KR102582035B1 - 면역요법을 위한 나노입자 조성물 및 방법 - Google Patents

면역요법을 위한 나노입자 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역요법을 위한 조성물 및 방법을 제시하는데, 이들은 항원 특이적 T 세포를 유도하기 위한 상온 보존 제약학적 조성물을 포함한다. 이런 조성물은 항원 (가령, 종양 항원) 및/또는 T 세포 동시자극성 분자의 제시를 위한 복합체를 환자에 제공하기 위한 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 성분으로서 이용된다.

Description

면역요법을 위한 나노입자 조성물 및 방법
우선권 출원에 대한 참조
본 출원은 2014년 12월 24일자 제출된 US 가출원 번호 62/096,725에 우선권을 주장하고, 이것은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 면역 세포의 활성을 조정하기 위한 생물학적 리간드를 제공하는 나노입자 조성물에 관계한다.
배경
항원 제시 세포 (APC)는 그들의 표면 상에서 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 단백질과의 복합체에서 항원성 펩티드를 처리하고 전시하는 세포이다. 작동체 세포, 예를 들면, T-세포는 세포 표면 수용체, 예를 들면, T 세포 수용체 (TCRs)를 통해 이들 펩티드-MHC (pMHC) 복합체를 인식한다.
수지상 세포 (DCs)는 자극되어 항원을 효과적으로 제시하고 면역 작동체 세포의 확대를 뒷받침하고, 따라서 항원을 향한 세포독성 반응을 활성화시킬 수 있는 항원 제시 세포의 실례이다. 일부 면역요법에서, DCs는 환자로부터 수확되고, 그리고 항원으로 펄싱되거나 또는 바이러스 벡터로 형질감염된다. 환자 내로 되돌려 수혈 시에, 이들 활성화된 세포는 종양 항원을 작동 림프구 (가령, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 B 세포)에 제시한다. 성공적일 때, 이러한 요법은 항원 (종양 항원 포함)을 발현하는 세포에 대항하여 세포독성 반응을 개시한다.
하지만, 암에 대한 항원 특이적 면역요법을 비롯한 면역요법에 효과적인 상온 보존 제약학적 조성물이 여전히 요구된다. 본 발명은 이런 저런 목적에 부합한다.
발명의 간단한 설명
본 발명은 면역요법을 위한 조성물 및 방법을 제시하는데, 이들은 환자에서 항원 특이적 T 세포를 유도하기 위한 상온 보존 제약학적 조성물을 포함한다. 이런 조성물은 예로서, 암 및 감염성 질환의 치료에 유용하다. 조성물은 일부 양상에서 인공 항원 제시 세포 (aAPC)인데, 이것은 항원 특이적 T 세포 (가령, 세포독성 T 세포)의 활성화를 위한 적절한 맥락에서 하나 또는 그 이상의 항원 (가령, 종양 항원(들))을 제시하는 분자 복합체를 환자에게 제공하기 위해, 항원 제시 복합체를 갖는 제약학적으로 허용되는 비드 또는 입자 및 임의선택적으로, 이의 표면 상에서 T 세포 동시자극성 신호를 포함한다. 이러한 비드 또는 입자는 순환 성질, 생체분포, 분해 동역학뿐만 아니라 미경험 및/또는 이전에 활성화된 T 세포의 항원 특이적 활성화 및/또는 확대를 비롯한 약력학적 이점을 제공하도록 설계된다. 물리적 파라미터는 그 중에서도 특히, 크기, 표면 전하, 다분산성 지수, 중합체 조성, 리간드 접합 화학, 리간드 밀도, 리간드 비율을 포함한다. 일부 양상에서, 본 발명은 표적 조직, 예를 들면, 림프절, 비장, 및 종양 부위로 분포하는 나노규모 aAPCs (가령, 약 200 nm보다 작은)를 제공한다. 본원에서 설명된 나노-aAPC 플랫폼은 다양한 면역요법 적용을 위해 미세하게 조정될 수 있다. 일부 구체예에서, aAPCs는 약 20 nM 내지 약 200 nM의 범위 안에 있고, 그리고 일부 구체예에서, 입자당 약 150개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 100개보다 적은 리간드, 예를 들면, 입자당 약 5 내지 약 90개 리간드를 비롯하여, 입자당 5 내지 약 1500개 리간드를 내포할 수 있다. 일부 구체예에서, 나노 aAPCs는 그들의 표면에 접합된 (평균적으로) 약 150개보다 적은 리간드 또는 약 100개보다 적은 리간드를 갖고, 따라서 활성 및/또는 효능의 손실 없이, 표면 상에서 리간드의 존재비로부터 입체 제약을 방지한다.
일부 구체예에서, T-세포 동시자극성 신호는 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 부분인데, 이것은 IgG, IgD, IgA, 또는 IgM 아이소타입에서 선택되는 서열을 비롯한 인간 중쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 서열은 인간 IgG 불변과 가변 서열을 포함한다. 프레임워크 (FW) 서열은 항원 결합 부위(들)의 완전성을 유지하기 위해 중요한 또는 원하는 뮤린 프레임워크 잔기를 내포하도록 변형될 수 있다. 상보성 결정 영역 (CDRs)은 뮤린 항체 아미노산 서열 (가령, 9.3 mAb), 또는 다른 CD28 결합 서열에 근거될 수 있고, 그리고 9.3 mAb와 경쟁하는 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 중쇄는 인간 IGHV4 (가령, IGHV4-59) 생식계열 FW의 변이체이다. 일부 구체예에서, 항체는 경쇄를 포함하고, 그리고 상기 경쇄는 인간 IGKV4-01 FW의 변이체이다. 항체는 불변 영역을 포함할 수 있고, 그리고 상기 불변 영역은 일부 구체예에서 인간 IgG4 불변 영역 또는 이의 변이체이다.
동시자극성 분자는 항원 특이적 T 세포를 유도하기 위해, 항원-제시 분자 복합체를 갖는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 항원-제시 분자 복합체는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 복합체, 또는 항원 결합 틈새를 포함하는 이들의 부분을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 분자 복합체는 하나 또는 그 이상의 HLA 아미노산 서열을 포함하고 (가령, HLA의 세포외 도메인 또는 이의 항원-제시 부분을 포함하고), 이것은 추가 서열, 예를 들면, 면역글로불린 서열, 또는 다른 다합체화 (가령, 이합체화) 또는 안정화 서열을 내포할 수 있다. HLA-Ig 이합체화 융합은 일부 구체예에서 안정성, 결합 친화성 및/또는 T 세포 활성화에서 이점을 제공한다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 T 세포에 항원의 제시를 위한 비드- 또는 입자-접합된 분자 복합체를 제공하고, 여기서 상기 복합체는 클래스 I 또는 클래스 II 항원 결합 틈새를 형성하는 아미노산 서열, 또는 이의 부분을 포함한다. 항원 제시 복합체의 아미노산 서열은 예로서, 안정성, 친화성 및 입체 이점을 제공하기 위해 이종성 서열에 융합을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이종성 서열은 면역글로불린 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 복합체는 이종성 서열, 예를 들면, 면역글로불린 서열에 융합된 HLA (가령, HLA-A2) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 서열은 인간 중쇄 면역글로불린 서열 (가령, IGVH4)을 포함하는데, 이것은 이합체성 HLA를 제공하기 위한 면역글로불린 불변 영역 서열을 포함할 수 있고 (가령, 힌지 영역을 포함하고), 그리고 가변 영역 서열을 임의선택적으로 포함할 수 있다. 가변 영역 서열은 존재하면, 잠재적 항원 결합을 감소시키거나 또는 제거하기 위해 임의선택적으로 변형될 수 있고, 그리고 임의선택적으로 뮤린 FW 잔기가 없다. 일부 구체예에서, HLA 항원 제시 복합체는 Ig 힌지 영역에 직접적으로 융합된다 (가령, 경쇄 또는 중쇄 가변 서열을 포함하지 않는다). HLA 아미노산 서열은 HLA-A*02:01 (IMGT 수탁 번호 HLA00005) 또는 이의 유도체이다.
T 세포 동시자극성 리간드 및/또는 항원 제시 복합체 (뿐만 아니라 표적화 리간드를 비롯한 본원에서 개시된 다른 리간드)는 탈체 또는 생체내 항원 제시 및 항원 특이적 T 세포 활성화를 위한 입자 지지체에 접합된다. 일부 구체예에서, 입자는 PLGA-PEG 또는 PLA-PEG 중합체를 갖는 PLGA 또는 PLA 중합체 코어로 형성된다. 대안으로, 다른 중합체 및/또는 공중합체가 이용될 수 있다. 가령, 중합체는 1:0 및 0:1 사이, 예를 들면, 약 1:0 내지 약 1:1의 비율에서 젖산 (L) 및 글리콜산 (G)을 내포할 수 있다. 일부 구체예에서, 리간드를 연계하기 위한 표면 기능기가 친수성 덮개를 형성하는 PEG 사슬의 말단 단부에 부착된다. 입자는 순환 성질, 생체분포 및 분해 동역학뿐만 아니라 항원 특이적 T 세포를 활성화시키는데 있어서 고효능을 비롯한 약력학적 이점을 제공하도록 설계된다. 물리적 파라미터는 그 중에서도 특히, 크기, 표면 전하, 중합체 조성, 리간드 접합 화학, 리간드 밀도를 포함한다. 가령, 일부 구체예에서, 입자는 PLGA 또는 PLA 중합체 코어, 그리고 이들 공중합체의 PEG 부분에 의해 형성된 친수성 껍질을 갖고, 여기서 이들 중합체의 부분은 폴리펩티드 리간드의 말단 부착을 갖는다. 친수성 껍질은 리간드 접합을 위한 기능기에 대하여 비활성인 일부 PEG 사슬, 예를 들면, PLGA-PEG-MeOH 또는 PLA-PEG-MeOH 중합체를 포함한다. 이들 구체예에서, 입자 화학은 리간드 밀도의 우수한 제어를 허용한다.
일부 구체예에서, 입자는 중합성 나노입자, 예를 들면, 본원에서 상세하게 설명된 PLGA-PEG 또는 PLA-PEG 화학 또는 다른 중합체 화학이고, 그리고 약 20 내지 약 200 nm의 범위 내에 크기를 갖는다. 일부 구체예에서, 리간드 밀도는 입자당 5 내지 약 1500개 리간드 (평균적으로), 그리고 일부 구체예에서 입자당 약 150개보다 적은 리간드 또는 입자당 약 100개보다 적은 리간드 (가령, 입자당 약 5 내지 약 90개 리간드)가 있도록 제어된다.
다양한 구체예에서 제약학적 조성물은 T 세포에 제시를 위한 항원성 펩티드를 더욱 포함할 수 있고, 그리고 이것은 리간드-접합된 비드 또는 입자와 공동조제될 수 있다. 다양한 구체예에서, 제약학적 조성물은 상온 보존성이고, 그리고 투여에 앞서 재구성을 위한 동결건조된 형태에서 제공될 수 있거나, 또는 대안으로, 환자에 투여 (가령, 비경구 투여)를 위한 다른 편의한 형식에서 제공될 수 있다.
본원에서 설명된 제약학적 조성물은 이러한 조성물의 효과량을 병든 환자에 투여함으로써, 면역요법, 예를 들면, 항원 특이적 T 세포의 형성을 유도하기 위한 방법에서 유용하다. 특히, 항원 제시 플랫폼은 암, 감염성 질환 또는 자가면역 질환을 앓는 환자를 치료하거나, 또는 면역억제된 환자에 예방적 보호를 제공하는데 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 나노입자 조성물은 암 면역요법, 예를 들면, 체크포인트 저해제 요법 후 및/또는 입양 T 세포 면역요법 후 투여되고, 그리고 따라서, 다양한 암에서 증강된 및/또는 지속된 면역학적 공격을 제공한다.
본 발명은 본원에서 설명된 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 이를 발현하는 숙주 세포를 더욱 제공한다.
본 발명의 상세는 아래의 상세한 설명 및 청구항에서 진술된다. 비록 본원에서 설명된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법과 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있지만, 예시적인 방법과 재료가 하기에 설명된다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 그리고 이점은 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, 단수 형태는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함한다. 달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
도면의 간단한 설명
도면 1-3은 항-CD28에 대한 3개의 인간화 가변 중쇄 서열(서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6)을 보여준다.
도면 4-6은 항-CD28에 대한 3개의 인간화 가변 경쇄 서열(서열식별번호: 7, 8, 9, 10, 11, 12)을 보여준다.
도면 7은 변형된 불변 중쇄 서열(서열식별번호: 13, 14)을 보여준다.
도면 8은 불변 κ 경쇄 서열(서열식별번호: 15, 16)을 보여준다.
도면 9는 HLA 융합을 작제하기 위한 인간화 비-CD28-결합 가변 영역(서열식별번호: 17, 18)을 보여준다.
도면 10은 인간화 HLA-IgG4HC에 대한 아미노산 서열(서열식별번호: 19)을 보여준다.
도면 11은 경쇄 3 (LC3, 또는 Vκ3)에 대한 아미노산 서열(서열식별번호: 20)을 보여준다.
도면 12는 중쇄 1 (HC1)에 대한 아미노산 서열(서열식별번호: 21)을 보여준다.
도면 13은 중쇄 2 (HC2)에 대한 아미노산 서열(서열식별번호: 22)을 보여준다.
도면 14-16은 STABLEFAST-NS0 세포주에서 발현을 위한 발현 구조체를 보여준다.
도면 17은 인간화 항-CD28 mAb가 수퍼 효현제가 아니라는 것을 보여준다.
도면 18은 인간화 항-CD28 클론이 인간 T-세포주에서 CD28을 특이적으로 염색한다는 것을 보여준다. 도면 18(A): 뮤린 항인간 CD8 mAb (클론 9.3, 아이소타입 IgG2a)로 염색; 도면 18(B): 인간화 항-CD28 (아이소타입 IgG4)로 염색.
도면 19는 Fc 힌지 영역에 직접적으로 항원 제시 복합체의 융합에 근거된 더욱 작은 MHC-Ig 융합 단백질의 설계를 보여준다.
도면 20은 리간드가 가용한 일차 아민을 통해 접합된 PLGA 및 PLGA-PEG-COOH 나노-aAPC 사이에 비교를 보여준다. 1:4의 PEG-COOH : mPEG 비율에서, 비드는 안정할 뿐만 아니라 활성이었다.
도면 21은 나노-aAPC가 동계 TCRs를 갖는 T 세포를 특이적으로 염색한다는 것을 보여준다. TCR 결합 특이성에 대한 FACS-기초된 생물분석 검정이 도시된다.
도면 22는 PLGA-PEG aAPC 입자가 항원 특이적 T 세포의 증식을 용량 의존성 방식으로 자극한다는 것을 보여준다.
도면 23은 PLGA-PEG-기초된 aAPCs가 동결건조 시에 안정하다는 것을 보여준다.
도면 24는 증가하는 양의 SIY-적하된 PLGA-PEG 나노 aAPC와 함께 2C T 세포의 4 일자 배양을 보여준다.
도면 25는 나노-aAPCs로 자극 후 1 일에 T 세포 증식 클러스터를 보여준다.
도면 26은 변형된 (Gen 2.0) 동시자극성 리간드의 결합 활성을 보여준다.
도면 27은 Kb-SIY Fc-힌지 단백질에 근거된 나노-aAPCs가 동계 표적 2C T 세포를 특이적으로 염색한다는 것을 보여준다.
도면 28은 리간드의 부위 특이적 티올 접합을 갖는 나노-aAPC를 보여준다. 비드는 1:1 비율의 PEG-COOH 대 mPEG 중합체 (72B) 또는 1:9 PEG-mal:mPEG 비율 (77B)을 내포하였다. 둘 모두 안정하고 활성이었다.
도면 29는 힌지 이합체 구조체를 내포하는 나노 aAPCs를 이용한, Kb-특이적 2C T 세포 (A) 및 Db-gp100-특이적 pmel T 세포의 확대를 보여준다.
도면 30은 인간 CMV 또는 MART-1 특정한 T 세포의 나노 aAPC-기초된 확대를 보여준다. Dynal-기초된 APCs가 비교를 위해 도시된다.
도면 31은 예시적인 나노입자 제제를 도해한다. (A) 말레이미드 부위 지향된 화학으로 입자에 리간드의 접합; (B) 동적 광 산란 (DLS)에 의한 입자의 특징화; (C) NI-26 배치의 전하 및 PDI.
도면 32는 예시적인 나노입자 제제 배치의 성질을 열거한다.
발명의 상세한 설명
다음의 약어가 전역에서 이용된다: BLAST-기본 국부 정렬 검색 도구, CDR-상보성 결정 영역, Cκ-카파 경쇄 불변 영역, Fc-항체 단편 결정가능 영역, Fw-프레임워크 영역 (가변 영역의), HLA-인간 백혈구 항원, MHC-주요 조직적합성 복합체, VH-가변 중쇄, Vκ-가변 카파 경쇄, 그리고 V 영역-항체의 가변 영역, VH 또는 Vκ.
본 발명은 면역요법을 위한 조성물 및 방법을 제시하는데, 이들은 환자에서 항원 특이적 T 세포를 유도하기 위한 상온 보존 제약학적 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 이합체성 HLA 항원 제시 복합체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 인간화 면역글로불린 서열 또는 이들의 부분을 포함하고, 이들은 하나 또는 그 이상의 항원 (가령, 종양 항원(들))의 제시를 위한 이합체성 분자 복합체 및 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 동시자극성 신호를 환자에게 제공하기 위해, 인공 항원 제시 세포 (aAPCs) 상에서 리간드의 성분으로서 이용될 수 있다. 항원 제시 플랫폼은 아래에 더욱 상세하게 설명된 바와 같이, 인공 고체 지지체, 예를 들면, 중합성 비드 또는 입자를 포함하는 제약학적으로 허용되는 지지체에 근거될 수 있다.
일부 구체예에서, T-세포 동시자극성 신호는 항-CD28 항체 또는 이의 부분이다. 일부 구체예에서, 항-CD28 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, 또는 IgM에서 선택되는 최소한 하나의 인간 면역글로불린 아이소타입의 서열을 포함한다. 가령, 항-CD28 항체는 IgG 아이소타입일 수 있고, 그리고 하나 또는 그 이상의 IgG 생식계열 프레임워크 서열의 서열을 내포할 수 있다. 가령, 항-CD28은 인간 IGHV4 중쇄 아미노산 서열을 내포할 수 있는데, 이것은 1 내지 15개 아미노산 변형으로 변형될 수 있다. 이들 변형은 항원 결합 부위(들)의 완전성을 뒷받침하기 위한 뮤린 프레임워크 잔기를 포함할 수 있다.
상보성 결정 영역 (CDR)은 일부 구체예에서, 뮤린 항체 아미노산 서열에 근거되는데, 이것은 임의선택적으로 1 내지 10개, 예를 들면, 1 내지 5개 아미노산 변형을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 CDR은 생쥐 9.3 mAb에 근거되는데 (Tan et al.. J. Exp. Med. 1993 177:165), 이것은 공개적으로 가용하다. 예시적인 CDR은 도면 1-6에서 도시된다. 일부 구체예에서, 항체는 9.3 mAb의 풀 세트의 중쇄 및/또는 풀 세트의 경쇄 CDR을 갖는다. 가령, 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 다음의 CDR 중에서 1개, 2개 또는 3개를 내포하는데, 이들은 임의선택적으로, 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가에 의해 각각 변형될 수 있다: CDR1 (DYGVH; 서열식별번호: 23), CDR2 (VIWAGGGTNYNSALMS; 서열식별번호: 24), 그리고 CDR3 (DKGYSYYYSMDY; 서열식별번호: 25). 일부 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 다음의 CDR 중에서 1개, 2개 또는 3개를 내포하는데, 이들은 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가에 의해 각각 변형될 수 있다: CDR1 (RASESVEYYVTSLMQ; 서열식별번호: 26), CDR2 (AASNVES; 서열식별번호: 27), 그리고 CDR3 (QQSRKVPYT; 서열식별번호: 28).
일부 구체예에서, 항-CD28 리간드는 9.3 mAb와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하거나, 또는 9.3 mAb의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는 항체와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합한다. 동일한 또는 중복 에피토프를 갖는 항체는 예로서, 표면 플라스몬 공명 (Biacore)을 이용한 경쟁 면역검정을 비롯한 임의의 적합한 기술에 의해 선별될 수 있다.
대안적 CDR 서열, 가변 영역, 또는 CD28-결합 리간드가 다양한 구체예에서 이용될 수 있다. 대안적 리간드, CD28 에피토프, 그리고 항-CD28 항체는 예로서, US 특허 7,612,170, US 특허 6,987,171 및 US 특허 6,887,466에서 설명되고, 그리고 이들 개시는 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
일부 구체예에서, 항체 중쇄는 인간 IGHV4-59 생식계열 프레임워크 (FW)의 변이체를 포함하는데, 이것은 5 내지 15개 뮤린 FW 잔기를 포함하도록 변형된다. 일부 구체예에서, 항체는 경쇄 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 상기 경쇄 서열은 인간 IGKV4-01 FW 서열의 변이체이고, 그리고 3 내지 15개 뮤린 FW 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다.
항-CD28 인간 중쇄 서열은 예로서, 위치 1, 3, 6, 37, 48, 67, 71, 73, 76, 78, 82, 82a 및 82c (Kabat 넘버링에 근거됨)에서 하나 또는 그 이상 (가령, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 또는 모든) 뮤린 Fw 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다. 이들 위치에서 뮤린 Fw 잔기는 9.3 mAb에서와 동일할 수 있다. 경쇄는 위치 3, 4, 49, 70, 85, 87 및 80에서 하나 또는 그 이상 (가령, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 또는 모든) 뮤린 Fw 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다. 선별된 뮤린 Fw 잔기는 항원 결합 부위의 완전성을 뒷받침할 수 있다. 인간화 항-CD28 항체는 CD28에 대한 친화성 및 9.3 mAb의 T 세포 동시자극성 활성을 유지하고, 그리고 9.3 mAb보다 CD28 결합 및 T 세포 활성화에 대해 최소한 40%, 50%, 75%, 80%, 90% 및 일부 구체예에서 100% 또는 그 이상 효과적이다. 다양한 구체예에서, 항-CD28 리간드는 수퍼 효현제가 아니다. 일부 구체예에서, 항-CD28 리간드는 9.3 mAb와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합한다.
항체는 불변 영역을 포함할 수 있고, 그리고 상기 불변 영역은 임의의 아이소타입일 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 불변 영역은 인간 IgG4 또는 이의 변이체이다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 하나 또는 그 이상의 힌지 안정화 돌연변이를 포함하는데, 이것은 CH 사슬 (가령, S241, 이것은 P로 치환될 수 있다)에서 도입될 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 불변 영역을 포함하고, 그리고 상기 불변 영역은 항체를 고체 지지체에 화학적으로 연계하는데 적합한 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다. 연계하는데 적합한 하나 또는 그 이상의 돌연변이는 아미노산 측쇄 기능기 (가령, 티올, 아민, 또는 히드록실), 예를 들면, 비대합된 시스테인 (가령, S473에서)을 창출할 수 있다. 불변 영역에 대한 다른 변화는 Fc 감마 수용체 결합을 감소시키는 변형을 포함한다. 가령, CH 사슬은 L248에서 변형될 수 있다 (가령, L248E).
일부 구체예에서, 동시자극성 리간드는 이러한 리간드가 나노입자 표면에 대한 기능적 부착에 더욱 적합하도록 최소화된다. 가령, 항체는 항체 단편, 예를 들면, F(ab')2 또는 Fab일 수 있거나, 또는 단일 사슬 항체 또는 다른 항원 결합 항체 단편이다. 가령, 항체 단편은 본원에서 설명된 인간화 mAb 또는 다른 항-CD28의 단일 사슬 가변 단편일 수 있다.
일부 구체예에서, 동시자극성 분자는 항CD28 mAb, 예를 들면, 본원에서 설명된 항체의 VH 및 VL 사슬에 의해 형성된 항원 결합 루프를 포함하거나 또는 이들로 본질적으로 구성되는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)이다. scFv 항체 구조체는 짧은 펩티드 링커에 의해 머리-머리 또는 머리-꼬리 형상에서 함께 연결된 1개 또는 여러 개 (2, 3, 4, 또는 5개)의 VH 및 VL 초가변 영역 사슬 (3-D 항원성 에피토프 결합 주머니를 함께 형성하는 각 사슬의 부분)을 포함할 수 있다. 이런 구조체는 그들의 더욱 작은 크기로 인해 완전 합성 루트를 통해 편의하게 생산될 수 있다. 게다가, scFv는 면역원성에 대한 더욱 낮은 잠재력을 전시할 수 있다.
다른 구체예에서, 동시자극성 리간드는 동시자극성 분자 리간드 또는 저해성 리간드의 scFv에 결합된 하나 또는 그 이상의 HLA 분자를 포함하는 이중특이적 구조체이다. 항원 제시 복합체 및 동시자극성 또는 저해성 리간드는 이중특이적 구조체가 나노입자 표면에 공유 연결되도록 허용하는 펩티드 묶음을 통해 접합될 수 있다. 일부 구체예에서, 이런 구조체는 HLA의 더욱 큰 구조체 및 NP 표면에 독립적으로 각각 연결된 동시자극성 또는 저해성 리간드를 내포하는 나노입자와 동일한 활성을 산출하고, 따라서 제조 이점을 제공한다.
일부 구체예에서, 다른 리간드-결합 형식이 펩티드, 앱타머 및 아드넥틴을 비롯한 동시자극성 리간드를 생산하는데 이용된다. 표적 결합에 대한 다양한 형식은 본원에 전체적으로 참조로서 편입된 US 특허 번호 또는 특허 공개 번호 US 7,417,130, US 2004/132094, US 5,831,012, US 2004/023334, US 7,250,297, US 6,818,418, US 2004/209243, US 7,838,629, US 7,186,524, US 6,004,746, US 5,475,096, US 2004/146938, US 2004/157209, US 6,994,982, US 6,794,144, US 2010/239633, US 7,803,907, US 2010/119446 및/또는 US 7,166,697에서 설명된 바와 같이, 단일-도메인 항체, 재조합 중쇄-단독 항체 (VHH), 단일 사슬 항체 (scFv), 상어 중쇄-단독 항체 (VNAR), 마이크로단백질 (시스테인 매듭 단백질, 크노틴), DARPin, 테트라넥틴, 어피바디; 트랜스바디, 안티칼린, 아필린, 미세소체, 펩티드 앱타머, 필로머, 스트라도바디, 맥시바디, 에비바디, 피노머, 아르마딜로 반복 단백질, 쿠니츠 도메인, 아비머, 아트리머, 프로바디, 이뮤노바디, 트리오맙, 트로이바디, 펩바디, 유니바디, 듀오바디, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 펩티드 모방 분자, 또는 합성 분자를 포함한다. 또한, Storz MAbs. 2011 May-Jun; 3(3): 310-317을 참조한다.
동시자극성 분자는 항원 특이적 T 세포를 유도하기 위해, 항원-제시 분자 복합체를 갖는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 항원-제시 분자 복합체는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 복합체, 또는 항원 결합 틈새를 포함하는 이들의 부분을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 분자 복합체는 추가 이종성 서열, 예를 들면, 면역글로불린 서열을 내포할 수 있는 1개 또는 2개의 HLA 아미노산 서열을 포함한다. 대안적 이종성 서열은 이합체화 아미노산 서열, 예를 들면, c-fos 및 c-jun을 포함한다. HLA-융합은 일부 구체예에서 안정성, 결합 친화성 및/또는 T 세포 활성화에서 추가 이점을 제공한다.
다양한 구체예에서, 항원 제시 복합체는 MHC 클래스 I 분자 복합체 또는 MHC 클래스 II 분자 복합체이거나, 또는 대안으로 CD1d이다. MHC 클래스 I 분자 복합체는 최소한 2개의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 첫 번째 융합 단백질은 첫 번째 MHC 클래스 I α 사슬 및 첫 번째 면역글로불린 중쇄를 포함하고, 그리고 두 번째 융합 단백질은 두 번째 MHC 클래스 I α 사슬 및 두 번째 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 첫 번째와 두 번째 면역글로불린 중쇄는 연관하여 MHC 클래스 I 분자 복합체를 형성한다. MHC 클래스 I 분자 복합체는 첫 번째 MHC 클래스 I 펩티드 결합 틈새 및 두 번째 MHC 클래스 I 펩티드 결합 틈새를 포함한다. MHC 클래스 II 분자 복합체는 최소한 4개의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 2개의 첫 번째 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 중쇄 및 (ii) MHC 클래스 IIβ 사슬의 세포외 도메인을 포함한다. 2개의 두 번째 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 경쇄 및 (ii) MHC 클래스 IIα 사슬의 세포외 도메인을 포함한다. 2개의 첫 번째 및 2개의 두 번째 융합 단백질은 연관하여 MHC 클래스 II 분자 복합체를 형성한다. 각 첫 번째 융합 단백질의 MHC 클래스 IIβ 사슬의 세포외 도메인 및 각 두 번째 융합 단백질의 MHC 클래스 IIα 사슬의 세포외 도메인은 MHC 클래스 II 펩티드 결합 틈새를 형성한다. 항원성 펩티드는 펩티드 결합 틈새에 결합된다. 다양한 구체예에서, 면역글로불린 서열은 이합체화를 뒷받침하기 위한 힌지 영역을 포함하는 부분적인 중쇄 서열이다.
일부 구체예에서, 항원 제시 복합체는 비대합된 시스테인을 내포하도록 가공된, 또는 나노입자에 접합을 위한 자연발생 비대합된 시스테인을 이용하는 합성 또는 재조합 HLA 단위체 (가령, β2 마이크로글로불린을 갖는 클래스 I 알파 사슬)이다. 게다가, 동시자극성 신호 (또는 다른 항체-기초된 리간드)는 Fab 또는 scFv일 수 있다. 이런 구체예에서, 2개의 신호는 원하는 수용체에 결합하는 항원 결합 항체 단편 (가령, scFv)에 묶인 HLA 분자를 포함하는 단일 다중기능성 구조체에서 합동될 수 있다.
다른 양상 및 구체예에서, 본 발명은 T 세포에 항원의 제시를 위한 비드- 또는 입자-접합된 분자 복합체를 제공하고, 여기서 상기 복합체는 항원 제시 서열, 예를 들면, HLA 아미노산 서열에 융합된 인간화 면역글로불린 서열 또는 이의 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 서열은 인간 중쇄 서열 (가령, IGHV4 프레임워크)이다. 가변 영역은 CD28, 또는 다른 인간 단백질에 항원 결합 활성을 포함하지 않는다. HLA 아미노산 서열은 HLA-A*02:01 (IMGT 수탁 번호 HLA00005) 또는 이의 유도체 또는 단편, 예를 들면, 1 내지 10개, 또는 1 내지 5개 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 유도체일 수 있다. 인간화 면역글로불린 서열은 HLA 및 면역글로불린 서열 사이에 링커 아미노산 서열을 더욱 포함할 수 있다. 바람직하게는, 링커는 면역원성을 결여한다. 분자 복합체는 β2 마이크로글로불린 펩티드를 더욱 포함할 수 있다.
다양한 구체예에서, 면역글로불린 융합 서열은 IgG, IgD, IgA, 또는 IgM 아이소타입이고, 그리고 임의의 인간 생식계열 프레임워크로부터 유래될 수 있다. 생식계열 프레임워크는 IGHV4 (가령, IGHV4-59)를 포함하고, 이것은 항-CD28에 대하여 설명된 뮤린 프레임워크 잔기 중에서 하나 또는 그 이상을 내포하거나 또는 내포하지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 앞서 설명된 항-CD28 항체의 중쇄 (뮤린 프레임워크 잔기가 있거나 또는 없음)는 이러한 양상에 따라서 HLA에 융합되고, 그리고 이런 구체예에서, 가변 영역은 CD28 결합을 감소시키거나 또는 제거하도록 변형된다.
일부 구체예에서, HLA 융합 구조체는 가변적 사슬 서열을 내포하지 않는다. 가령, HLA 또는 항원 제시 복합체는 이합체성 HLA를 제공하기 위해 힌지 영역 위에서 Ig 불변 영역 서열에 융합될 수 있다. 가령, HLA 또는 이의 항원 제시 부분은 각 IgG 중쇄의 CH1 부분에 접합될 수 있다. 모든 IgG 분자는 힌지 영역 (위쪽 및 아래쪽)에서 이황화 결합에 의해 함께 연결된 2개의 동일한 중쇄 (불변과 가변 영역)로 구성된다. 가령, 일부 구체예에서, HLA 분자 또는 항원 제시 복합체는 CH1 (힌지 영역 위에서 IgH 사슬의 N 말단 단부)에 융합되고, 따라서 임의의 VH 및 VL 경쇄 서열의 결여로 인해 더욱 작은 이합체성 융합 단백질을 창출한다. 따라서, 이런 구조체는 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 것이다. 이런 구조체는 제조 이점을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 면역원성에 대한 더욱 적은 잠재력을 전시한다. 일부 구체예에서, 이런 구조체는 또한, 힌지 영역으로부터 더욱 작은 거리에도 불구하고, 효율적인 T 세포 활성화를 위한 충분한 결합 협동성을 전시한다.
입자 화학은 리간드 밀도가 미세 조정되는 것을 허용한다. 일반적으로, 나노 aAPCs는 평균적으로 그들의 표면에 접합된 5 내지 약 1500개 리간드를 갖는다. 일부 구체예에서, 입자는 입자당 약 500개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 400개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 300개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 200개보다 적은 리간드를 갖는다. 일부 구체예에서, 중합성 나노입자는 입자당 약 150개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 100개보다 적은 리간드를 갖는다. 가령, 입자는 입자당 약 5 내지 약 90개 리간드를 가질 수 있다. 다양한 구체예에서, 나노입자는 입자당 약 90개보다 적은 접합된 리간드, 또는 입자당 약 80개보다 적은, 또는 약 70개보다 적은, 또는 약 60개보다 적은, 또는 약 50개보다 적은, 또는 약 40개보다 적은, 또는 약 30개보다 적은, 또는 약 20개보다 적은 접합된 리간드를 포함한다. 일부 구체예에서, 입자는 입자당 10 내지 약 80개 접합된 리간드, 또는 10 내지 약 70개, 또는 약 10 내지 약 50개 접합된 리간드를 표면 상에 내포한다.
또 다른 구체예에서, 항원 제시 복합체 (가령, HLA 서열)은 Ig 융합 상대를 내포하지 않고, 그리고 단위체성이다. 가령, 일부 구체예에서, 항원 제시 복합체 또는 HLA 분자 (가령, HLA-A2 등)의 C 말단 단부는 고체/반고체 기질, 예를 들면, 합성 나노입자에서 기능기 (가령, 말레이미드 모이어티)에 부위 지향된 결합에 적합한 펩티드 묶음 서열을 내포한다 (가령, PLGA-PEG-말레이미드 또는 PLA-PEG-말레이미드 블록 중합체를 내포한다). 묶음 서열은 친수성 잔기, 예를 들면, Gly, Ser, Ala 및 Thr로 지배적으로 구성될 수 있는 임의의 적합한 서열, 예를 들면, GGGSG (서열식별번호: 29) 또는 AAAGG (서열식별번호: 30)의 2, 3, 4, 또는 5개 반복을 내포할 수 있는데, 시스테인 잔기는 약 5 내지 약 15개 (또는 약 5 내지 약 10개 아미노산) 묶음 내에 어딘가에 통합된다. 시스테인 잔기는 분자내 이황화 결합을 형성하지 않는 것으로 예측된 부위에서 통합되어야 한다.
일부 구체예에서, HLA-Ig 융합 또는 다른 HLA 구조체는 T 세포에 제시를 위해 HLA에 결합된 항원성 펩티드를 더욱 포함한다. 항원성 펩티드는 티로시나아제, hTERT, MAGE-1, MAGE-3, gp-100, NY-ESO-1, Melan A/Mart-1, HPV 16-E7, gp75/brown, BAGE 및 S-100 중에서 하나 또는 그 이상의 항원성 부분 및/또는 클래스 I 또는 클래스 II 복합체에 의한 제시에 대해 WO 2004/006951에서 설명된 바와 같은 임의의 항원성 펩티드를 포함할 수 있고, 상기 문헌의 내용은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
항원 제시 복합체가 제공될 수 있는 다른 신호는 다음을 포함한다: CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), B7-H3, 4-1BBL, CD27, CD30, CD134 (OX-40L), B7h (B7RP-1), CD40, LIGHT, (또는 이런 분자 또는 이들의 활성 부분의 본원에서 설명된 바와 같이 임의선택적으로 인간화된 Ig 융합), HVEM에 특이적으로 결합하는 항체, CD40L에 특이적으로 결합하는 항체, OX40에 특이적으로 결합하는 항체, Fas에 특이적으로 결합하는 항체, PD1에 특이적으로 결합하는 항체, GITR에 특이적으로 결합하는 항체, 그리고 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체. 동시자극성 신호가 자연 리간드에 대한 항체인 경우에, 항체 리간드 (가령, scFv 및 이중특이적 구조체)를 인간화하고 및/또는 이의 크기를 최소화하고, 그리고 입자에 접합을 위한 항체를 정교하게 설계하기 위해 본원에서 이용된 기술이 이용될 수 있다.
본 발명의 항원 제시 플랫폼에 유용한 부착 분자는 T 세포에 또는 T 세포 전구체에 상기 플랫폼의 부착을 매개할 수 있다. 본 발명에서 유용한 부착 분자는 예로서, ICAM-1 및 LFA-3을 포함한다.
T 세포 성장 인자는 T 세포의 증식 및/또는 분화에 영향을 준다. T 세포 성장 인자의 실례는 사이토킨 (가령, 인터류킨, 인터페론) 및 초항원을 포함한다. 특히 유용한 사이토킨은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15 및 감마 인터페론을 포함한다. T 세포 성장 인자는 비드 또는 입자 내에 피포되거나 또는 표면에 화학적으로 접합되거나 또는 흡착될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 나노입자는 입자의 소수성 코어 내에 포획된 치료 화합물 또는 단백질/펩티드 (가령, 화학요법 작용제, 사이토킨 또는 인터류킨, 예를 들면, IL-2, T 세포를 유인하는 CCL9와 같은 케모킨 및/또는 항-PD1 항체 또는 항-PD1 펩티드와 같은 체크포인트 저해제 분자)를 더욱 포함한다. 이런 aAPC는 일부 구체예에서, 자극 또는 저해뿐만 아니라 재프로그래밍을 위해 특정한 세포를 표적으로 하도록 작제된다. 일부 구체예에서, 포획된 화합물은 입자 매트릭스의 분해에 의해 방출된다. 이런 aAPC는 부정확한 상호작용으로 인한 원치 않는 활성을 제한함으로써, 복합 요법을 더욱 내약성이고 유효하도록 만들 수 있었다. 일부 구체예에서, 나노입자 aAPCs는 약물 화합물, 예를 들면, 사이토킨 및 소형 분자 약물을 피포하지 않는다.
본 발명의 양상에 따라서 제시된 항원은 종양 연관된 항원을 포함한다. 종양-연관된 항원은 이들이 유래되는 종양에 의해 배타적으로 발현된 독특한 종양 항원, 많은 종양에서 발현되지만 정상적인 성체 조직에서는 발현되지 않는 공유된 종양 항원 (종양태아 항원, 암/고환 항원), 그리고 종양이 발생했던 정상적인 조직에 의해 또한 발현된 조직 특이적 항원을 포함한다. 종양-연관된 항원은 예로서, 배아 항원, 비정상적인 번역후 변형을 갖는 항원, 분화 항원, 돌연변이된 종양유전자 또는 종양 억제인자의 산물, 융합 단백질, 또는 종양바이러스 단백질일 수 있다. 다양한 종양-연관된 항원은 당분야에서 공지되고, 그리고 이들 중에서 다수는 공개적으로 가용하다. 종양태아 및 배아 항원은 암배아 항원 및 알파 태아단백질 (통상적으로 단지 발달 중인 배아에서만 고도로 발현되지만, 각각 간 및 결장의 종양에 의해 빈번하게 고도로 발현됨), 태반 알칼리 인산분해효소 시알릴-루이스 X (선암종에서 발현됨), CA-125 및 CA-19 (위장관, 간 및 부인과 종양에서 발현됨), TAG-72 (결장직장 종양에서 발현됨), 상피 당단백질 2 (많은 암종에서 발현됨), 췌장 종양태아 항원, 5T4 (위 암종에서 발현됨), 알파 태아단백질 수용체 (복수 종양 유형, 특히 유방 종양에서 발현됨), 그리고 M2A (생식 세포 신생물에서 발현됨)를 포함한다.
일부 구체예에서, 최소한 하나의 항원은 암/고환 (CT) 항원이고, 이것은 NY-ESO-1, MAGE-A, B 및 C, CTAG-1, CTAG-45, GAGE, 그리고 SSX를 포함할 수 있는데, 이들은 고환의 생식 세포에 의해 정상적으로 발현되지만 정상적인 성체 체조직에서는 발현되지 않는다. 하지만, 흑색종, 유방, 간, 폐, 난소 및 호지킨 림프종을 비롯한 다양한 유형의 암 세포가 CT 항원을 발현하는 것으로 밝혀졌다.
종양-연관된 분화 항원은 티로시나아제 (흑색종에서 발현됨) 및 특정 표면 면역글로불린 (림프종에서 발현됨)을 포함한다.
돌연변이된 종양유전자 또는 종양-억제 유전자 산물은 Ras 및 ρ53 (이들 둘 모두 많은 종양 유형에서 발현된다, Her-2/neu (유방 - 및 부인과 암에서 발현됨), EGF-R, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 망막모세포종 유전자 산물, myc (폐암과 연관됨), ras, 유방 종양과 연관된 p53 비돌연변이체, MAGE-1, 그리고 MAGE-3 (흑색종, 폐 및 다른 암과 연관됨)을 포함한다.
다른 종양 항원은 융합 단백질, 예를 들면, BCR-ABL (이것은 크롬 골수성 백혈병에서 발현된다), 그리고 종양바이러스 단백질, 예를 들면, HPV 유형 16, E6 및 E7 (이들은 경부 암종에서 발견된다)을 포함한다. 조직 특이적 종양 항원은 멜라노트랜스페린 및 MUCl (췌장 및 유방암에서 발현됨); CD 10 (이전에 공통 급성 림프모구성 백혈병 항원, 또는 CALLA로서 알려져 있음) 또는 표면 면역글로불린 (B 세포 백혈병 및 림프종에서 발현됨); IL-2 수용체, T 세포 수용체, CD45R, CD4+/CD8+의 α 사슬 (T 세포 백혈병 및 림프종에서 발현됨); 전립선-특이적 항원 및 전립선 산-포스파타아제 (전립선 암종에서 발현됨); gp100, MelanA/Mart-1, 티로시나아제, gp75/brown, BAGE 및 S-100 (흑색종에서 발현됨); 시토케라틴 (다양한 암종에서 발현됨); 그리고 CD19, CD20 및 CD37 (림프종에서 발현됨)을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원성 펩티드는 MART-1, gp100, NY-ESO-1 및 MAGE-A3을 포함하는데, 이들은 본원에서 설명된 HLA 항원 제시 복합체, 예를 들면, 본원에서 설명된 HLA-Ig 융합 복합체에 의해 제시된다.
일부 구체예에서, aAPC는 종양-주동 돌연변이에 근거된 하나 또는 그 이상의 항원성 펩티드, 또는 환자 종양의 개인맞춤된 평가로부터 결정된 신항원을 제시한다.
또 다른 구체예에서, 조성물은 종양 유형에 대한 복수의 항원, 예를 들면, 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 항원 (가령, 2 내지 10개 또는 3-8개 항원)을 내포하는 aAPCs의 칵테일을 포함한다. 일반적으로, 각 aAPC는 단일 항원을 제시한다.
일부 구체예에서, 항원은 자가항원인데, 이것은 생물체가 면역 반응을 발생시키는 생물체의 자체 "자가항원"이다. 자가항원은 자가면역 질환, 예를 들면, 굿파스처 증후군, 다발성 경화증, 그레이브스병, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 루푸스, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 류마티스성 관절염, 심상성 천포창, 애디슨병, 포진성 피부염, 소아 지방변증, 그리고 하시모토 갑상선염에 관련된다. 가령, 당뇨병-관련된 자가항원은 인슐린, 글루타민산 탈카르복실화효소 (GAD) 및 다른 도세포 자가항원, 예를 들면, ICA 512/IA-2 단백질 티로신 포스파타아제, ICA12, ICA69, 인슐린전구물질 또는 이의 면역학적으로 활성 단편 (가령, 인슐린 B- 사슬, A 사슬, C 펩티드 또는 이들의 면역학적으로 활성 단편), IGRP, HSP60, 카르복시펩티드분해효소 H, 페리페린, 강글리오시드 (가령, GM1-2, GM3) 또는 이들의 면역학적으로 활성 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 항원(들)은 감염체의 항원, 예를 들면, 원생동물, 세균, 균류 (단세포 및 다세포 둘 모두), 바이러스, 프리온, 세포내 기생충, 연충, 그리고 면역 반응을 유도할 수 있는 다른 감염체의 성분이다.
항원성 펩티드를 포함하는 항원은 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는 U.S. 특허 6,268,411에서 설명된 바와 같이, 항원 제시 복합체의 항원 결합 틈새에 능동적으로 또는 수동적으로 결합될 수 있다. 임의선택적으로, 항원성 펩티드는 펩티드 결합 틈새에 공유 결합될 수 있다.
원하는 경우에, 펩티드 묶음이 항원성 펩티드를 펩티드 결합 틈새에 연결하는데 이용될 수 있다. 가령, 복수 클래스 I MHC 분자의 결정학적 분석은 β2M의 아미노 말단이 MHC 펩티드 결합 틈새 내에 상재하는 항원성 펩티드의 카르복실 말단으로부터 매우 근접한다는 것을 지시한다 (대략 20.5 옹스트롬 떨어져 있음). 따라서, 상대적으로 짧은 링커 서열 (길이에서 대략 13개 아미노산)을 이용하여, 펩티드를 β2M의 아미노 말단에 묶을 수 있다. 상기 서열이 적절하면, 펩티드는 MHC 결합 그루브에 결합할 것이다 (본원에 참조로서 편입되는 U.S. 특허 6,268,411을 참조한다).
일부 구체예에서, aAPCs는 이들이 항원 특이적 T 세포 (미경험 세포 포함)를 확대하고 활성화시키는, 예를 들면, 세포독성 T 세포 및 이상적으로는 길게 생존하는 기억 T 세포를 생산하는 것을 허용하는 물리적 성질을 갖는다. 본 발명에 따른 나노-aAPC는 그 중에서도 특히, 입자 크기, 리간드 친화성, 리간드 결합의 지속 기간, 결합 리간드의 밀도 및/또는 클러스터, 리간드의 크기 및 정향, 그리고 입자 표면 성질의 양상에 근거하여 가공된다. 인공 항원 제시 세포 (aAPCs)는 전통적으로, 면역 시냅스의 맥락에서 고려되는데, 여기서 TCR 및 공동신호 군집화가 특히 미경험 T 세포에 대한 활성화에서 중요한 역할을 하는 것으로 고려된다. 따라서, aAPCs가 "뗏목" 또는 리간드 클러스터를 제공하도록 설계된 세포-크기산정된 입자 및/또는 매트릭스를 이용함으로써 이들 상호작용을 모의하려는 시도에서 창출되긴 했지만, 현재의 나노규모 aAPCs는 다양한 구체예에서 가공된 입자 크기 및 화학, T 세포 리간드, 리간드 정향, 리간드 밀도, 그리고 리간드 비율을 갖는 나노-크기 입자를 통해 생물학적 시스템을 모의한다.
일부 구체예에서, 항원-제시 복합체 및 동시자극성 신호는 PEG 공중합체의 말단 단부 (가령, 입자의 표면을 향하여 바깥쪽을 향하는 단부)에서 표면 기능기를 갖는 PLGA / PLGA-PEG 입자 또는 PLA / PLA-PEG 입자, 예를 들면, PLGA-PEG-말레이미드 또는 PLA-PEG-말레이미드 입자에 접합되는데, 이들은 친수성 외부 표면 상에서 화학적 연계를 위한 기능기를 제공한다. 일부 구체예에서, aAPCs는 혈액/림프 교환을 통한 림프절로의 트래피킹을 비롯하여, 표적 조직의 분포를 허용할 만큼 충분히 길게 말초혈 순환에서 존속한다. 껍질의 조성 역시 생체분포에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 다양한 구체예에서 입자는 친수성 껍질을 갖는데, 이것은 상기 공중합체의 PEG 부분에 의해 형성될 수 있다. 다양한 구체예에서, 입자의 전하는 예로서, PLGA 또는 PLA에서 COOH 기의 조합뿐만 아니라 입자의 표면에 부착된 표적화 리간드에 의해 기여된 전하로 인해 약간 음성이다. 일부 구체예에서, 입자 (접합된 리간드가 있거나 또는 없음)는 약 0 내지 약 -20 mV, 또는 일부 구체예에서 -5 내지 -15 mV, 또는 약 -5 내지 약 -10 mV의 표면 전하를 갖는다. 일부 구체예에서, 나노입자의 크기 및 표면 특성은 이들이 T 세포에 의해 내재화될 수 있는 정도이다.
PLGA-PEG 공중합체를 포함하는 나노입자는 예로서, 본원에 참조로서 편입되는 US 특허 8,420,123에서 설명된다.
입자는 불규칙한 모양으로부터 구형으로 및/또는 불균등한 또는 불규칙한 표면을 갖는 것으로부터 평활면을 갖는 것으로 변할 수 있다. 구형 입자는 불규칙한 크기의 입자에 비하여 더욱 적은 표면적을 갖는다. 구형 입자가 이용되면, 감소된 표면적으로 인해 더욱 적은 시약이 필요하다. 다른 한편, 불규칙하게 성형된 입자는 구형 입자보다 훨씬 큰 표면적을 갖는데, 이것은 세포에 대한 표면적 및 표면 접촉 면적당 접합된 단백질 함량의 이점을 제공한다. 가령, 비대칭 나노입자는 다음의 범위 중에서 한 가지에 있는, 최소한 하나의 축을 따라서 굴곡의 반지름을 갖는 최소한 하나의 표면을 가질 수 있다: (a) 약 1 nm 내지 약 10 nm; (b) 약 11 nm 내지 약 100 nm; (c) 약 101 nm 내지 약 400 nm; (d) 약 401 nm 내지 약 1 μm; (e) 약 10 μm 내지 약 20 μm; (f) 약 20 μm 내지 약 100 μm; 그리고 (g) 약 101 μm 내지 약 1 mm. 일부 구체예에서, 비대칭 나노입자는 x 축을 따라서 치수 (a), y 축을 따라서 치수 (b), 그리고 z-축을 따라서 치수 (c)에 의해 규정된 비대칭 모양을 가질 수 있고, 여기서 (a), (b), 또는 (c) 중에서 최소한 하나는 최소한 하나의 다른 치수 (a), (b), 또는 (c)에 동등하지 않다. 일부 구체예에서, 비대칭 모양은 타원체인데, 이것은 다음의 방정식 중에서 한 가지에 의해 설명될 수 있다: a > b = c (장형 타원체); a > b > c (3축 타원체); 그리고 a = b > c (편평 타원체). 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 비대칭 나노입자는 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는 WO 2013/086500에서 설명된다.
입자 크기는 다양한 구체예에서 직경 (평균 직경)에서 20 내지 500 nm, 또는 50 내지 500 nm의 범위 안에 있다. 일부 구체예에서, 입자는 종양 조직을 비롯한 조직의 더욱 우수한 말초혈 순환 및 침투를 허용하는, 약 400 nm보다 작은, 또는 약 300 nm보다 작은, 또는 약 200 nm보다 작은 평균 크기를 갖는다. 일부 구체예에서, 나노입자는 약 50 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 100 nm 내지 약 200 nm, 예를 들면, 약 120 nm 내지 약 180 nm 또는 약 50 내지 약 100 nm의 평균 크기 (가령, 직경 또는 가장 큰 축)를 갖는다. 용어 "약"은 수치 특질에 연결될 때, ±10%를 의미한다. 일부 구체예에서, 입자 중에서 최소한 90%는 약 120 nm 내지 약 180 nm 또는 약 40 nm 내지 약 110 nm의 범위 안에 있다. 입자는 크기에서 균일하거나 또는 크기에서 변할 수 있고, 평균 입자 크기가 바람직하게는 앞서 설명된 바와 같다. 일부 구체예에서, 입자는 "EPR 효과" (증강된 투과성 및 체류 효과)를 이용할 만큼 충분히 작다.
본원에서 설명된 리간드 및 분자 복합체는 임의의 가용한 과정을 이용하여 비드에 화학적으로 접합될 수 있다. 리간드 결합을 위한 기능기는 PEG-COOH, PEG-NH2, PEG-SH, PEG-말레이미드, PEG-피리딜 이황화물 및 PEG 아크릴레이트를 포함한다. 가령, Hermanson, BlOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, New York, 1996을 참조한다. 활성화 기능기는 알킬 및 아실 할로겐화물, 아민, 술피드릴, 알데히드, 불포화된 결합, 히드라지드, 이소시안산염, 이소티오시안산염, 케톤, 아지드, 알킨-유도체, 무수물, 에폭시드, 탄산염, 아미노옥시, 푸란-유도체 및 화학 결합을 활성화시키는 것으로 알려져 있는 다른 기를 포함한다. 대안으로, 분자는 소형 분자-연계 시약의 이용을 통해 고체 지지체에 결합될 수 있다. 연계 시약의 무제한적 실례는 카르보디이미드, 말레이미드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 비스클로로에틸아민, 이중기능성 알데히드, 예를 들면, 글루타르알데히드, 무수물 등을 포함한다. 다른 구체예에서, 분자는 당분야에서 널리 공지된 바와 같이, 친화성 결합, 예를 들면, 비오틴-스트렙타비딘 연쇄 또는 연계를 통해 고체 지지체에 연계될 수 있다. 가령, 스트렙타비딘은 공유 또는 비공유 부착에 의해 고체 지지체에 결합될 수 있고, 그리고 비오틴화된 분자는 당분야에서 널리 공지된 방법을 이용하여 합성될 수 있다.
활성화 화학은 고체 지지체의 표면에 분자의 특정하고 안정된 부착을 허용한다. 단백질을 기능기에 부착하는데 이용될 수 있는 다양한 방법이 있다. 가령, 통상적인 교차연결제 글루타르알데히드가 2-단계 과정에서 단백질 아민 기를 아민화된 고체 지지체 표면에 부착하는데 이용될 수 있다. 결과의 연쇄는 가수분해적으로 안정하다. 다른 방법은 단백질 상에서 아민과 반응하는 n-히드로-숙신이미도 (NHS) 에스테르를 내포하는 교차연결제, 아민-, 술피드릴-, 또는 히스티딘-내포 단백질과 반응하는 활성 할로겐을 내포하는 교차연결제, 아민 또는 술피드릴 기와 반응하는 에폭시드를 내포하는 교차연결제의 이용, 말레이미드 기 및 술피드릴 기 사이에 접합, 그리고 펜던트 당 모이어티의 과옥소산염 산화에 의한 단백질 알데히드 기의 형성, 그 이후에 환원성 아미노화를 포함한다.
일부 구체예에서, 입자 또는 비드는 코어 중합체로서 PLGA, PLGA-PEG-말레이미드, 그리고 에스테르-말단캡 PLGA-PEG를 포함하는 중합체이다. 대안으로, 입자 또는 비드는 코어 중합체 PLA, PLA-PEG-말레이미드, 그리고 에스테르-말단캡 PLA-PEG를 포함한다. 말레이미드 기는 입자의 외측 표면 상에서 친수성 "스텔스" 코팅 (PEG)뿐만 아니라 가용한 최소한 하나의 유리 술피드릴 (-SH) 기를 갖는 리간드의 공유 부착에 이용될 수 있는 이러한 껍질에 부착된 기능기를 형성된 입자에 제공한다. 가령, HLA-Ig 리간드 및/또는 항-CD28 (또는 다른 항체 리간드)는 Fc 내에 S473C 치환을 내포하는 인간 IgG4 프레임워크 (본원에서 설명된 바와 같음)에서 작제될 수 있다. HLA-Ig 또는 항-CD28의 473에서 이러한 비대합된 시스테인 잔기는 온화한 환원 조건 하에, PEG에 부착된 말레이미드 기에 접합될 수 있다. 온화한 환원 조건은 이들 단백질, 특히 HLA-Ig 분자의 HLA-베타-2-마이크로글로불린 부분을 비가역적으로 변성시킬 가능성이 낮다.
한 예시적인 구체예에서, 나노입자는 생체내에서 특정한 생체내분해 비율 (PLGA 중합체의 LA:GA 비율 및/또는 분자량을 조정함으로써), 혈청 단백질에 의한 옵소닌화 및 순환으로부터 제거를 막는 친수성 외부 껍질 ("PEG 브러시"와 유사하게 작용), 리간드 밀도의 일관된 제어 (1 분자/말레이미드 기의 확률 관계)로 기능화된 표면, 그리고 코어로부터 멀리 리간드의 정향에 대해 조정될 수 있는 코어 (PLGA)를 갖는다. 예시적인 구체예에서, PLGA는 5/95, 10/90, 15/85, 20/80, 25/75, 30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 50/50, 55/45, 60/40, 65/35, 70/30, 75/25, 80/20, 85/15, 90/10, 또는 95/5의 L/G의 조성을 비롯하여, 20:1 내지 1:20의 LA:GA 비율에 근거된다. PLGA는 이의 에스테르 연쇄의 가수분해에 의해 분해된다. PLGA의 분해를 위해 필요한 시간은 단위체의 비율에 관련된다: 글리콜리드 단위의 함량이 더욱 높을수록, 지배적으로 락티드 단위와 비교하여 분해에 필요한 시간이 더욱 작다. 이에 더하여, 에스테르 (유리 카르복실산과는 대조적으로)로 말단캡핑된 중합체는 더욱 긴 분해 반감기를 갖는다.
일부 구체예에서, PLGA는 4:1 내지 1:4, 그리고 일부 구체예에서 약 1:1인 LA:GA 비율에 근거된다. 일부 구체예에서, PLGA 코어는 약 20K 내지 약 50K, 또는 약 30K 내지 약 40K (가령, 약 35K)의 분자량을 갖는다. PLGA-PEG 중합체 (PLGA-PEG-말레이미드 및 PLGA-PEG-MeOH 중합체 포함)는 분자량에서 10K 내지 30K (가령, 약 20K)의 범위에서 PLGA 부분, 그리고 약 2K 내지 약 10K, 예를 들면, 약 3K 및/또는 약 5K의 분자량을 갖는 PEG 부분을 갖는다. 다양한 구체예에서, PLGA-PEG-말레이미드 및 PLGA-PEG-MeOH 중합체의 질량비는 약 15:1 내지 약 1:15, 예를 들면, 약 10:1 내지 약 1:10, 또는 약 5:1 내지 약 1:5이다. 일부 구체예에서, PLGA-PEG-말레이미드 및 PLGA-PEG-MeOH 중합체의 비율은 4:1 내지 약 1:4, 예를 들면, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 그리고 약 1:4이다. 또 다른 추가의 구체예에서, PLGA-PEG-말레이미드 및 PLGA-PEG-MeOH의 질량비는 1:5 내지 약 1:15, 예를 들면, 약 1:10의 범위 안에 있다. 이러한 비율은 일부 구체예에서, 최적 T 세포 활성화를 위한 리간드 밀도를 미세 조정하기 위해 선별된다.
일부 구체예에서, 입자는 PLA 중합체에 근거된다. 일부 구체예에서, PLA 코어 중합체는 약 20K 내지 약 50K, 또는 약 30K 내지 약 40K (가령, 약 35K)의 분자량을 갖는다. PLA-PEG 중합체 (PLA-PEG-말레이미드 및 PLA-PEG-MeOH 중합체 포함)는 분자량에서 10K 내지 30K (가령, 약 20K)의 범위에서 PLA 부분, 그리고 약 2K 내지 약 10K, 예를 들면, 약 3K 및/또는 약 5K의 분자량을 갖는 PEG 부분을 갖는다. 다양한 구체예에서, PLA-PEG-말레이미드 및 PLA-PEG-MeOH 중합체의 질량비는 약 15:1 내지 약 1:15, 예를 들면, 약 10:1 내지 약 1:10, 또는 약 5:1 내지 약 1:5이다. 일부 구체예에서, PLA-PEG-말레이미드 및 PLA-PEG-MeOH 중합체의 비율은 4:1 내지 약 1:4, 예를 들면, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 그리고 약 1:4이다. 또 다른 추가의 구체예에서, PLA-PEG-말레이미드 및 PLA-PEG-MeOH의 질량비는 1:5 내지 약 1:15, 예를 들면, 약 1:10의 범위 안에 있다. 이러한 비율은 일부 구체예에서 최적 T 세포 활성화를 위한 리간드 밀도를 미세 조정하기 위해 선별된다.
입자 상에서 특정 단백질의 비율은 변할 수 있다. 가령, 항원 제시 복합체 대 항-CD28의 비율은 최소한 약 30:1, 또는 최소한 약 10:1, 약 3:1, 약 1:1, 약 1:3; 약 1:10, 또는 최소한 약 1:30일 수 있다. 일부 구체예에서, 비율은 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 또는 약 1:5이다. 입자에 연계된 단백질의 총량은 입자 mg당 1 내지 약 100 μg, 또는 약 1 내지 약 50 μg, 또는 1 내지 약 10 μg, 또는 일부 구체예에서, 입자 mg당 2 내지 6 μg일 수 있다. 일부 구체예에서, 입자의 리간드 밀도는 약 103 내지 약 105 리간드 / μm2, 또는 약 104 리간드 / μm2이다. 가령, 크기에서 20 내지 200 nm의 범위에서 나노입자의 경우, 이들 나노입자는 평균적으로, 입자당 약 5 내지 약 1500개 리간드, 예를 들면, 입자당 약 10 내지 약 1500개 리간드, 또는 입자당 약 10 내지 약 1200개 리간드, 또는 입자당 약 10 내지 약 1000개 리간드, 또는 입자당 약 10 내지 약 800개 리간드를 갖는다. 일부 구체예에서, 입자는 입자당 약 500개 보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 400개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 300개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 100개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 90개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 80개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 70개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 60개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 50개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 40개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 30개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 20개보다 적은 리간드, 또는 입자당 약 10개보다 적은 리간드, 일부 구체예에서 입자당 적게는 약 5개 리간드를 내포한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 신호 1 및 신호 2에 대한 최소 구조체를 이용하고 (예를 들면, 신호 1의 경우, 연결된 β2 마이크로글로불린을 갖는 단위체성 클래스 I 알파 사슬, 이들은 힌지 영역 바로 위에서 Ig 서열에 융합에 의해 임의선택적으로 이합체성이고, 그리고 신호 2의 경우, 설명된 바와 같은 scFv), 따라서 자가-조립하는 나노입자에 대한 잠재력을 제공한다. 가령, PLGA-PEG 또는 PLA-PEG 중합체는 접합된 리간드 (가령, PLGA-PEG-신호 1 및 PLGA-PEG-신호 2)로 제조되고, 그리고 이후, 특정한 중합체 비율에서 PLGA 또는 PLA와 혼합되고, 그 이후에 최종 NP 산물이 혼합/침전 단계 (자가-어셈블리) 동안 형성되도록 나노-침전된다. 이런 과정은 제조 절차를 실제적으로 단순화할 수 있다.
다양한 구체예에서, 본 발명은 중합성 비드 또는 입자, 본원에서 설명된 바와 같은 항-CD28 항체 및/또는 본원에서 설명된 바와 같은 항원-제시 복합체, 예를 들면, 인간화 Ig HLA 융합 복합체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 제약학적 조성물은 설명된 바와 같이 T 세포에 제시를 위한 항원성 펩티드를 더욱 포함할 수 있고, 그리고 이것은 접합된 비드 또는 입자와 공동조제될 수 있다. 다양한 구체예에서, 제약학적 조성물은 상온 보존이고, 그리고 일부 구체예에서, 투여에 앞서 재구성을 위한 동결건조된 형태에서 제공되거나, 또는 다른 "표준 재고" 제약학적 제조물에서 제공된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 직경 또는 평균 직경에서 50 내지 200 nm (가령, 100 내지 200 nm)의 PLGA / PLGA-PEG 기초된 나노입자, 또는 PLA / PLA-PEG 기초된 나노입자를 포함하고, 그리고 표면-접합된 항-CD28 항체 및 항원-제시 복합체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 항-CD28 항체는 예로서, 본원에서 설명된 바와 같은 인간화 항체일 수 있고, 그리고 항체 단편, 예를 들면, 단일 사슬 가변 단편일 수도 있다. 항원 제시 복합체는 일부 구체예에서, 최소한 하나의 HLA 항원-결합 틈새를 포함한다. 항-CD28 및 HLA 복합체는 동일한 반응에서 별개로 또는 함께 입자에 연계될 수 있다. 제약학적 조성물은 최소한 하나의 펩티드 항원, 예를 들면, 종양 항원 (가령, MART-1 또는 본원에서 설명된 다른 항원)을 포함할 수 있고, 그리고 임의의 능동 적하 과정 없이 입자와 공동조제될 수 있다.
본원에서 설명된 나노-aAPC 플랫폼과 관련하여 이용될 수 있는 대안적 중합체는 시클로덱스트린-내포 중합체, 양이온성 시클로덱스트린-내포 중합체, 폴리(D,L-젖산-코-글리콜산) (PLGA), 폴리(카프로락톤) (PCL), 에틸렌 비닐 아세트산염 중합체 (EVA), 폴리(젖산) (PLA), 폴리(L-젖산) (PLLA), 폴리(글리콜산) (PGA), 폴리(L-젖산-코-글리콜산) (PLLGA), 폴리(D,L-락티드) (PDLA), 폴리(L-락티드) (PLLA), PLGA-b-폴리(에틸렌 글리콜)-PLGA (PLGA-bPEG-PLGA), PLLA-bPEG-PLLA, PLGA-PEG-말레이미드 (PLGA-PEG-mal), PLA-PEG-말레이미드, 폴리(D,L-락티드-코-카프로락톤), 폴리(D,L-락티드-코-카프로락톤-코-글리콜리드), 폴리(D,L-락티드-코-PEO~코-D,L-락티드), 폴리(D,L-락티드-코-PPO-코-D,L-락티드), 폴리알킬 시아노아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리-L-리신 (PLL), 히드록시프로필 메타크릴레이트 (HPMA), 폴리에틸렌글리콜, 폴리-L-글루타민산, 폴리(히드록시산), 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리(에스테르 아미드), 폴리아미드, 폴리(에스테르 에테르), 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 예를 들면, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리알킬렌 산화물 (PEO), 폴리알킬렌 테레프탈염산, 예를 들면, 폴리(에틸렌 테레프탈염산), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 예를 들면, 폴리(비닐 아세트산염), 폴리비닐 할로겐화물, 예를 들면, 폴리(염화비닐) (PVC), 폴리비닐피롤리돈, 폴리실록산, 폴리스티렌 (PS), 폴리우레탄, 유도체화된 셀룰로오스, 예를 들면, 알킬 셀룰로오스, 히드록시 알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 에스테르, 니트로 셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 아크릴산의 중합체, 예를 들면, 폴리메틸메타크릴산염) (P MA), 폴리(에틸(메트)아크릴레이트), 폴리(부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(이소부틸 (메트)아크릴레이트), 폴리(헥실(메트)아크릴레이트), 폴리(이소데실(메트)아크릴레이트), 폴리(라우릴(메트)아크릴레이트), 폴리(페닐(메트)아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트) (폴리 아크릴산) 및 이의 공중합체와 혼합물, 폴리디옥사논 및 이의 공중합체, 폴리히드록시알카노에이트, 폴리프로필렌 푸마르산염), 폴리옥시메틸렌, 폴록사머, 폴리(오르토)에스테르, 폴리(부티르산), 폴리( 발레르산), 폴리(락티드-코-카프로락톤), 트리메틸렌 탄산염, 폴리비닐피롤리돈, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 그리고 폴리포스포에스테르, 덴드리머 및 이들의 유도체, 그리고 2개 또는 그 이상의 이런 중합체의 블렌드 및/또는 블록 공중합체 중에서 하나 또는 그 이상을 포함한다.
본원에서 설명된 제약학적 조성물은 이러한 조성물의 효과량을 병든 환자에 투여함으로써, 면역요법, 예를 들면, 항원 특이적 세포독성 T 세포의 형성을 유도하기 위한 방법에서 유용하다. 일부 구체예에서, 환자는 암 환자이다.
본원에서 설명된 입자-기초된 항원 제시 플랫폼은 정맥내 투여, 동맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 림프관내 투여, 그리고 종양내 투여를 비롯한 임의의 적합한 루트에 의해 환자에 투여될 수 있다. 환자는 인간 및 수의학적 환자 둘 모두를 포함한다.
일부 구체예에서 본 발명은 약 20 내지 200 nm (가령, 일부 구체예에서 50 내지 200 nm 또는 100 내지 200 nm)의 범위에서 크기, 약 -0 내지 -20 mV의 표면 전하 (및 일부 구체예에서 -5 내지 -10 mV), 그리고 입자당 약 10 내지 1500개 단백질 리간드, 또는 입자당 10 내지 약 150개 리간드 (가령, 입자당 약 10 내지 약 100개 리간드)를 갖는 중합성 PLGA / PLGA-PEG 입자, 또는 PLA / PLA-PEG 입자를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 예시적인 입자는 0.3 또는 그 이하의 다분산성 지수 (PDI)를 갖는다. 단백질 리간드는 일부 구체예에서, 술피드릴-말레이미드 화학을 통해 입자에 각각 연계된다. 리간드는 항-CD28 항체 리간드의 개체군, HLA 리간드의 개체군 및 T 세포에 제시를 위한 하나 또는 그 이상의 항원성 펩티드를 포함한다. 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 피내, 림프관내, 또는 종양내 투여를 위한 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 피하 투여용으로 조제된다.
특히, 항원 제시 플랫폼은 감염성 질환, 암, 또는 자가면역 질환을 앓는 환자를 치료하거나, 또는 면역억제된 환자에 예방적 보호를 제공하는데 유용할 수 있다.
치료될 수 있는 감염성 질환은 세균, 바이러스, 프리온, 균류, 기생충, 연충 등에 의해 유발된 것들을 포함한다. 이런 질환은 AIDS, 간염, CMV 감염, 그리고 이식후 림프세포증식성 질환 (PTLD)을 포함한다. CMV는 예로서, 장기 이식 환자에서 발견되는 가장 흔한 바이러스 병원체이고, 그리고 골수 또는 말초혈 줄기 세포 이식조직을 받은 환자에서 이환상태 및 사망의 주요 원인이다 (Zaia, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 4, 603-23, 1990). 이것은 이들 환자의 면역손상된 상태에 기인하는데, 이것은 혈청반응양성 환자에서 잠복성 바이러스의 재활성화 또는 혈청반응음성 개체에서 기회 감염을 허용한다. 현재 치료는 항바이러스성 화합물, 예를 들면, 간시클로비르의 이용에 주력하는데, 이것은 여러 결점이 있고, 이들 중에서 가장 유의미한 결점은 약제 내성 CMV의 발달이다. 이들 치료에 대한 유용한 대안은 이식조직 절차의 개시 전에 환자로부터 또는 적절한 공여자로부터 유래된 바이러스-특이적 CTL의 산출을 수반하는 예방적 면역치료 섭생이다.
PTLD는 이식조직 환자 중에서 유의미한 분율에서 일어나고, 그리고 엡스타인 바르 바이러스 (EBV) 감염으로부터 발생한다. EBV 감염은 미국에서 성인 개체군 중에서 대략 90%에서 존재하는 것으로 생각된다 (Anagnostopoulos & Hummel, Histopathology 29, 291-2) 15, 1996). 활성 바이러스 복제 및 감염은 면역계에 의해 억제되지만, CMV의 사례에서처럼, 이식 요법에 의해 면역손상된 개체는 제어 T 세포 개체군을 상실하는데, 이것은 바이러스 재활성화를 허용한다. 이것은 이식조직 프로토콜에 대한 심각한 장애를 나타낸다. EBV는 또한, 다양한 혈액학적 및 비-혈액학적 암에서 종양 증진에 관련될 수도 있다. 또한, EBV 및 코인두 암종 사이에 강한 연관이 있다. 따라서 EBV-특이적 T 세포로 예방적 처치는 현재 요법에 대한 탁월한 대안을 제공한다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 암은 흑색종, 암종, 예를 들면, 결장, 두경부암, 십이지장, 전립선, 유방, 폐, 난소, 관, 결장, 간, 췌장, 신장, 자궁내막, 위, 형성장애 구강 점막, 폴립증, 침습성 구강암, 비소세포 폐 암종, 이행성 및 편평상피 세포 소변 암종 등; 신경학적 악성, 예를 들면, 신경모세포종, 신경교종 등; 혈액학적 악성, 예를 들면, 만성 골수성 백혈병, 아동기 급성 백혈병, 비호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병, 악성 피부 T-세포, 균상식육종, 비-MF 피부 T-세포 림프종, 림프종모양 구진증, T-세포 풍부한 피부 림프구 과다형성, 수포성 유천포창, 원반모양 홍반성 루푸스, 편평 태선 등; 기타 등등을 포함한다. 가령, Mackensen et al, Int. J. Cancer 86, 385-92, 2000; Jonuleit et al., Int. J. Cancer 93, 243-51, 2001; Lan et al., J. Immunotherapy 24, 66-78, 2001; Meidenbauer et al, J. Immunol. 170(4), 2161-69, 2003을 참조한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 항종양 활성을 갖는 T-세포를 활성화시키기 위한 본원에서 설명된 제약학적 조성물의 투여를 통해, 상기 확인된 암을 비롯한 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 요법은 하나 또는 그 이상의 면역 체크포인트 저해제, 예를 들면, 니볼루맙, 펨브로리주맙 및 이필리무맙과 함께 제공된다. 일부 구체예에서, 추가 요법은 항-CTLA4 또는 항-PD1, 또는 항-PD-L1이다. 추가 요법 또는 체크포인트 저해제는 이의 전통적인 섭생을 통해 별도로 투여될 수 있거나, 또는 본원에서 설명된 나노입자에 추가 리간드로서 투여되거나, 또는 나노입자의 별개의 개체군에 부착될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 면역 체크포인트 저해제는 초기 요법으로서, 그리고 본원에서 설명된 aAPCs가 차후에, 예를 들면, 약 1 내지 약 8 주의 체크포인트 저해제 요법 후에, 또는 약 2 내지 약 4 주의 체크포인트 저해제 요법 후에 시작되는 요법으로서 제공된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 체크포인트 저해제는 예로서 요법의 개시에서 및 약 2 주마다, 또는 요법의 개시에서 및 하나 또는 그 이상의 체크포인트 저해제의 경우 대략 2 주마다 및 나노입자 요법의 경우 약 4 주마다 나노입자 요법에 부수적으로 제공된다. 일부 구체예에서, 환자는 체크포인트 저해제 요법에 내성이거나, 또는 단지 부분적인 또는 일시적인 반응만을 보여주고, 그리고 본원에서 설명된 aAPCs는 이들 환자에서 종양 퇴행을 증강한다. 또 다른 구체예에서, 체크포인트 저해제 요법에 전형적으로 내성인 암의 경우, 본원에서 설명된 조성물은 이런 암에 대한 체크포인트 저해제의 성공적인 이용을 확대한다.
일부 구체예에서, 펩티드 항원은 환자의 종양의 분석에 근거하여, 환자에 대한 개인맞춤된 기초에서 선별된다. 가령, Ionov Y., A high throughput method for identifying personalized tumor-associated antigens, Oncotarget 1(2):148-155 (2010) (이것은 본원에 참조로서 편입된다)에 의해 설명된 과정, 또는 다른 과정이 이용될 수 있다. 이들 구체예에서, 나노입자가 제공될 수 있고 ("표준 재고" 기초에서), 그리고 종양 항원이 개인맞춤된 기초에서 선별되고 적하될 수 있다.
일부 구체예에서, 나노-aAPCs는 입양 T 세포 요법 후 부스터 백신으로서 이용되는데, 여기서 환자로부터 미경험 T 세포 또는 HLA-정합된 공여자로부터 T 세포가 탈체에서 확대되고, 그리고 환자에 투여된다. 나노 aAPC 조성물은 이들 구체예에서 암 면역성을 증강하기 위해, 4 개월 내지 약 1 년의 코스에 걸쳐 1 내지 약 10 회 투여될 수 있다.
치료될 수 있는 자가면역 질환은 천식, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, I형 당뇨병, 다발성 경화증, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 중증 근무력증, 굿파스처 증후군, 그레이브스병, 심상성 천포창, 애디슨병, 포진성 피부염, 소아 지방변증, 그리고 하시모토 갑상선염을 포함한다.
항원 특이적 보조 T 세포는 예로서, 감염성 질환 및 암을 치료하는데 이용될 수 있는 특이적 항체를 생산하기 위해 대식세포를 활성화시키거나 또는 B 세포를 활성화시키는데 이용될 수 있다. 항체-생산 B 세포 그들 자체가 또한 이런 목적으로 이용될 수 있다.
본 발명은 본원에서 설명된 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 이를 발현하는 숙주 세포를 더욱 제공한다.
본 발명은 다음의 무제한적 실시예에 의해 더욱 예시된다.
실시예
실시예 1: 생식계열 인간화 가변 영역 및 인간 불변 영역 서열의 설계
본 실시예는 그 중에서도 특히, 생쥐 항-CD28 항체 주형으로부터 생식계열 인간화 (CDR 합체된) 항체에 대한 서열의 설계; S241P (Kabat 넘버링) 힌지 안정화 돌연변이, 잔여 Fc 감마 수용체 결합을 제거하기 위한 L248E (Kabat 넘버링) 돌연변이 및 항체를 연계하는데 적합한 Cys 잔기 (S473C, Kabat 넘버링)를 내포하는 인간 IgG4를 포함하는 인간 불변 영역 서열의 설계; CD28에 잠재적 비결합을 갖는 변이체 생식계열 인간화 항체 V 도메인의 설계; 잠재적 T 세포 에피토프를 내포하지 않는 생식계열 인간화 항체의 N 말단에 HLA-A*02:01의 융합을 위한 링커 서열의 설계를 보여준다.
시작 항-CD28 항체는 뮤린 9.3 단일클론 항체이었다 (Tan et al.. J. Exp. Med. 1993 177:165). 9.3 항체 V 영역의 구조적 모형은 Swiss PDB를 이용하여 생산되고, 그리고 상기 항체의 결합 성질에 필수적일 가능성이 높은 V 영역에서 아미노산을 확인하기 위해 분석되었다. 다수의 프레임워크 잔기와 함께 이들 CDR 내에 내포된 모든 잔기 (Kabat 및 Chothia 정의 둘 모두를 이용)는 결합에 잠재적으로 중요한 것으로 고려되었다. 항-CD28의 VH 및 Vκ 서열 둘 모두 전형적인 프레임워크 (Fw) 잔기를 내포하고, 그리고 CDR 1, 2 및 3 모티프는 많은 뮤린 항체에 필적한다.
인간화를 위해, 인간 IGHV4-59 생식계열 Fw가 중쇄에 대한 주형으로서 선별되었다 (Tan et al. J. Immunol 2002 169:1119-1125에 의해 선별된 IGHV3/OR16-10보다 우선적으로). IGKV4-01 생식계열 Fw가 경쇄에 대한 주형으로서 선별되었다. 이들 Fw 둘 모두 그들의 개별 뮤린 VH 및 Vκ 서열에 62% 상동성을 갖는다. 뮤린 CDR이 이들 Fw 내로 합체되고, 그리고 변하는 숫자의 뮤린 Fw 잔기가 또한, 3개의 인간화 VH 변이체 및 3개의 인간화 Vκ 변이체를 창출하기 위해 포함되었다 (도면 1-6).
중쇄 Fw의 경우, Fw1 잔기 1 및 3은 항원 결합에 중요한 것으로 생각되었는데, 그 이유는 이들이 결합 포켓에 인접하기 때문이고, 반면 잔기 6은 베타 가닥 뒷받침 잔기 1 및 3 둘 모두의 입체형태 및 CDR3의 입체형태에 영향을 주는 것으로 고려되었다. 이런 이유로, 이들 뮤린 Fw 잔기는 모든 변이체에서 유지되었다.
Fw2에서, 잔기 37은 VH 및 Vκ 사이에 인터페이스를 유지하는데 중요한 것으로 고려되었고, 반면 잔기 48은 CDR2의 입체형태를 뒷받침하는 것으로 고려되었다; 이런 이유로 이들 잔기 둘 모두 모든 변이체에서 유지되었다.
Fw3에서, 잔기 73, 76 및 78은 CDR1과 직접적으로 접촉하고, 반면 잔기 71은 CDR1 및 CDR2 둘 모두와 접촉한다; 이런 이유로, 이들 잔기는 항원 결합에 필요할 가능성이 높고 (CDR1 및 CDR2의 기여에 따라), 그리고 이런 이유로, 모든 변이체에서 유지되었다. 잔기 71은 때때로, 잔기 71 내지 78의 입체형태에 영향을 줌으로써 CDR1의 입체형태에 간접적으로 영향을 줄 수 있고, 반면 잔기 82a 및 82c는 또한, CDR2의 입체형태에 간접적으로 영향을 줄 수 있다. 이들 잔기는 이런 이유로, VH1 단독에서 유지되었다. 잔기 67 및 82는 3차원 구조에서 인접하고 상호작용하여, CDR2의 입체형태에 영향을 주고, 그리고 CDR 1 및 3을 뒷받침하는 베타 가닥에 잠재적으로 영향을 줄 수 있는 공간을 채운다. 이런 이유로, 이들 잔기는 변이체 VH1 및 VH2에서 유지되었다.
경쇄 Fw의 경우, Fw1 잔기 3은 결합 포켓에 인접하고 항원 결합에 직접적으로 관련될 수 있고, 반면 잔기 4는 CDR3의 입체형태를 직접적으로 뒷받침한다. 이런 이유로, 이들 뮤린 Fw 잔기는 모든 변이체에서 유지되었다.
Fw2에서, 잔기 49는 CDR2의 입체형태를 뒷받침하고, 그리고 또한, 중쇄와 경쇄 사이에 인터페이스에 결정적인데, 여기서 이것은 중쇄 CDR3의 입체형태를 직접적으로 뒷받침하고, 따라서 모든 변이체에서 유지되었다.
Fw3에서, 잔기 85 및 87은 중쇄와 경쇄의 인터페이스에 중요하고, 그리고 또한, CDR3의 입체형태를 뒷받침하는 것으로 고려되었고, 그리고 이런 이유로 모든 변이체에서 유지되었다. 잔기 80은 CDR 2 및 3의 입체형태에 대한 잠재적으로 간접적인 효과를 갖는 것으로 고려되고 Vκ1 단독에서 유지되었다. 잔기 70은 통상적으로, 경쇄 잔기 R24와 염 가교를 이루고, 그리고 이런 이유로 Vκ 도메인에 대한 중요한 입체형태적 효과를 갖는다. 항-CD28에서, 이러한 염 가교는 부재하고 (잔기 70이 D가 아닌 N이기 때문에), 그리고 이러한 상호작용을 도입하는 것은 불리할 수 있었다; 하지만 뮤린 항체에서 N70은 당화되고 (NFS), 그리고 인간화 동안 이것을 제거하는 것이 유익할 것이다; 이런 이유로, 뮤린 N은 Vκ1 및 Vκ2에서 유지되지만, Vκ3에서 D로 변하였다.
인간 IgG4/κ에 근거된 불변 영역 서열은 힌지 안정화 돌연변이 (S241P) 및 잔여 Fc 감마 수용체 결합을 제거하는 하부 힌지에서 돌연변이 (L248E)를 통합하도록 설계된다. 시스테인 잔기가 또한, 화학적 연계 목적으로 Fc의 C 말단 인근에 포함되었다 (S473C). 변형된 IgG4 중쇄 불변 영역 서열은 κ 경쇄 불변 영역 서열 (도면 8)과 함께, 도면 7에서 도시된다.
추가 VH 도메인이 CD28에 잠재적 비결합을 위해 설계되었고, 그리고 이러한 서열은 도면 9에서 도시된다. 뮤린 V 영역 서열의 분석은 VH가 CD28 결합에 대한 주요 기여자일 가능성이 높다는 것을 제안하였다 (생쥐 생식계열 V 영역의 체성 돌연변이의 정도로부터). 이런 이유로, 단지 잠재적 비결합 인간화 VH 변이체만 설계되었다. 이러한 변이체는 정확한 CDR 입체형태를 재구성하기 위해 생쥐 Fw 잔기를 전혀 내포하지 않고, 그리고 또한, 결합에 결정적일 가능성이 높은 CDRH3 내에 잔기에서 3개의 돌연변이를 내포한다 (Y100A, Y100aA, Y100bA).
실시예 2: 인간화 항체에 HLA-A * 02:01의 융합을 위한 링커의 설계
잠재적 면역원성을 제거하기 위해 인간화 항-CD28 항체의 N 말단에 HLA-A*02:01 (IMGT 수탁 번호 HLA00005)의 융합을 위한 링커가 작제되고, 그리고 iTope™ 및 TCED™에 의한 분석을 통합하였다.
iTope™ 소프트웨어는 펩티드의 아미노산 측쇄 및 34개 인간 MHC 클래스 II 대립형질의 개방형 결합 그루브 내에 특정한 결합 주머니 (특히, 주머니 위치; p1, p4, p6, p7 및 p9) 사이에 우호적인 상호작용을 예측한다. 이들 대립형질은 임의의 특정 인종적 개체군에서 가장 유력하게 발견되는 것들에 기인한 가중 없이 전 세계적으로 발견되는 가장 흔한 HLA-DR 대립형질을 대표한다. 이들 대립형질 중에서 20개는 '열린' p1 형상을 내포하고, 그리고 14개는 위치 83에서 글리신이 발린에 의해 대체되는 '닫힌' 형상을 내포한다. 핵심 결합 잔기의 위치는 시험 단백질 서열에 걸치는 1개 아미노산에 의해 중복되는 9mer 펩티드의 인실리코 산출에 의해 달성된다. 물리적 MHC 클래스 II 결합 실험과의 비교는 iTope™이 MHC 클래스 II 분자에 결합하거나 또는 이들에 결합하지 않는 펩티드를 높은 정확도로 성공적으로 구별하는데 이용될 수 있다는 것을 보여주었다. 인실리코 MHC 클래스 II 결합 분석의 임의의 제한은 EpiScreen™ 탈체 T 세포 에피토프 지도화 검정에서 이전에 선별검사된 서열로부터 유래된 대규모 펩티드 데이터베이스 (>10,000개 펩티드)의 서열을 내포하는 TCED™을 이용하여 감소된다. TCED™은 따라서, 실제 탈체 면역원성과의 상관을 찾기 위해, 관련 없는 항체 및 단백질 서열에 대하여 임의의 시험 서열을 검색하는데 이용될 수 있다.
iTope™을 이용한 링커 서열의 분석은 34개 MHC 클래스 II 대립형질 각각에 대하여 시험되는 링커 서열에 걸치는 중복 9 mer로 수행되었다. 각 9mer은 잠재적 '적합' 및 MHC 클래스 II 분자와의 상호작용에 근거하여 채점되었다. 상기 소프트웨어에 의해 계산된 펩티드 점수는 0 및 1 사이에 있다. 높은 평균 결합 점수 (iTope™ 채점 함수에서 >0.55)를 산출한 비-생식계열 펩티드는 강조되고, 그리고 MHC 클래스 II 결합 펩티드 중에서 ≥50% (즉, 34개 대립형질 중에서 17개)가 높은 결합 친화성 (점수 >0.6)을 가지면, 이런 펩티드는 "불규칙한 높은 친화성" MHC 클래스 II 결합 펩티드 (이들은 CD4+ T 세포 에피토프를 내포하는 높은 위험을 갖는 것으로 고려된다)로서 규정되었다. 점수 >0.55 (하지만 대다수가 >0.6이 아님)를 갖는 MHC 클래스 II 결합 펩티드 중에서 ≥50%를 갖는 펩티드는 "불규칙한 중등도 친화성" MHC 클래스 II 결합 펩티드로서 규정되었다. 이들 서열의 추가 분석은 TCED™을 이용하여 수행되었다. 이들 서열은 이전 EpiScreen™ 연구에서 T 세포 반응을 자극한 관련 없는 단백질로부터 펩티드 (T 세포 에피토프) 사이에 임의의 높은 서열 상동성을 확인하기 위해, BLAST 검색에 의해 TCED™을 규문하는데 이용되었다.
Schneck 등에 의해 이용된 서열은 2개의 링커: N 말단 신호 서열과 연결하기 위한 HLA-A*02:01의 N 말단에서 하나 및 항-CD28 VH 도메인에 융합을 위한 C 말단에서 하나를 통합하였다 (아래 도면 9를 참조한다). N 말단 링커의 경우, 서열은 링커를 통해, 그리고 HLA-A*02:01 성숙 단백질의 첫 8개 아미노산을 포함하는 신호 서열 개열 부위로부터 분석되었다. C 말단 링커의 경우, 서열은 링커 서열을 통해, 그리고 항-CD28 VH 도메인의 첫 8개 아미노산까지 HLA-A*02:01 α3 도메인의 말단 8개 아미노산으로부터 분석되었다.
결합 점수 >0.6 (높은 친화성)을 갖는 펩티드는 대다수 (≥17)의 MHC 클래스 II 대립형질 (불규칙한 높은 친화성 결합제로 명명됨)에 결합한다. 0.55 및 0.6 사이에 결합 점수를 갖는 중간 친화성 결합제는 ≥17 MHC 클래스 II 대립형질에 결합한다. N 말단 링커는 2개의 불규칙한 MHC 클래스 II 결합 서열: 하나의 높은 친화성 (위치 2에서 p1 앵커와) 및 하나의 중간 친화성 (위치 4에서 p1 앵커와)을 내포하는 것으로 밝혀졌다. C 말단 링커는 위치 11에서 p1 앵커와 하나의 불규칙한 중등도 친화성 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 내포하는 것으로 밝혀졌다.
Antitope의 T 세포 에피토프 데이터베이스 (TCED™)의 BLAST 검색은 이전에 확인된 에피토프와의 임의의 상동성을 결정하기 위해 iTope™ 분석에서 이용된 바와 동일한 서열을 이용하여 실행되었다. TCED™은 EpiScreen™ T 세포 에피토프 지도화 검정에서 시험된 관련 없는 서열로부터 유래된 대규모 펩티드(>10,000개 펩티드) 데이터베이스에 대하여 임의의 시험 서열을 검색하는데 이용된다. 이들 링커 서열 중에서 어느 것도 TCED™에서 '히트'를 내포하지 않는 것으로 밝혀졌다.
iTope™은 MHC 클래스 II에 결합에 대한 이들의 성향을 감소시키기 위한, 이들 링커에 대한 서열 변화를 사정하는데 더욱 이용되었다. N 말단 링커는 HLA-A*02:01의 N 말단이 pBFKsr 벡터에서 제공된 신호 서열에 또는 이의 자연 신호 서열에 직접적으로 융합되도록 완전하게 제거될 수 있는 것으로 확인되었다. 이것은 융합 단백질의 N 말단이 단지 인간 생식계열 서열만을 내포하고 T 세포 에피토프의 위험을 방지하도록 담보할 것이다. 아래의 권장된 링커 서열은 MHC 클래스 II 결합을 배경 잔여 수준 (임의의 9mer에 의해 결합된 대립형질 중에서 <5)을 감소시키고, 그리고 클로닝을 위한 적합한 제한 부위를 제공하는 것으로 밝혀졌다 (비록 양쪽 서열이 벡터의 변형을 필요로 할 것이긴 하지만):
실시예 3: 서열의 코돈 최적화 및 발현 클로닝
코돈은 GeneOptimizer®을 이용하여 최적화되었고, 그리고 최적화된 서열은 아래에 나타나 있는 바와 같이 발현에 대해 클로닝되었다.
서열은 PmeI 제한 부위, 코자크 서열, 그리고 NS0 세포에서 발현을 위한 신호 펩티드로 가공되었다. 번역은 코자크 서열의 즉시 하류에서 시작된다.
HLA-IgG4HC 융합의 완전한 번역 아미노산 서열은 도면 10에서 도시된다.
LC3 (VK3)의 번역 서열은 도면 11에서 도시된다.
HC1에 대한 번역 서열은 도면 12에서 도시된다.
HC2에 대한 번역 서열은 도면 13에서 도시된다.
인간 β2 마이크로글로불린 역시 발현되었다.
실시예 4: NS0 세포에서 발현
Biacore 친화성 데이터 및 다른 고려 사항에 근거하여, HC1::LC3 및 HC2::LC3 중쇄 및 경쇄 조합이 StableFast-NS0 세포주 개발을 위한 일차와 이차 mAb 후보로서 각각 선별되었다.
STABLEFAST-NS0 세포주 산출을 위한 pBFksr::HC1::LC3 이중시스트론 발현 벡터에 대한 최종 벡터 지도는 도면 14에서 묘사된다. pBFksr::HC2::LC3의 작제는 동일한 접근법을 이용하여 행위되었다.
부모 NS0 세포는 보충된 혈청 없는 성장 배지에서 확대되었다. 건강한 배양액의 확립 시에, 10 백만 세포 (10x106)는 45 μg 선형화된 (△PvuI) 발현 벡터 DNA로 형질감염되었다. 세포는 성장 배지에서 대량으로 24 시간 동안 회복하도록 허용되었다. 회복 이후에, 세포는 보충된 혈청 없는 선택 배지 (콜레스테롤-)에서 세척되고, 상기 선택 배지에서 재현탁되고, 웰마다 200 μL에서 40x96-웰 평판에 분포되었다. 실제 분포는 HC1::LC3 및 HC2::LC3에 대해 각각 1140 세포/웰 및 840 세포/웰이었다. 평판은 37℃, 5% CO2에서 1 주 동안 배양되고 페놀 레드 보충된 선택 배지가 사양되었다. 형질감염후 2 주에, 다양한 웰은 적색으로부터 황색으로의 배지 컬러 변화에 근거하여 활발하게 성장하였다.
HC1::LC3 형질감염으로부터 총 1,127개 웰이 ELISA에 의해 인간 IgG 발현에 대해 선별검사되었다. HC2::LC3 형질감염으로부터 총 612개 웰이 선별검사되었다. IgG 농도에 근거하여, 총 290개 및 101개 세포주가 HC1::LC3 및 HC2::LC3 각각에 대해 24-웰 평판에 정률증가되었다. 24-시간 생산성 검정이 추가 분석을 위한 최고 발현자를 선별하는데 이용되었다. 간단히 말하면, 24-웰 평판은 500 μL 신선한 배지에서 5x105 세포에서 파종되었다. 24 시간 후, 상층액은 ELISA에 의해 선별검사되었다. IgG 농도에 근거하여, 총 60개 및 24개 세포주가 HC1::LC3 및 HC2::LC3 각각에 대해 6-웰 평판에 정률증가되었다.
3-일 비생산성 검정이 추가 분석을 위한 최고 발현자를 선별하는데 이용되었다. 간단히 말하면, 6-웰 평판은 1.5 mL 신선한 배지에서 4x105 세포에서 파종되었다. 3 일 후, 세포가 계수되었고, 그리고 상층액이 ELISA에 의해 선별검사되었다. IgG 농도 및 성장에 근거하여, pg/세포/일에서 평균 비생산성 비율 또는 SPR이 계산될 수 있다. 상대적 SPR에 근거하여, 총 20개 및 10개 세포주가 HC1::LC3 및 HC2::LC3 각각에 대해 T-75 플라스크에 정률증가되었다. 3-일 SPR 검정이 mAb 생산을 위한, 현탁액 적응 및 정률증가를 위한 최종 세포주를 선별하기 위해 T-75 규모에서 반복되었다.
각 mAb에 대한 5개 세포주가 30-mL 진탕기 배양액에 정률증가되고 SPR 및 성장에 대해 재평가되었다. 모든 현탁액 라인은 쌓아 올려졌다. 각 mAb에 대한 최고 성과 세포주는 소규모 생산을 위해 교반 배양에 척도화되었다.
HLA-IgG4 융합 단백질의 경우, pBFksr::HLA-IgG4::LC3 이중시스트론 발현 벡터가 STABLEFAST-NS0 세포주 산출을 위해 작제되었다. 벡터 지도는 도면 15에서 도시된다. 인간 β2 마이크로글로불린 유전자를 내포하는 발현 카세트 및 벡터 또한, 3개의 융합 단백질 아단위 (인간 HLA-IgG4 중쇄 융합, a-CD28 경쇄 [LC3] 및 인간 β2 마이크로글로불린) 모두를 인코딩하는 삼중시스트론 발현 벡터를 위해 창출되었다. 삼중시스트론 구조체는 도면 16에서 도시된다. 3개 유전자 모두의 발현은 상층액의 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 일시적인 HEK293 배양액에서 확증되었다.
실시예 5: 인간화 리간드의 기능적 특징화
CD28에 대한 인간화 단일클론 항체가 mAb 코팅된 평판에서 새로 단리된 PBMC의 확대를 유도하는 능력에 대해 시험되었다. 도면 17에서 보여지는 바와 같이, 인간화 항-CD28은 부모와 매우 유사하게 기능하고 수퍼 효현제가 아니다.
인간화 단일클론 항체는 인간 T-세포주에서 CD28을 염색하는 능력에 대해 시험되었다. 결과는 도면 18에서 도시된다. 패널 (A)는 뮤린 항인간 CD8 mAb (클론 9.3, 아이소타입 IgG2a)로 염색을 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽으로 피크는 다음과 같다: 염색되지 않은 세포, 항-IgG2a FITC, 그리고 항-CD28 + 항-IgG2a FITC. 패널 (B)는 인간화 항-CD28 (아이소타입 IgG4)로 염색을 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽으로 피크는 다음과 같다: 염색되지 않은 세포, 항-IgG4 PE, 항-CD28 (35 ng) + 항-IgG4 PE, 항-CD28 (1 μg) + 항-IgG4 PE. 인간화 항-CD28로 염색은 클론 9.3 mAb로 차단될 수 있다 (제시되지 않음).
HLA-Ig의 정제 후, 항원 펩티드 적하 효율은 펩티드 적하된 단백질을 포획하기 위해 입체형태 의존성 항-HLA mAb를 이용한 ELISA에 의해 점검된다 (Current protocols in Immunology Chapter 17.2에서 설명된 바와 같이). 비특이적 펩티드 (즉, MHC 부정합)의 경우 0%와 비교하여, 특정한 펩티드 (즉, 정확한 MHC 제한)의 경우 ~90%의 재현가능한 적하 효율이 기대된다.
실시예 6: 나노입자 제제
다음의 실시예는 35K의 분자량을 갖는 PLGA (LA:GA = 1:1)로 형성된 코어를 갖는 나노입자의 합성을 실증한다. 입자의 코로나는 PLGA-PEG-COOH 또는 PLGA-PEG-말레이미드 및 PLGA-mPEG (메톡시 PEG)의 혼합물로부터 PEG 공중합체에 의해 형성된다. COOH 및 말레이미드 기능적 말단기는 폴리펩티드 접합을 허용한다. 메톡시PEG는 PEG 사슬 상에서 기능적 말단기에 대하여 비활성이다. PLGA 부분은 10-30K (가령, 약 20K)의 분자량을 갖고, 그리고 PEG 부분의 분자량은 3 및 5K이다. 이러한 실례의 경우, 나노입자는 50% 코어 PLGA (35K) 및 25% PLGA-PEG-COOH와 25% PLGA-mPEG의 혼합물로 형성된다. PLGA-PEG-COOH (또는 말레이미드) 및 PLGA-mPEG의 상기 비율은 입자의 표면 상에서 리간드 밀도의 미세 조정을 허용한다. 유사한 입자가 유사한 분자량 및 기능기 밀도를 갖는 다른 중합체, 예를 들면, PLA 및 PLA-PEG를 이용하여 제조될 수 있다.
PLGA 내측 코어는 구조 및 크기를 제공하고, 그리고 분해 속도의 운전자이다. 물로 코어 나노입자의 침윤은 PLGA 중합체의 가수분해 및 궁극적으로 나노입자의 분해를 유발한다.
PLGA-mPEG 중합체는 단백질/펩티드 리간드를 접합하는데 이용될 수 있는 기능기에 대하여 비활성이고, 그리고 따라서, 친수성 PEG 최외각 층을 갖는 소수성 PLGA 코어로부터 멀리 떨어져 확장하는 코어 나노입자에 코로나 코팅을 제공하는데 역할을 한다. 그 중에서도 특히, 이것은 혈청 단백질 (가령, 알부민)의 결합을 제한하는 것을 비롯하여, 단핵 식세포계 (MPS)에 의한 나노입자의 옵소닌화 및 제거를 예방하는데 도움을 준다.
PLGA-PEG-COOH 및 PLGA-PEG-말레이미드는 PLGA-mPEG와 동일한 역할을 제공하고, 그리고 이에 더하여, 공중합체의 각 PEG 사슬은 기능기로 종결된다. 완전한 나노입자의 형성 후, PLGA-PEG 상에서 말단 COOH 기는 단백질/펩티드 상에서 가용한 일차 아민 기와 펩티드 결합을 형성할 반응성 기를 창출하기 위해 EDC-술포-NHS를 이용하여 활성화될 수 있다. 이러한 전략은 어떤 가용한 일차 아민 기가 PLGA-PEG 중합체 상에서 활성화된 -COOH 기에 접합할 지를 제어하지 못하기 때문에, 나노입자의 표면 상에서 리간드의 정향은 제어되지 않고, 그리고 따라서, 반드시 생물학적으로 활성이지는 않을 것이다.
대안은 예로서, 단일클론 IgG (생쥐 리간드의 경우 IgG1; 인간 리간드의 경우 IgG4)의 원위 Fc 영역에서 비대합된 시스테인 잔기를 내포하는 리간드를 제조하는 것이다. 이러한 비대합된 시스테인은 PLGA-PEG-말레이미드 (또는 비대합된 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성하는데 이용될 수 있는 다른 적합한 기능기)에 접합을 위한 특정한 부위로서 역할을 한다. 이것은 표면 리간드의 대부분이 생물학적 활성을 뒷받침하는 외부 정향으로 접합되도록 야기할 부위 특이적 방식으로, 각 리간드가 접합되도록 허용한다. 가령, 이러한 전략은 각 리간드의 결합 부분이 나노입자의 소수성 PLGA 부분으로부터 멀리 및 코로나의 친수성 PEG 사슬의 약간 외부로 확장하도록 한다.
나노입자는 20 내지 200 nm의 크기 범위에 있다; 다분산성 지수 (PDI)는 2 또는 그 이하 (가령, 일부 구체예에서 0.3 또는 그 이하)이다; 그리고 제타 전위 (표면 전하)는 -15 mV 내지 0 mV이다. 이러한 조성, 크기 및 전하를 갖는 나노입자는 생체내 PK/ADME에 대한 유익한 성질을 가질 것으로 예상된다. 구체적으로, 이들은 종양 미세환경을 비롯한 표적 조직으로 수송될 뿐만 아니라 혈액 및 림프 사이에서 움직일 만큼 충분히 작다 (<200 nm); 이들의 친수성 PEG 층 및 약간 음성 전하는 혈청 단백질의 결합, 그리고 표적 조직으로 분포에 앞서 MPS의 세포에 의한 순환으로부터 제거를 유발할 나노입자의 옵소닌화를 지연시키는데 도움을 줄 것이다; 중합체 혼합은 수일 내지 많게는 2 주 동안 계측되는 생체내분해 비율을 야기할 것이다; 그리고 외부적으로 정향된 단백질 리간드는 동계 TCRs 및 동시자극성 수용체 (가령, CD28, 4-1BB)를 갖는 T 세포의 결합에 대하여 최대 생물학적 활성을 제공할 것이다. 게다가, 일부 구체예에서 나노입자의 소수성 코어는 조제 동안 가용성 유상하중 (가령, IL-2, 항-TGF-b, IL-21, 또는 소형 분자 약물)으로 적하될 수 있었다.
예시적인 중합체 조성 (총 중합체 중량 100 mg):
PLGA 35KDa 50% w/w
PLGA-PEG-기능기 20KDa-5KDa 25% w/w
PLGA-PEG-MeOH 20KDa-5KDa 25% w/w
이들 중합체는 1 ml 디클로로메탄에서 용해되고, 2.3 ml 5% PVA (20KDa)가 첨가되었고, 그리고 용액은 프로브 초음파발생장치를 이용하여 유화되었다. 유제는 46 ml 0.5% PVA 용액에 첨가되고, 그리고 용매가 완전히 증발될 때까지 2 시간 동안 교반되었다.
정제를 위해, 입자는 3,700 rpm에서 30 분 동안 원심분리되고, 0.45 마이크론 필터를 통해 여과되고, 그리고 더욱 큰 입자를 제거하기 위해 10,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리되었다. 이들 입자는 PVA를 제거하기 위해 2000 rpm에서 원심 여과 (컷오프 100KDa)를 이용하여 탈이온수로 세척되었다.
다음의 프로토콜이 리간드의 접합에 이용되었다. 40 mg의 나노입자가 10mM HEPES 완충액 pH 6에서 1 mg/ml 농도에서 분산되었다. 80mg EDC 및 89.16 mg S-NHS가 용액에 첨가되고 30 분 동안 교반되었다. 과잉의 EDC 및 S-NHS는 2500 rpm에서 원심 필터에 의해 제거되었다. 이들 입자는 PBS에서 1 mg/ml 농도에서 재현탁되었고, 그리고 mg 입자당 8 mg에 상응하는 Kb-Ig 및 항-CD28의 혼합물이 용액에 첨가되었다. 이들 입자는 4℃에서 하룻밤 동안 교반되었다.
이들 입자는 PBS (17,000 rpm x 50 분)로 세척되었다. 두 번째 세척 후, 이들 입자는 100 mg/ml 수크로오스 용액에서 재구성되었다 (첨가된 전체 수크로오스는 4 mg이었다).
입자 성질이 결정되었다.
실시예 7: Fc 힌지 영역 융합
이합체성 항원 제시 리간드는 항원 제시 복합체 (가령, H2-Kb 또는 HLA-2)를 Ig 힌지 영역에 직접적으로 융합함으로써 설계되었다. H2-Kb Fc 힌지 단백질은 비대합된 시스테인 잔기가 중쇄의 위치 231에서 세린 잔기를 대체하도록 가공된, 생쥐 IgG1의 힌지-CH2-CH3 부분에 융합된 생쥐 클래스 I Kb 세포외 도메인을 내포한다. 이러한 설계는 도면 19에서 도시된다.
도면 27은 Kb-SIY Fc-힌지 단백질에 근거된 나노-aAPCs가 동계 표적 2C T 세포를 특이적으로 염색한다는 것을 보여준다.
도면 29는 힌지 이합체 구조체를 내포하는 나노 aAPCs를 이용한, Kb-특이적 2C T 세포 (A) 및 Db-gp100-특이적 pmel T 세포의 확대를 보여준다. Miltenyi 비드 및 Dyna 비드 (약 4.5 마이크론 직경)가 비교에 이용되었다. 배치 NI-19, NI-21, NI-22 (Kb 힌지 이합체 내포), 그리고 배치 NI-24 및 NI-25 (Db 힌지 이합체 내포)의 물리적 성질은 도면 32에서 도시된다. NI-22는 음성 대조이다.
실시예 8: 예시적인 나노-aAPC 화학
PLGA 및 PLGA-PEG-COOH 나노-aAPCs는 가용한 일차 아민을 통해 접합된 리간드로 제조되었다. PLGA 40 (200 nm)에 근거된 PLGA 입자는 충분한 안정성을 보여주지 않았다. PLGA-PEG-COOH (40K/3K) : PLGA-mPEG (17K/3K)에 근거되고, 그리고 1:4의 PEG:mPEG 비율을 갖는 입자는 우수한 안정성 및 활성을 보여주었다. 도면 20.
다음은 도면 31에서 도해된, 리간드의 부위 지향된 접합을 위한 과정을 설명한다. 나노-aAPC는 Ig 힌지 영역에 융합된 pHLA 복합체에 근거된 리간드를 비롯한 두 번째 산출 리간드의 부위 특이적 티올 접합으로 제조되었다. 리간드의 뮤린 및 인간화 이형 둘 모두 나노-aAPC를 제조하는데 이용되었다. 나노-APC는 2-단계 방법을 거쳐 제조된다. 먼저, PLGA-mPEG 및 PLGA-PEG-말레이미드로 구성된 입자는 나노침전 방법에 의해 제조된다. 가령, PLGA-mPEG 및 PLGA-PEG-말레이미드의 혼합물 (PLGA-PEG-말레이미드 %w/w는 1-55% 사이에서 변한다)은 아세토니트릴에서 50 mg/mL의 최종 농도에서 용해된다. 이러한 용액은 주입기 펌프를 이용하여, 교반 하에 PVA 용액 (MnPVA = 9 kDa, 0.5 % w/v) 내로 5 mL/분에서 주입된다. 유기:수성 용매 점프는 1:1 내지 1:20 사이에서 변하였다. 미소유체, 국한된 충돌 분사 및 멀티-주입구 와동 혼합기 장치가 우수한 경도 및 좁은 크기 분포를 담보하는 입자를 제조하는데 이용될 수 있다. 입자는 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 또는 Amicon 원심 필터를 이용하여 정제된다. 입자는 이후, 접합 완충액 (HEPES 50 mM, EDTA 10 mM, pH = 6.7)에서 재현탁되었다. 최종적으로, 나노-aAPC는 항-CD28 및 KbSIY/HLA 리간드의 혼합물을 입자에 접합함으로써 제조된다. 입자에 리간드의 접합은 실온에서 하룻밤 동안 진행하도록 허용된다. 리간드:입자의 질량비는 1 - 500 μg/mg 입자의 범위에서 변한다. 항-CD28:Kb/HLA의 비율은 0 - 1 사이에서 변한다. 결합되지 않은 리간드는 SEC 또는 TFF를 이용하여 제거된다. 90 nm의 평균 크기 직경 및 50-120 nm 사이의 크기 분포를 갖는 입자가 제조되었다. 도면 32.
도면 22에서 보여지는 바와 같이, PLGA-PEG aAPC 입자는 항원 특이적 T 세포의 증식을 용량 의존성 방식으로 자극한다. 게다가, 그리고 도면 23에서 보여지는 바와 같이, PLGA-PEG-기초된 aAPCs는 동결건조 시에 안정된다.
증가하는 양의 SIY-적하된 PLGA-PEG 나노 aAPC를 갖는 2C T 세포의 4 일자 배양액은 도면 24에서 도시되고, 항원 특이적 T 세포의 용량 의존성 확대를 보여준다. 도면 25는 나노-aAPCs로 자극 후 1 일에 T 세포 증식 클러스터를 보여준다.
도면 28은 리간드의 부위 특이적 티올 접합을 갖는 나노-aAPC를 보여준다. 비드는 1:1 비율의 PEG-COOH 대 mPEG 중합체 (배치 72B) 또는 1:9 PEG-mal:mPEG 비율 (배치 77B)을 내포하였다. 둘 모두 안정하고 활성이었다.
도면 30은 인간 CMV 또는 MART-1 특정한 T 세포의 나노 aAPC-기초된 확대를 보여준다. Dynal-기초된 APCs가 비교를 위해 도시된다. 확대는 0 일자, 7 일자, 14 일자 및 21 일자에 도시된다. CD8 염색은 x 축에서 도시되고, 그리고 항원 특이적 T 세포는 펩티드-MHC 사합체 염색에 근거하여 y 축에서 확인된다.
도면 31은 말레이미드 부위 지향된 화학 (A); 동적 광 산란 (DLS)에 의한 입자의 특징화 (B); 그리고 대표적인 배치 (NI26)의 크기, 전하 및 PDI의 특징화를 갖는 입자에 리간드의 접합을 포함하는 예시적인 나노입자 제제를 도해한다. NI26 입자는 대략 108 nm에서 피크 크기 분포, 0.08의 PDI, 그리고 -6.7 mV의 전하를 보여준다.
참조로서 편입
본원에서 인용된 모든 특허 및 간행물은 본원에서 전체적으로 완전히 참조로서 편입된다.
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Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (Anti-CD28 VK3) <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 11 gac atc gag ctc act cag tct cca gat tct ttg gct gtg tct cta ggg 48 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag aga gcc acc atc aac tgc aga gcc agt gag agt gtt gaa tat tat 96 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 gtc aca agt tta atg cag tgg tac cag cag aag cca gga cag cca ccc 144 Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 aaa ctc ctc atc ttt gct gca tcc aac gta gaa tct ggg gtc cct gac 192 Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 agg ttt agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc acc ctc acc atc tct 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 tct ctg cag gcc gag gat gtt gca atg tat ttc tgt cag caa agt agg 288 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 aag gtt cct tac acg ttc gga ggg ggg acc aag gtg gaa ata aaa 333 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 984 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (modified constant heavy sequence) <220> <221> CDS <222> (1)..(984) <400> 13 gct tcc acc aag ggc cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 agc acc tcc gag agc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acg aag acc 240 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 tac acc tgc aat gta gat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aga gtt gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca cca tgc cca gca cct 336 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 gag ttc gag ggg gga cca tca gtc ttc ctg ttc ccc cca aaa ccc aag 384 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 gac act ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg 432 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 gac gtg agc cag gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gat 480 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag ttc 528 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 576 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc 624 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 ccg tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga 672 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cag gag gag atg acc aag 720 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac 768 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag 816 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 864 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 agg cta acc gtg gac aag agc agg tgg cag gag ggg aat gtc ttc tca 912 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag agc 960 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 ctc tgc ctg tct ctg ggt aaa tga 984 Leu Cys Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 14 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 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gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 324 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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att cgc cag cct cca gga aag gga ctg gag tgg atc 144 Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gta ata tgg gct ggt gga ggc acg aat tat aat tcg gct ctc atg 192 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 tcc aga gtg acc atc agc gtg gac acc tcc aag aac caa ttt tcc tta 240 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 aaa ctg agc agt gtg aca gct gct gac aca gcc gtg tat tac tgt gcc 288 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga gat aag gga tac tcc gct gcc gct tct atg gac tac tgg ggc caa 336 Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Ala Ala Ala Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp 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Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Cys Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 22 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (Heavy Chain 2 (HC2)) <400> 22 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Cys Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 23 Asp Tyr Gly Val His 1 5 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 24 Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser 1 5 10 15 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 25 Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 26 Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln 1 5 10 15 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 27 Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 28 Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 29 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 30 Ala Ala Ala Gly Gly 1 5 <210> 31 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (N-terminal linker) <220> <221> CDS <222> (1)..(51) <400> 31 cag gtc caa ctg acg cgt gag ggg tcc ggc tct cac tcc atg agg tat 48 Gln Val Gln Leu Thr Arg Glu Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr 1 5 10 15 ttc 51 Phe <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Gln Val Gln Leu Thr Arg Glu Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr 1 5 10 15 Phe <210> 33 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence (C-terminal linker) <220> <221> CDS <222> (1)..(57) <400> 33 gag ggt ttg ccc aag ccc ctc acc tgg gct cga gag gtg agc gag gtc 48 Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Trp Ala Arg Glu Val Ser Glu Val 1 5 10 15 aag ctg cag 57 Lys Leu Gln <210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Trp Ala Arg Glu Val Ser Glu Val 1 5 10 15 Lys Leu Gln

Claims (44)

  1. 항원 특이적 T 세포의 활성화에 적합한 부착된 폴리펩티드 리간드를 갖는 중합성 나노입자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 있어서, 상기 나노입자는 20 내지 200 nm의 범위 내의 크기를 가지며,
    폴리(젖산-코-글리콜산) 또는 폴리젖산 (PLGA/PLA) 중합체 코어, 그리고
    폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체로 형성된 친수성 껍질
    을 포함하고,
    여기서 중합성 나노입자는 PLGA/PLA-PEG 및 PLGA/PLA-메톡시PEG (PLGA/PLA-mPEG) 블록 공중합체를 포함하며, PLGA/PLA 부분은 약 10 kDa 내지 약 30 kDa의 분자량을 갖고, PEG 부분은 약 2 kDa 내지 약 10 kDa의 분자량을 가지며, PEG 부분은 친수성 껍질을 형성하고,
    PLGA/PLA-PEG 및 PLGA/PLA-mPEG 블록 공중합체는 질량 기준으로 약 1:10 내지 약 2:1의 비로 존재하며; PLGA/PLA-PEG 중합체는 폴리펩티드 리간드 상의 비대합된 시스테인 측쇄 및 PEG-말레이미드 관능기를 통한 폴리펩티드 리간드의 말단 부착을 갖는 반면, PLGA/PLA-mPEG 블록 공중합체는 폴리펩티드 리간드의 말단 부착을 갖지 않고;
    폴리펩티드 리간드는 펩티드-HLA 리간드 및 항-CD28 리간드를 포함하는 것인,
    aAPC.
  2. 제1항에 있어서, PEG 중합체가 상이한 분자량을 갖는 것인 aAPC.
  3. 제1항에 있어서, 약 0 내지 -20 mV의 표면 전하를 갖는 aAPC.
  4. 제1항에 있어서, 약 -5 내지 -10 mV의 표면 전하를 갖는 aAPC.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 입자당 500개 미만의 리간드를 갖는 aAPC.
  6. 제5항에 있어서, 입자당 400개 미만의 리간드를 갖는 aAPC.
  7. 제5항에 있어서, 입자당 300개 미만의 리간드를 갖는 aAPC.
  8. 제5항에 있어서, 입자당 약 200개 미만의 리간드를 갖는 aAPC.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, HLA 리간드가 이합체성인 것인 aAPC.
  10. 제9항에 있어서, HLA 리간드가 면역글로불린 서열과의 융합을 포함하는 것인 aAPC.
  11. 제10항에 있어서, HLA 리간드가 면역글로불린 가변 도메인 서열이 없이, 면역글로불린 힌지 영역에 융합된 HLA의 세포외 도메인을 포함하는 것인 aAPC.
  12. 제1항에 있어서, 사이토킨을 피포(encapsulation)하지 않는 aAPC.
  13. 제1항에 있어서, 각각의 HLA 리간드 및 하나 이상의 항-CD28 리간드가 코돈 S241 및 L248에 돌연변이를 갖는 IgG4 불변 영역, 및 코돈 473에 비대합된 시스테인을 갖는 것인 aAPC.
  14. 암 환자 또는 바이러스 감염을 갖는 환자에서의 항원 특이적 세포독성 T 세포의 형성을 유도하는데 사용하기 위한, 제1항 또는 제2항의 aAPC를 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 피하 투여, 림프관내 투여 또는 종양내 투여용으로 조제된 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 환자가 하나 이상의 체크포인트 저해제를 이용한 요법을 받고 있거나 또는 받았던 암 환자인 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 환자가 입양 T 세포 요법을 받고 있는 환자인 조성물.
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