些實驗結果指出，本揭示內容所述之IAV為一種有前景的方式以製備萬用流行性感冒疫苗組合物。

其他實施方式

可任意組合本揭示內容所揭示之所有特徵成任一種組合。可取代本揭示內容所揭示之每一種特徵成另一種具有相同的、均等的或相類似的目的的替代特徵。因此，除非本說明書有明確的聲明，本揭示內容所揭示之每一種特徵僅作為一系列通用之均等或相類似的特徵之實例。

本領域技術人員能輕易地自上文的敘述中判明本揭示內容的必要特徵，且在不悖離本揭示內容的原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，以運用在各種用法及狀態下。因此，其他實施方式亦在申請專利範圍所界定的範圍內。

無

第1圖之數據闡述醣化修飾對IAV之HA免疫力的影響。（A）：IAV表面蛋白HA及NA之醣化位點（Ψ）的示意圖。CT：細胞質域C端；TM：穿膜域；N：細胞質域N端。（B）：比較具有不同醣化修飾型態之病毒在MDCK細胞中的複製率。（C）：利用抗-HA、抗-M1及抗-β-肌動蛋白等抗體進行西方墨點法來分析感染四種特定IAV變異株之A549細胞。（D）：醣類陣列分析野生型IAV及142-G IAV的HA結合型態。（E）：特定IAV變異株的血球凝集試驗結果。（F）：醣類陣列分析具有去醣化修飾之HA（deglycosylated）的野生型病毒。（G）：在小鼠中測試野生型IAV及特定IAV變異株的免疫力。以失活的野生型IAV及特定IAV變異株免疫化（immunized）小鼠後，取其抗血清進行血球凝集抑制試驗。（H）：以特定病毒免疫化小鼠後，再以致死劑量之H5N1病毒接種（challenged）該小鼠後的存活率。圖（B）、（D）及（F）為3次獨立試驗所得的平均值±標準差（mean ± standard error of the mean，SEM）；圖（G）為10次獨立試驗所得的平均值±標準差；圖（H）為10次獨立試驗結果。*：P ＜ 0.001，**：P ＜ 0.05。

第2圖之數據闡述醣化修飾對IAV毒力及NA結構的影響。（A）：比較特定病毒在A549細胞中的複製率。（B）：利用抗-NA抗體進行西方墨點法來分析經醣化修飾及去醣化修飾之NA變異體分子量。（C）：特定IAV的NA之圓二色性光譜分析結果。（D）：去醣化修飾的NA變異體之圓二色性光譜分析結果。（E）：利用2-(4-甲基傘形酮)-α-D-N-乙醯神經胺酸（2-(4-methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid ，4-MUNANA）螢光分析IAV之NA活性。圖（B）為3次獨立試驗所得的平均值±標準差；圖（E）為5次獨立試驗所得的平均值±標準差。*：P ＜ 0.001。

第3圖之數據闡述醣化修飾對IAV之NA免疫力的影響。（A）：利用2’（4-甲基傘型酮）-α-D-N-乙醯神經胺酸（4-Muα-Neu5Ac）、6’-唾液酸-N-乳糖胺（6-SLN）及3’-唾液酸-N-乳糖胺（3-SLN）等醣共軛分子來測量NA活性；該NA活性係相對於野生型NA（訂為100％）的活性。（B）：比較病毒在LMH細胞中的複製率。於48 hpi（hours post infection）檢測病毒效價。（C）：利用薄層色層分析特定病毒變異株與6’-唾液乳糖（6-SL）作用。（D）：於37°C及55°C下，利用4-MUNANA分析44-72-G、去醣化修飾的44-72-G及44-72-219-G等病毒的NA活性。（E）：利用穿透式電子顯微鏡觀察野生型病毒型態。（F）：如圖（E）所述之方式觀察44-72-219-G病毒型態。（G）：以WT IAV（WSN）或含有特定NA變異體之IAV接種小鼠後的存活率。（H）：如圖（G）所述之小鼠的體重。圖（A）、（B）及（D）為3次獨立試驗所得的平均值±標準差；圖（G）為5次獨立試驗結果；圖（H）為5次獨立試驗所得的平均值±標準差。*：P ＜ 0.001，**：P ＜ 0.05。

第4圖之數據闡述於活性減毒流行性感冒疫苗（live attenuated influenza vaccine，LAIV）中截斷NA對NA免疫力的影響。（A）：LAIV H1N1 A/WSN/33（WSN）-NA設計示意圖。數字表示為自cRNA之5’端起算的核苷酸數目。TGA係終止密碼。（B）：在小鼠中測試WT IAV（WSN）及特定IAV變異株的免疫力。以失活的WT IAV（WSN）及特定IAV變異株免疫化小鼠，取其抗血清進行血球凝集抑制試驗。（C）：以特定病毒免疫化小鼠後，再以致死劑量之H5N1病毒接種該小鼠後的存活率。（D）：以特定方式處理小鼠後，於其肺部觀察H5N1病毒複製動態。（E）：在小鼠中測試WT IAV（WSN）及LAIV WSN-NA的免疫力。取免疫化後的小鼠之抗血清進行血球凝集抑制試驗。（F）：當受到病毒感染時，LAIV WSN-NA病毒引發CD8+T細胞活化的能力。以特定病毒免疫化小鼠，取其周邊血液單核球細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），並與WSN病毒（+virus）作用後，利用流式細胞儀分析INF-γ於CD8+T細胞表面的表現。（G）：當受到M1及NP抗原決定位刺激時，LAIV WSN-NA病毒引發CD8+T細胞活化的能力。以LAIV WSN-NA病毒免疫化小鼠，取其PBMC，並與M1及NP抗原決定位作用後，利用流式細胞儀分析INF-γ於CD8+T細胞表面的表現。圖（B）、（D）及（E）為10次獨立試驗所得的平均值±標準差；圖（C）為10次獨立試驗結果；圖（F）及（G）之實驗數據來自3次具代表性的相似實驗。*：P ＜ 0.001。

第5圖之數據闡述HA去醣化修飾對IAV之HA免疫力的影響。（A）：11種含不同醣化位點之HA的IAV示意圖。CT：細胞質域C端；TM：穿膜域。全部的重組病毒皆經基因體測序確認。（B）： 11種病毒變異株感染A549細胞後，於48 hpi比較病毒的複製率。（C）：特定HA變異體之圓二色性光譜分析結果。（D）：利用抗-HA、抗-M1等抗體進行西方墨點法來分析相同濃度的四種特定IAV變異株。轉漬膜係與抗-HA、抗-M1等單株抗體作用。（E）：含特定HA變異體之病毒的感染力。感染MDCK細胞後，利用溶菌斑檢定分析檢測病毒效價。（F）：利用細胞結合試驗分析細胞受器結合的親和力。（G）：於48 hpi比較特定病毒在LMH細胞中的複製率（利用病毒效價定出）。（H）：以抗-HA抗體對3株IAV變異株進行西方墨點法分析。該些變異株係經糖苷内切酶混合物（Endo-F1、F2、F3及H）去醣化修飾後的變異株。（I）：以致死劑量之特定病毒接種小鼠後的存活率。該病毒係經糖苷内切酶混合物處理。圖（B）、（E）、（F）及（G）為3次獨立試驗所得的平均值±標準差；圖（I）為10次獨立試驗結果。*：P ＜ 0.001。

第6圖之數據闡述醣化修飾對HA之結合專一性（binding specificity）及總結合力（binding avidity）的影響。（A）：醣類陣列上之唾液酸苷結構用於IAV結合性試驗之示意圖。該合成的SA醣類陣列由下列唾液酸苷所組成：20種α2,3-多糖（1–20）、9種α2,6-多糖（21–29）、10種α2,8-及α2,9-多糖（30–39），以研究IAV結合性。（B）：利用醣類陣列分析4株特定病毒變異株。（C）：利用醣類陣列分析4種HA蛋白變異體。（D）：利用醣類陣列分析去醣化修飾之285-497-556-G HA的IAV。（E）：利用醣類陣列分析142-285-497-556-G HA的IAV。圖（B）、（C）、（D）及（D）為3次獨立試驗所得的平均值±標準差。

第7圖之數據闡述醣化修飾對IAV之NA活性的影響。（A）：8種含不同醣化修飾型態之NA的IAV示意圖。醣化位點如圖所示；N為細胞質域N端；TM為穿膜域。全部的重組病毒皆經基因體測序確認。（B）： 8種病毒變異株感染MDCK細胞後，比較該些病毒的複製率。（C）：利用凝膠過濾層析法分析5種NA蛋白。（D）：利用凝膠過濾層析法分析5種去醣化修飾的NA蛋白。（E）：利用抗-NA抗體進行西方墨點法來分析病毒。該病毒係經糖苷内切酶混合物處理。（F）：利用4-MUNANA分析去醣化修飾之IAV的NA活性。圖（B）為3次獨立試驗所得的平均值±標準差；圖（F）為5次獨立試驗所得的平均值±標準差。*：P ＜ 0.001。

第8圖之數據闡述醣化修飾對NA之熱穩定性及IAV之型態的影響。（A）：特定WSN NA突變株無法切割3’-唾液乳糖（3’-sialyllactose，3-SL）。（B）：利用4-MUNANA分析溫度對特定病毒之NA活性的影響。（C）：利用抗-NA抗體進行西方墨點法來分析44-72-G及44-72-219-G病毒。該些病毒係經糖苷内切酶混合物後（F1、F2、F3及H）處理。（D）：利用穿透式電子顯微鏡觀察44-G NA的病毒型態。（E）：利用電子顯微鏡觀察72-G NA的病毒型態。（F）：利用電子顯微鏡觀察44-72-G NA的病毒型態。圖（B）為5次獨立試驗所得的平均值±標準差。*：P ＜ 0.001。

第9圖之數據闡述醣化修飾對LAIV之NA免疫力的影響。（A）：以WSN、LAIV WSN-44-72-219-G或PBS免疫化小鼠後，再以致死劑量之H5N1病毒接種該小鼠後的存活率。（B）：在小鼠中測試WT IAV及特定LAIV變異株的免疫力。以失活的WT IAV及特定LAIV變異株免疫化小鼠，取其抗血清進行血球凝集抑制試驗。（C）：以特定病毒免疫化小鼠後，利用神經胺酸酶抑制分析法檢測該小鼠的NA抗體效價。以WSN免疫化的小鼠，其血清的半抑制濃度（IC50）為每毫升4.3微克，而以LAIV WSN-44-72-219-G免疫化者為每毫升3.2微克。圖（A）為5次獨立試驗結果；圖（B）及（C）為5次獨立試驗所得的平均值±標準差。

第10圖之數據闡述LAIV WSN-NA病毒為有效的低致病性疫苗。（A）：以WSN及LAIV WSN-NA病毒分別感染WT MDCK及會表現NA的MDCK（MDCK+NA）後，比較溶菌斑形成情形。（B）：利用抗-NA及抗-β-肌動蛋白等抗體進行西方墨點法來分析MDCK+NA細胞的NA表現。（C）：以MOI為3的病毒感染A549細胞後，於特定時間點測定特定病毒效價。（D）：利用抗-M1及抗-β-肌動蛋白等抗體進行西方墨點法來分析A549細胞中的M1病毒蛋白表現量。該A549 細胞係經特定病毒感染。（E）：以WSN或特定LAIV WSN-NA病毒感染小鼠後的存活率。（F）：小鼠感染特定病毒後14天的體重變化。圖（C）為3次獨立試驗所得的平均值±標準差；圖（E）為5次獨立試驗結果；圖（F）為5次獨立試驗所得的平均值±標準差。*：P ＜ 0.001。

第11圖之數據比較宿主對失活的WSN及WSN-NA病毒的免疫反應。（A）：以特定失活的病毒免疫化小鼠後，再以致死劑量之WSN病毒接種該小鼠後的存活率。（B）：以特定病毒免疫化小鼠後，再以致死劑量之H5N1病毒接種該小鼠後的存活率。（C）：以特定病毒免疫化小鼠後，利用神經胺酸酶抑制分析法檢測小鼠的NA抗體效價。以WSN病毒免疫化的小鼠，其血清的IC50為每毫升5.2微克，而以WSN-NA病毒免疫化的小鼠為每毫升4.7微克。圖（A）及（B）為10次獨立試驗結果；圖（C）為10次獨立試驗所得的平均值±標準差。

第12圖之數據闡述LAIV WSN-NA處理之跨株系保護力。（A）：以WSN、LAIV WSN-NA或PBS免疫化小鼠後，再以致死劑量之WSN病毒接種該小鼠後的存活率。（B）：以特定方式處理小鼠後，於感染後第4天及第6天於其肺部觀察WSN病毒複製動態。（C）：以WSN、LAIV WSN-NA或PBS免疫化小鼠後，再以致死劑量之A/Cal/07/2009（H1N1）病毒接種該小鼠後的存活率。（D）：以特定方式處理小鼠後，於感染後第4天及第6天於其肺部觀察A/Cal/07/2009病毒複製動態。（E）：以H5N1及WSN接種小鼠後，分析LAIV WSN-NA劑量與小鼠存活率之關係。（F）：失活的WSN病毒對在CD8+T細胞中INF-γ表現的影響。以活的WSN、LAIV WSN-NA及PBS免疫化小鼠後取其CD8+T細胞，並利用流式細胞儀分析。（G）：利用抗-顆粒酶B及抗-β-肌動蛋白等抗體進行西方墨點法來分析顆粒酶B表現。以LAIV WSN-NA免疫化小鼠後取其CD8+T細胞，該細胞分別與活的WSN病毒（+virus）、NP（+NP）或M1（+M1）等抗原決定位作用後進行西方墨點法分析。圖（A）、（C）及（E）為10次獨立試驗結果；圖（B）及（D）為3次獨立試驗所得的平均值±標準差；圖（F）之實驗數據來自3次具代表性的相似實驗。*：P ＜ 0.001。

第13圖之數據闡述M2醣化修飾IAV複製的影響。（A）：M2域結構示意圖；以重點標示其醣化位點。M2之醣化位點序列為NDS。利用逆向遺傳工程將N改為G或將S改為I。（B）：比較特定IAV變異株感染MDCK細胞後的病毒複製率。該病毒MOI為0.01，並於感染24小時後，利用溶菌斑檢定分析測定病毒效價。本圖為3次獨立試驗所得的平均值±標準差。

第14圖之數據闡述NA活性對病毒釋出的影響。（A）：10種含不同修飾之NA的IAV示意圖。醣化位點如圖所示；AS1構築載體含R102A突變，其使活性位置1失去活性；AS2構築載體含D135A突變，其使活性位置2失去活性；N為細胞質域N端；TM為穿膜域。全部的重組病毒皆經基因體測序確認。（B）：以MOI為3之特定病毒變異株感染A549細胞後的病毒效價。於感染後8小時及24小時收集細胞培養液。（C）：細胞內的病毒RNA量。如圖（B）所述之病毒感染A549細胞後，取其全細胞溶胞物進行檢測。（D）：利用抗-NA、抗-NP、抗-M1及抗-β-肌動蛋白等抗體進行西方墨點法來分析NA、N及M1蛋白表現量。如圖（B）所述之病毒感染A549細胞後，取其全細胞溶胞物進行檢測。圖（B）及（C）為3次獨立試驗所得的平均值±標準差。

第15圖之數據比較宿主對LAIV WSN-NA及WSN-NA-AS1病毒的免疫反應。以1×10⁶ PFU的WSN、LAIV WSN-NA、WSN-NA-AS1或非致死劑量之WSN（WSN（UL））等病毒感染小鼠後，記錄14天的存活率（A）及體重（B）。（C）：以特定方式處理小鼠後，取其抗血清進行血球凝集抑制試驗分析。（D）：以特定IAV變異株感染小鼠後，於感染後第4天於其肺部觀察病毒複製動態。（E）：以WSN（UL）、LAIV WSN-NA、WSN-NA-AS1或PBS處理小鼠後，再以致死劑量之H5N1病毒接種該小鼠後的存活率。圖（A）、（B）及（E）為10次獨立試驗結果；圖（C）及（D）為3次獨立試驗結果。