KR102579648B1 - 신규한 페닐 유도체 - Google Patents

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KR102579648B1
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리부스 파마슈티칼스, 인크.
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Abstract

본원은 미토콘드리아 활성을 조절하고, 지방과다를 감소시키고, 당뇨병 및 당뇨병 관련 합병증을 포함하는 질환을 치료하는 데 유용한 신규한 페닐 유도체인 5-[(2,4-디니트로페녹시)메틸]-1-메틸-2-니트로-1H-이미다졸 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.

Description

신규한 페닐 유도체
본원은 신규한 페닐 유도체를 제공한다. 신규한 화합물은 미토콘드리아 활성을 조절하고, 지방과다를 감소시키고, 당뇨병 및 당뇨병 관련 합병증을 포함하는 질환을 치료하는 데 유용하다.
비만은 2형 당뇨병 (T2D) 및 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD)과 같은 많은 일반적인 질환의 발병에 대한 익히 공지된 위험 인자이다. 비만은 건강에 위험을 주는 어느 정도의 과도한 지방과다로 간주된다. 에너지 섭취가 소비를 초과하면, 과잉 칼로리는 주로 지방 조직에 저장되고, 이 이러한 순 양성 밸런스가 길어지면 비만이 발생한다. 즉, 체중 균형에 2개의 성분이 존재하고, 양측(섭취 또는 소비)의 이상이 비만으로 이어질 수 있다. 이 과정은 에너지 소비를 증가시키거나 에너지 섭취를 감소시킴으로써 대응할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 에너지 소비를 증가시키거나 에너지 섭취를 감소시킴으로써 과량의 지방 조직을 조절할 수 있는 약제학적 제제가 필요하다.
신체는 글루코스 및 지방산과 같은 음식의 산화를 통해 에너지를 얻는다. 미토콘드리아가 당 및 지방을 태워 개별 세포의 대사를 조절한다는 것이 공지되어 있다. 이의 주요 기능 중 하나는 글루코스 또는 지방산과 같은 연료의 대사로부터 유래된 에너지가 ATP로 전환되는 과정인 산화적 인산화이다. 미토콘드리아에서 ATP의 생성은 NADH의 산화에 커플링되어 전자 전달 연쇄계에서 양성자를 전달하게 된다. 화학적 짝풀림제는 미토콘드리아를 갖는 세포에서 효율적인 에너지 (ATP) 생산을 억제할 수 있다. 그들은 미토콘드리아 막을 교차하여 양성자를 운반함으로써 산화적 인산화를 서로 분리시켜 ATP의 생성 없이 에너지의 빠른 소비(에너지 소비)를 유도한다. 환언하면, 짝풀림제는 미토콘드리아 매트릭스를 양성자로 침수시키고, NADH의 산화는 계속되지만, ATP 형태로 에너지를 생성하는 대신, 양성자 구배 에너지는 열로서 손실된다.
지방 축적을 감소시키기 위해 미토콘드리아의 화학적 짝풀림제의 조작은 80년 이상 동안 과학적 목표였다. 다음을 참조한다: Simkins S "Dinitrophenol and desiccated thyroid in the treatment of obesity: a comprehensive clinical and laboratory study". J Am Med Assoc 108:2110-2117 (1937) and Fleury C et al, Nature Genetics 15, 269 - 272 (1997), Uncoupling Protein- 2:A Novel Gene Linked to Obesity and Hyperinsulinemia. 가장 잘 공지된 화학적 짝풀림제는 인간뿐만 아니라 동물에서 에너지 소비를 증가시키는 것으로 나타난 2,4-디니트로페놀(DNP)이다. 그러나, 화학적 짝풀림제는 종종 독성이다. 위험한 부작용에 대한 우려로 인해 시장에서 DNP가 제거되었다.
개체에 해를 끼치지 않고 목적하는 의료 효과를 안전하게 생성할 수 있는 안전한 미토콘드리아 짝풀림제가 필요하다. 본원에 개시된 신규한 페닐 유도체가 이러한 요구를 만족시킨다.
신규한 화합물인 5-[(2,4-디니트로페녹시)메틸]-1-메틸-2-니트로-1H-이미다졸 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(화합물 A)이 본원에 개시된다.
다음 화학식 I의 신규 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 또한 본원에 개시된다:
화학식 I,
여기서
환 A는 -NO2 및 메틸로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환된 이미다졸이고;
각각의 R1은 독립적으로 할로, 시아노, NO2, -C(O)H, -COOH, -C(O)O(C1-4 알킬), -C(O)(C1-4 알킬), C1-4 알킬, C1-4 알케닐 또는 C1-4 알키닐이고, 여기서 상기 C1-4 알킬, C1-4 알케닐 및 C1-4 알키닐은 각각 독립적으로 및 선택적으로 할로, NO2 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환되고;
y는 1, 2 또는 3이고;
x는 1 내지 6의 정수이다.
일부 구현예에서, 환 A는 -NO2 및 메틸로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이고;
각각의 R1은 독립적으로 할로, NO2, C1-4 알킬, C1-4 알케닐 및 C1-4 알키닐이고, 여기서 상기 C1-4 알킬 및 C1-4 알케닐은 각각 독립적으로 및 선택적으로 할로, NO2 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환되고;
y는 1, 2 또는 3이고;
x는 1 내지 3의 정수이다.
일부 구현예에서, 환 A는 -NO2 및 메틸로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이고;
각각의 R1은 독립적으로 할로 또는 NO2이고;
y는 1, 2 또는 3이고;
x는 1 내지 2의 정수이다.
일부 구현예에서, 환 A는 -NO2 및 메틸로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이고;
각각의 R1은 독립적으로 할로 또는 NO2이고;
y는 1, 2 또는 3이고;
x는 1 내지 2의 정수이다.
일부 구현예에서, 환 A는 -NO2 및 메틸로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이고;
각각의 R1은 NO2이고;
y는 1 또는 2이고;
x는 1 내지 2의 정수이다.
일부 구현예에서, 환 A는 -NO2 및 메틸로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이고;
각각의 R1은 NO2이고;
y는 2이고;
x는 1이다.
본 발명의 신규 화합물은 미토콘드리아 활성을 조절하고, 지방과다를 감소시키고, 대사 장애, 당뇨병 또는 당뇨병 관련 합병증, 예를 들어, 심장 질환 및 신부전을 포함하는 질환을 치료하고, 포유동물에서 체중 증가를 완화시키거나 조절하는 데 유용하다.
도 1은 화합물의 경구 투여 후 처음 24시간 동안 곡선하 면적 (AUC) 및 x-축에 표시된 각각의 농도에 의해 계산된 DNP (회색) 및 화합물 A (흑색)의 총 노출을 도시한다. DNP를 투여한 동물의 절반이 연구에서 살아남지 못하여 DNP에 대한 LD50을 100mpk로 확립하였다.
도 2는 화합물 A를 마우스에 투여함을 도시한다. DNP 잔기의 최대 혈장 농도 (Cmax)는 DNP를 직접 투여하는 것과 비교하여 급격히 감소되고, 독성이 급격히 감소된다.
도 3은 DNP 총 노출이 적어도 1500mpk 화합물 A까지 선형 방식으로 증가함을 도시한다. 100mpk DNP의 투여 후 DNP의 총 노출은 이 그래프에서 100%로 설정되었다. 각각의 데이터 포인트는 흑색 점으로 표시된다. 직선 선형성 (Y=0.1932*x+13.94)은 흑색 실선으로 그래프화되고, 95% 신뢰 구간은 점선으로 그래프화된다. R2 = 0.9770. 그래프에서 노출은 총 DNP 노출 백분율로서 표현되고, 여기서 100mpk DNP 투여 후 노출은 100%로 설정되었다.
도 4는 화합물 A를 투여한 마우스에서 DNP의 최대 혈장 농도가 투여량에 의해 선형으로 증가되지만, DNP의 LD50 투여량의 투여시 관찰되는 것과 동일한 수준에 도달하지 않는다는 것을 도시한다. 100mpk DNP 투여 후 DNP의 최대 농도는 이 그래프에서 100%로 설정되었다. 각각의 데이터 포인트는 흑색 점으로 표시된다. 직선 선형성 (Y=0/04178*x+11.34)은 흑색 실선으로 그래프화되고, 95% 신뢰 구간은 점선으로 그래프화된다. R2 = 0.9770.
도 5는 화합물 A 투여 4주 후에 유도된 지방 간 질환을 갖는 마우스에서 ALT, AST 및 ALP 간 효소의 혈장 농도를 도시한다.
도 6은 모두 3개의 치료 그룹(25mg/kg 및 100mg/kg 치료의 경우 p<0.05, 5mg/kg 치료의 경우 p<0.01)에서 글루코스 도전 120분 후에 처리되지 않은 대응물과 비교하여 화합물 A 처리된 동물의 혈당을 도시한다. 비히클과 처리군 사이의 차이는 모두 통계적으로 유의하다(p<0.05). 이러한 경구 글루코스 내성 시험은 화합물 A 치료 5주 후에 수행되었다. 　
도 7은 MCD 식이-유도된 NASH 공급 마우스 중 대조군 마우스 간에서의 지질 액적을 도시한다.
도 8은 5 mpk 화합물 A로 처리된 MCD 식이-유도된 NASH 공급 마우스 중 마우스 간에서의 마우스 지질 액적을 도시한다.
도 9는 5 mpk 화합물 A로 처리된 MCD 식이-유도된 NASH 사료가 공급된 마우스에서 감소된 간 TNFα 및 IL-1β를 도시한다.
도 10은 실시예 5의 연구 그룹의 혈청 TG 수준을 도시한다.
도 11은 실시예 5의 연구 그룹의 혈청 FFA 수준을 도시한다.
도 12는 실시예 5의 연구 그룹의 간 TG 수준을 도시한다.
도 13은 실시예 5의 연구 그룹의 간 세라미드 수준을 도시한다.
도 14는 실시예 6의 연구 그룹의 음식 소비 곡선을 도시한다.
도 15는 실시예 6의 제3 그룹에서 유리 지방산(FFA) 수준을 도시한다. 비히클 그룹 (평균±표준오차)과 비교될 때 p<0.01과 비교하여 p<0.05임을 주의한다.
도 16은 처리된 그룹에서의 결과를 나타내는 실시예 6의 혈액 TG (트리글리세라이드) 수준이 모든 연구 그룹에서 비히클 대조군보다 낮았다는 것을 도시한다.
도 17은 간 TG가 실시예 6의 모든 연구 그룹에서 또한 더 낮았고, 감소가 비히클 그룹 (평균±표준오차)과 비교하여 p<0.05로 화합물 A의 최고 수준(5.0 mg/kg)으로 처리된 그룹에서 통계적 유의성을 가졌다는 것을 도시한다.
도 18은 혈중 인슐린 수준이 실시예 6의 모든 치료 그룹에서 더 낮아지는 것으로 관찰되었음을 도시한다.
도 19는 실시예 7에 기재된 바와 같은 인간 Hep3B-luc 간 암의 동소이식 모델의 치료에서 소라페닙 단독 및 화합물 A와의 조합의 효과를 도시하다.
도 20은 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 실험 설계 및 질환 진행을 도시한다. 실시예 8을 참조한다.
도 21은 웨스턴 식이를 도입한 후(0주) 및 치료 동안(12 내지 20주) 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 체중 증가를 도시한다. 데이터는 고용량 화합물 A에서 유의한 전반적인 체중 감소를 보여준다. 실시예 8을 참조한다.
도 22는 8주의 고용량 화합물 A 후, 비-알코올성 지방 간 질환의식이 유도 동물 모델에서 유의한 전반적인 체중 감소를 도시한다. 실시예 8을 참조한다.
도 23은 8주 투여 후 간 중량에 대한 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 저용량 및 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다. 실시예 8을 참조한다.
도 24는 8주 투여 후 간 중량에 대한 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 저용량 및 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다. 실시예 8을 참조한다.
도 25는 ALT (알라닌 아미노트랜스아미나제)의 혈청 수준에 대한 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 저용량 및 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다. 실시예 8을 참조한다.
도 26은 Alk Phos (알칼리성 포스파타제)의 혈청 수준에 대한 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 저용량 및 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다. 실시예 8을 참조한다.
도 27은 AST (아스파르테이트 트랜스아미나제)의 혈청 수준에 대한 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 저용량 및 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다. 실시예 8을 참조한다.
도 28은 ALB (알부민)의 혈청 수준에 대한 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 저용량 및 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다. 실시예 8을 참조한다.
도 29는 화합물 A 또는 DNP 10μM로 처리된 NCI-60 세포주의 세포 성장을 도시한다. 실시예 10을 참조한다.
도 30은 상이한 종의 간 마이크로솜에서 2μM 화합물 A로부터 DNP의 형성을 도시하고, 이 형성이 NADPH를 필요로 한다는 것을 도시한다. 실시예 11을 참조한다.
도 31은 거동 및 안전성 파라미터의 변화를 평가하기 위해 7일 반복 투여 마우스 독성 연구를 도시한다. 500mg/kg만큼 높은 수준으로 경구 투여된 화합물 A는 혈액내 크레아티닌에 의해 측정된 신장 기능 장애를 일으키지 않은 반면, 1mg/kg 또는 DNP 만큼 적은 양은 혈액 크레아티닌을 상승시켰다. 크레아티닌의 변화는 Cmax 의존적이다.
도 32는 ALT, AST 및 ALP의 혈청 수준에 대한 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다. 실시예 8을 참조한다.
도 33은 NAS 및 SAF 활성 점수에 대한 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다. 둘 다 화합물 A로 현저히 낮아졌다.
정의
본원에서 사용된 바와 같이, 본원에 사용된 모든 용어들은 약제학적 분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유효량은 치료된 환자에게 치료 효과를 부여하는 데 필요한 양으로서 정의되며, 전형적으로 환자의 연령, 표면적, 체중 및 상태에 기초하여 결정된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포유동물", "환자" 또는 "대상체"는 인간, 가축 및 반려 동물을 포함하는 임의의 동물을 지칭한다. 어구 "반려 동물" 또는 "반려 동물들"은 애완 동물로 기르는 동물을 지칭한다. 반려 동물의 예는 고양이, 개 및 말을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 상태를 "조절하는", "치료하는" 또는 "치료"란 용어는 다음을 포함한다: (1) 질환, 상태 또는 장애를 억제하고, 즉, 질환 또는 이의 임상 증상/징후의 발병을 억제하거나 감소시키는 것; 또는 (2) 질환을 완화시키는 것, 즉 질환 또는 이의 임상 증상/징후의 퇴행을 야기하는 것.
본원에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는"은 포유동물, 반려 동물 또는 가축 동물에 사용하기에 적합함을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "DNP"는 2,4-디니트로페놀 또는 이의 염, 용매화물 또는 부가물을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대사 장애"는 대사 기능의 변경 또는 방해를 특징으로 하는 상태를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "약제학적으로 허용되는 염"은 무기산, 유기산, 용매화물 또는 이의 수화물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 무독성 산인 염을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 담체, 예를 들어, 액체 또는 고체 충전제, 안정화제, 분산제, 현탁화제, 희석제, 부형제, 증점제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 다음 화학식 I의 신규 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
화학식 I,
여기서,
환 A는 -NO2 및 메틸로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환된 이미다졸이고;
각각의 R1은 독립적으로 할로, 시아노, NO2, -C(O)H, -COOH, -C(O)O(C1-4 알킬), -C(O)(C1-4 알킬), C1-4 알킬, C1-4 알케닐 또는 C1-4 알키닐이고, 여기서 상기 C1-4 알킬, C1-4 알케닐 및 C1-4 알키닐은 각각 독립적으로 및 선택적으로 할로, NO2 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환되고;
y는 1, 2 또는 3이고;
x는 1 내지 6의 정수이다.
일부 구현예에서, 환 A는 -NO2 및 메틸로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이고;
각각의 R1은 독립적으로 할로, NO2, C1-4 알킬, C1-4 알케닐 및 C1-4 알키닐이고, 여기서 상기 C1-4 알킬 및 C1-4 알케닐은 각각 독립적으로 및 선택적으로 할로, NO2 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환체로 치환되고;
y는 1, 2 또는 3이고;
x는 1 내지 3의 정수이다.
일부 구현예에서, 환 A는 -NO2 및 메틸로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이고;
각각의 R1은 독립적으로 할로 또는 NO2이고;
y는 1, 2 또는 3이고;
x는 1 내지 2의 정수이다.
일부 구현예에서, 환 A는 -NO2 및 메틸로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이고;
각각의 R1은 독립적으로 할로 또는 NO2이고;
y는 1, 2 또는 3이고;
x는 1 내지 2의 정수이다.
일부 구현예에서, 환 A는 -NO2 및 메틸로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이고;
각각의 R1은 NO2이고;
y는 1 또는 2이고;
x는 1 내지 2의 정수이다.
일부 구현예에서, 환 A는 -NO2 및 메틸로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이고;
각각의 R1은 NO2이고;
y는 2이고;
x는 1이다.
일부 구현예에서, 환 A는 1-이미다졸릴, 5-이미다졸릴 또는 2-이미다졸릴이다.
일부 구현예에서, 환 A는 1-이미다졸릴 또는 5-이미다졸릴이다.
일부 구현예에서, 환 A는 1-이미다졸릴이다.
일부 구현예에서, 환 A는 5-이미다졸릴이다.
일부 구현예에서, 환 A는 2-이미다졸릴이다.
일부 구현예에서, 환 A는 다음과 같다:
일부 구현예에서, 환 A는 다음과 같다:
일부 구현예에서, 환 A는 다음과 같다:
일부 구현예에서, 각각의 R1은 독립적으로 할로, 시아노, NO2, C1-4 알킬 또는 C1-4 알케닐이고, 여기서 상기 C1-4 알킬 및 C1-4 알케닐은 각각 독립적으로 및 선택적으로 1 내지 3개의 시아노 또는 플루오로 치환체로 치환된다.
일부 구현예에서, 할로 치환체는 Cl 및 Br로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, R1은 CH2F, CHF2 또는 CF3이다.
일부 구현예에서, 각각의 C1-4 알킬은 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸이다. 일부 추가의 구현예에서, 각각의 C1-4 알킬은 독립적으로 프로필 또는 부틸이다. 또 추가의 구현예에서, 각각의 C1-4 알킬은 독립적으로 부틸이다. 추가의 구현예에서, 각각의 C1-4 알킬은 3급-부틸이다.
일부 구현예에서, 각각의 C1-4 알케닐은 독립적으로 1 내지 3개의 시아노 치환체로 선택적으로 치환된 에테닐, 알릴, 부트-3-엔-1-일 또는 부트-2-엔-1-일이다. 일부 추가 구현예에서, 상기 C1-4 알케닐은 2개의 시아노 치환체로 치환된다. 추가 구현예에서, 상기 C1-4 알케닐은 이다.
일부 구현예에서, R1은 NO2이다.
일부 구현예에서, R1은 할로 또는 NO2이다.
일부 구현예에서, y는 2이고, 각각의 R1은 NO2 또는 할로이다.
일부 구현예에서, 잔기
는 다음으로부터 선택된다:
일부 구현예에서, 각각의 R1은 독립적으로 할로, 시아노, NO2, C1-4 알킬 또는 C1-4 알케닐이고, 여기서 상기 C1-4 알킬 및 C1-4 알케닐은 각각 독립적으로 및 선택적으로 1 내지 3개의 시아노 치환체로 치환되고, 환 A는 -NO2 또는 메틸로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이거나; 환 A는 하나의 -NO2 및 하나의 메틸로 치환된 이미다졸이거나; 환 A는 1-이미다졸릴, 5-이미다졸릴 및 2-이미다졸릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 환 A는 1-이미다졸릴 및 5-이미다졸릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 환 A는 1-이미다졸릴이거나; 환 A는 5-이미다졸릴이거나; 환 A는 2-이미다졸릴이거나; 환 A는
이거나; 환 A는 으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 각각의 R1은 독립적으로 Cl, Br, 시아노, NO2, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 에테닐, 알릴, 부트-3-엔-1-일 또는 부트-2-엔-1-일이고, 여기서 상기 에테닐, 알릴, 부트-3-엔-1-일 또는 부트-2-엔-1-일은 선택적으로 1 내지 3개의 시아노 치환체로 치환되고, 환 A는 -NO2 또는 메틸로부터 독립적으로 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이거나; 환 A는 하나의 -NO2 및 하나의 메틸로 치환된 이미다졸이거나; 환 A는 1-이미다졸릴, 5-이미다졸릴 및 2-이미다졸릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 환 A는 1-이미다졸릴 및 5-이미다졸릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 환 A는 1-이미다졸릴이거나; 환 A는 5-이미다졸릴이거나; 환 A는 2-이미다졸릴이거나; 환 A는
이거나;
환 A는 으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 각각의 R1은 독립적으로 Cl, Br, 시아노, NO2, 메틸, 3급-부틸 또는 에테닐이고, 여기서 상기 에테닐은 1 내지 3개의 시아노 치환체로 선택적으로 치환되고, 환 A는 -NO2 또는 메틸로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이거나; 환 A는 하나의 -NO2 및 하나의 메틸로 치환된 이미다졸이거나; 환 A는 1-이미다졸릴, 5-이미다졸릴 및 2-이미다졸릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 환 A는 1-이미다졸릴 및 5-이미다졸릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 환 A는 1-이미다졸릴이거나; 환 A는 5-이미다졸릴이거나; 환 A는 2-이미다졸릴이거나; 환 A는
이거나;
환 A는 으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 잔기
는 다음으로부터 선택된다:
그리고, 환 A는 -NO2 또는 메틸로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환체로 치환된 이미다졸이거나; 환 A는 하나의 -NO2 또는 하나의 메틸로 치환된 이미다졸이거나; 환 A는 1-이미다졸릴, 5-이미다졸릴 및 2-이미다졸릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 환 A는 1-이미다졸릴 및 5-이미다졸릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 환 A는 1-이미다졸릴이거나; 환 A는 5-이미다졸릴이거나; 환 A는 2-이미다졸릴이거나; 환 A는
이거나; 환 A는
으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, y는 1이다. 일부 구현예에서, y는 2이다. 일부 구현예에서, y는 3이다.
일부 구현예에서, x는 1 내지 3의 정수이다. 추가 구현예에서, x는 1이다. 또 다른 추가의 구현예에서, x는 2이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 다음 화학식 IIa로 표시될 수 있다:
또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 여기서 R1 및 y는 상기 정의된 바와 같다.
화학식 IIa의 일부 구현예에서, y는 1이고, R1은 NO2이다. 또 다른 구현예에서, y는 2이고, 각각의 R1은 독립적으로 NO2 또는 할로이다. 추가 구현예에서, y는 2이고, 각각의 R1은 독립적으로 NO2, Cl 또는 Br이다. 또 다른 구현예에서, y는 3이고, 각각의 R1은 독립적으로 NO2 또는 Cl이다. 또 다른 구현예에서, y는 3이고, 각각의 R1은 독립적으로 메틸 또는 3급-부틸이다. 또 다른 구현예에서, y는 3이고, 각각의 R1은 독립적으로 3급-부틸 또는
이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 다음 화학식 IIb 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 표시될 수 있다:
화학식 IIb
여기서 R1 및 y는 상기 정의된 바와 같다.
화학식 IIb의 일부 구현예에서, y는 1이고, 각각의 R1은 독립적으로 NO2이다. 또 다른 구현예에서, y는 2이고, 각각의 R1은 독립적으로 NO2 또는 할로이다. 추가 구현예에서, y는 2이고, 각각의 R1은 독립적으로 NO2 또는 Cl이다. 또 다른 구현예에서, y는 3이고, 각각의 R1은 독립적으로 NO2 또는 Cl이다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 이하 표 A에 열거된 화합물로부터 선택된다.
표 A
일 구현예에서, 본 개시내용은 신규한 화합물인 5-[(2,4-디니트로페녹시)메틸]-1-메틸-2-니트로-1H-이미다졸 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 이를 필요로 하는 포유동물에서 비만, 당뇨병, 인슐린 내성, 및 심장 또는 신부전을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 미토콘드리아-관련 장애를 치료하는 데 유용하다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 이를 필요로 하는 포유동물에서 미토콘드리아 기능의 결함과 관련되는 질환, 장애 및 상태를 치료하는 데 유용하다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 이를 필요로 하는 포유동물에서 산소 소비 속도(OCR)를 자극할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 이를 필요로 하는 포유동물에서 비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD), 비-알코올성 지방간염(NASH), 간 지방증 및 2형 당뇨병(T2DM)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당뇨병을 치료하는 데 유용하다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 이를 필요로 하는 포유동물에서 지방이영양증 (후천척 또는 선천적)을 치료하는 데 유용하다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 이를 필요로 하는 포유동물에서 고중성지질혈증을 치료하는 데 유용하다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 이를 필요로 하는 포유동물에서 대사 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용하다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 이를 필요로 하는 포유동물에서 비만을 치료하거나 지방과다를 감소시키는 데 유용하다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 이를 필요로 하는 포유동물에서 체중 증가를 조절하거나 예방하거나 체중을 유지하는 데 유용하다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 다음에 유용하다:
이를 필요로 하는 포유동물에서 비만 또는 과잉 체지방의 조절 또는 예방.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 다음에 유용하다:
이를 필요로 하는 포유동물에서 이상지질혈증의 치료.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 다음에 유용하다:
이를 필요로 하는 포유동물에서 심혈관 질환의 치료.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 다음에 유용하다:
이를 필요로 하는 포유동물에서 심장 질환의 치료.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 다음에 유용하다:
이를 필요로 하는 포유동물에서 심혈관 질환의 치료.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 다음에 유용하다:
이를 필요로 하는 포유동물에서 죽상경화증의 치료.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 이를 필요로 하는 포유동물에서 허혈 재관류 손상을 조절하거나 예방하는 데 유용하다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물은 NASH를 초래하는 염증 및 섬유증을 치료하는 데 유용하다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 약제학적으로 허용되는 담체 및 본 개시내용의 신규 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
투여 경로
포유동물에서 체중 증가를 조절하거나 예방하기 위한 치료 용도에서, 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약제학적 조성물은 1일 1회 경구 투여될 수 있다.
약제학적 염
화학식 I의 화합물은 이의 천연 형태 또는 염으로서 사용될 수 있다. 안정한 비독성 산 또는 염기 염을 형성하는 것이 목적시 되는 경우에, 약제학적으로 허용되는 염으로서의 화합물의 투여가 적절할 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용되는 염은 설페이트, 황산수소, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 카본산, 황산, 인산, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 석신산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 글루쿠론산, 말레산, 푸마르산, 피루브산, 아스파르트산, 글루탐산, 벤조산, 안트라닐산, 4-하이드록시 벤조산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산 (파모산), 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 판토텐산, 트리플루오로메탄설폰산, 설파닐산, 스테아르산, 알긴산, 2-하이드록시에탄설폰산, p-톨루엔 설폰산, 사이클로헥실아미노설폰산, 살리실산, 갈락타르산, β-하이드록시부티르산 및 갈락투론산을 포함하는 무기 및 유기 산으로부터 제조되거나; 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 아연 염을 포함하는 암모늄 염 및 금속 염으로부터 제조된 것들을 포함한다.
조성물/제형
본 개시내용의 약제학적 조성물은 당업계에 익히 공지된 방법, 예를 들어, 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 부상, 유화, 캡슐화, 포획, 동결건조 방법 또는 분무 건조에 의해 제조될 수 있다.
본 개시내용에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 활성 화합물의 처리를 촉진시키는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 의존적이다. 약제학적으로 허용되는 부형제 및 담체는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있고, 따라서 본 개시내용에 포함된다. 이러한 부형제 및 담체는, 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다: "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Pub.Co., New Jersey (1991).
투여량
본 개시내용에 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 활성 성분이 의도된 목적, 즉, 체중 증가의 억제 또는 예방, 또는 유지를 달성하기에 충분한 양으로 함유되는 조성물을 포함한다.
약제학적 조성물 중 본 개시내용의 신규 화합물인 활성 성분의 양 및 이의 단위투여 형태는 특정 화합물의 효력 및 목적하는 농도에 따라 변하거나 조정될 수 있다. 치료적 유효량의 결정은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 일반적으로, 활성 성분의 양은 조성물의 0.01중량% 내지 99.9중량% 범위이다.
일반적으로, 활성 성분의 치료적 유효량의 투여량은 약 0.001 내지 약 1000mg/체중kg/일의 범위일 수 있다. 목적하는 용량은 편리하게는 단일 용량으로 또는 적절한 간격으로, 예를 들어, 하루에 2, 3, 4회 또는 그 이상의 하위 용량으로 투여되는 분할 용량으로 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 신규 화합물의 유효량은 약 0.01 mg/kg보다 더 크다. 다른 구현예에서, 신규 화합물의 유효량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 1000 mg/kg이고, 약 0.1 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 0.01 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 10 mg/kg 및 약 100 mg/kg을 포함하여 사이에 존재하는 임의의 모든 전체 도는 부분적 증분이다.
일부 구현예에서, 신규 화합물의 유효량은 약 100 내지 50 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 신규 화합물의 유효량은 약 50 내지 10 mg/kg이다. 다른 구현예에서, 신규 화합물의 유효량은 약 10 내지 5 mg/kg이다. 다른 구현예에서, 신규 화합물의 유효량은 약 5 내지 2.5 mg/kg이다.
실시예
정의:
ALT = 알라닌 아미노트랜스아미나제.
AST = 아스파르테이트 트랜스아미나제.
ALP = 알칼리성 포스파타제.
ALB = 알부민.
일반적인 합성식
화학식 I의 화합물은 당업자에게 공지된 합성 절차에 의해 생성될 수 있다. 가변 환 A, R1, x 및 y가 상기 정의된 바와 같은 2 가지 상기 방법이 반응식 1에 제공되며, 어떠한 방식으로도 제한되는 것을 의도하지 않는다. 사실, 본 발명의 화합물을 합성하기 위한 더 많은 타당한 경로가 있을 수 있다.
경로 A에 제공된 바와 같이, 미츠노부(Mitsunobu) 화학을 사용하여 디이소프로필 아조디카복실레이트(DIAD) 또는 디에틸 아조디카복실레이트(DEAD)와 트리페닐포스핀과 같은 시약 조합을 사용하여 이미다졸 화합물의 하이드록실 산소를 활성화시킬 수 있고, 이는 활성화된 하이드록실과 페놀의 친핵성 치환 방법을 제공한다.
화학식 I의 화합물은 또한 경로 B의 친핵성 방향족 치환 전략에 의해 제조될 수 있다. 여기서, 플루오로페닐 화합물은 디메틸포름아미드 중 탄산칼륨과 같은 적당한 염기성 조건하에 이미다졸 화합물과 반응시킨다. 이미다졸 화합물의 하이드록실 그룹에 의한 불소의 치환은 화학식 I의 화합물의에테르 결합을 제공한다.
실시예 1 DNP 및 화합물 A 투여 후 DNP 또는 화합물 A의 혈장 농도
물질 및 방법:체중 18 내지 20g의 5 내지 7주령 수컷 C57BL/6 마우스를 Beijing Vital River Co., LTD로부터 입수했다. 동물을 연구 전 및 연구 동안 7일 동안 각 케이지에 3마리 동물로 층류실에서 (22±3℃)의 온도 및 40% 내지 80%의 상대 습도로 유지된 폴리카보네이트 케이지 및 환경적으로 모니터링된 충분히 환기된 방에 격리시켰다. 형광 조명은 하루에 약 12시간 조명을 제공했다. 침구 재료는 옥수수 속대였고, 이는 주당 1회 변경되었다. 각각의 동물은 식별 번호가 배정되었다. 마우스는 전체 연구 기간 동안 조사 멸균된 건조 과립 음식(Beijing Keaoxieli Feed Co., Ltd., Beijing, China) 및 멸균 음용수에 임의로 접근할 수 있었다.
체중을 기준으로 하여, 동물을 컴퓨터 생성된 무작위화 절차를 사용하여 각 그룹에 무작위로 배정했다(n=4). 하기 용량을 정상 식염수 중 7.1% DMSO에 경구 위관영양법으로 투여했다: 비히클 단독 (식염수 중 7.1% DMSO), 100mg/kg DNP, 및 1, 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 1000, 1250, 1500mg/kg 화합물 A.DNP는 Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd로부터 입수했다. DMSO는 Sigma Aldrich로부터 입수했다.
혈장은 0, 15분, 30분, 45분, 1h, 2h, 3h, 4h, 6h, 8h, 12h, 20h 및 24h 후에 0.5ml 헤파린 코팅된 원심관으로 안와 천공에 의해 수집되었다.
샘플을 벤치 탑 원심분리기에서 4000rcf 속도로 5분 동안 원심분리시켰다. 투명한 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, PK 분석을 위해 -80℃에서 저장했다.
모든 통계 분석을 수행하였고, 유의성 수준은 P<0.05로 설정되었다. 그룹 평균 및 표준 오차는 연구가 설계될 때 모든 측정 파라미터에 대해 계산되었다. 그룹 간의 일원 ANOVA 비교는 소프트웨어 SPSS 17.0으로 수행되었다.
결과: 100mg/kg DNP가 투여된 동물 중 2마리(50%)는 투여 후 처음 2시간 이내에 죽었고, 1500mg/kg 화합물 A의 동물 중 1마리는 12시간 후에 죽은 것으로 밝혀졌다. 전체 실험 동안 다른 비정상적인 임상 증상은 관찰되지 않았다. PK 분석은, 화합물 A가 DNP 잔기로 가수분해되었고, 화합물 A가 가장 많이 투여된 동물의 혈장에서 소량으로만 검출되었다는 것을 보여준다. 도 1 및 도 2는 화합물 A가 투여된 동물에서 DNP 잔기의 최대 혈장 농도 (Cmax)가 DNP를 직접 투여하는 것에 비해 급격히 감소되었다는 것을 도시한다. 화합물 A가 투여된 그룹 중 어떤 것도 DNP가 투여된 그룹과 동일한 Cmax에 도달되지 않았다. Tmax는 화합물 A가 투여된 동물에서 지연되었다. 동시에, DNP와 비교하여 화합물 A가 투여된 동물에서 DNP 잔기의 상당히 더 높은 총 노출이 측정되었다. 요약하면, 화합물 A는 감소된 Cmax로 인해 DNP보다 더 안전한 약물이다. DNP 잔기의 총 노출 및 Cmax 모두가 화합물 A의 용량에 의해 선형 방식으로 증가한다.
실시예 2 유도된 지방 간 질환이 있는 마우스에게 화합물 A를 투여한 후 ALT, AST 및 ALP 간 효소의 혈장 농도
수컷 C57BL/6 마우스는 Beijing Vital River Co., LTD로부터 입수했다. 동물은 연구 전 및 연구 동안 7일 동안 각 케이지에 3마리 동물로 층류실에서 (22±3℃)의 온도 및 40% 내지 80%의 상대 습도로 유지된 폴리카보네이트 케이지 및 환경적으로 모니터링된 충분히 환기된 방에 격리시켰다. 형광 조명은 하루에 약 12시간 조명을 제공했다. 마우스는 제1 주 동안 조사 멸균된 건조 과립 음식(Beijing Keaoxieli Feed Co., Ltd., Beijing, China) 및 멸균 음용수에 선택적으로 접근하였다.
순응 후, 그리고 연구 기간 내내, 음식은 메티오닌/콜린-결핍 음식(MCD)과 교환되어 동물에서 비알코올성 지방 간 질환(NAFLD)을 유도하였다. MCD에서 4주 후, 동물을 4개 그룹(n=8)으로 나누고, 정상 식염수 중 7.1% DMSO에 경구 위관영양법에 의해 0mpk, 5mpk, 25mpk 또는 100mpk 화합물 A를 투여했다.
혈액을 항응고제가 없는 튜브에 수집하고, 혈청 샘플은 4 ℃, 6000 g에서 15분 동안 원심분리로 즉시 처리한 다음, 새로운 시험 튜브로 옮겼다. 샘플을 3개의 간 효소에 대해 분석했다: TOSHIBA TBA-40FR 자동화 생화학적 분석기를 사용하는 ALT; AST; 및 ALP.
결과: 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, ALT 및 AST 수준은 MCD 처리된 마우스에서 급격히 증가된다. 이들 수준은 화합물 A로 용량 의존적 방식으로 감소된다. 통계적으로 유의한 감소는 5mpk 및 100mpk에서 관찰된 반면, 통계적 유의성은 두 개의 통계적 이상점이 분석으로부터 배제되면 25mpk 용량 수준 그룹에서만 도달된다.
실시예 3 유도된 지방 간 질환을 갖는 마우스에게 화합물 A 투여 후 경구 글루코스 내성 시험
마우스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 처리하였다. 경구 글루코스 내성 시험(OGTT)은 5주간의 화합물 A 처리 후 모든 연구 동물에 대해 수행되었다. 기준선 (시간 0) 글루코스 수준은 16시간 공복 후 측정되었다. 2g/kg 글루코스의 경구 투여 후, 혈당치는 30, 60 및 120분에 Accu-Chek Performa 시스템을 사용하여 측정되었다.
결과.혈당치는 모두 3개의 치료 그룹(25mg/kg 및 100mg/kg 치료의 경우 p<0.05, 5mg/kg 치료의 경우 p<0.01)에서 글루코스 시험 후 120분에 유의하게 더 낮았다. 도 6을 참조한다.
실시예 4 MCD 식이 유도된 NASH 마우스 모델에서 화합물 A의 효과의 평가.
본 발명자들은 화합물 A가 MCD 식이-유도된 NASH 마우스 간에서 지방간염 및 염증성 사이토카인을 감소시킨다는 것을 보여주었다. 지질 액적의 외관은 치료 6주 후에 감소되었다. 도 7 및 8을 참조한다. 이러한 이미지는 5mpk 화합물 A의 치료 후 간에서의 지방 저장량이 급격히 감소됨을 나타낸다. 도 7은 MCD 식이 유도된 NASH 공급 마우스 중 대조군 마우스 간에서의 지질 액적을 도시한다. 도 8은 5 mpk 화합물 A로 처리된 MCD 식이 유도된 NASH 공급 마우스 중 마우스 간에서의 마우스 지질 액적을 도시한다. 처리된 마우스는 6주 치료 후에 지질 액적이 급격하게 감소되었다.
간 TNFα 및 IL-1β도 또한 처리된 마우스에서 감소되었다. 도 9를 참조한다.
실시예 5 HFD에 의해 유도된 래트 NAFLD 모델에서 화합물 A의 효과의 평가
고지방 식이(HFD)를 공급한 래트에서 화합물 A의 효과를 결정하기 위해, 화합물 A를 14일 동안 1일 1회 경구 위관영양법으로 투여하였다. 6 내지 8주령의 50마리 SD 래트는 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd에 의해 공급되었다. 동물을 연구 전 최소 7일 동안 격리시켰다. 동물을 일정한 온도 및 습도에서 층류실에 보관하고, 멸균 음용수는 각 케이지에서 한 마리 동물로 임의로 이용가능했다. 7일 순응 기간 후, 래트에게 2주 유도 기간 동안 고지방 식이(D12492, 연구 식이)를 공급했다. 유도 기간 후, 동물을 그들의 체중에 기초하여 각각의 그룹으로 무작위로 할당했다. 연구 그룹 및 치료의 세부 정보는 표 1에 제시된다.
표 1 그룹 및 치료
동물에게 14일 (15일째부터 28일째까지) 동안 매일 경구 위관영양법에 의해 5 mL/kg PO 화합물 A, DNP 또는 비히클 단독 (물 중 7.5% DMSO)을 투여했다. 모든 동물의 체중은 연구 전반에 걸쳐 매주 2회 측정했다. 음식 소비는 모든 그룹의 동물에 대해 연구 전반에 걸쳐 매주 2회 기록했다. 혈액 샘플은 15일(전처리), 22일 및 29일째에 항응고제 없이 튜브에 안와 천공으로 수집했다. 혈액 샘플은 4℃에서 15분 동안 6000g으로 원심분리시킨 다음, 혈청 샘플을 수집하고 또 다른 샘플 튜브로 옮겼다. 분석이 즉시 분석되지 않으면 혈청 샘플을 -80℃로 유지시켰다. 트리글리세라이드 (TG), 총 콜레스테롤 (TCHO), 고밀도 지질단백질 콜레스테롤 (HDL-C), 저밀도 지질단백질 콜레스테롤 (LDL-C) 및 유리 지방산 (FFA)을 포함하는 지질 수준을 연구 말기에 TOSHIBA TBA-40FR 자동화 생화학적 분석기를 사용하여 측정했다. 모든 연구 그룹의 동물은 29일째에 안락사시키고, 검시를 수행했다.
간 조직 샘플을 모든 동물로부터 수집하고, 각각의 간 샘플을 3조각으로 절단하고, 한 조각은 간 지질 수준 분석을 위한 것이고, 한 조각은 조직학을 위한 것이고, 마지막 조각은 백업으로 스냅 냉동시켰다. 연구 종료시, 간 TG, TCHO, HDL-C, LDL-C 및 FFA 수준은 화학 분석기를 사용하여 분석하고, 간 세라미드 수준은 LC-MS/MS 방법을 사용하여 분석했다.
이 연구의 결과는, 연구 그룹 사이에서 글루코스 내성(경구 글루코스 내성 시험에 의해 측정됨), 체중 또는 음식 소비의 유의한 변화 또는 경향이 관찰되지 않았음을 보여주었다.
혈청 FFA 수준은, 혈청 FFA 및 혈청 TG 수준이 비히클 대조군과 비교하여 용량 의존 방식으로 낮아지는 경향이 있었지만, 비히클과 비교하여 7일 투여 후에 유의한 차이를 보였다(참조: 도 8 및 9). 도 9는 비히클 그룹 (평균±표준오차)과 비교될 때, p < 0.05 (T-시험)로 통계적으로 유효하다. 결과는, 화합물 A가 심혈관 질환, NASH 및 NAFLD의 위험을 감소시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
도 10은 혈청 TG 수준을 나타내는 차트이다. 도 10에서, p < 0.05 (ANOVA) (평균±표준오차). 도 11은 혈청 FFA 수준을 나타내는 차트이다.
TG, TCHO, HDL-C, LDL-C, FFA 및 세라미드를 포함하는 모든 간 지질 수준은 모든 치료 용량에서 낮아지는 경향이 있음을 주의한다. FFA의 현저한 감소가 화합물 A의 2개의 최고 용량에서 관찰되었다. 간 세라미드의 감소가 또한 최고 투여 그룹에서 유의성에 도달했다.
도 12는 간 TG 수준을 도시한다. 도 13은 간 세라미드 수준을 도시한다.
실시예 6 쥬커 당뇨병성 지방 (ZDF) 래트에서 화합물 A의 효과의 평가.
쥬커 당뇨병성 지방 (ZDF) 래트에서 28일 동안 1일 1회 경구 위관영양법으로 투여된 화합물 A의 효과를 결정하기 위해, 50마리 수컷 래트를 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co로부터 입수했다. 동물은 유도 개시시 8주령이었고, 연구 전 7일 동안 격리시켰다. 래트는 각 케이지에 한 마리 동물로 일정한 온도 및 습도에서 층류실에 보관하고, 격리 및 연구 기간 동안 물은 자유롭게 제공되었다.
7일 순응 기간 후, 50마리 ZDF 래트를 4주 동안 특별한 식이(Purina 5008 식이)에 유지시켜 2형 당뇨병을 유도했다. 4주 유도 후, 동물은 체중 및 공복 혈당 수준에 기초하여 무작위로 각각의 그룹으로 할당했다. 연구 그룹 및 그룹당 동물의 수는 표 2에 제시된다.
표 2 그룹 및 치료
시험 물품을 7% DMSO (Sigma) 수용액 (v/v)에 용해시키고, 29일째부터 58일째까지 30일 동안 1일 1회 5mL/kg 용적으로 P.O. 투여했다. 제형은 매주 2회 제조했다.
체중은 연구 전반에 걸쳐 매주 2회 측정하였고, 음식 소비(음식 섭취/음식 배출)를 연구 전반에 걸쳐 매주 기준으로 모든 그룹의 동물에 대해 기록했다.
연구 동물의 빠른 혈당 수준은 Accu-Chek Performa 시스템을 사용하여 꼬리 정맥 출혈을 통한 유도 기간 후 매주 측정했다. 모든 시험은 29일째(기준선), 36일째, 43일째, 50일째 및 57일째에 수행했다. 동물은 측정 전 밤새(17:00에서 다음 날 9:00시까지 16시간 동안) 금식했다.
혈청 지질 프로파일 및 간 효소 수준은 유도 기간 후 매주 측정하였고, 특이적 혈액 화학 파라미터는 표 3에 열거된다. 모든 시험은 29일째(기준선), 36일째, 43일째, 50일째 및 57일째에 수행했다. 혈액은 항응고제 없이 튜브에 안와 정맥으로부터 수집하고, 혈청 샘플은 4℃, 6000g에서 15분 동안 원심분리로 즉시 처리한 다음, 새로운 시험 튜브로 옮겼다. 지질 수준 및 전체 패널 혈액 화학은 TOSHIBA TBA-40FR 자동화 생화학적 분석기를 사용하여 측정했다.
표 3 혈액 생화학 파라미터
모든 연구 동물의 인슐린 수준은 ELISA 방법을 사용하여 57일째에 측정했다. 혈청을 이 분석에 사용하였다.
종료일(59일째)에 완전한 검시를 수행하고, 간을 모든 동물로부터 수집했다. 간 샘플을 3부분으로 분할했다; 1/3은 10% 포르말린으로 고정시키고 조직학적 파라핀 블록으로 처리하고, 1/3은 지질 측정(TG, TCHO, HDL-C, LDL-C 및 FFA)용으로 처리하고, 나머지 1/3은 스냅 냉동시키고 미래 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다.
통계 시험을 모든 데이터에 대해 수행하였고, 유의성 수준은 5% 또는 P<0.05로 설정하였다. 그룹 평균 및 표준 편차는 연구가 설계될 때 모든 측정 파라미터에 대해 계산되었다. 소프트웨어 GraphPad Prism 6.0을 사용하는 그룹 간에 일원 분산 분석(ANOVA)이 사용되었다.
본 발명자들은, 연구 그룹 사이에서 체중 및 음식 소비의 유의한 변화가 관찰되지 않았지만, 최고 화합물 A 투여 그룹에서 더 높은 음식 소비 추세가 비히클과 비교된 36일 후 모든 투여 그룹에서 체중 감소 추세와 커플링된다는 것을 보고한다. 도 14는 실시예 6의 연구 그룹의 음식 소비 곡선을 도시한다.
도 15는 NEFA (비-에스테르화된 지방산, 즉 유리 지방산 (FFA)) 수준이 최고 수준의 화합물 A로 처리된 두 그룹에서 상당히 더 낮았다는 것을 도시한다. 제3 그룹, 0.1mg/kg도 또한 낮아졌다. 도 15를 참조한다. 도 16에서 *p < 0.05, **p < 0.01은 비히클 그룹 (평균±표준오차)과 비교되었음을 주의한다. 도 16은 혈액 TG (트리글리세라이드) 수준이 유사한 결과는 나타내었고, 모든 연구 그룹에서 비히클 그룹(평균±표준오차)보다 낮았음을 도시한다. 도 16을 참조한다. 도 17은 모든 연구 그룹에서 간 TG가 또한 낮았고, 감소가 비히클 그룹(평균±표준오차)과 비교하여 최고 수준의 화합물 A (5.0 mg/kg) *p < 0.05로 처리된 그룹에서 통계적 유의성에 도달했다는 것을 도시한다. 도 17을 참조한다. 도 18은 혈중 인슐린 수준이 모든 치료 그룹에서 더 낮은 것으로 관찰되었음을도시한다. *p < 0.05는 비히클 그룹 (평균±표준오차)과 비교되었음을 주의한다(참조: 도 18). 상기 연구는, 화합물 A가 심장 및 심혈관 질환의 위험을 줄이는데 효과적일 수 있고, NAFLD, NASH 및 2형 당뇨병을 치료하는 데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 7 Hep3B-luc 인간 간암 뮤린 동소이식 모델에서 화합물 A의 효과의 평가.
60마리의 암컷 BALB/c 누드 마우스를 연구 전에 7일 동안 격리시켰다. 연구의 길이 동안, 동물을 표준 실험실 조건에 보관하고, 조사 멸균된 건조 과립 음식 및 멸균 음용수에 자유롭게 접근할 수 있도록 했다. 격리 기간 후, 마우스를 동일 반응계에서 10 μL MEM/매트리겔 혼합물 (7:3)에 현탁된 1 x 10E6 루시퍼라제-발현 Hep3B-luc 세포로 접종시켰다. 마취된 마우스에서 피부 및 복막을 절개하여 좌측 간엽을 노출시키고, 세포를 좌측 간엽에 서서히 주입하여 세포의 투명한 수포를 간 캡슐을 통해 관찰하였다. 종양 성장은 이미지 분석에 의해 모니터링했다. 14일째에, 컴퓨터 생성된 무작위 절차를 사용하여 체중 및 바이오 발광 이미징(BLI) 값(그룹당 10마리 마우스)에 기초하여 6개 그룹으로 무작위화여 평균 BLI가 그룹간에 유사했다는 것을 보장했다.
연구 동물은 종양 성장뿐만 아니라 이동성, 음식 및 물 소비 (단지 케이지 사이드 체크에 의해), 체중 (BW), 눈/모발 매팅 및 임의의 다른 비정상 효과와 같은 거동을 모니터링했다.
BLI 측정을 위해, 마우스에게 15 mg/ml (5μL/g BW)의 D-루시페린 (Pharmaron)을 복강내 주사하고, 1 내지 2% 이소플루란 흡입으로 마취시켰다. 루시페린 주사 10분 후, 마우스를 1주일에 2회 IVIS Lumina II (캘리퍼스)를 사용하여 이미지화하였다.
현재 사용되는 이미지 소프트웨어 (캘리퍼스)을 사용하여 관심 영역(ROI)을 계산하고, 각각의 ROI에서 총 생물발광 신호를 통합하였다. ROI의 생물발광 신호 (광자/s)를 정량화하여 종양 성장 및 항종양 활성의 지표로서 사용했다.
치료는 평균 종양 생물발광 신호가 종양 세포 접종 후 14일째에 약 52 × 10E6 광자/s에 도달했을 때 개시했다. 동물을 다음 치료 그룹으로 나누었다(n=10/그룹):
1. 비히클 대조군
2. 소라페닙 토실레이트 80mg/kg
3. 소라페닙 토실레이트 80mg/kg + 25 mg/kg 화합물 A
4. 소라페닙 토실레이트 80mg/kg + 100 mg/kg 화합물 A
5. 소라페닙 토실레이트 80mg/kg + 200 mg/kg 화합물 A
6. 소라페닙 토실레이트 80mg/kg + 300 mg/kg 화합물 A
모든 약물을 7% DMSO + 20% 하이드록시프로필 베타 사이클로덱스트린 (HPBCD)에 용해시켰다.
시험 도중 또는 연구 그룹 간에 체중 변화는 관찰되지 않았다. 단일 제제로서 소라페닙은 28일 연속 치료 후 Hep3B-luc 인간 간 종양 생체내 생물발광의 BLI 감소에 영향을 미치는 경향을 나타냈다(참조: 도 19). 그러나, 이 효과는 임의의 시험된 투여 수준에서 화합물 A에 의해 증강되지 않았고, 화합물 A는 소라페닙의 효과를 개선시키거나 세포를 세포자멸사에 민감하게 하는 것으로 보이지 않는다. 사실상, 소라페닙 단독은 연구 종료시 최저 BLI를 가졌다. 모든 시험 물품은 동소이식 종양-함유 마우스에 의해 현재 시험 상태에서 충분히 내성이었다.
치료 기간 동안 모든 동물에서 다른 중대한 임상적 비정상은 관찰되지 않았다. 도 19는 인간 Hep3B-luc 간 암의 동소이식 모델의 치료에서 소라페닙 단독 및 화합물 A와의 조합의 효과를 예시한다.
실시예 8 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 화합물 A 효능의 설명.
이 연구는 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델(DIAMOND) 수컷 C57BL/6J(B6)-129s1/SvImJ(S129) 마우스에서 지방간염 및 섬유증으로의 진행에 대한 화합물 A의 효과를 평가했다. Sanyal DIAMOND 마우스 모델은 진행성 NASH를 갖는 인간에게서 나타나는 주요 생리학적, 대사적, 조직학적, 유전자 전사적 및 세포-신호전달 변화의 개요를 말한다. 또한, 다음을 참조한다: Journal of Hepatology Volume 65, Issue 3, September 2016, Pages 579-588 'A diet-induced animal model of non-alcoholic fatty liver disease and hepatocellular cancer' by A.Asgharpour et al.
화합물 A의 2가지 용량 수준(8주 동안 비히클에서 1일 용량 1 mg/kg 또는 5 mg/kg)을 비히클 대조군 및 정상 음식(Harlan Normal Rodent Chow, TD 7012 Teklad LM-485) 및 역 삼투압 (RO) 정제수에 대한 변형 일치된 음성 대조군 마우스로부터의 병력 데이터와 비교하였다.
연구 시작시(0주), 30마리의 8 내지 12주령 수컷 마우스에게 임의로 웨스턴 식이, 지방 (Harlan TD.88137)으로부터 Harlan 42% 칼로리 및 당 물 (SW 23.1　g/L d-푸럭토스　+　18.9　g/L d-글루코스)를 공급했다. 마우스를 12주 동안 지방간염으로 진행하도록 한 후 그들을 3개의 치료 그룹(n=10)으로 무작위로 나누었다:
1.비히클 대조군 - 0.1% Tween-80(VC)을 갖는 0.5% 수성 나트륨 카복시메틸 셀룰로스
2.비히클 중 화합물 A 1.0 mg/kg/일 (저용량 화합물 A)
3.비히클 중 화합물 A 5.0 mg/kg/일 (고용량 화합물 A)
추가의 두 그룹 (병력 데이터)은 또한 비교용으로 사용되었다.
4.음성 대조군 - 정상 음식 식이 공급된 마우스(20주 NC)
5.양성 대조군 - SW를 갖고 치료 없고 위관영양법 없이 WD 공급된 마우스(20주 PC)
20주 후 8주 치료 후, 모든 마우스를 부검했다.
본 발명자들은 5mg/kg 투여된 동물이 20주에 상당한 체중 감소를 보였다는 것을 발견했다. 이 그룹에서 동물들은 또한 통계적으로 유의한 낮은 간 중량, 총 콜레스테롤, ALT, ALP 및 ASP 값을 가졌다. 소엽 염증은 화합물 A로 유의하게 감소되었다. NAS 및 SAF 활성 점수는 화합물 A로 상당히 낮아졌다. 화합물 A로 NASH로의 진행이 현저히 감소했다(화합물 A에서 한 마리의 마우스만 NASH로 진행된 반면, 모든 대조군은 NASH로 진행되었다). 연구는, 화합물 A가 NAFLD 및 NASH를 치료하는 데 효과적일 것이고, 또한 비만을 치료하기 위해 BMI를 낮추고 심장 질환의 위험을 감소시키는 데에도 효과적일 수 있음을 나타낸다.
이들 결과는 다음 도면에 기재된다: 도 20은 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 실험 설계 및 질환 진행을 도시한다. 도 21은 웨스턴 식이가 도입된 후(0주) 및 치료 동안(12 내지 20주) 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 체중 증가를 도시한다. 데이터는 고용량 화합물 A에서 유의한 전반적인 체중 감소를 보여준다. 도 22는 8주의 고용량 화합물 A 후 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도동물 모델에서 유의한 전반적인 체중 감소를 도시한다. 도 23은 8주 투여 후 간 중량에 대한 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 저용량 및 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다. 도 24는 8주 투여 후 간 중량에 대한 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 저용량 및 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다. 도 25는 ALT (알라닌 아미노트랜스아미나제)의 혈청 수준에 대한 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 저용량 및 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다. 도 26은 ALP (알칼리성 포스파타제)의 혈청 수준에 대한 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 저용량 및 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다. 도 27은 ALP (알칼리성 포스파타제)의 혈청 수준에 대한 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 저용량 및 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다. 도 28은 ALB (알부민)의 혈청 수준에 대한 비-알코올성 지방 간 질환의 식이 유도 동물 모델에서 저용량 및 고용량 화합물 A의 효과를 도시한다.
실시예 9 5-[(2,4-디니트로페녹시)메틸]-1-메틸-2-니트로-1H-이미다졸 (표 A에서 화합물 #2 또는 화합물 A)의 제조.
2,4-디니트로페놀 (약 20% 물로 습윤됨, 제조원: TCI America, Cat.번호 D0109) (269 mg 습윤 중량, 215 mg 건조 중량, 1.17 mmol)을 메틸렌 클로라이드(2 mL)에 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 무수 황산나트륨으로 교반시켰다. 메틸렌 클로라이드 용액을 반응 플라스크에 경사 분리하고, 황산나트륨은 추가의 메틸렌 클로라이드(2 mL)로 세척했다. 이 용액에 (1-메틸-2-니트로-1H-이미다졸-5-일) 메탄올(115 mg, 0.732 mmol, US 8,003,625 B2에 기재된 절차에 의해 제조됨) 및 트리페닐포스핀 (211 mg, 0.805 mmol)을 첨가한다. 혼합물을 용액이 달성될 때까지 실온에서 교반한다. 이어서, 용액을 빙욕으로 냉각시키고, 디이소프로필 아조디카복실레이트, DIAD (158 μL, 0.805 mmol)로 처리한다. 1시간 후 빙욕을 제거하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼에서 정제하여 트리페닐포스핀 옥사이드와 혼합된 생성물을 단리시킨다. 고체를 3급-부틸 메틸 에테르로 연마하여 트리페닐포스핀 옥사이드를 제거하여 5-[(2,4-디니트로페녹시)메틸]-1-메틸-2-니트로-1H-이미다졸 (70 mg, 0.236 mmol, 30% 수율)을 수득한다.
1H NMR (DMSO-d 6 ) d 8.80 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.58 (dd, J = 9.6, 2.4 Hz, 1 H); d 7.82 (D, J = 9.6 Hz, 1 H), 7.40 (s, 1 H), 5.66 (s, 2 H), 3.95 (s, 3 H). C11H9N5O7 에 대한 MS (ESI+) m/z 324.1 (M+H)+.
실시예 10 NCI-60 암 세포주 패널에서 화합물 A의 성장 억제 특성의 평가.
암 스크리닝 패널의 인간 종양 세포주를 5% 태아 소 혈청 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 성장시킨다. 전형적인 스크리닝 실험의 경우, 세포를 개별 세포주의 배가 시간에 따라 5,000 내지 40,000 세포/웰 범위의 플레이팅 밀도에서 100 μL로 96 웰 미세적정 플레이트에 접종한다. 세포 접종 후, 미세적정 플레이트를 실험 약물 첨가 전에 24시간 동안 37℃, 5% CO2, 95% 공기 및 100% 상대 습도에서 배양한다.
24시간 후, 각각의 세포주의 2개의 플레이트를 동일 반응계에서 TCA로 고정시켜 약물 첨가시(Tz) 각각의 세포주에 대한 세포 집단의 측정치를 나타낸다. 실험 약물을 목적하는 최종 최대 시험 농도의 400배로 디메틸 설폭사이드에 용해시키고, 사용 전에 냉동 저장한다. 약물 첨가시, 냉동된 농축물의 분취액을 해동시키고, 50μg/ml 겐타마이신을 함유하는 완전 배지로 목적하는 최종 최대 시험 농도의 2배로 희석시킨다. 약물 희석액의 100 μL의 분취액을 이미 100 μL의 배지를 함유하는 적합한 미세적정 웰에 첨가하여 필요한 최종 약물 농도를 유도한다.
약물 첨가 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2, 95% 공기, 및 100% 상대 습도에서 추가의 48시간 동안 배양한다. 부착 세포의 경우, 검정은 차가운 TCA의 첨가로 종결된다. 세포는 동일 반응계에서 50 μL의 차가운 50% (w/v) TCA (최종 농도, 10% TCA)의 부드러운 첨가로 고정하고, 4°C에서 60분 동안 배양한다. 상청액을 버리고, 플레이트를 수돗물로 5회 세척하고, 공기를 건조시킨다. 1% 아세트산 중 0.4% (w/v)의 설포로다민 B (SRB) 용액 (100 μL)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10분 동안 배양한다. 착색 후, 미결합된 염료는 1% 아세트산으로 5회 세척하여 제거하고, 플레이트를 공기 건조시킨다. 결합된 착색제는 후속적으로 10 mM trizma 염기로 가용화시키고, 흡광도는 515nm의 파장에서 자동화 플레이트 판독기로 판독한다. 현탁액 세포의 경우, 방법론은 검정이 50 μL의 80% TCA (최종 농도, 16% TCA)를 부드럽게 첨가하여 웰의 바닥에 침강된 세포를 고정시킴으로써 종결되는 것을 제외하고는 동일하다. 7개의 흡광도 측정치[시간 제로, (Tz), 대조군 성장, (C), 및 5개의 농도 수준에서약물의 존재하에 시험 성장 (Ti)]를 사용하여, 성장 백분율은 각각의 약물 농도 수준에서 계산된다. 성장 억제 백분율은 다음과 같이 계산된다:
Ti>/=Tz의 농도의 경우 [(Ti-Tz)/(C-Tz)] x 100
Ti<Tz의 농도의 경우 [(Ti-Tz)/Tz] x 100.
1회-용량 데이터는 처리된 세포의 성장률의 평균 그래프로서 제시된다. 보고된 수는 비-약물 대조군 및 제로 시간 세포 수에 대한 성장이다. 이것은 성장 억제 (0 내지 100 사이의 값) 및 치사율 (0 미만의 값) 모두의 검출을 가능하게 한다.
NCI-60을 교차하여, 화합물 A는 시험된 모든 세포주에 대해 26.47%의 델타와 40.14%의 범위로 대조군의 평균 성장률이 98.63이었다. 유사하게, DNP는 44.43%의 범위로 시험된 모든 세포주에 대해 28.44의 델타로 대조군의 평균 성장률이 98.4이었다. 세포주에 의한 결과는 하기에 나타낸다. 화합물 A도 DNP도 임의의 NCI-60 세포주 중 10uM에서 강력한 성장 억제(적어도 50%)를 생성하지 않았다. 도 29는 화합물 A 또는 DNP 10μM으로 처리된 NCI-60 세포주의 세포 성장을 도시한다.
실시예 11 간 마이크로솜에 의한 화합물 A로부터의 DNP의 형성
단계 1: 용액을 표 4에 따라서 제조했다.
표 4 마스터 용액의 제조
단계 2:40 μL의 10 mM NADPH 용액을 각 웰에 첨가했다. NADPH의 최종 농도는 1 mM이었다. 혼합물을 37℃에서 5분 동안 예비 가온시켰다. 음성 대조군 샘플은 NADPH 용액을 40 μL의 초-순수 H2O로 대체하여 제조했다. 음성 대조군은 화학물질 자체의 불안정성으로 인한 오해 인자를 배제하는 데 사용되었다. NADPH를 갖는 샘플을 이중으로 제조하였다. 음성 대조군은 단일선으로 제조했다 (참조: 도 30). 상이한 종의 간 마이크로솜에서 2μM 화합물 A로부터 DNP의 형성.시험된 종의 공급원은 표 5에 열거되어 있다.
표 5 간 마이크로솜 정보
단계 3:4 μL의 200 μM 대조군 화합물 또는 시험 화합물 용액을 첨가하여 반응을 개시했다. 베라파밀은 이 연구에서 양성 대조군으로 사용되었다. 시험 화합물 또는 대조군 화합물의 최종 농도는 2 μM였다.
단계 4:50 μL의 분취액을 0, 15, 30, 45 및 60분에 반응 용액으로부터 취했다. 반응을 IS (200 nM 이미프라민, 200 nM 라베탈롤 및 2 μM 케토프로펜)와 함께 차거운 메탄올 4용적을 첨가하여 중단시켰다. 샘플을 3, 220 g에서 40분 동안 원심분리시켰다. 90 μL의 상청액의 분취액을 90 μL의 초-순수 H2O와 혼합한 다음, LC-MS/MS 분석에 사용했다.
단계 5:데이터 분석
모든 계산은 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 수행했다.
피크 면적은 추출된 이온 크로마토그램으로부터 결정되었다. 기울기 값 k는 모 약물의 나머지 백분율 대 배양 시간 곡선의 자연 로그의 선형 회귀에 의해 결정되었다.
결과는, DNP의 형성이 향신료 사이에서 번역가능하고, 간에서 일반적인 효소에 의해 쉽게 발생한다는 것을 나타낸다.
실시예 12 제안된 단계 1/2 임상 시험 포함 기준
포함 기준:
대사 증후군의 2 내지 3개의 마커
간 중 10% 지방
40 이상의 ALT
FIB4 패널 1.1 이상
배제 기준:
BMI<25, 알코올 사용
동성 빈맥, 허혈성 질환 또는 신장 기능이상의 병력
단계 1/2 연구의 탐구 효능 종점
MRI-PDFF 및 MRE를 사용하는 간 지방 정량화
CK18을 순환시킴
간 미토콘드리아 활성 비-침습성 호흡 시험(BreathID® System, Exalenz Biosciences)
표적 참여 및 PD를 확인
반응자 ID 및 환자 계층화
설계 목표의 신속한 검증
NASH(NCT02314026, NCT01244503, NCT01281059)의 다중 단계 II 연구에 이용된 BreathID® 시스템
실시예 13 1-[2-(2,4-디니트로-페녹시)-에틸]-2-메틸-5-니트로-1H-이미다졸 (표 A의 화합물 #1)의 합성.
2,4-디니트로페놀 (약 20% 물로 습윤됨) (269 mg 습윤 중량, 215 mg 건조 중량, 1.17 mmol)을 메틸렌 클로라이드(2 mL)에 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 무수 황산나트륨으로 교반시킨다. 메틸렌 클로라이드 용액을 반응 플라스크에 경사 분리하고, 황산나트륨은 추가의 메틸렌 클로라이드(2 mL)로 세척했다. 이 용액에 2-(2-메틸-5-니트로-이미다졸-1-일)-에탄올 (125 mg, 0.732 mmol) 및 트리페닐포스핀 (211 mg, 0.805 mmol)을 첨가한다. 혼합물을 용액이 달성될 때까지 실온에서 교반한다. 이어서, 용액을 빙욕으로 냉각시키고, 디이소프로필 아조디카복실레이트, DIAD (158 μL, 0.805 mmol)로 처리한다. 1시간 후 빙욕을 제거하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼에서 정제하여 트리페닐포스핀 옥사이드와 혼합된 생성물을 단리시킨다. 고체를 3급-부틸 메틸 에테르로 연마하여 트리페닐포스핀 옥사이드를 제거하여 1-[2-(2,4-디니트로-페녹시)-에틸]-2-메틸-5-니트로-1H-이미다졸을 수득한다. C12H11N5O7 에 대한 MS (ESI+) m/z 338.1 (M+H)+.
실시예 14 1-메틸-2-니트로-5-(4-니트로-페녹시메틸)-1H-이미다졸 (표 A의 화합물 #3)의 합성.
4-니트로페놀 (162 mg, 1.17 mmol)을 메틸렌 클로라이드(2 mL)에 용해시킨다. 그 용액에 (3-메틸-2-니트로-3H-이미다졸-4-일)-메탄올 (115 mg, 0.732 mmol) 및 트리페닐포스핀 (211 mg, 0.805 mmol)을 첨가한다. 혼합물을 용액이 달성될 때까지 실온에서 교반한다. 이어서, 용액을 빙욕으로 냉각시키고, 디이소프로필 아조디카복실레이트, DIAD (158 μL, 0.805 mmol)로 처리한다. 1시간 후 빙욕을 제거하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼에서 정제하여 트리페닐포스핀 옥사이드와 혼합된 생성물을 단리시킨다. 고체를 3급-부틸 메틸 에테르로 연마하여 트리페닐포스핀 옥사이드로 제거하여 1-메틸-2-니트로-5-(4-니트로-페녹시메틸)-1H-이미다졸을 수득한다. C11H10N4O5 에 대한 MS (ESI+) m/z 279.1 (M+H)+.
실시예 15 1-메틸-2-니트로-5-(3-니트로-페녹시메틸)-1H-이미다졸 (표 A의 화합물 #4)의 합성.
3-니트로페놀 (162 mg, 1.17 mmol)을 메틸렌 클로라이드(2 mL)에 용해시킨다. 그 용액에 (3-메틸-2-니트로-3H-이미다졸-4-일)-메탄올 (115 mg, 0.732 mmol) 및 트리페닐포스핀 (211 mg, 0.805 mmol)을 첨가한다. 혼합물을 용액이 달성될 때까지 실온에서 교반한다. 이어서, 용액을 빙욕으로 냉각시키고, 디이소프로필 아조디카복실레이트, DIAD (158 μL, 0.805 mmol)로 처리한다. 1시간 후 빙욕을 제거하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼에서 정제하여 트리페닐포스핀 옥사이드와 혼합된 생성물을 단리시킨다. 고체를 3급-부틸 메틸 에테르로 연마하여 트리페닐포스핀 옥사이드를 제거하여 1-메틸-2-니트로-5-(3-니트로-페녹시메틸)-1H-이미다졸을 수득한다. C11H10N4O5 에 대한 MS ( ESI +) m/z 279.1 (M+H)+.
실시예 16 5-(3,5-디니트로-페녹시메틸)-1-메틸-2-니트로-1H-이미다졸 (표 A의 화합물 #5)의 합성.
3,5-디니트로-페놀 (215 mg, 1.17 mmol)을 메틸렌 클로라이드(2 mL)에 용해시킨다. 이 용액에 (3-메틸-2-니트로-3H-이미다졸-4-일)-메탄올 (115 mg, 0.732 mmol) 및 트리페닐포스핀 (211 mg, 0.805 mmol)을 첨가한다. 혼합물을 용액이 달성될 때까지 실온에서 교반한다. 이어서, 용액을 빙욕으로 냉각시키고, 디이소프로필 아조디카복실레이트, DIAD (158 μL, 0.805 mmol)로 처리한다. 1시간 후 빙욕을 제거하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼에서 정제하여 트리페닐포스핀 옥사이드와 혼합된 생성물을 단리시킨다. 고체를 3급-부틸 메틸 에테르로 연마하여 트리페닐포스핀 옥사이드를 제거하여 5-(3,5-디니트로-페녹시메틸)-1-메틸-2-니트로-1H-이미다졸을 수득한다. C11H9N5O7 에 대한 MS ( ESI +) m/z 324.1 (M+H)+.
실시예 17 5-(2,4-디클로로-페녹시메틸)-1-메틸-2-니트로-1H-이미다졸이미다졸 (표 A의 화합물 #6)의 합성.
2,4-디클로로-페놀 (190 mg, 1.17 mmol)을 메틸렌 클로라이드(2 mL)에 용해시킨다. 그 용액에 (3-메틸-2-니트로-3H-이미다졸-4-일)-메탄올 (115 mg, 0.732 mmol) 및 트리페닐포스핀 (211 mg, 0.805 mmol)을 첨가한다. 혼합물을 용액이 달성될 때까지 실온에서 교반한다. 이어서, 용액을 빙욕으로 냉각시키고, 디이소프로필 아조디카복실레이트, DIAD (158 μL, 0.805 mmol)로 처리한다. 1시간 후 빙욕을 제거하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼에서 정제하여 트리페닐포스핀 옥사이드와 혼합된 생성물을 단리시킨다. 고체를 3급-부틸 메틸 에테르로 연마하여 트리페닐포스핀 옥사이드를 제거하여 5-(2,4-디클로로-페녹시메틸)-1-메틸-2-니트로-1H-이미다졸을 수득한다. C11H9Cl2N3O3 에 대한 MS ( ESI +) m/z 301.1 (M+H)+.
실시예 18 5-(2,6-디클로로-4-니트로-페녹시메틸)-1-메틸-2-니트로-1H-이미다졸 (표 A의 화합물 #8)의 합성.
2,6-디클로로-4-니트로-페놀 (243 mg, 1.17 mmol)을 메틸렌 클로라이드(2 mL)에 용해시킨다. 그 용액에 (3-메틸-2-니트로-3H-이미다졸-4-일)-메탄올 (115 mg, 0.732 mmol) 및 트리페닐포스핀 (211 mg, 0.805 mmol)을 첨가한다. 혼합물을 용액이 달성될 때까지 실온에서 교반한다. 이어서, 용액을 빙욕으로 냉각시키고, 디이소프로필 아조디카복실레이트, DIAD (158 μL, 0.805 mmol)로 처리한다. 1시간 후 빙욕을 제거하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼에서 정제하여 트리페닐포스핀 옥사이드와 혼합된 생성물을 단리시킨다. 고체를 3급-부틸 메틸 에테르로 연마하여 트리페닐포스핀 옥사이드를 제거하여 5-(2,6-디클로로-4-니트로-페녹시메틸)-1-메틸-2-니트로-1H-이미다졸을 수득한다. C11H8Cl2N4O5 에 대한 MS ( ESI +) m/z 347.0 (M+H)+.
실시예 19 2-((2,4-디니트로페녹시)메틸)-1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸 (표 A의 화합물 #16)의 합성.
DMF (5 mL) 중의 (1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸-2-일)메탄올 (176 mg, 1.12 mmol) 및 1-플루오로-2,4-디니트로벤젠 (250 mg, 1.34 mmol) 및 K2CO3 (465 mg, 3.36 mmol)의 혼합물을 2시간 동안 주위 온도에서 교반했다. 반응물은 추출로 후처리했다. 잔기를 하기 조건으로 예비-HPLC에 의해 정제했다: 컬럼:XBridge 예비 C18 OBD 컬럼 19Х150 mm, 5 um; 이동상 A: 물 (10 mmol/L NH4HCO3), 이동상 B:ACN; 유량:20 mL/분; 구배 용출. 생성물-함유 분획을 수집한 다음, 동결건조시켜 2-(2,4-디니트로-페녹시메틸)-1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸을 황색 고체로서 수득한다. LC-MS:(ES, m/z) 324.(M+H)+. 1H-NMR: (400MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.79 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.57 (dd, J 1 = 2.8 Hz, J 2 = 9.2 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.79 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.72 (s, 2H), 3.95 (s, 3H); 분석:C, 42.79; H, 3.43; N, 20.68; O, 33.25.
간 마이크로솜에 의해 화합물 B로부터 DNP의 형성
인간 효소에서 화합물 A를 표제 화합물로 대체한 것 이외에는 실험 조건을 변경하지 않고 실시예 11에 기재된 실험 절차에 따라 다음 결과가 수득된다:
실시예 20 2-[2-(2,4-디니트로-페녹시)-에틸]-1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸 (표 A의 화합물 #17)의 합성.
DMF (5 mL) 중의 2-(1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸-2-일)-에탄올 (1.32 mmol) 및 1-플루오로-2,4-디니트로벤젠 (1.65 mmol) 및 K2CO3 (465 mg, 3.36 mmol)의 혼합물을 2시간 동안 주위 온도에서 교반한다. 반응물은 추출로 후처리했다. 잔기를 하기 조건으로 예비-HPLC에 의해 정제했다: 컬럼: XBridge 예비 C18 OBD 컬럼 19Х150 mm, 5 um; 이동상 A: 물 (10 mmol/L NH4HCO3), 이동상 B:ACN; 유량: 20 mL/분; 구배 용출. 생성물 함유 분획을 수집한 다음, 동결건조시켜 2-[2-(2,4-디니트로-페녹시)-에틸]-1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸을 수득한다. LC-MS:(ES, m/z) 338.07 (M+H)+; 분석:C, 42.62; H, 3.20; N, 20.83; O, 33.32.
실시예 21 1-메틸-5-니트로-2-(4-니트로-페녹시메틸)-1H-이미다졸 (표 A의 화합물 #18)의 합성.
DMF (5 mL) 중의 2-(1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸-2-일)-에탄올 (1.24 mmol) 및 1-플루오로-4-니트로벤젠 (1.45 mmol) 및 K2CO3 (465 mg, 3.36 mmol)의 혼합물을 2시간 동안 주위 온도에서 교반한 다음, 가열한다. 반응물은 추출로 후처리했다. 잔기를 하기 조건으로 예비-HPLC에 의해 정제했다: 컬럼:XBridge 예비 C18 OBD 컬럼 19Х150 mm, 5 um; 이동상 A: 물 (10 mmol/L NH4HCO3), 이동상 B:ACN; 유량:20 mL/분; 구배 용출. 생성물 함유 분획을 수집한 다음, 동결건조시켜 1-메틸-5-니트로-2-(4-니트로-페녹시메틸)-1H-이미다졸을 수득한다. LC-MS:(ES, m/z) 279.07 (M+H)+; 분석:C, 47.35; H, 3.71; N, 20.24; O, 28.82.
실시예 22 1-메틸-5-니트로-2-(3-니트로-페녹시메틸)-1H-이미다졸 (표 A의 화합물 #19)의 합성.
DMF (5 mL) 중의 2-(1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸-2-일)-에탄올 (1.32 mmol) 및 1-플루오로-3-니트로벤젠 (1.67 mmol) 및 K2CO3 (465 mg, 3.36 mmol)의 혼합물을 2시간 동안 주위 온도에서 교반한 다음, 가열했다. 반응물은 추출로 후처리했다. 잔기를 하기 조건으로 예비-HPLC에 의해 정제했다: 컬럼:XBridge 예비 C18 OBD 컬럼 19×150 mm, 5 um; 이동상 A: 물 (10 mmol/L NH4HCO3), 이동상 B:ACN; 유량:20 mL/분; 구배 용출. 생성물 함유 분획을 수집한 다음, 동결건조시켜 1-메틸-5-니트로-2-(3-니트로-페녹시메틸)-1H-이미다졸을 수득한다. LC-MS:(ES, m/z) 279.07 (M+H)+; 분석:C, 47.53; H, 3.69; N, 20.24; O, 28.85.
실시예 23 2-(3,5-디니트로-페녹시메틸)-1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸 (표 A의 화합물 #20)의 합성.
DMF (5 mL) 중의 2-(1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸-2-일)-에탄올 (1.22 mmol) 및 3,5-디-니트로-1-플루오로벤젠 (1.54 mmol) 및 K2CO3 (465 mg, 3.36 mmol)의 혼합물을 2시간 동안 주위 온도에서 교반한 다음, 가열했다. 반응물은 추출로 후처리했다. 잔기를 하기 조건으로 예비-HPLC에 의해 정제했다: 컬럼: XBridge 예비 C18 OBD 컬럼 19Х150 mm, 5 um; 이동상 A: 물 (10 mmol/L NH4HCO3), 이동상 B:ACN; 유량:20 mL/분; 구배 용출. 생성물 함유 분획을 수집한 다음, 동결건조시켜 2-(3,5-디니트로-페녹시메틸)-1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸을 수득한다. LC-MS:(ES, m/z) 324.05 (M+H)+; 분석:C, 40.90; H, 2.89; N, 21.72; O, 34.60.
실시예 24 2-(2,4-디클로로-페녹시메틸)-1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸 (표 A의 화합물 #21)의 합성.
DMF (5 mL) 중의 2-(1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸-2-일)-에탄올 (1.25 mmol) 및 2,4-di-클로로-1-플루오로벤젠 (1.45 mmol) 및 K2CO3 (465 mg, 3.36 mmol)의 혼합물을 2시간 동안 주위 온도에서 교반한 다음, 가열했다. 반응물은 추출로 후처리했다. 잔기를 하기 조건으로 예비-HPLC에 의해 정제했다: 컬럼:XBridge 예비 C18 OBD 컬럼 19Х150 mm, 5 um; 이동상 A: 물 (10 mmol/L NH4HCO3), 이동상 B:ACN; 유량:20 mL/분; 구배 용출. 생성물 함유 분획을 수집한 다음, 동결건조시켜 2-(2,4-디클로로-페녹시메틸)-1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸을 수득한다. LC-MS:(ES, m/z) 302.00 (M+H)+; 분석:C, 43.78; H, 3.08; Cl, 23.52; N, 13.81; O, 15.99.
실시예 25 2-(2,6-디클로로-4-니트로-페녹시메틸)-1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸 (표 A의 화합물 #22)의 합성.
DMF (5 mL) 중의 2-(1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸-2-일)-에탄올 (1.15 mmol) 및 1,3-디클로로-2-플루오로-5-니트로-벤젠 (1.24 mmol) 및 K2CO3 (465 mg, 3.36 mmol)의 혼합물을 2시간 동안 주위 온도에서 교반한 다음, 가열했다. 반응물은 추출로 후처리했다. 잔기를 하기 조건으로 예비-HPLC에 의해 정제했다: 컬럼:XBridge 예비 C18 OBD 컬럼 19×150 mm, 5 um; 이동상 A: 물 (10 mmol/L NH4HCO3), 이동상 B:ACN; 유량:20 mL/분; 구배 용출. 생성물 함유 분획을 수집한 다음, 동결건조시켜 2-(2,6-디클로로-4-니트로-페녹시메틸)-1-메틸-5-니트로-1H-이미다졸을 수득한다. LC-MS:(ES, m/z) 346.(M+H)+; 분석:C, 38.01; H, 2.22; Cl, 20.13; N, 16.19; O, 23.15.
실시예 26 표 A의 화합물 11, 12, 13, 14, 및 15의 합성.
반응 용기에서, 이미다졸 화합물 (1몰 당량), 메틸렌 요오다이드 (1몰 당량), 페놀 화합물의 칼륨 염 (1몰 당량), 무수 트리에틸아민 (1몰 당량) 및 촉매량의 TBAB의 혼합물을 무수 아세토니트릴에 용해시켰다. 용액을 2시간 동안 환류시킨 다음, 용매를 증발시켰다. 이어서, 잔기를 CHCl3에 용해시키고, 물(2x 200 mL)로 세척했다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 증발시켜 조 생성물을 수득했다. 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 추가의 정제를 수행했다.

Claims (13)

  1. 5-[(2,4-디니트로페녹시)메틸]-1-메틸-2-니트로-1H-이미다졸 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  2. 청구항 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 포함하는, 비만, 당뇨병, 인슐린 내성 또는 불내성, 비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD), 비-알코올성 지방간염(NASH), 간 지방증, 2형 당뇨병(T2DM), 과잉 체지방, 이상지질혈증, 심혈관 질환, 심장 질환, 또는 죽상경화증으로부터 선택되는 장애의 치료를 필요로 하는 포유동물에서 상기 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 장애가 비만, 당뇨병, 또는 인슐린 내성 또는 불내성인, 약제학적 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 장애가 비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD), 비-알코올성 지방간염(NASH), 간 지방증 또는 2형 당뇨병(T2DM)인, 약제학적 조성물.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 장애가 비만 또는 과잉 체지방인, 약제학적 조성물.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 장애가 이상지질혈증인, 약제학적 조성물.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 장애가 심혈관 질환인, 약제학적 조성물.
  8. 청구항 2에 있어서, 상기 장애가 심장 질환인, 약제학적 조성물.
  9. 청구항 2에 있어서, 상기 장애가 죽상경화증인, 약제학적 조성물.
  10. 청구항 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 포함하는, 지방과다의 감소 또는 체중 증가의 조절 또는 예방을 필요로 하는 포유동물에서 지방과다를 감소시키거나 체중 증가를 조절하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  11. 청구항 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 포함하는, 산소 소비 속도(OCR)의 자극을 필요로 하는 포유동물에서 OCR을 자극하기 위한 약제학적 조성물.
  12. 청구항 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 포함하는, NASH를 초래하는 염증 및 섬유증의 치료를 필요로 하는 포유동물에서 NASH를 초래하는 염증 및 섬유증을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  13. 청구항 2 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
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