CN108359013A - 一种人工抗原递呈纳米制剂及其用于体内外扩增特异性t细胞的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物大分子药物制剂领域，具体涉及一种人工抗原递呈纳米制剂及其用于体内外扩增特异性T细胞的应用。本发明中，人工抗原递呈纳米制剂为一种表面连接了MHC复合抗原的纳米制剂，并载有T细胞共刺激因子，进一步地，本发明制备的制剂能够模拟人工抗原递呈细胞，达到体内外扩增特异性T细胞的效果。

Description

一种人工抗原递呈纳米制剂及其用于体内外扩增特异性T细 胞的应用
技术领域
本发明属于生物大分子药物制剂领域，具体涉及一种人工抗原递呈纳米制剂及其用于体 内外扩增特异性T细胞的应用。
背景技术
肿瘤治疗的传统方法一直采用三种传统治疗方法，即放疗、化疗及手术治疗。传统的 手术治疗只能解决局部问题，放疗及化疗在杀伤癌细胞的同时还会使人体正常组织和细胞 受到损伤。因此，放疗、化疗及手术三大传统治疗方式一直存在着不彻底、易转移、副作 用大等弊端。肿瘤免疫治疗是继放疗、化疗及手术治疗之后的一种新的肿瘤治疗手段，在 预防肿瘤复发、转移、治疗肿瘤病灶等方面具有其独特的优势。
肿瘤免疫治疗是应用免疫学原理和方法，激发和增强机体针对肿瘤细胞的特异性免疫 识别和杀伤，具体地可以通过将免疫细胞和增强肿瘤免疫的药物分子输注入宿主体内，协 同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。Zhang L等2003年发表于《新英格兰医学杂志》 的一项研究发现，肿瘤浸润T细胞数量与宫颈癌患者的总生存期及无进展生存期相关，提 示了肿瘤病人中肿瘤特异性T细胞(tumor specific antigen T cells)的存在，表明免疫系统 是可以识别肿瘤的，但病人体内往往由于免疫抑制作用，肿瘤特异性T细胞数量极其匮乏， 无法达到杀伤肿瘤细胞的作用。
目前，肿瘤特异性T细胞的临床应用被寄予厚望，以Rosenburg教授为代表对于肿瘤 特异性淋巴细胞的研究已经展开多项临床实验，已在治疗转移性黑色素瘤上获得了良好的 结果。可知肿瘤特异性T细胞治疗肿瘤疾病具有安全，靶向，高效的特点。技术手段主要 是将患者自体T细胞分离后，采用不同刺激因子进行体外扩增至一定数量后回输至患者体 内。
其中都需要依赖于组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)这一核 心物质发挥作用。MHC是机体免疫识别的重要分子，在抗原递呈以及获得性免疫应答中有 重要作用。1975年，Doherty和Zinkernagel在研究小鼠病毒免疫反应时证明了MHC限制 性(MHC Restriction)，即病毒上的多肽只有在与特定的MHC分子结合的情况下才能被特定 的T细胞识别。MHC分子包括MHC I类分子及MHC II类分子。MHC I类分子与经蛋白酶体降解处理的内源性抗原肽(如病毒蛋白)在内质网(Endoplasmic Reticulum,ER)中结合 成肽-MHC I类复合体并递呈到细胞表面，激活相应的CD8+T细胞，即细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cell,CTL)。MHC-I类分子又称为第一型人类白细胞抗原分子(HumanLeukocyte Antigen,HLA)，可细分为HLA-A、HLA-B及HLA，根据其基因多态性又可逐步 细分，例如HLA-A2的基因有12个变异体(A*0201～A*0212)。同时，HLA基因型存在 地域及人群差异性，不同地区不同人群HLA等位基因分布频率不同，如在亚裔人群中HLA A*0201基因出现频率相对较高。
现有的肿瘤特异性淋巴细胞的诱导培养需要消耗大量的时间，并且由于肿瘤组织中普 遍存在免疫抑制的微环境，所以针对肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen,TSA)的T细胞 表型更多为Treg，无法有效地诱导抗肿瘤免疫应答。为获得抗原特异性还通常需加入特异性 抗原多肽一同体外培养，对技术的要求相对较高，因此极大地限制了这项治疗方法在癌症患 者身上的广泛运用。怎样选择一种能够有效诱导分离肿瘤特异性CTL的方法是目前CTL技 术亟待解决的问题。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种人工抗原递呈纳米 制剂及其用于体内外扩增特异性T细胞的应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种人工抗原递呈纳米制剂，包括纳米粒、连接在所述纳米粒上的至少一种T细胞表面受体识别因子以及连接在所述纳米粒上的至少一种T细胞 共刺激因子。
优选地，所述纳米粒为脂质体。
优选地，所述纳米粒为长循环脂质体。
优选地，所述纳米制剂为生物素化的纳米制剂，所述纳米制剂中的纳米粒上通过生物素 连接了亲和素。
优选地，所述亲和素为链霉亲和素。
优选地，所述T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子进行了生物素修饰，所述T 细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子上所修饰的生物素与纳米粒上连接的亲和素结 合，从而连接在所述纳米粒上。
优选地，所述T细胞表面受体识别因子为肿瘤相关抗原多肽与MHC I的融合蛋白。所 述T细胞共刺激因子选自CD28抗体、PD-1抗体或CTLA4抗体。
优选地，所述肿瘤相关抗原多肽与MHC I的融合蛋白选自肝癌表面抗原AFP中的抗原 决定簇多肽与MHC I的融合蛋白或神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中的抗原决定簇 与MHC I的融合蛋白。
优选地，所述肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白的结构中包括N端到C端依次排列的肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段、β2m轻链、MHC-1重链、 亲和素标签。
优选地，所述肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。 所述β2m轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。所述MHC-1重链的氨基酸序列如SEQID NO.19所示。所述亲和素标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
优选地，所述肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段与所述β2m轻链之间通过第一连接肽 连接。所述β2m轻链与所述MHC-1重链之间通过第二连接肽连接。所述重链MHC-1与所 述亲和素标签之间通过第三连接肽连接。
优选地，所述第一连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.21。所述第二连接肽的氨基酸序 列如SEQ ID NO.22所示。所述第三连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
优选地，所述肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
优选地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中的抗原决定簇与MHC I的融合 蛋白的结构中包括N端到C端依次排列的神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段、β2m轻链、MHC-1重链、亲和素标签。
优选地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段的氨基酸如SEQ ID NO.25所示。所述β2m轻链的的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。所述MHC-1重链的氨 基酸序列如SEQ ID NO.27所示。所述亲和素标签氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示。
优选地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段与所述β2m轻链之 间通过第四连接肽连接。所述β2m轻链与所述MHC-1重链之间通过第五连接肽连接。所述MHC-1重链与所述亲和素标签之间通过第六连接肽连接。
优选地，所述第四连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。所述第五连接肽的氨基 酸序列如SEQ ID NO.30所示。所述第六连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示。
优选地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中的抗原决定簇与MHC I的融合 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子之间的个 数比例范围是(1～4)：4。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子之间的个 数比例范围是(2～4)：4。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子之间的个 数比例范围是(3～4)：4。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子之间的个 数比例范围是(1～2)：4。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子之间的个 数比例范围是(2～3)：4。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子之间的个 数比例是1:4、1:2、3:4或1:1。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数为57～227。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数为57～227。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数为113～227。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数为170～227。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数为57～170。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数为57～113。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数为113～170。
优选地，每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数为57、113、170或227。
本发明的第二方面，提供前述人工抗原递呈纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)在生物素化的纳米制剂上连接链霉亲和素，获得连接有链霉亲和素的纳米制剂；
(2)将生物素化标记的T细胞共刺激因子及生物素化标记的T细胞表面受体识别因子 分别与步骤(1)获得的连接有链霉亲和素的纳米制剂连接，获得连接有T细胞共刺激因子 及T细胞表面受体识别因子的纳米制剂，即为人工抗原递呈纳米制剂。
本发明的第三方面，提供前述人工抗原递呈纳米制剂用于制备T细胞激活剂的用途。
优选地，人工抗原递呈纳米制剂用于体内外激活多克隆T细胞群中抗原特异性T细胞。
本发明的第四方面，提供一种体内外激活多克隆T细胞群中抗原特异性T细胞的方法， 所述方法包括步骤：使用人工抗原递呈纳米制剂孵育多克隆T细胞群。
本发明的第五方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白为肝癌表面抗原AFP中的抗原 决定簇多肽与MHC I的融合蛋白或神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中的抗原决定簇 与MHC I的融合蛋白。
优选地，所述肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白的结构中包括N端到C端依次排列的肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段、β2m轻链、MHC-1重链、 亲和素标签。
优选地，所述肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。 所述β2m轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。所述MHC-1重链的氨基酸序列如SEQID NO.19所示。所述亲和素标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
优选地，所述肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段与所述β2m轻链之间通过第一连接肽 连接。所述β2m轻链与所述MHC-1重链之间通过第二连接肽连接。所述重链MHC-1与所 述亲和素标签之间通过第三连接肽连接。
优选地，所述第一连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.21。所述第二连接肽的氨基酸序 列如SEQ ID NO.22所示。所述第三连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
优选地，所述肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
优选地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中的抗原决定簇与MHC I的融合 蛋白的结构中包括N端到C端依次排列的神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段、β2m轻链、MHC-1重链、亲和素标签。
优选地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段的氨基酸如SEQ ID NO.25所示。所述β2m轻链的的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。所述MHC-1重链的氨 基酸序列如SEQ ID NO.27所示。所述亲和素标签氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示。
优选地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段与所述β2m轻链之 间通过第四连接肽连接。所述β2m轻链与所述MHC-1重链之间通过第五连接肽连接。所述MHC-1重链与所述亲和素标签之间通过第六连接肽连接。
优选地，所述第四连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。所述第五连接肽的氨基 酸序列如SEQ ID NO.30所示。所述第六连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示。
优选地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中的抗原决定簇与MHC I的融合 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示。
本发明的第六方面，提供一种多核苷酸，其编码前述第五方面所述融合蛋白。
本发明的第七个方面，提供一种表达载体，其含有前述多核苷酸。
本发明的第八方面，提供一种宿主细胞，其被前述表达载体所转化。
本发明第九方面，提供一种制备第五方面所述融合蛋白的方法，包括如下步骤：构建含有融合蛋白基因序列的表达载体，然后将含融合蛋白基因序列的表达载体转 化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的融合蛋白。
本发明的第十方面，提供本发明第五方面所述融合蛋白用于制备人工抗原递呈纳米制剂 的用途。
优选地，所述融合蛋白作为T细胞表面受体识别因子发挥作用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用已结合抗原多肽的MHC I类分子作为激活T细胞表面受体的信号I，同时加 入共刺激因子作为信号II，如CD80、CD86，抗CD28的抗体等，或导入细胞因子或协同共刺 激分子的编码基因构建人工抗原递呈纳米制剂。本发明制备的制剂能够模拟人工抗原递呈细 胞，达到体内外扩增特异性T细胞的效果。
附图说明
图1：DSPE-PEG-Biotin结构示意图。
图2A：未连接有Streptavidin的生物素化脂质体粒径表征。
图2B：连接有Streptavidin的生物素化脂质体粒径表征。
图3：AFP-β2m-MHC-1-Avi Tag及EGFRvIII-β2m-MHC-1-Avi Tag结构示意图。
图4：单链MHC I类分子SDS-PAGE鉴定图，其中1#.AFP-β2m-MHC-1-Avi protein,2#. EGFRvIII-β2m-MHC-2-Avi protein。
图5：Elisa检测单链MHC I类分子生物活性结果图。
图6：连接有生物素化标记的Anti-human CD28antibody、Anti-human PD-1antibody或 Anti-human CTLA4antibody的脂质体粒径表征。
图7：SDS-PAGE鉴定纳米制剂结果图。
图8：流式细胞术检测纳米制剂结合Jurkat细胞结果图。
图9A：Elisa检测包载肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白及Anti-human CD28antibody的纳米制剂激活HLA-A 0201CD8+T细胞结果图。
图9B：Elisa检测包载神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中的抗原决定簇与MHCI的融合蛋白及Anti-human CD28antibody的纳米制剂激活HLA-A 0201CD8+T细胞结果 图。
具体实施方式
本发明中，缩写符号表示如下：
MHC 主要组织相容性复合物
HSPC 氢化大豆卵磷脂
Cholesterol 胆固醇
DSPE 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
PEG 聚乙二醇
Biotin 生物素
Streptavidin(SA) 链霉亲合素
AFP 甲胎蛋白
EGFRvIII 表皮生长因子受体III型突变体
一、一种人工抗原递呈纳米制剂
本发明的一种人工抗原递呈纳米制剂，包括纳米粒、连接在所述纳米粒上的至少一种T 细胞表面受体识别因子以及连接在所述纳米粒上的至少一种T细胞共刺激因子。
需要说明的是，所述纳米制剂中的纳米二字并不对纳米制剂的粒径大小构成限制。只 要是其中的纳米粒的直径≤5微米，符合药用条件，都可以在本发明中称之为纳米制剂。
本发明对于纳米制剂并无特别的限制，只要能够将T细胞表面受体识别因子及T细胞 共刺激因子偶联至纳米制剂中的纳米粒表面，使其发挥相应生物学作用即可。
例如，所述纳米制剂可以是脂质体。本发明对于脂质体的载体材料及含量并无特别的 限制。如实施例所列举的，所述脂质体的制备材料可以包括HSPC、Cholesterol。
本发明的实施例中，列举了所述脂质体为生物素标记的长循环脂质体。
长循环脂质体是指在脂质体上连接了可以使得脂质体在体内进行较长时间循环的分 子。例如使得脂质体在体内进行较长时间循环的分子可以是PEG，也就是本领域常说的PEG 化修饰。如本发明实施例所列举的使得脂质体在体内进行较长时间循环的分子可以是 DSPE-PEG，进一步可以为DSPE-PEG2000。PEG的分子量并不限制于2000，只要能够起 到长循环的作用即可。
进一步地，所述纳米制剂可以是生物素化的纳米制剂。所述生物素化的纳米制剂是指 在纳米制剂的纳米粒上修饰了生物素。
进一步地，所述脂质体可以为生物素化的脂质体。所述生物素化是指在脂质体中修饰 了生物素。例如，可以在脂质体中加入生物素标记的脂质分子。如本发明实施例所列举的， 可在脂质体中加入生物素标记的聚乙二醇化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-Biotin)。 所述生物素标记的聚乙二醇化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-Biotin)的结构式如图 1所示。
生物素—亲和素系统(Biotin-Streptavidin System)由于生物素与亲和素之间高亲合力的 特点而几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，因此本研究中选择将其作为抗体与脂质 体载体系统之间的连接桥梁。将一定比例HSPC、Cholesterol、DSPE-PEG和DSPE-PEG-Biotin 通过薄膜分散法制备成脂质体制剂，因DSPE-PEG-Biotin尾部为聚乙二醇化修饰，活性基 团Biotin大部分暴露在脂质体双分子层膜外，可与Streptavidin形成连接桥梁，后者可作为 作为后续激活因子连接位点。因此，生物素标记的脂质体具有结构简单、反应迅速、亲和 力强等优点，我们选择其作为人工抗原递呈纳米制剂载体。
所以，纳米制剂中的纳米粒可以是修饰了生物素-亲和素。T细胞表面受体识别因子及 T细胞共刺激因子可进行生物素修饰，所述T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子 上所修饰的生物素与纳米粒上连接的亲和素结合，从而连接在所述纳米粒上。
也就是说，所述纳米制剂中的纳米粒通过生物素-亲和素与T细胞表面受体识别因子及 T细胞共刺激因子进行连接。
进一步地，所述T细胞表面受体识别因子为肿瘤相关抗原MHC I类分子。所述T细胞共刺激因子为针对CD28的抗体。例如，所述针对CD28的抗体可以是Anti-human CD28antibody。
进一步地，所述T细胞表面受体识别因子为肝癌表面抗原AFP MHC I类分子或神经胶 质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII MHC I类分子。
进一步地，所述肝癌表面抗原AFP MHC I类分子的结构中包括N端到C端依次排列的肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段、β2m轻链、MHC-1重链、亲和素标签。
进一步地，所述肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所 示。所述β2m轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。所述MHC-1重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。所述亲和素标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
进一步地，所述肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段与所述β2m轻链之间通过第一连接 肽连接。所述β2m轻链与所述MHC-1重链之间通过第二连接肽连接。所述重链MHC-1与 所述亲和素标签之间通过第三连接肽连接。
进一步地，所述第一连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.21。所述第二连接肽的氨基酸 序列如SEQ ID NO.22所示。所述第三连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
进一步地，所述肝癌表面抗原AFP MHC I类分子氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
进一步地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII MHC I类分子的结构中包括N 端到C端依次排列的神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段、β2m轻链、MHC-1重链、亲和素标签。
进一步地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段的氨基酸如SEQ ID NO.25所示。所述β2m轻链的的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。所述MHC-1重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示。所述亲和素标签氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示。
进一步地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段与所述β2m轻 链之间通过第四连接肽连接。所述β2m轻链与所述MHC-1重链之间通过第五连接肽连接。所述MHC-1重链与所述亲和素标签之间通过第六连接肽连接。
进一步地，所述第四连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。所述第五连接肽的氨 基酸序列如SEQ ID NO.30所示。所述第六连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示。
进一步地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII MHC I类分子的氨基酸序列如 SEQ ID NO.32所示。
进一步地，每个纳米粒上连接的T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子之间的 个数比例范围是(1～4)：4。每个纳米粒上连接的T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子之间的个数比例范围还可以是(2～4)：4。每个纳米粒上连接的T细胞表面受体识 别因子及T细胞共刺激因子之间的个数比例范围还可以是(3～4)：4。每个纳米粒上连接 的T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子之间的个数比例范围还可以是(1～2)：4。 每个纳米粒上连接的T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子之间的个数比例范围还 可以是(2～3)：4。
进一步地，每个纳米粒上连接的T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子之间的 个数比例可以是1:4、1:2、3:4或1:1。
进一步地，每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数为57～227。每个纳米粒上连 接的T细胞共刺激因子的个数为57～227。每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数 可以为113～227。每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数可以为170～227。每个纳 米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数可以为57～170。每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数可以为57～113。每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数可以为113～170。每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数可以为57、113、170或227。
二、一种人工抗原递呈纳米制剂的制备方法
本发明的一种人工抗原递呈纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)在生物素化的纳米制剂上连接链霉亲和素，获得连接有链霉亲和素的纳米制剂；
(2)将生物素化标记的T细胞共刺激因子及生物素化标记的T细胞表面受体识别因子 分别与步骤(1)获得的连接有链霉亲和素的纳米制剂连接，获得连接有T细胞共刺激因子 及T细胞表面受体识别因子的纳米制剂，即为人工抗原递呈纳米制剂。
三、人工抗原递呈纳米制剂的用途
本发明的人工抗原递呈纳米制剂可用于制备T细胞激活剂，用于体内外激活多克隆T 细胞群中抗原特异性T细胞。
四、因此，本发明还可以提供一种体内外激活多克隆T细胞群中抗原特异性T细胞的 方法，所述方法包括步骤：使用人工抗原递呈纳米制剂孵育多克隆T细胞群。
五、融合蛋白
本发明的所述融合蛋白为肝癌表面抗原AFP MHC I类分子或神经胶质母细胞瘤表面 抗原EGFRvIII MHC I类分子。
进一步地，所述肝癌表面抗原AFP MHC I类分子的结构中包括N端到C端依次排列的肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段、β2m轻链、MHC-1重链、亲和素标签。
进一步地，所述肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所 示。所述β2m轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。所述MHC-1重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。所述亲和素标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
进一步地，所述肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段与所述β2m轻链之间通过第一连接 肽连接。所述β2m轻链与所述MHC-1重链之间通过第二连接肽连接。所述重链MHC-1与 所述亲和素标签之间通过第三连接肽连接。
进一步地，所述第一连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.21。所述第二连接肽的氨基酸 序列如SEQ ID NO.22所示。所述第三连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
进一步地，所述肝癌表面抗原AFP MHC I类分子氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
进一步地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII MHC I类分子的结构中包括N 端到C端依次排列的神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段、β2m轻链、MHC-1重链、亲和素标签。
进一步地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段的氨基酸如SEQ ID NO.25所示。所述β2m轻链的的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。所述MHC-1重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示。所述亲和素标签氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示。
进一步地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段与所述β2m轻 链之间通过第四连接肽连接。所述β2m轻链与所述MHC-1重链之间通过第五连接肽连接。所述MHC-1重链与所述亲和素标签之间通过第六连接肽连接。
进一步地，所述第四连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。所述第五连接肽的氨 基酸序列如SEQ ID NO.30所示。所述第六连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示。
进一步地，所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII MHC I类分子的氨基酸序列如 SEQ ID NO.32所示。
六、编码融合蛋白的多核苷酸
本发明的编码所述融合蛋白的多核苷酸，可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
本发明的编码所述融合蛋白的多核苷酸，可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技 术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，科 学出版社，1995)。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法；例如采用重叠延伸PCR 法。
七、表达载体
本发明的所述表达载体含有编码所述融合蛋白的多核苷酸。本领域的技术人员熟知的方 法能用于构建所述表达载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所 述融合蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达蛋白， 或者用于同源重组。本发明的较佳案例中，所述表达载体采用pcDNA3.1。所述宿主细胞采 用中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary ce1l，CHO)。
八、制备融合蛋白的方法
本发明的制备融合蛋白的方法，包括步骤：构建含有融合蛋白基因序列的表达载体， 然后将含融合蛋白基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得 所述的融合蛋白。
九、融合蛋白的用途
本发明的融合蛋白可作为T细胞表面受体识别因子发挥作用，可用于制备人工抗原递 呈纳米制剂。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特 定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施 方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通 常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例 中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域 常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1生物素化脂质体的制备及表征
我们选择采用薄膜分散法制备生物素化脂质体。将一定比例HSPC、Cholesterol、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-Biotin置于50ml梨形瓶中，加入适量氯仿，水浴超声使 其溶解，旋转蒸发仪减压蒸发除去氯仿直至梨形瓶底部形成一层薄膜，加入适量HEPS溶 液水浴超声使其重新溶解，水浴超声至脂质体溶液呈半透明状态后，使用Avanti Extruder 将脂质体溶液先后推过100nm、80nm和50nm的聚碳酸酯膜直至粒径达到要求，置于4℃ 冰箱保存备用。粒度分析仪(PCS)测定，制剂粒径均为80nm左右，PDI为0.099(图2A)。
将链霉亲和素(Streptavidin，SA)在氮气保护下按照摩尔比例DSPE-PEG2000-Biotin: Streptavidin＝1:1混合加入，在37℃的条件下孵育1小时后，使用截留分子量为100KD的 超滤管除去未连接上的Streptavidin。PCS测定，制剂的最终粒径均为190nm左右，PDI为0.239(图2B)。
实施例2构建肝癌表面抗原AFP的单链MHC I类分子以及神经胶质母细胞瘤表面抗原 EGFRvIII的单链MHC I类分子
MHC I类分子由一条较长的重链(α链)，一条较短的轻链(β链)以及抗原表位肽组成，其中轻链又称为β-2微球蛋白(β2m)。通过在相关抗原表位肽序列、β2m轻链基因、 MHC重链基因中引入Linker序列，并在尾部接入Avi Tag序列(可用于与生物素连接)构 建可生物素化的单链MHC分子。
我们选择肝癌表面抗原AFP或神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII作为特定肿瘤抗 原，肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段为FMNKFIYEI，神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段为LEEKKGNYV，并选择亚裔人群中出现频率相对较高的HLA A*0201基因作为我们的研究对象(重链)，分别构建了单链MHC I类分子：
AFP-β2m-MHC-1-Avi Tag及EGFRvIII-β2m-MHC-1-Avi Tag(结构示意图如图3所示)。 两者均相当于重组蛋白。
AFP-β2m-MHC-1-Avi Tag的结构中包括从N端到C端依次排列的肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段(简称AFP)、轻链(简称β2m)、重链(简称MHC-1)、亲和素标签(简 称AviTag)。
肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段(简称AFP)与轻链(简称β2m)之间通过第一 连接肽连接。轻链(简称β2m)与重链(简称MHC-1)之间通过第二连接肽连接、重链(简 称MHC-1)与亲和素标签(简称Avi Tag)之间通过第三连接肽连接。
肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段(简称AFP)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
TTTATGAATAAGTTTATTTATGAGATT。
轻链(简称β2m)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
ATTCAGCGTACCCCGAAGATCCAGGTTTACAGTCGTCACCCGGCCGAGAACGGTAAAAGCAACTTCCTGAACTGCTATGTTAGCGGCTTTCATCCGAGCGACATCGAAGTGGATCTGCTGAAAAACGGCGAGCGCATTGAAAAGGTGGAACACAGCGACCTGAGCTTCAGCAAAGACTGGAGCTTCTACCTGCTGTACTACACCGAGTTCACCCCGACAGAGAAAGACGAATATGCCTGCCGCGTTAACCACGTGACCCTGAGCCAGCCGAAGATCGTGAAATG GGATCGCGACATG。
重链(简称MHC-1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
GGCAGCCACAGCATGCGCTACTTCTTTACCAGCGTGAGCCGTCCTGGTCGTGGTGAACCGCGCTTTATTGCAGTGGGCTACGTGGACGATACCCAATTCGTGCGCTTTGATAGCGATGCAGCCAGCCAGCGTATGGAACCTCGCGCCCCGTGGATCGAACAGGAAGGTCCGGAATATTGGGATGGCGAAACCCGCAAGGTGAAAGCCCATAGCCAGACACATCGCGTTGATCTGGGCACCCTGCGCGGCTACTATAACCAGAGCGAAGCCGGCAGTCACACCGTTCAGCGCATGTACGGTTGCGATGTTGGTAGCGATTGGCGCTTTCTGCGTGGTTACCATCAGTATGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGATCTGCGTAGCTGGACAGCCGCAGATATGGCAGCACAGACCACAAAGCATAAATGGGAGGCCGCACATGTGGCCGAACAACTGCGCGCCTATCTGGAGGGCACCTGTGTTGAGTGGCTGCGTCGTTACCTGGAAAATGGCAAAGAGACCCTGCAACGCACCGATGCCCCTAAAACCCACATGACCCATCACGCAGTTAGCGATCATGAAGCCACCCTGCGTTGTTGGGCACTGAGCTTCTATCCGGCCGAAATTACACTGACATGGCAACGTGATGGCGAAGATCAGACCCAGGATACCGAGCTGGTGGAGACCCGCCCTGCAGGTGATGGCACCTTTCAGAAATGGGCAGCAGTTGTTGTGCCGAGTGGTCAAGAACAGCGCTACACCTGTCACGTTCAGCATGAAGGCCTGCCGAAACCGCTGACACTGCGCTGGGAGCCGAGTAGCCAGCCGACAATTCCGATT。
亲和素标签(简称Avi Tag)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
GGTCTGAACGACATTTTCGAAGCACAGAAAATTGAATGGCATGAG。
肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段(简称AFP)与轻链(简称β2m)之间的第一连 接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：
GGCGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGTGGTAGTGGTGGTGGCGGTAGC。
轻链(简称β2m)与重链(简称MHC-1)之间的第二连接肽的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，具体为：
GGCGGTGGCGGTAGTGGTGGTGGCGGTAGTGGCGGTGGTGGTAGTGGCGGTGG TGGTAGC。
重链(简称MHC-1)与亲和素标签(简称Avi Tag)之间的第三连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：
GGCAGCGGT。
AFP-β2m-MHC-1-Avi Tag的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：
CATATGTTTATGAATAAGTTTATTTATGAGATTGGCGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGTGGTAGTGGTGGTGGCGGTAGCATTCAGCGTACCCCGAAGATCCAGGTTTACAGTCGTCACCCGGCCGAGAACGGTAAAAGCAACTTCCTGAACTGCTATGTTAGCGGCTTTCATCCGAGCGACATCGAAGTGGATCTGCTGAAAAACGGCGAGCGCATTGAAAAGGTGGAACACAGCGACCTGAGCTTCAGCAAAGACTGGAGCTTCTACCTGCTGTACTACACCGAGTTCACCCCGACAGAGAAAGACGAATATGCCTGCCGCGTTAACCACGTGACCCTGAGCCAGCCGAAGATCGTGAAATGGGATCGCGACATGGGCGGTGGCGGTAGTGGTGGTGGCGGTAGTGGCGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGTGGTAGCGGCAGCCACAGCATGCGCTACTTCTTTACCAGCGTGAGCCGTCCTGGTCGTGGTGAACCGCGCTTTATTGCAGTGGGCTACGTGGACGATACCCAATTCGTGCGCTTTGATAGCGATGCAGCCAGCCAGCGTATGGAACCTCGCGCCCCGTGGATCGAACAGGAAGGTCCGGAATATTGGGATGGCGAAACCCGCAAGGTGAAAGCCCATAGCCAGACACATCGCGTTGATCTGGGCACCCTGCGCGGCTACTATAACCAGAGCGAAGCCGGCAGTCACACCGTTCAGCGCATGTACGGTTGCGATGTTGGTAGCGATTGGCGCTTTCTGCGTGGTTACCATCAGTATGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGATCTGCGTAGCTGGACAGCCGCAGATATGGCAGCACAGACCACAAAGCATAAATGGGAGGCCGCACATGTGGCCGAACAACTGCGCGCCTATCTGGAGGGCACCTGTGTTGAGTGGCTGCGTCGTTACCTGGAAAATGGCAAAGAGACCCTGCAACGCACCGATGCCCCTAAAACCCACATGACCCATCACGCAGTTAGCGATCATGAAGCCACCCTGCGTTGTTGGGCACTGAGCTTCTATCCGGCCGAAATTACACTGACATGGCAACGTGATGGCGAAGATCAGACCCAGGATACCGAGCTGGTGGAGACCCGCCCTGCAGGTGATGGCACCTTTCAGAAATGGGCAGCAGTTGTTGTGCCGAGTGGTCAAGAACAGCGCTACACCTGTCACGTTCAGCATGAAGGCCTGCCGAAACCGCTGACACTGCGCTGGGAGCCGAGTAGCCAGCCGACAATTCCGATTGGCAGCGGTGGTCTGAACGACATTTTCGAAGCACAGAAAATTGAATGGCATGAGTGAGGATCC。
EGFRvIII-β2m-MHC-1-Avi Tag的包括从N端到C端依次排列的神经胶质母细胞瘤表 面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段(简称EGFRvIII)、轻链(简称β2m)、重链(简称MHC -1)、亲和素标签(简称Avi Tag)。
神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段(简称EGFRvIII)与轻链(简称β2m)之间通过第四连接肽连接。轻链(简称β2m)与重链(简称MHC-1)之间通过第 五连接肽连接。重链(简称MHC-1)与亲和素标签(简称Avi Tag)之间通过第六连接肽 连接。
神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段(简称EGFRvIII)的核苷酸如 SEQ ID NO.9所示，具体为：
CTGGAGGAGAAAAAGGGCAATTATGTG。
轻链(简称β2m)的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：
ATTCAGCGTACCCCGAAGATCCAGGTTTACAGTCGTCACCCGGCCGAGAACGGTAAAAGCAACTTCCTGAACTGCTATGTTAGCGGCTTTCATCCGAGCGACATCGAAGTGGATCTGCTGAAAAACGGCGAGCGCATTGAAAAGGTGGAACACAGCGACCTGAGCTTCAGCAAAGACTGGAGCTTCTACCTGCTGTACTACACCGAGTTCACCCCGACAGAGAAAGACGAATATGCCTGCCGCGTTAACCACGTGACCCTGAGCCAGCCGAAGATCGTGAAATG GGATCGCGACATG。
重链(简称MHC-1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：
GGCAGCCACAGCATGCGCTACTTCTTTACCAGCGTGAGCCGTCCTGGTCGTGGTGAACCGCGCTTTATTGCAGTGGGCTACGTGGACGATACCCAATTCGTGCGCTTTGATAGCGATGCAGCCAGCCAGCGTATGGAACCTCGCGCCCCGTGGATCGAACAGGAAGGTCCGGAATATTGGGATGGCGAAACCCGCAAGGTGAAAGCCCATAGCCAGACACATCGCGTTGATCTGGGCACCCTGCGCGGCTACTATAACCAGAGCGAAGCCGGCAGTCACACCGTTCAGCGCATGTACGGTTGCGATGTTGGTAGCGATTGGCGCTTTCTGCGTGGTTACCATCAGTATGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGATCTGCGTAGCTGGACAGCCGCAGATATGGCAGCACAGACCACAAAGCATAAATGGGAGGCCGCACATGTGGCCGAACAACTGCGCGCCTATCTGGAGGGCACCTGTGTTGAGTGGCTGCGTCGTTACCTGGAAAATGGCAAAGAGACCCTGCAACGCACCGATGCCCCTAAAACCCACATGACCCATCACGCAGTTAGCGATCATGAAGCCACCCTGCGTTGTTGGGCACTGAGCTTCTATCCGGCCGAAATTACACTGACATGGCAACGTGATGGCGAAGATCAGACCCAGGATACCGAGCTGGTGGAGACCCGCCCTGCAGGTGATGGCACCTTTCAGAAATGGGCAGCAGTTGTTGTGCCGAGTGGTCAAGAACAGCGCTACACCTGTCACGTTCAGCATGAAGGCCTGCCGAAACCGCTGACACTGCGCTGGGAGCCGAGTAGCCAGCCGACAATTCCGATT。
亲和素标签(简称Avi Tag)的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，具体为：
GGTCTGAACGACATTTTCGAAGCACAGAAAATTGAATGGCATGAG。
神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段(简称EGFRvIII)与轻链(简称β2m)之间的第四连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：
GGCGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGTGGTAGTGGTGGTGGCGGTAGC。
轻链(简称β2m)与重链(简称MHC-1)之间的第五连接肽的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示，具体为：
GGCGGTGGCGGTAGTGGTGGTGGCGGTAGTGGCGGTGGTGGTAGTGGCGGTGG TGGTAGC。
重链(简称MHC-1)与亲和素标签(简称Avi Tag)之间的第六连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，具体为：
GGCAGCGGT。
EGFRvIII-β2m-MHC-1-Avi Tag的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，具体为：
CATATGCTGGAGGAGAAAAAGGGCAATTATGTGGGCGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGTGGTAGTGGTGGTGGCGGTAGCATTCAGCGTACCCCGAAGATCCAGGTTTACAGTCGTCACCCGGCCGAGAACGGTAAAAGCAACTTCCTGAACTGCTATGTTAGCGGCTTTCATCCGAGCGACATCGAAGTGGATCTGCTGAAAAACGGCGAGCGCATTGAAAAGGTGGAACACAGCGACCTGAGCTTCAGCAAAGACTGGAGCTTCTACCTGCTGTACTACACCGAGTTCACCCCGACAGAGAAAGACGAATATGCCTGCCGCGTTAACCACGTGACCCTGAGCCAGCCGAAGATCGTGAAATGGGATCGCGACATGGGCGGTGGCGGTAGTGGTGGTGGCGGTAGTGGCGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGTGGTAGCGGCAGCCACAGCATGCGCTACTTCTTTACCAGCGTGAGCCGTCCTGGTCGTGGTGAACCGCGCTTTATTGCAGTGGGCTACGTGGACGATACCCAATTCGTGCGCTTTGATAGCGATGCAGCCAGCCAGCGTATGGAACCTCGCGCCCCGTGGATCGAACAGGAAGGTCCGGAATATTGGGATGGCGAAACCCGCAAGGTGAAAGCCCATAGCCAGACACATCGCGTTGATCTGGGCACCCTGCGCGGCTACTATAACCAGAGCGAAGCCGGCAGTCACACCGTTCAGCGCATGTACGGTTGCGATGTTGGTAGCGATTGGCGCTTTCTGCGTGGTTACCATCAGTATGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGATCTGCGTAGCTGGACAGCCGCAGATATGGCAGCACAGACCACAAAGCATAAATGGGAGGCCGCACATGTGGCCGAACAACTGCGCGCCTATCTGGAGGGCACCTGTGTTGAGTGGCTGCGTCGTTACCTGGAAAATGGCAAAGAGACCCTGCAACGCACCGATGCCCCTAAAACCCACATGACCCATCACGCAGTTAGCGATCATGAAGCCACCCTGCGTTGTTGGGCACTGAGCTTCTATCCGGCCGAAATTACACTGACATGGCAACGTGATGGCGAAGATCAGACCCAGGATACCGAGCTGGTGGAGACCCGCCCTGCAGGTGATGGCACCTTTCAGAAATGGGCAGCAGTTGTTGTGCCGAGTGGTCAAGAACAGCGCTACACCTGTCACGTTCAGCATGAAGGCCTGCCGAAACCGCTGACACTGCGCTGGGAGCCGAGTAGCCAGCCGACAATTCCGATTGGCAGCGGTGGTCTGAACGACATTTTCGAAGCACAGAAAATTGAATGGCATGAGTGAGGATCC。
完成核苷酸序列构建后，测序鉴定正确的重组质粒转化BL21(DE3)菌，于含100μg/ml 氨苄青霉素的LB培养基中培养，加IPTG诱导浓度为0.4μmol/L表达。通过12％SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达部位和表达量。目的蛋白主要以包涵体的形式存在，包涵体经洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,1％Triton X 100,5mM EDTA)洗涤至上清不含 目的蛋白后溶于裂解缓冲液中(50mM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,10％Glycerol,1％Protease inhibitor cocktail)，超声破碎。4℃，9000g离心10min，去除上清。重复裂解 离心两次后，将包涵体溶于变性缓冲液中(PBS pH 7.5,8M urea)，BCA法检测浓度后， 取2μg用于SDS-PAGE鉴定。鉴定完成后，采用稀释复性法进行复性，以浓度梯度法稀释 缓冲液中尿素浓度，直至最终缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.5,150mM NaCl,5mM GSH, 0.5mM GSSG，SDS-PAGE鉴定最终所得产物。根据图4结果可知AFP-β2m-MHC-1-Avi Tag 及EGFRvIII-β2m-MHC-1-Avi Tag重组蛋白分子量均为49kDa作用左右。
经检测，所得两种融合蛋白读框均正确，与预期一致。
也就是说：AFP-β2m-MHC-1-Avi Tag中的肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段(简称AFP)的氨基酸序列为：FMNKFIYEI(SEQ ID NO.17)。
轻链(简称β2m)的氨基酸序列为：
IQRTPKIQVY SRHPAENGKS NFLNCYVSGF HPSDIEVDLL KNGERIEKVE HSDLSFSKDWSFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVNHVTLSQP KIVKWDRDM(SEQ ID NO.18)。
重链(简称MHC-1)的氨基酸序列为：
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPI (SEQ ID NO.19)。
亲和素标签(简称Avi Tag)的氨基酸序列为GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO.20)。
肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段(简称AFP)与轻链(简称β2m)之间的第一连 接肽的氨基酸序列为GGGASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.21)。
轻链(简称β2m)与重链(简称MHC-1)之间的第二连接肽的的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.22)。
重链(简称MHC-1)与亲和素标签(简称Avi Tag)之间的第三连接肽的的氨基酸序列为GSG(SEQ ID NO.23)。
AFP-β2m-MHC-1-Avi Tag的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，具体为：
FMNKFIYEIGGGASGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPIGSGGLNDIFEAQKIEWHE。
神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段(简称EGFRvIII)的氨基酸如 SEQ ID NO.25所示，具体为：
LEEKKGNYV。
轻链(简称β2m)的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，具体为：
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM。
重链(简称MHC-1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，具体为：
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPI。
亲和素标签(简称Avi Tag)的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示，具体为：
GLNDIFEAQKIEWHE。
神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段(简称EGFRvIII)与轻链(简称β2m)之间的第四连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，具体为：GGGGSGGGGSGGGGS。
轻链(简称β2m)与重链(简称MHC-1)之间的第五连接肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.30所示，具体为：
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。
重链(简称MHC-1)与亲和素标签(简称Avi Tag)之间的第六连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示，具体为：
GSG。
EGFRvIII-β2m-MHC-1-Avi Tag的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，具体为：
LEEKKGNYVGGGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTIPIGSGGLNDIFEAQKIEWHE。
实施例3ELISA法检测单链MHC I类分子生物学活性
标记上生物素后的单链MHC-1类分子的制备：
首先，将上述实施例2中获得的单链MHC I类分子进行生物素化标记，方法包括如下 步骤：
将上述实施例2中获得的单链MHC I类分子AFP-β2m-MHC-1-Avi Tag及 EGFRvIII-β2m-MHC-1-Avi Tag分别经截留分子量为10K的超滤管超滤浓缩至浓度为 40μM，并更换原缓冲液为生物素化缓冲液(100mM Tris-HCL,pH 8及5mM MgCl2)。加 入5mM ATP、1mM生物素、蛋白酶抑制剂(2mM EDTA、0.1mM PMSF、1mg/L亮抑 蛋白酶肽及1mg/L胃蛋白酶抑制剂)及5μmol/L BirA酶,于室温反应1h，分别获得标 记上生物素后的单链MHC-1类分子AFP-β2m-MHC-1-Avi Tag及EGFRvIII-β2m-MHC-1-Avi Tag。
鼠单抗W6/32能特异地识别正确折叠后的单链MHC I类分子的抗原结合槽，用Goatanti-β2m Antibody包被ELISA板，W6/32作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为二 抗，通过双抗体夹心ELISA法检验MHC重折叠后是否形成活性构象。同时利用间接ELISA 原理，用Anti-humanβ2m Antibody包被ELISA板结合标记上生物素后的单链MHC-1类分 子，用HRP-Strepavidin检测单链MHC I类分子的生物活性。根据图5结果可知 AFP-β2m-MHC-1-Biotin及EGFRvIII-β2m-MHC-1-Biotin生物活性较高。具体地，各组 *Protein Concentration均为5nM。纵坐标中，*OD450为450nM波长下吸光度值。*因为实 验为夹心Elisa法，只有当单链MHC I类分子具有完整结构时才具备活性，因此阴性对照组 HLA A2Protein(重链)，B2MProtein(轻链)，HLA+B2M(直接简单混合两种蛋白)， HLA+B2M+Peptide(简单混合两种蛋白及抗原多肽)OD值仅为0.02左右，阳性对照组 (Positive Control)是从Biolegend公司买的产品用于对照使用，OD值仅为0.237左右。而 本发明的AFP-β2m-MHC-1-Avi Tag的OD值高达0.642，EGFRvIII-β2m-MHC-1-Biotin的 OD值高达0.561。
实施例4包载Anti-human CD28antibody的纳米制剂的制备及表征
(一)包载Anti-human CD28antibody的纳米制剂的制备
我们将前述实施例2中的单链MHC-I类分子AFP-β2m-MHC-1-Avi Tag作为靶向表达AFP特异性T细胞表面受体标记物，将生物素化标记的AFP-β2m-MHC-1-Avi Tag修饰在长 循环脂质体表面作为靶向配体，同时将生物素化标记的Anti-human CD28antibody、 Anti-human PD-1antibody或Anti-human CTLA4antibody作为T细胞共刺激因子修饰在脂质 体表面，达到刺激特定T细胞增殖的目的。
首先研究，在长循环脂质体表面修饰生物素化标记的Anti-human CD28antibody、Anti-human PD-1antibody或Anti-human CTLA4antibody的制剂制备方法。
生物素化标记的Anti-human CD28antibody、Anti-human PD-1antibody或Anti-human CTLA4antibody的制备方法，包括如下步骤：
将抗体经截留分子量为10K的超滤管超滤浓缩至浓度为40μM，并更换原储存缓冲液 为生物素化缓冲液(100mM Tris-HCL,pH 8及5mM MgCl2)。加入5mM ATP、1mM生物 素、蛋白酶抑制剂(2mM EDTA、0.1mM PMSF、1mg/L亮抑蛋白酶肽及1mg/L胃蛋 白酶抑制剂)及5μmol/L BirA酶,于室温反应1h。获得生物素化标记的抗体产物。
接下来，将生物素化标记的Anti-human CD28antibody、Anti-human PD-1antibody或 Anti-human CTLA4antibody在氮气保护下加入到实施例1中的长循环脂质体上，37℃的条 件下孵育1小时。PCS测定，制剂的最终粒径均为250nm左右，PDI为0.258(图6)。
其次以Anti-human CD28antibody为主要共刺激因子，研究每个长循环脂质体表面所修 饰的生物素化标记的Anti-human CD28antibody量。
生物素化标记的Anti-human CD28antibody的制备方法，包括如下步骤：
将Anti-human CD28antibody经截留分子量为10K的超滤管超滤浓缩至浓度为40μM， 并更换原储存缓冲液为生物素化缓冲液(100mM Tris-HCL,pH 8及5mM MgCl2)。加入5mM ATP、1mM生物素、蛋白酶抑制剂(2mM EDTA、0.1mM PMSF、1mg/L亮抑蛋白 酶肽及1mg/L胃蛋白酶抑制剂)及5μmol/L BirA酶,于室温反应1h。获得生物素化标 记的Anti-humanCD28antibody。
接下来，将生物素化标记的Anti-human CD28antibody在氮气保护下以不同连接比率， 加入到实施例1中的长循环脂质体上，37℃的条件下孵育1小时。连接比率为每个脂质体 上分别接入57、113、170和227个生物素化标记的Anti-human CD28antibody。
(二)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及流式细胞术检测连接效率
当Biotin Anti-human CD28antibody与实施例1中的长循环脂质体上的Streptavidin连 接成功后，其总体分子量会相应增大，因此可使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 检测二者是否连接成功。以Biotin Anti-human CD28antibody为例，具体步骤为：
1.使用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒制备浓度为12％的凝胶。
2.将制剂连接产物用10K超滤管脱盐浓缩。
3.制剂连接产物及作为对照的Streptavidin，Biotin Anti-humanCD28antibody， Streptavidin-Biotin Anti-human CD28antibody连接产物中加入蛋白上样缓冲液， 95℃下加热5min，直至蛋白变性。
4.样品冷却至室温后上样至SDS-PAGE加样槽内，用1X蛋白上样缓冲液调整每组样品浓度及体积，保证每组上样量一致且每组样品的蛋白上样量为2μg。
5.浓缩胶用80伏电压，浓缩胶用120伏电压电泳至蓝色染料到达胶底端后停止。
6.电泳结束后将SDS-PAGE凝胶置于考马斯亮蓝染色液中，摇床摇30min。
蛋白凝胶加入50ml去离子水微波炉高火煮3min，换去离子水后再煮3min，摇床摇5min， 直至凝胶背景基本为无色。
根据图7结果可知，生物素化脂质体连接链霉亲合素及激活因子后分子量上移至250kDa 左右。
除用SDS-PAGE凝胶检测连接效率之外，还可用流式细胞术检测已连接有BiotinAnti-human CD28antibody的荧光制剂是否能结合至靶细胞，从而检测其连接效率。以Biotin Anti-human CD28antibody为例，具体步骤为：
1.取出液氮中冻存的Jurkat细胞，快速将冻存管置于37℃水浴锅中，不断轻轻摇晃， 直至细胞完全溶解，加入10ml左右RPMI 1640完全培养基，1000rpm，离心 5min。
2.小心弃去上清液，加入适量完全培养基，使细胞培养密度为1*105cells/ml。
3.将Jurkat细胞接种至96孔细胞培养板中，每孔细胞数量为1*106cells。
4.将5ug不同抗体连接比例的脂质体制剂加入细胞中，在避光条件下，置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中孵育2h。
5.孵育完成后，取出细胞置于流式管中，加入适量PBS充分混悬后，4℃，500g条件下离心5min，重复两次。
6.使用流式细胞仪上机检测。
根据图8结果可知，当连接比率为每个脂质体上接入227个生物素化标记的Anti-human CD28antibody时，纳米制剂结合效率最高。*相比于未结合脂质体组别，PE荧光强度随抗 体加入量的升高而升高，因此除连接比率为每个脂质体上接入227个生物素化标记的Anti-human CD28antibody以外，其他连接比率每个脂质体上接入57、113或170个生物素化标记的Anti-human CD28antibody时，也是有一定的效果。具体地，未结合脂质体组别，PE荧光强度为16.2；每个脂质体上接入57个生物素化标记的Anti-human CD28antibody组，PE荧光强度为45.5；每个脂质体上接入113个生物素化标记的Anti-human CD28antibody组，PE荧光强度为55.2；每个脂质体上接入170个生物素化标记的Anti-humanCD28antibody 组，PE荧光强度为62.4；每个脂质体上接入227个生物素化标记的Anti-human CD28antibody 组，PE荧光强度为111。
实施例5
包载肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白及Anti-humanCD28antibody的纳米制剂的制备及表征、包载神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中 的抗原决定簇与MHC I的融合蛋白及Anti-human CD28antibody的纳米制剂的制备及表 征
(一)HLA A*0201肿瘤特异性CD8+T cells的诱导分离
具体步骤如下：
1.选择HLA A*0201阳性肝癌患者及脑胶质瘤患者，其中肝癌患者血液AFP高表达，脑胶质瘤患者血液EGFRvIII高表达。用肝素钠抗凝管分别抽取外周静脉血各10ml。
2.将采集旳新鲜血液(含抗凝剂)以无菌PBS缓冲液(pH 7.2)或0.9％浓度NaCl溶液1:1混 合稀释，降低红细胞的凝聚，提高淋巴细胞收获量。
3.将15～20ml人外周血淋巴细胞分离液转移至50ml无菌离心管底部，用无菌移液管吸 取20～30ml稀释后的血液样品，沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液表面，注意切勿破坏液 层分界面。
4.500g，25℃，以水平转子，最低加减速度离心30min。
5.离心后将离心管小心取出。此时离心管由上至下分四层:第一层为血浆层，呈淡黄色； 第二层为较薄的环状致密淋巴细胞层(亦含有单核粒细胞)，呈乳白色；第三层为分离液层， 呈透明状；第四层为红细胞层，呈暗红色。
6.用移液管先吸去第一层血浆，随后沿液面将淋巴细胞层缓慢吸出，移至另一无菌离心 管中。为充分获得淋巴细胞，可适当多吸取一些淋巴细胞层上下的血浆或分离液。
7.将吸出的淋巴细胞悬液以PBS缓冲液1:1稀释后，1500rpm，25℃离心10min，重复两次，弃去上清，待用Biolegend公司MojosortTM CD8+T cells负分选试剂盒分离PBMCs中的CD8+T cells。
8.用已预冷的MojoSortTMBuffer重悬细胞，细胞计数。
9.细胞计数后以MojoSortTMBuffer稀释至密度为1*107cells/ml以上，待分离。
10.按照10ul/1*107cells加入适量试剂盒中Biotin-Antibody Cocktail，混合后置于冰上孵 育15min。
11.取出试剂盒中Streptavidin Nanobeads置于涡旋仪上，以最大涡旋速度，涡旋五次，待 用。
12.按照10ul/1*107cells加入适量Streptavidin Nanobeads，加入3～4mlMojoSortTMBuffer 混合均匀后，置于分离磁极中5min。
13.小心弃去上清，加入3～4ml MojoSortTMBuffer后，重复步骤(11)。
14.弃去上清后，加入适量RPMI 1640完全培养基重悬，细胞计数。
15.细胞计数后以完全培养基稀释至2.5*106cells/ml。
16.在37℃、5％CO2条件下，以每孔1ml细胞悬液培养至24孔板中。
17.培养一天后(24h)，每孔细胞悬液加入人工抗原递呈纳米制剂刺激特异性T细胞增 殖，并加入0.5μg/ml外源凝集素(PHA)作为对照组。
18.培养期间，视细胞状态及培养液挥发状况适当半量换液，补充培养基。培养至第2～4 天收获细胞，进行细胞试验。
(二)包载肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白及 Anti-human CD28antibody的纳米制剂的制备
根据实施例4的试验结果，选定在每个脂质体上接入227个Anti-humanCD28antibody 的基础上，按照每个脂质体上的接入的AFP-β2m-MHC-1-Biotin与Anti-human CD28 antibody的个数比例分别为1:4、1:2、3:4、1:1，继续分别接入AFP-β2m-MHC-1-Biotin，制 备获得包载肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白及Anti-human CD28antibody的纳米制剂。
(三)包载神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中的抗原决定簇与MHC I的融合蛋白及Anti-human CD28antibody的纳米制剂的制备
根据实施例4的试验结果，选定在每个脂质体上接入227个Anti-humanCD28antibody 的基础上，按照每个脂质体上的接入的EGFRvIII-β2m-MHC-1-Biotin与Anti-human CD28 antibody的个数比例分别为1:4、1:2、3:4、1:1，继续分别接入AFP-β2m-MHC-1-Biotin，制 备获得包载肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白及Anti-human CD28antibody的纳米制剂。
(四)ELISA法检测免疫相关细胞因子(IFN-γ)表达量
具体步骤如下：
1.抗原包被：将Capture Antibody以1:1000的比例用50mM碳酸盐缓冲液进行稀释， 每孔加入100μl，置于湿盒中，4℃孵育过夜。
2.第二天弃去孔内液体，于餐巾纸上拍干，用PBST洗板3次，每孔至少300μl，1min一次，拍干待用。
3.每孔加入200μl封闭液，37℃，置于湿盒内1h。
4.重复步骤(2)。
5.每孔加入用封闭液浓度梯度稀释的HLA A*0201CD8+T细胞培养基上清液100μl，37℃，置于湿盒内2h。
6.重复步骤(4)。
7.每孔加入用封闭液稀释的Detection Antibody 100μl，37℃，置于湿盒内2h。
8.重复步骤(6)。
9.每孔加入以1:1000的比例用封闭液稀释HRP Streptavidin，每孔100μl，37℃，置于 湿盒内1h。
10.重复步骤(8)。
11.每孔加入TMB显色剂100μl，注意避光，显色15min后每孔加入100μl 2M H2SO4终止显色。
12.去除个孔起泡，用酶标仪在450/630nm波长下检测OD值，检测体积200μl，振荡10s再检测。
根据图8结果可知，所制备人工抗原递呈纳米制剂AFP-MHC&CD28长循环脂质体(亦即包载肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白及Anti-humanCD28antibody的纳米制剂)相比于单个激活因子及阳性对照组可有效激活患者CD8+Tcells，达到抗原递呈作用。具体地，本实验以用Elisa法检测到的IFN-γ作为衡量T细胞是否被激活的指标(纵坐标)，因为激活T淋巴细胞需要T细胞表面受体信号(MHC I类分 子)及共刺激信号(CD28)，因此设置阴性对照组别AFP-MHC-Liposome(每个脂质体上 接入227个AFP-β2m-MHC-1-Biotin)以及CD28-Liposome(每个脂质体上接入227个 Anti-humanCD28antibody)，并以植物凝集素(phytohaemagglutinin,PHA)作为阳性对照， 可以作为刺激淋巴细胞增殖试剂，并以未加任何试剂(仅PBS)组别作为阴性对照组设计 实验(亦及Medium组)。由此可见，Medium组，用Elisa法检测到的IFN-γ为78pg/ml。 PHA组用Elisa法检测到的IFN-γ为1686pg/ml。AFP-MHC-Liposome组，用Elisa法检测 到的IFN-γ为540pg/ml。CD28-Liposome组，用Elisa法检测到的IFN-γ为235pg/ml。NMHC： NCD28组＝1：4组(每个脂质体上的接入的AFP-β2m-MHC-1-Biotin与个Anti-human CD28 antibody的个数比例为1：4，每个脂质体上接入227个Anti-human CD28antibody)用Elisa 法检测到的IFN-γ为584pg/ml。NMHC：NCD28＝1：2组(每个脂质体上的接入的 AFP-β2m-MHC-1-Biotin与个Anti-human CD28antibody的个数比例为1：2，每个脂质体上 接入227个Anti-humanCD28antibody)用Elisa法检测到的IFN-γ为1189pg/ml。NMHC： NCD28＝3：4组(每个脂质体上的接入的AFP-β2m-MHC-1-Biotin与个Anti-human CD28 antibody的个数比例为3：4，每个脂质体上接入227个Anti-human CD28antibody)用Elisa 法检测到的IFN-γ为1331pg/ml。NMHC：NCD28＝1：1组(每个脂质体上的接入的 AFP-β2m-MHC-1-Biotin与个Anti-humanCD28antibody的个数比例为1：1，每个脂质体上 接入227个Anti-human CD28antibody)，用Elisa法检测到的IFN-γ为2115pg/ml。
根据图8结果可知，所制备人工抗原递呈纳米制剂及EGFRvIII-MHC&CD28长循环脂质体(亦即包载神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中的抗原决定簇与MHC I的融合 蛋白及Anti-human CD28antibody的纳米制剂)相比于单个激活因子及阳性对照组可有效激活患者CD8+T cells，达到抗原递呈作用。具体地，本实验以用Elisa法检测到的IFN-γ作为衡量T细胞是否被激活的指标(纵坐标)，因为激活T淋巴细胞需要T细胞表面受体信号(MHC-I类分子)及共刺激信号(CD28)，因此设置阴性对照组别EGFRvIII-MHC-Liposome (每个脂质体上接入227个EGFRvIII-β2m-MHC-1-Biotin)，以及CD28-Liposome(每个脂 质体上接入227个Anti-human CD28antibody)，并以植物凝集素(phytohaemagglutinin,PHA) 作为阳性对照，可以作为刺激淋巴细胞增殖试剂，并以未加任何试剂(仅PBS)组别作为 阴性对照组设计实验(亦即Medium组)。由此可见，Medium组，用Elisa法检测到的IFN-γ 为78pg/ml。PHA组用Elisa法检测到的IFN-γ为1686pg/ml。EGFRvIII-MHC-Liposome， 用Elisa法检测到的IFN-γ为365pg/ml。CD28-Liposome组，用Elisa法检测到的IFN-γ为235pg/ml。NMHC：NCD28＝1:4组(每个脂质体上的接入的EGFRvIII-β2m-MHC-1-Biotin与 个Anti-human CD28antibody的个数比例为1:4，每个脂质体上接入227个Anti-human CD28antibody)，用Elisa法检测到的IFN-γ为280pg/ml。NMHC：NCD28＝1:2组(每个脂质体上 的接入的EGFRvIII-β2m-MHC-1-Biotin与个Anti-human CD28antibody的个数比例为1:2， 每个脂质体上接入227个Anti-human CD28antibody)，用Elisa法检测到的IFN-γ为618pg/ ml。NMHC：NCD28＝3:4组(每个脂质体上的接入的EGFRvIII-β2m-MHC-1-Biotin与个 Anti-humanCD28antibody的个数比例为3:4，每个脂质体上接入227个Anti-human CD28 antibody)，用Elisa法检测到的IFN-γ为1604pg/ml。NMHC：NCD28＝1:1组(每个脂质体上 的接入的EGFRvIII-β2m-MHC-1-Biotin与个Anti-human CD28antibody的个数比例为1:1， 每个脂质体上接入227个Anti-human CD28antibody)，用Elisa法检测到的IFN-γ为2325pg/ ml。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当 指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干 改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不 脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修 饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实 施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种人工抗原递呈纳米制剂及其用于体内外扩增特异性T细胞的应用
<130> 181268
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttatgaata agtttattta tgagatt 27
<210> 2
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attcagcgta ccccgaagat ccaggtttac agtcgtcacc cggccgagaa cggtaaaagc 60
aacttcctga actgctatgt tagcggcttt catccgagcg acatcgaagt ggatctgctg 120
aaaaacggcg agcgcattga aaaggtggaa cacagcgacc tgagcttcag caaagactgg 180
agcttctacc tgctgtacta caccgagttc accccgacag agaaagacga atatgcctgc 240
cgcgttaacc acgtgaccct gagccagccg aagatcgtga aatgggatcg cgacatg 297
<210> 3
<211> 852
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcagccaca gcatgcgcta cttctttacc agcgtgagcc gtcctggtcg tggtgaaccg 60
cgctttattg cagtgggcta cgtggacgat acccaattcg tgcgctttga tagcgatgca 120
gccagccagc gtatggaacc tcgcgccccg tggatcgaac aggaaggtcc ggaatattgg 180
gatggcgaaa cccgcaaggt gaaagcccat agccagacac atcgcgttga tctgggcacc 240
ctgcgcggct actataacca gagcgaagcc ggcagtcaca ccgttcagcg catgtacggt 300
tgcgatgttg gtagcgattg gcgctttctg cgtggttacc atcagtatgc ctacgacggc 360
aaggattaca tcgccctgaa agaggatctg cgtagctgga cagccgcaga tatggcagca 420
cagaccacaa agcataaatg ggaggccgca catgtggccg aacaactgcg cgcctatctg 480
gagggcacct gtgttgagtg gctgcgtcgt tacctggaaa atggcaaaga gaccctgcaa 540
cgcaccgatg cccctaaaac ccacatgacc catcacgcag ttagcgatca tgaagccacc 600
ctgcgttgtt gggcactgag cttctatccg gccgaaatta cactgacatg gcaacgtgat 660
ggcgaagatc agacccagga taccgagctg gtggagaccc gccctgcagg tgatggcacc 720
tttcagaaat gggcagcagt tgttgtgccg agtggtcaag aacagcgcta cacctgtcac 780
gttcagcatg aaggcctgcc gaaaccgctg acactgcgct gggagccgag tagccagccg 840
acaattccga tt 852
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
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<400> 4
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<400> 8
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agtggtggtg gcggtagcat tcagcgtacc ccgaagatcc aggtttacag tcgtcacccg 120
gccgagaacg gtaaaagcaa cttcctgaac tgctatgtta gcggctttca tccgagcgac 180
atcgaagtgg atctgctgaa aaacggcgag cgcattgaaa aggtggaaca cagcgacctg 240
agcttcagca aagactggag cttctacctg ctgtactaca ccgagttcac cccgacagag 300
aaagacgaat atgcctgccg cgttaaccac gtgaccctga gccagccgaa gatcgtgaaa 360
tgggatcgcg acatgggcgg tggcggtagt ggtggtggcg gtagtggcgg tggtggtagt 420
ggcggtggtg gtagcggcag ccacagcatg cgctacttct ttaccagcgt gagccgtcct 480
ggtcgtggtg aaccgcgctt tattgcagtg ggctacgtgg acgataccca attcgtgcgc 540
tttgatagcg atgcagccag ccagcgtatg gaacctcgcg ccccgtggat cgaacaggaa 600
ggtccggaat attgggatgg cgaaacccgc aaggtgaaag cccatagcca gacacatcgc 660
gttgatctgg gcaccctgcg cggctactat aaccagagcg aagccggcag tcacaccgtt 720
cagcgcatgt acggttgcga tgttggtagc gattggcgct ttctgcgtgg ttaccatcag 780
tatgcctacg acggcaagga ttacatcgcc ctgaaagagg atctgcgtag ctggacagcc 840
gcagatatgg cagcacagac cacaaagcat aaatgggagg ccgcacatgt ggccgaacaa 900
ctgcgcgcct atctggaggg cacctgtgtt gagtggctgc gtcgttacct ggaaaatggc 960
aaagagaccc tgcaacgcac cgatgcccct aaaacccaca tgacccatca cgcagttagc 1020
gatcatgaag ccaccctgcg ttgttgggca ctgagcttct atccggccga aattacactg 1080
acatggcaac gtgatggcga agatcagacc caggataccg agctggtgga gacccgccct 1140
gcaggtgatg gcacctttca gaaatgggca gcagttgttg tgccgagtgg tcaagaacag 1200
cgctacacct gtcacgttca gcatgaaggc ctgccgaaac cgctgacact gcgctgggag 1260
ccgagtagcc agccgacaat tccgattggc agcggtggtc tgaacgacat tttcgaagca 1320
cagaaaattg aatggcatga gtgaggatcc 1350
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctggaggaga aaaagggcaa ttatgtg 27
<210> 10
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
attcagcgta ccccgaagat ccaggtttac agtcgtcacc cggccgagaa cggtaaaagc 60
aacttcctga actgctatgt tagcggcttt catccgagcg acatcgaagt ggatctgctg 120
aaaaacggcg agcgcattga aaaggtggaa cacagcgacc tgagcttcag caaagactgg 180
agcttctacc tgctgtacta caccgagttc accccgacag agaaagacga atatgcctgc 240
cgcgttaacc acgtgaccct gagccagccg aagatcgtga aatgggatcg cgacatg 297
<210> 11
<211> 852
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggcagccaca gcatgcgcta cttctttacc agcgtgagcc gtcctggtcg tggtgaaccg 60
cgctttattg cagtgggcta cgtggacgat acccaattcg tgcgctttga tagcgatgca 120
gccagccagc gtatggaacc tcgcgccccg tggatcgaac aggaaggtcc ggaatattgg 180
gatggcgaaa cccgcaaggt gaaagcccat agccagacac atcgcgttga tctgggcacc 240
ctgcgcggct actataacca gagcgaagcc ggcagtcaca ccgttcagcg catgtacggt 300
tgcgatgttg gtagcgattg gcgctttctg cgtggttacc atcagtatgc ctacgacggc 360
aaggattaca tcgccctgaa agaggatctg cgtagctgga cagccgcaga tatggcagca 420
cagaccacaa agcataaatg ggaggccgca catgtggccg aacaactgcg cgcctatctg 480
gagggcacct gtgttgagtg gctgcgtcgt tacctggaaa atggcaaaga gaccctgcaa 540
cgcaccgatg cccctaaaac ccacatgacc catcacgcag ttagcgatca tgaagccacc 600
ctgcgttgtt gggcactgag cttctatccg gccgaaatta cactgacatg gcaacgtgat 660
ggcgaagatc agacccagga taccgagctg gtggagaccc gccctgcagg tgatggcacc 720
tttcagaaat gggcagcagt tgttgtgccg agtggtcaag aacagcgcta cacctgtcac 780
gttcagcatg aaggcctgcc gaaaccgctg acactgcgct gggagccgag tagccagccg 840
acaattccga tt 852
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtctgaacg acattttcga agcacagaaa attgaatggc atgag 45
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggcggtggtg gtagtggcgg tggtggtagt ggtggtggcg gtagc 45
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggcggtggcg gtagtggtgg tggcggtagt ggcggtggtg gtagtggcgg tggtggtagc 60
<210> 15
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggcagcggt 9
<210> 16
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
catatgctgg aggagaaaaa gggcaattat gtgggcggtg gtggtagtgg cggtggtggt 60
agtggtggtg gcggtagcat tcagcgtacc ccgaagatcc aggtttacag tcgtcacccg 120
gccgagaacg gtaaaagcaa cttcctgaac tgctatgtta gcggctttca tccgagcgac 180
atcgaagtgg atctgctgaa aaacggcgag cgcattgaaa aggtggaaca cagcgacctg 240
agcttcagca aagactggag cttctacctg ctgtactaca ccgagttcac cccgacagag 300
aaagacgaat atgcctgccg cgttaaccac gtgaccctga gccagccgaa gatcgtgaaa 360
tgggatcgcg acatgggcgg tggcggtagt ggtggtggcg gtagtggcgg tggtggtagt 420
ggcggtggtg gtagcggcag ccacagcatg cgctacttct ttaccagcgt gagccgtcct 480
ggtcgtggtg aaccgcgctt tattgcagtg ggctacgtgg acgataccca attcgtgcgc 540
tttgatagcg atgcagccag ccagcgtatg gaacctcgcg ccccgtggat cgaacaggaa 600
ggtccggaat attgggatgg cgaaacccgc aaggtgaaag cccatagcca gacacatcgc 660
gttgatctgg gcaccctgcg cggctactat aaccagagcg aagccggcag tcacaccgtt 720
cagcgcatgt acggttgcga tgttggtagc gattggcgct ttctgcgtgg ttaccatcag 780
tatgcctacg acggcaagga ttacatcgcc ctgaaagagg atctgcgtag ctggacagcc 840
gcagatatgg cagcacagac cacaaagcat aaatgggagg ccgcacatgt ggccgaacaa 900
ctgcgcgcct atctggaggg cacctgtgtt gagtggctgc gtcgttacct ggaaaatggc 960
aaagagaccc tgcaacgcac cgatgcccct aaaacccaca tgacccatca cgcagttagc 1020
gatcatgaag ccaccctgcg ttgttgggca ctgagcttct atccggccga aattacactg 1080
acatggcaac gtgatggcga agatcagacc caggataccg agctggtgga gacccgccct 1140
gcaggtgatg gcacctttca gaaatgggca gcagttgttg tgccgagtgg tcaagaacag 1200
cgctacacct gtcacgttca gcatgaaggc ctgccgaaac cgctgacact gcgctgggag 1260
ccgagtagcc agccgacaat tccgattggc agcggtggtc tgaacgacat tttcgaagca 1320
cagaaaattg aatggcatga gtgaggatcc 1350
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Phe Met Asn Lys Phe Ile Tyr Glu Ile
1 5
<210> 18
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu
1 5 10 15
Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro
20 25 30
Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys
35 40 45
Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu
50 55 60
Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys
65 70 75 80
Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp
85 90 95
Arg Asp Met
<210> 19
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
50 55 60
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu
115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
130 135 140
His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His
180 185 190
Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile
275 280
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 23
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gly Ser Gly
1
<210> 24
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Phe Met Asn Lys Phe Ile Tyr Glu Ile Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg
145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190
Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg
195 200 205
Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu
210 215 220
Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg
225 230 235 240
Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr
245 250 255
His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp
260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His
275 280 285
Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala
325 330 335
Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr
340 345 350
Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr
355 360 365
Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr
385 390 395 400
Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg
405 410 415
Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Gly Ser Gly Gly Leu
420 425 430
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
435 440 445
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val
1 5
<210> 26
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu
1 5 10 15
Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro
20 25 30
Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys
35 40 45
Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu
50 55 60
Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys
65 70 75 80
Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp
85 90 95
Arg Asp Met
<210> 27
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
50 55 60
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu
115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
130 135 140
His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His
180 185 190
Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile
275 280
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 31
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Gly Ser Gly
1
<210> 32
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg
145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190
Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg
195 200 205
Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu
210 215 220
Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg
225 230 235 240
Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr
245 250 255
His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp
260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His
275 280 285
Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala
325 330 335
Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr
340 345 350
Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr
355 360 365
Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr
385 390 395 400
Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg
405 410 415
Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Gly Ser Gly Gly Leu
420 425 430
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
435 440 445

Claims (21)

1.一种人工抗原递呈纳米制剂，包括纳米粒、连接在所述纳米粒上的至少一种T细胞表面受体识别因子以及连接在所述纳米粒上的至少一种T细胞共刺激因子。
2.根据权利要求1所述的人工抗原递呈纳米制剂，其特征在于，所述T细胞共刺激因子选自CD28抗体、PD-1抗体或CTLA4抗体。
3.根据权利要求1所述的人工抗原递呈纳米制剂，其特征在于，所述T细胞表面受体识别因子为肿瘤相关抗原多肽与MHC I的融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的人工抗原递呈纳米制剂，其特征在于，所述肿瘤相关抗原多肽与MHC I的融合蛋白选自肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白或神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中的抗原决定簇与MHC I的融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的人工抗原递呈纳米制剂，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白的结构中包括N端到C端依次排列的肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段、β2m轻链、MHC-1重链、亲和素标签；(2)所述肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段与所述β2m轻链之间通过第一连接肽连接；(3)所述β2m轻链与所述MHC-1重链之间通过第二连接肽连接；(4)所述重链MHC-1与所述亲和素标签之间通过第三连接肽连接。
6.根据权利要求5所述的人工抗原递呈纳米制剂，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述肝癌表面抗原AFP的抗原多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；(2)所述β2m轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；(3)所述MHC-1重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；(4)所述亲和素标签氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；(5)所述第一连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.21；(6)所述第二连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；(7)所述第三连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
7.根据权利要求4所述的人工抗原递呈纳米制剂，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中的抗原决定簇与MHC I的融合蛋白的结构中包括N端到C端依次排列的神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段、β2m轻链、MHC-1重链、亲和素标签；(2)所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段与所述β2m轻链之间通过第四连接肽连接；(3)所述β2m轻链与所述MHC-1重链之间通过第五连接肽连接；(4)所述MHC-1重链与所述亲和素标签之间通过第六连接肽连接。
8.根据权利要求7所述的人工抗原递呈纳米制剂，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII的抗原多肽片段的氨基酸如SEQID NO.25所示；(2)所述β2m轻链的的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；(3)所述MHC-1重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；(4)所述亲和素标签氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示；(5)所述第四连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示；(6)所述第五连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示；(7)所述第六连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示。
9.根据权利要求4所述的人工抗原递呈纳米制剂，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；(2)所述神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中的抗原决定簇与MHC I的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示。
10.根据权利要求1所述的人工抗原递呈纳米制剂，其特征在于，所述纳米制剂为生物素化的纳米制剂，所述纳米制剂中的纳米粒上通过生物素连接了亲和素，所述T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子进行了生物素修饰，所述T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子上所修饰的生物素与纳米粒上连接的亲和素结合，从而连接在所述纳米粒上。
11.根据权利要求1所述的人工抗原递呈纳米制剂，其特征在于，每个纳米粒上连接的T细胞表面受体识别因子及T细胞共刺激因子之间的个数比例范围是(1～4)：4。
12.根据权利要求1所述的人工抗原递呈纳米制剂，其特征在于，每个纳米粒上连接的T细胞共刺激因子的个数为57～227。
13.如权利要求1～12之任一项人工抗原递呈纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：(1)在生物素化的纳米制剂上连接链霉亲和素，获得连接有链霉亲和素的纳米制剂；(2)将生物素化标记的T细胞共刺激因子及生物素化标记的T细胞表面受体识别因子分别与步骤(1)获得的连接有链霉亲和素的纳米制剂连接，获得连接有T细胞共刺激因子及T细胞表面受体识别因子的纳米制剂，即为人工抗原递呈纳米制剂。
14.如权利要求1～12之任一项所述人工抗原递呈纳米制剂用于制备T细胞激活剂的用途。
15.一种体内外激活多克隆T细胞群中抗原特异性T细胞的方法，所述方法包括步骤：使用如权利要求1～12之任一项所述人工抗原递呈纳米制剂孵育多克隆T细胞群。
16.一种融合蛋白，所述融合蛋白为权利要求4-9中的肝癌表面抗原AFP中的抗原决定簇多肽与MHC I的融合蛋白或神经胶质母细胞瘤表面抗原EGFRvIII中的抗原决定簇与MHCI的融合蛋白。
17.一种多核苷酸，其编码如权利要求16所述融合蛋白。
18.一种表达载体，其含有如权利要求17所述多核苷酸。
19.一种宿主细胞，其被如权利要求18所述表达载体所转化。
20.如权利要求16所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建含有融合蛋白基因序列的表达载体，然后将含融合蛋白基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的融合蛋白。
21.如权利要求16所述融合蛋白用于制备人工抗原递呈纳米制剂的用途。
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