KR102553252B1 - 경옥고가미방인 고형재료를 포함한 반려견 바이러스성 감염질환 예방을 위한 면역력 강화 영양간식 제조방법 - Google Patents

경옥고가미방인 고형재료를 포함한 반려견 바이러스성 감염질환 예방을 위한 면역력 강화 영양간식 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 경옥고가미방인 고형재료를 포함한 반려견 바이러스성 감염질환 예방을 위한 면역력 강화 영양간식 제조방법은 반려견에 경옥고가미방의 보허로(補虛勞) 작용에 기반한 면역력 강화할 수 있도록 영양간식을 제공하여 면역력 저하로 인해 바이러스, 세균 및 곰팡이 등의 감염성 질병에 취약하게 되어 피부질환, 알러지성 질환, 종양 발생 및 자가면역성 질병 등의 위험성 요인의 발생을 최대한 억제할 수 있게 하고, 고지방 식단에 길들어진 반려견의 체질을 개선할 수 있는 동시에 포만감을 높여 반려견의 비만이 적절히 억제되면서 반려견의 활동성을 증진시키며, 균형잡힌 영양소의 섭취가 가능하게 하는데 그 특징이 있다.

Description

경옥고가미방인 고형재료를 포함한 반려견 바이러스성 감염질환 예방을 위한 면역력 강화 영양간식 제조방법{Mnufacturing mathod of the nutrition snack with enhancing immune activity for companion dogs using Gyoungokgo}
본 발명은 경옥고가미방인 고형재료를 포함한 반려견 바이러스성 감염질환 예방을 위한 면역력 강화 영양간식 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 반려견에 경옥고가미방의 보허로(補虛勞) 작용에 기반한 면역력 강화할 수 있도록 영양간식을 제공하도록 하고, 고지방 식단에 길들어진 반려견의 체질을 개선할 수 있도록 하는 동시에 포만감을 높여 반려견의 비만이 적절히 억제되면서 반려견의 활동성을 증진시켜 전체적인 균형잡힌 영양소의 섭취가 가능하도록 하는 경옥고가미방인 고형재료를 포함한 반려견 바이러스성 감염질환 예방을 위한 면역력 강화 영양간식 제조방법에 관한 것이다.
핵가족화, 미혼 독립 인구 증가, 노령층 인구 증가 등 사회현상으로 인해 반려견을 인간생활의 동반자로 인식하고 기르는 가정이 급속히 증가하고 있다.
이와 같은 반려견은 사람이 먹다 남은 음식물을 먹이로 주던 종래와 달리 반려견용 사료를 먹이로 주는 것이 보편화되어 있다.
상기 반려견에게 위생적이고 필요한 영양을 공급해주는 사료, 예컨대 단백질, 지방, 탄수화물과 같은 필수 영양소 외에도 무기염류나 비타민과 같은 보조요소도 필요로 하고 있으며, 이에 부응하여 관련 상품들이 많이 개발되고 있는 중이다.
지금까지 시중에 나와 있는 사료를 분석하면, 먼저 반려견에 대한 사료중 가장 중요한 성분 중 하나는 단백질인데, 단백질에 대한 라벨에 표시내용만 본다면 생물학적가치(질소평형치수)와 소화흡수율에 대하여 간과하고 넘어가게 되는데, 이는 사료 제조과정 중 멸균을 위하여 장시간 고온에 노출시 생물학적 가치가 높은 유용한 단백질이 파괴되고 음식에서 발생하는 당과 단백질은 체내의 소화효소에 의해 파괴될 수 없는 새로운 화합물을 만들기 때문에 사료에 표시되는 단백질은 반려동물이 실제로 소화해서 흡수할 수 있는 양이 아닌 오로지 조단백의 양만 표시하며, 이러한 단백질은 반려동물에게 거의 무의미하다.
또한, 반려견 사료의 육류 부산물(meat by-products)에는 닭, 오리, 가금류의 날개나 결합조직(연골), 레더 미트(leather meat: 구두제조시 사용하는 가죽), 다른 동물의 배설물, 말이나 소의 털을 의미하는 것으로, 이러한 것이 포함되어 있다.
또한, 탄수화물은 단백질과 같이 영양을 공급해 주는 것으로, 이는 대체적으로 당(자당), 프로필렌글리콜, 옥수수시럽과 같은 식물(단백질이나 비타민 등을 포함하지 않은) 칼로리를 지칭하는 것이고, 결론적으로 반려동물이 사료를 통하여 얻을 수 있는 영양소는 당을 제외하고는 거의 없다는 의미이며, 실제로 라벨에 표기된 탄수화물에 대한 부분을 해석해보면, 미분은 매우 곱게 간 쌀가루로 분쇄의 마지막 단계로 영양분이 거의 없고, 사탕무우탕은 건조시킨 사탕무우 찌꺼기로 약간의 당분 외 영양가 없으며, 옥수수 글루텐가루는 옥수수에서 녹말 등 껍질을 제거후 건조시킨 찌꺼기로 영양가 없다.
이에 따라, 종래에 제공되는 사료는 반려견에게 먹이고 싶은 단백질, 지방, 비타민, 미네랄 등의 영양소가 부족하고, 도축장의 폐기물이나 부산물 등 반려견에게 먹이고 싶지 않은 재료를 포함하고 있기에, 반려견에게 먹이면서 반려견의 면역체계가 변이되고 파괴되며, 질 높은 영양소의 공급을 원하고 있는데 지속적으로 영양소가 부족한 사료를 주어 반려견이 질병에 노출되고 실정이어서, 전체적으로 반려견에게 면역체계를 바로 잡아 줄 수 있는 양질의 재료를 사용하여 변형되고 망가진 반려견의 면역체계를 복구시킬 수 있는 물질이 없는 실정이다.
한편, 경옥고(瓊玉膏)는 한의학상 보약 처방의 하나로, 인삼, 백복령, 생지황, 봉밀의 약재로 구성된다. 경옥고는 정(精)을 채우고 수(髓)를 보하며, 모발을 검게 하고 치아를 나게 하며, 만신(萬神)이 구족(俱足)하여 백병을 제거한다고 되어 있고, 경옥고에 천문동, 맥문동, 구기자를 더 넣은 것이 익수영진고(益壽永眞膏)이다. 익수영진고는 경옥고에 보음(補陰)시킬 수 있는 재료가 추가되어 있어서 기를 돋우고 음기를 길러주는(益氣養陰) 효과를 증강한 제제이다(Kim MD. The literature study on the efficacy and manufacturing process of Gyeongoggo. J Oriental Medical Classics. 2011 ; 24(2) : 51-64). 경옥고와 익수영진고는 허(虛)한 것을 보(補)하는 대표적인 고(膏) 형태의 제제로서, 본 발명의 발명자는 익수영진고에 꽃송이버섯을 포함하여 반려견에 대해 바이러스성 감염질환 예방을 위한 면역 활성을 증진시킴을 확인하고 본 발명에 이르렀다.
한국등록특허 제10-0636389호(등록일: 2006.10.12.) 한국공개특허 제10-2018-0021983호(공개일: 2018.03.06.)
본 발명은 반려견에 경옥고가미방의 보허로(補虛勞) 작용에 기반한 면역력 강화할 수 있도록 영양간식을 제공하여 면역력 저하로 인해 바이러스, 세균 및 곰팡이 등의 감염성 질병에 취약하게 되어 피부질환, 알러지성 질환, 종양 발생 및 자가면역성 질병 등의 위험성 요인의 발생을 최대한 억제할 수 있게 하는 경옥고가미방인 고형재료를 포함한 반려견 바이러스성 감염질환 예방을 위한 면역력 강화 영양간식 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적은 기존에 폐기 처분되던 꽃송이버섯을 활용함으로써 원가를 절감할 수 있는 동시에 제조 비용을 저비용으로 유지할 수 있으므로 인해 소비자로 하여금 저렴한 영양간식을 제공 받을 수 있게 하는 경옥고가미방인 고형재료를 포함한 반려견 바이러스성 감염질환 예방을 위한 면역력 강화 영양간식 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 고지방 식단에 길들어진 반려견의 체질을 개선할 수 있는 동시에 포만감을 높여 반려견의 비만이 적절히 억제되면서 반려견의 활동성을 증진시키고, 균형잡힌 영양소의 섭취가 가능하게 하는 경옥고가미방인 고형재료를 포함한 반려견 바이러스성 감염질환 예방을 위한 면역력 강화 영양간식 제조방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 경옥고가미방인 고형재료를 미세분쇄기를 통해 분쇄하여 미세 분말로 준비하고, 밀봉인 꿀을 준비하며, 생지황을 세척기를 통해 흙의 잔사와 부유물을 깨끗이 씻어내도록 세척하고, 세척된 생지황을 분쇄기에 넣어 생지황을 마쇄하며, 마쇄된 생지황을 착즙기에 넣어 생지황 즙액을 얻어 준비하는 단계와, 상기에서 준비된 생지황 즙액, 밀봉인 꿀 및 경옥고가미방인 고형재료를 일정한 비율로 혼합하여 반죽하는 단계와, 상기에서 반죽된 혼합물을 옹기에 넣은 다음 상기 옹기를 물이 채워진 중탕기에 넣는 단계와, 상기 옹기가 투입된 중탕기를 일정한 온도를 유지하면서 일정한 시간동안 1차로 중탕을 실시하는 단계와, 상기에서 1차로 중탕이 완료되면 일정한 시간동안 실온에서 1차 숙성시키는 단계와, 상기의 1차 숙성이 완료되면 상기 옹기가 투입된 중탕기를 일정한 온도를 유지하면서 일정한 시간동안 2차로 중탕을 실시하고, 상기에서 2차로 중탕이 완료되면 일정한 시간동안 실온에서 2차로 숙성시킨 다음 영양간식 제품이 완성되는 단계로 이루어지는 것이다.
여기서, 상기의 중탕기를 통해 실시되는 1차 및 2차의 중탕은 3일 동안 온도측정기(KP3001, Ziraffe, China)로 온도를 측정하여 100±2℃로 유지하면서 실시하게 되고, 상기 중탕기에 채워진 물은 옹기가 80% 이상 잠길 수 있게 유지되도록 보충하는 것이다.
또한, 상기의 1차 및 2차 숙성은 최적의 맛과 기미를 지닌 제품으로 완성시키기 위해 중탕한 후에 1일 동안 실온에서 숙성시키게 되는 것이다.
상기에서 준비된 생지황 즙액, 밀봉인 꿀 및 경옥고가미방인 고형재료로 혼합되어 반죽된 혼합물은 생지황 즙액 42중량%, 밀봉인 꿀 40중량% 및 경옥고가미방인 고형재료 18중량%의 비율로 이루어지는 것이다.
또한, 상기 경옥고가미방인 고형재료는 홍삼 10중량%, 백복령 50중량%, 맥문동 4중량%, 천문동 4중량%, 구기자 7중량%, 꽃송이버섯 5중량%, 노루궁뎅이버섯 16중량% 및 복령피 4중량%의 비율로 혼합되어 이루어지는 것이다.
본 발명은 반려견에 경옥고가미방의 보허로(補虛勞) 작용에 기반한 면역력을 강화되는 영양간식이 제공되는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 기존에 폐기 처분되던 꽃송이버섯을 활용함으로써 원가가 절감되는 동시에 제조 비용이 저비용으로 유지됨으로 인해 소비자로 하여금 저렴한 영양간식을 제공 받을 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 고지방 식단에 길들어진 반려견의 체질을 개선yl키게 하는 동시에 포만감을 높여 반려견의 비만이 적절히 억제되면서 반려견의 활동성이 증진되고, 균형잡힌 영양소의 섭취가 가능하게 되는 효과가 있다.
도 1은 반복투여 유효성 평가에 참여한 개의 NK cell 개선율(0주차 대비)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 반복투여 유효성 평가에 참여한 개의 Cytotoxic T cell 변화량(0주차 대비)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 반복투여 유효성 평가에 참여한 개의 혈중 TNF-α 변화량(0주차 대비)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 경옥고가미방에 대한 DPPH free radical 소거활성율(%)의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 L-Ascorbic acid에 대한 DPPH free radical 소거활성율(%)의 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 아래의 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래의 실시예들로 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시예는 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하며 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.　
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예들은 제조상 초래되는 형상의 변화를 포함하여야 한다.
본 발명에 따라 실시되는 경옥고가미방인 고형재료는 반려견 감염질환 예방을 위한 면역력 강화용으로 활용할 수 있도록 최적의 배합비 분석하고 연구하여 반려견을 위한 영양간식을 제조할 수가 있었다.
이를 이해, 상기 경옥고가미방인 고형재료는 홍삼 10중량%, 백복령 50중량%, 맥문동 4중량%, 천문동 4중량%, 구기자 7중량%, 꽃송이버섯 5중량%, 노루궁뎅이버섯 16중량% 및 복령피 4중량%의 비율로 혼합되어 이루어지게 된다.
여기서, 홍삼(紅蔘)은 보기, 보양작용 강화의 대표 재료로, 자양강장, 노화방지, 항피로, 항스트레스 효과가 있고, 혈액순환 촉진, 면역기능 향상, 골다공증 예방 작용이 있으며, 빈혈, 고혈압, 당뇨 개선에 도움이 되는 것으로 알려져 있다.
백봉령(白茯笭)은 건비삼습 작용의 강화 대표 재료로, 이뇨작용과 당뇨개선, 진정작용, 면역기능 향상이 있어서 부종, 설사, 건망증, 수면장애를 개선할 수 있고, 강장효과가 있어서 질병을 앓고 난 후 허약한 사람이나 만성 위장병 환자 등에 효과가 있다고 알려져 있다.
맥문동(麥門冬)은 보음기능 강화의 대표 재료로, 이뇨, 자양강장, 진해거담 작용이 있어서 가래, 기침, 만성기관지염, 퇴행성관절질환에 활용된다고 알려져 있다.
천문동(天門冬)은 보음기능 강화의 대표 재료로, 이뇨, 자양강장 효과 있고, 노인의 만성기관지염 등으로 객담이 잘 배출되지 않고 오래도록 해수가 지속되는 증상 및 천식에 유효하며, 건조한 피부를 윤택하게 하고, 성기능을 촉진시키는 작용도 있으며, 발열성 질환의 후기에 변비가 있고 미열에 사용한다고 알려져 있다.
구기자(枸杞子)는 치매와 기역력 개선에 도움이 되고, 만성 간염, 간견변증 등에 염증이 제거되고 간기능을 활성화하며, 구기자에 함유되어 있는 베타인은 세포가 손상되는 것을 억제하고 암 예방에 도움이 되고, 혈액순환을 잘 시키며, 허리와 다리에 힘이 강해지는 효과가 있다고 알려져 있다.
꽃송이버섯은 건조된 상태인 100g당 베타글루칸(β-glucan)을 43.6% 함유하고 있어서 천연물 중 가장 많은 양을 함유하고 있고, 베타글루칸은 면역기능 활성성분으로 면역력을 증가시켜 항암작용에 우수한 효과를 보이고 있으며, 항염, 항산화, 미백 등의 효과도 있다고 알려져 있다.
노루궁뎅이버섯은 소화기계암(식도암, 분문암, 위암, 장암), 위궤양, 만성위염, 소화불량, 당뇨병, 허약체질, 치매, 고혈압, 신경쇠약, 자양강장, 면역력증진, 생활습관병, 항염, 항균 효과가 탁월하고, 오장을 이롭게 하고 소화기관을 돕고, 아가리쿠스버섯(10.4g)의 3배이상 들어 있는 헤테로 ß-D-글루칸(글리칸, 다당류)의 경이로운 함유량(34.4g/100g)으로 사람의 몸안에 원래 갖 추고 있는 면역기능을 활성화시켜 암세포 증식을 억제한다고 알려져 있다.
복령피(茯笭皮)는 마음을 안정시키고 위장을 튼튼하게 하며, 버려지고 있는 상황이나 복령외피 추출물이 생체 내에서 조절성 T세포를 유도해 알레르기를 억제할 수 있다고 알려져 있다..
그리고, 생지황(生地黃)은 보혈 기능 강화의 대표 재료로, 혈의 열을 식히고, 기혈을 고르게 하고, 통증을 완화시키고, 음혈을 보충함으로 빈혈 개선에 도움을 주며, 허약체질, 토혈, 코피, 자궁출혈, 생리불순, 변비 등을 개선하는 작용이 있다고 알려져 있다.
밀봉(蜂蜜)인 꿀은 오장을 편하게 하고, 부족한 것을 보충하고, 백가지약을 중화시킬 수 있고, 진통해독을 도움을 주고, 폐가 약해서 기침하거나 장이 약해서 오는 변비에 사용하며, 영양을 보충하고, 면역력을 향상시키고, 상처를 빠르게 아물게 하는 작용 및 항균 작용이 있다고 알려져 있다.
이에 따라 본 발명은 상기에서 설명한 경옥고가미방인 고형재료를 미세분쇄기를 통해 분쇄하여 미세 분말로 준비하게 되는데, 이때 연구 및 분석에 의해 최적의 배합비율로 이루어지게 된다.
그리고, 밀봉인 꿀을 준비하고, 생지황 즙액을 준비하게 된다.
여지서, 생지황 즙액은 생지황을 세척기를 통해 흙의 잔사와 부유물을 깨끗이 씻어내도록 세척하고, 세척된 생지황을 분쇄기에 넣어 생지황을 마쇄하며, 마쇄된 생지황을 착즙기에 넣어 생지황 즙액으로 얻는 것이다.
상기에서 준비된 생지황 즙액, 밀봉인 꿀 및 경옥고가미방인 고형재료를 일정한 비율로 혼합하여 반죽하게 되는데, 이는 생지황 즙액 42중량%, 밀봉인 꿀 40중량% 및 경옥고가미방인 고형재료 18중량%의 비율로 혼합되어 반죽하게 된다.
상기에서 반죽된 혼합물을 옹기에 넣은 다음 상기 옹기를 물이 채워진 중탕기에 넣게 되고, 상기 옹기가 투입된 중탕기를 3일 동안 온도측정기(KP3001, Ziraffe, China)로 온도를 측정하여 100±2℃로 유지하면서 1차로 중탕을 실시하게 되고, 상기 중탕기에 채워진 물은 옹기가 80% 이상 잠길 수 있게 유지되도록 보충하는 것이다.
상기에서 1차로 중탕이 완료되면 최적의 맛과 기미를 지니기 위해 1일 동안 실온에서 1차 숙성시키게 되고, 상기의 1차 숙성이 완료되면 상기 옹기가 투입된 중탕기를 재차 3일 동안 온도측정기(KP3001, Ziraffe, China)로 온도를 측정하여 100±2℃로 유지하면서 2차로 중탕을 실시하게 되며, 이 또한 상기 중탕기에 채워진 물은 옹기가 80% 이상 잠길 수 있게 유지되도록 보충하게 된다.
상기에서 2차로 중탕이 완료되면 최적의 맛과 기미를 지니기 위해 1일 동안 실온에서 2차로 숙성시킨 다음 영양간식 제품이 완성되는 것으로, 영양간식 제품은 고(膏)의 제형으로 제조될 수 있다.
여기서, 상기의 중탕기를 통해 실시되는 1차 및 2차의 중탕은 3일 동안 온도측정기(KP3001, Ziraffe, China)로 온도를 측정하여 100±2℃로 유지하게 되는데, 3일 동안 이루어지지 않으면 제대로된 중탕이 이루어지지 못한 문제가 있고, 3일을 초과하여 중탕하게 되면 경제적 및 제품으로서의 효율성이는 저하되는 문제가 있으며, 상기 중탕기에 채워진 물은 옹기가 80% 이상 잠길 수 있게 유지되도록 보충하게 되는데, 이는 원할한 중탕을 위해 물을 보충하는 것이 바람직하다.
또한, 상기의 1차 및 2차로 1일 동안 실온에서 숙성하게 되는데, 1일이 되지 않거나 1일을 초과하게 되면 제품으로서의 맛과 기미가 떨어지는 문제가 있다.
이하, 본 발명에 의해 실시되는 경옥고가미방인 고형재료에 대한 실험을 통해 영양간식의 유효성 및 안정성을 검증하기 위한 것이다.
즉, 경옥고가미방인 고형재료를 이용하여 반려견 바이러스 감염질환 예방을 위한 면역력 강화 영양 간식의 유효성 및 안전성을 검증하기 위해 현재 반려동물에서 기능성 성분에 대한 구체적인 가이드라인은 존재하지 않으나, 농림축산식품부고시 '사료 등의 기준 및 규격', 식품의약품안전처의 '단회투여독성 동물대체 시험법 가이드라인(2018년 6월 26일)', '건강기능식품 기능성 평가 가이드'를 참고하여 가급적 최소한의 동물을 사용하여 안전성과 유효성을 평가하고자 한다.
<단회경구투여 독성시험>
총 3마리의 건강한 비글견을 시험에 사용하였다. 실험 진행에 앞서 모든 실험견은 신체검사, 전혈구 검사, 혈액 생화학 검사를 통해 건강한 비글견임을 확인하였다. 실험 전 과정은 동물실험윤리위원회 (IACUC)의 승인을 받아 진행하였다 (ORIENT-IACUC-20024). 모든 실험견들은 중동물실 비글견 사육실에서 동일한 스테인레스 재질 개 사육상자 (800W × 930L × 800H)에 1마리씩 사육되었다. 상시 여과되는 100% prefilterated air 공조조건 내 일정한 온도 (23±3℃)와 습도 (50±20%)가 유지되는 곳에서 계류하였다. 조명은 08시부터 20시까지 12시간동안 점등해주었고, 오전 사육관리 시 사육상자 바닥 판의 분,뇨를 처리하여주며, 바닥판은 2주 1회 소독액을 이용하여 소독해주었다. 비글견용 실험 동물 전용사료 (Lab diet®5007, PMI Nutrition International Inc.,USA.)는 사료 구입 시 첨부된 분석 성적서를 통해 일반성분의 조성과 오염물질 유무를 검토하여 시험의 결과에 영향을 미치지 않는 것을 확인 후 1일 1회 약 300g씩 동일하게 공급하여 주었으며, 역삼투압 처리한 신선한 지하수를 자동급수장치를 통해 공급해주었다.
즉, 시험물질의 최고 용량을 건강기능성식품의 단회독성시험에서 적용되는 최고용량 범위에 근거하여 2,000 mg/kg body weight 및 이로부터 공비2로 1,000, 500 mg/kg body weight의 세 가지 농도로 나누어 단회경구투여 독성시험을 실시하였다.
총 3마리의 건강한 비글견에게 시험물질 경구 투여 후 총 14일간 이상반응을 관찰하였으며, 투여 후 0일, 1일, 3일, 7일, 14일차에 하기 표 1에 나타난 단회경구투여 독성시험의 안전성 평가 항목을 관찰 및 평가하였다.
신체검사 - 체중, 체온, 심박수, 호흡수
혈액 검사 전혈구
검사		 - 백혈구 (WBC), 적혈구 (RBC), 혈색소 (Hb), 적혈구 용적비 (PCV), 평균 혈구 용적 (MCV), 평균 혈구 혈색소 (MCH), 평균 혈구 혈색소 농도 (MCHC), 혈소판 (PLT)
- 백혈구 감별계산 (호중구, 호산구, 림프구, 단핵구, 호염구)
혈액 화학 검사 - 신장기능 검사항목: 혈액 요소성 질소 (BUN), 크레아티닌 (CRE)
- 당뇨검사: 혈당 (Glu)
- 간기능부전 검사: 알라닌 아미노기 전달효소 (ALT), 아스파르트산 아미노기 전달효소 (AST), 알칼리 포스파타아제 (ALP), 감마 글루타밀 트랜스 펩티다아제 (GGT), 총 빌리루빈 (Tbil), 젖산 탈수소 효소 (LDH)
전해질
검사		 - Na(나트륨), K(칼륨), Cl(염소). 칼슘 (Ca), 인 (P)
뇨 검사 단백뇨, 혈뇨, 뇨산도, 뇨당 검사, 뇨원주검사, 세균감염검사, 곰팡이 감염검사, 뇨빌리루빈 검사
단백질/ 지질단백질 전기영동 - 단백질: 알부민, 글로불린
- 지질단백질: HDL, LDL, VLDL
<반복투여를 통한 안전성 및 유효성 시험>
총 9 마리의 건강한 비글견을 시험에 사용하였다. 실험 진행에 앞서 모든 실험견은 신체검사, 전혈구 검사, 혈액 생화학 검사를 통해 건강한 비글견임을 확인하였다. 실험 전 과정은 동물실험윤리위원회 (IACUC)의 승인을 받아 진행하였다(ORIENT-IACUC-20024). 모든 실험견들은 중동물실 비글견 사육실에서 동일한 스테인레스 재질 개 사육상자 (800W × 930L × 800H)에 1마리씩 사육되었다. 상시 여과되는 100% prefilterated air 공조조건 내 일정한 온도 (23±3℃)와 습도 (50±20%)가 유지되는 곳에서 계류하였다. 조명은 08시부터 20시까지 12시간동안 점등해주었고, 오전 사육관리 시 사육상자 바닥 판의 분,뇨를 처리하여주며, 바닥판은 2주 1회 소독액을 이용하여 소독해주었다. 비글견용 실험 동물 전용사료 (Lab diet®5007, PMI Nutrition International Inc.,USA.)는 사료 구입 시 첨부된 분석 성적서를 통해 일반성분의 조성과 오염물질 유무를 검토하여 시험의 결과에 영향을 미치지 않는 것을 확인 후 1일 1회 약 300g씩 동일하게 공급하여 주었으며, 역삼투압 처리한 신선한 지하수를 자동급수장치를 통해 공급해주었다.
즉, 총 9마리의 건강한 비글견을 실험군 (저용량군 -1g/5kg, 고용량군 - 5g/5kg) 과 대조군 (저용량군과 동량의 생리식염수 투여)로 나누어 비교 실험을 진행하였다. 대조군, 저용량군, 고용량군에 각각 무작위로 3마리씩 배정하였으며, 매일 2회씩 총 56일 (8주)동안 시험물질을 경구 투여하였다. 투여 전과, 투여후 매 2주마다 총 5회에 걸쳐 시험기간 동안 반복투여를 통한 시험물질의 안전성과 유효성을 평가하였다.
표 2는 반복투여 시험의 안전성 평가항목을 나타낸 것이고, 표 3은 반복투여 시험의 면역력 유효성 평가항목을 나타낸 것이다.
신체검사 - 체중, 체온, 심박수, 호흡수
혈액
검사		 전혈구 검사 - 백혈구 (WBC), 적혈구 (RBC), 혈색소 (Hb), 적혈구 용적비 (PCV), 평균 혈구 용적 (MCV), 평균 혈구 혈색소 (MCH), 평균 혈구 혈색소 농도 (MCHC), 혈소판 (PLT)
- 백혈구 감별계산 (호중구, 호산구, 림프구, 단핵구, 호염구)
혈액 화학
검사		 - 신장기능 검사항목: 혈액 요소성 질소 (BUN), 크레아티닌 (CRE)
- 당뇨검사: 혈당 (Glu)
- 간기능부전 검사: 알라닌 아미노기 전달효소 (ALT), 아스파르트산 아미노기 전달효소 (AST), 알칼리 포스파타아제 (ALP), 감마 글루타밀 트랜스 펩티다아제 (GGT), 총 빌리루빈 (Tbil), 젖산 탈수소 효소 (LDH)
전해질 검사 - Na(나트륨), K(칼륨), Cl(염소). 칼슘 (Ca), 인 (P)
뇨 검사 단백뇨, 혈뇨, 뇨산도, 뇨당 검사, 뇨원주검사, 세균감염검사, 곰팡이 감염검사, 뇨빌리루빈 검사
단백질/ 지질단백질 전기영동 - 단백질: 알부민, 글로불린
- 지질단백질: HDL, LDL, VLDL
백혈구 감별 계산 - 백혈구 감별계산 (호중구, 호산구, 림프구, 단핵구, 호염구)
유세포 분석 - 림프구 아집단 비율 확인
- B 림프구, T 림프구 (보조, 세포독성), NK 세포
NK 세포 활성도 - NK 세포 활성 변화를 통해 면역기능 증진 여부 판단
사이토카인 - 인터루킨 (Interleukin, IL): IL-2, IL-6, IL-8, IL-10
- 인터페론 (Interferon, IFN): IFN-γ￣
- 종양괴사인자 (Tumor necrosis factors, TNF): TNF-￡
또한, 안전성 시험방법에서 신체검사는 투여일 동안 비글견의 구토, 설사, 황달, 탈모, 변 이상 등을 검사하여 기록하고 평가하고, 체중검사는 1주일 간격으로 실시하고 심박수, 체온, 호흡수 등과 함께 기록하였다.
그리고, 전혈구 검사는 총 14개 항목 검사를 실시한다. 전혈구 검사 (CBC)는 다음의 장비를 이용하여 검사한다: Vetscan® HM2 Hematology system; Abaxis, Inc., Union City, CA, USA. 전혈구 검사는 백혈구 (WBC), 적혈구 (RBC), 혈색소 (Hb), 적혈구 용적비 (PCV), 평균 혈구 용적 (MCV), 평균 혈구 혈색소 (MCH), 평균 혈구 혈색소 농도 (MCHC), 그리고 혈소판 (PLT) 를 포함하며, 백혈구 감별계산 (호중구, 호산구, 림프구, 단핵구, 호염구등 검사)까지 확인하였다.
그리고, 혈액 화학 검사는 총 18개 항목에 대한 검사를 실시하고, 다음의 장비를 이용하여 검사하였다 :Cobas C III instrument; Roche Diagnostics, South San Francisco, CA, USA. 검사 항목은 다음과 같다.
① 신장기능 검사항목인 혈액 요소성 질소 (BUN), 크레아티닌 (CRE)
② 당뇨검사 혈당 (Glu)
③ 간기능부전 검사 : 알라닌 아미노기 전달효소 (ALT), 아스파르트산 아미노기 전달효소 (AST), 알칼리 포스파타아제 (ALP), 감마 글루타밀 트랜스 펩티다아제 (GGT), 총 빌리루빈 (Tbil), 젖산 탈수소 효소 (LDH)
④ 총 지질검사 : 총 콜레스테롤 (Tchol), 트리글리세리드 (TG)
⑤ 췌장기능 검사 :아밀라제, 리파아제 (Lipa)
⑥ 단백질 검사 : 총 단백질 (TP), 알부민 (Alb)
⑦ 기타 근육 및 신경계 이상검사 : 크레아티닌 키나아제 (CK), 요산 (UA)
그리고, 전해질 검사는 총 5종 검사로 다음의 검사 장비를 이용하여 검사한다. (9180 Electrolyte Analyzer; Roche Diagnostic, South San Francisco, CA, USA). 검사항목은 Na(나트륨), K(칼륨), Cl(염소). 칼슘 (Ca), 인 (P)을 포함한다.
그리고, 뇨검사는 단백뇨, 혈뇨, 뇨산도, 뇨당 검사, 뇨원주검사, 뇨빌리루빈 검사를 포함하는 종합 뇨검사를 실시하였다.
그리고, 단백질 및 지질단백 전기영동 중에 단백질 전기영동 (Protein electrophoresis : EP)은 채취한 개의 혈청샘플을 네오딘 연구센터(801#280-15 Seongsudong-2ga Seongdonggu Seoul, South Korea)로 보내어 검사를 실시한다. 특히 혈청 단백질 전기영동 (serum protein electrophoresis, SPE) 실험은 네오딘 연구센터에서 검사를 실시하였다. 혈청의 단백질 전기영동은 HYDRASYS® agarose gel electrophoresis system (Sebia, Norcross, GA, USA)을 사용하여 제조사의 사용법에 따라 진행하며, 겔은 GELSCAN densitometer (Sebia)와 PHORESISTM software를 이용하여 설계되고 분석하였다. 전기영동 결과는 각각의 부분마다 참조 간격과 함께 비교하였고, 지질 단백 전기영동(Lipoprotein electrophoresis :LPE)은 12시간 이상 절식한 환자의 경정맥에서 채취된 혈액샘플은 혈청분리 튜브(SST)에 수집되어 네오딘 연구센터에서 검사하며, 혈청의 지단백질 전기영동은 HYDRASYS® agarose gel electrophoresis system (Sebia, Norcross, GA, USA)을 사용하여 제조사의 사용법에 따라 실험한다. 겔은 GELSCAN densitometer (Sebia)와 PHORESISTM software를 이용하여 설계되고 분석하며, 혈청은 제조사 지시에 따라 HYDRASYS® 아가로스 겔 전기영동 시스템(Sebia, Norcross, GA, USA)의 종이전기영동에 의해 평가한다. 겔 영상은 GELSCAN을 사용해 판독되며 densitometry은 PHORESISTM software을 통해 수행된다. 지질 단백 전기영동 결과는 알파, 베타, 이전 베타구조의 백분율, 킬로미크론, 트라글리세라이드, 콜레스테롤 농도와 같은 지질분획에 기초해 표현되고 HDL, LDL, VLDL 등 혈관 기능개선 및 대사증후군 여부를 평가하였다.
또한, 유효성 시험 방법에서 백혈구 감별 계산은 정상적인 말초 혈액 내의 백혈구에는 서로 다른 종류의 세포들이 혼합되어 있으며, 이러한 백혈구가 어떤 종류의 백혈구로 구성되어있는가를 검사하였다. 말초혈액 도말 후 현미경을 통해 혈액 내 백혈구의 종류 및 수를 계산하고 평가하였다.
그리고, 유세포분석은 말초 혈액의 림프구 부분 집합들을 확인하기 위해서, 유동 세포 분석법을 통한 면역 표현형의 분석을 실시하였다. 유세포분석 측정은 형광 활성화 세포 분석기 (FACScan; Bcton-Dickinson, USA) 와 CELL QuestTMsoftware에서 이루어지며 총 10,000회의 과정이 각 준비과정에서 요구된다. 개 전혈 백혈구는 specific forward (FSC) 와 side (SSC) light-scatter properties을 기준으로 확인하며, FSC와 SCC gain 조정 후, 림프구는 FSC 대 SSC gain 분포도의 특성에 기반하여 선택된다. 림프구의 부분집합은 개폐형 림프구내의 양성세포(CD4+, CD8+, CD21+) 비율의 산물로 계산하였다.
그리고, NK 세포 활성도는 1ml의 전혈을 사용하여 PROMOCA로 자극 시킨 NK cell에서 나온 interferone- gamma (IFN-γ) 를 ELISA 방식을 통해 측정한다. 1ml의 전혈과 PROMOCA 1ml를 섞어 37℃에 24h동안 배양힌 후 상층액만을 채취하여 NK뷰키트 (ATgen, Korea)를 사용하여 IFN-γ를 측정하였다. NK Veu kit는 ELISA로 항-개-IFN-γ로 코팅된 96-well plate에 샘플을 적용한 뒤 2시간 동안 실온에서 반응시킨다. 그 후 워싱 버퍼 (0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.4)로 4회 씻어낸 뒤 IFN-γ conjugate를 각 well에 처리한 뒤 1시간 반응시킨다. 그 후 세척완충액으로 7회 세척후 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)을 추가하여 30분 동안 반응 시킨 뒤 stop solution으로 반응을 멈춘다. 그 후 450 nm의 흡광도로 측정하였다.
그리고, 혈중 사이토카인 측정은 사이토카인(cytokine)은 면역세포가 분비하는 단백질의 총칭으로 세포간의 의사소통을 원활하게 하는 세포간의 언어와도 같은 면역체계 신호전달 물질이다. 일부의 일반 세포와 면역계의 세포들이 분비하며 그 자신을 분비한 모세포 및 인근 세포에 작용하며, 그 작용범위와 기능에 따라 여러 가지 종류로 존재한다. 반려견의 감염성 (바이러스성) 질환과 관계된 체액성 면역 (주로 Th1면역반응; IL-2, TNF-a 등) 및 세포성 면역 (주로 Th2 면역반응; IL-6, IL-10 등) 과 관련된 사이토카인의 변화를 측정하였다.
밀리포어사 MIILLIPLEX® multiplex immunoassay를 통해서 사이토카인을 분석하는데, 먼저 분석하고자하는 사이토카인, 즉 target analyte에 대한 capture antibody가 코팅되어있는 color-coded bead와 샘플을 섞어서 analyte와 capture antibody를 결합시킨다. 이후 target analyte에 대한 biotinylated detection detection antibody를 첨가하여 capture Ab-analyte-detection Ab complex 형성을 유도한다. Streptavidin-PE (Phycoerythrin)을 첨가하여 biotinylated detection detection antibody에 결합시키고 Luminex® 200 장비에 반응이 완료된 샘플을 주입하여 bead color와 함께 결합된 PE intensity를 확인하고 xPONENT software로 분석하였다.
이에 따른, 안전성 평가는 2주간의 단회투여독성시험 및 8주간 반복투여 시험에서 임상증상 및 이상지표 미발현 시 안전하는가를 평가하고, 면역학적 유효성 평가는 8주간 반복투여 후, 면역학적 유효성 평가지표 중 1가지 이상에서 대조군에 비해 유의적인 (95% 신뢰수준) 개선효과를 보이거나 0-10% 이내의 정량적 수치의 개선이 보일 시 면역학적 유효성이 있는가를 평가한다.
하기에서는 시험 결과를 나타낸 것으로, 단회경구투여 독성시험에 건강한 비글견 3마리, 반복투여 안전성 및 유효성 시험에 건강한 비글견 9마리가 사용되었으며, 각 시험에 사용된 시험동물의 기본정보는 표 4 및 표 5에 나타낸 것으로, 표 4는 단회 경구 투여 독성시험 참여 동물 기본정보이고, 표 5는 반복 투여 평가시험 참여 동물 기본정보이다.
동물 종 (계통) Dog / Beagle
공급원 JEONGEUP BREEDING CENTER, KOREA
COVANCE Research Products Inc., USA
성별 Male
동물수 3
개월령 26~29개월령
동물 종 (계통) Dog / Beagle
공급원 JEONGEUP BREEDING CENTER, KOREA
COVANCE Research Products Inc., USA
성별 Male
동물수 9
개월령 26~29개월령
하기의 표 6 내지 표 12는 단회경구투여 독성시험 결과를 나타낸 것으로, 단회 경구투여 이후 2주동안 관찰 결과 체중, 체온, 심박수, 호흡수를 관찰한 결과 모두 정상범위 내로 확인되었다. 또한 전혈구 검사, 혈액 화학 검사, 말초 혈액 내 백혈구 감별계산, 단백 및 지질단백 전기영동, 뇨검사 결과 모두 시험 기간 동안 정상 범위 내에 존재하였다.
하기 표 6은 단회 경구투여 독성시험에 참여한 개의 신체검사 결과를 나타낸 것이다.
고용량1 D0 D1 D3 D7 D14 단위 reference
체중 10.2 10.2 10.6 11.6 11.5 Kg
체온 38.4 38.2 38.2 38.4 38.3 ℃ 37.8-39.1
심박수 132 126 126 138 128 /min 80-160
호흡수 30 30 30 30 30 /min <40
고용량2 D0 D1 D3 D7 D14 단위 reference
체중 10.1 10.1 10.4 11.3 11.4 Kg
체온 38.6 38.8 38.1 38.5 38.4 ℃ 37.8-39.1
심박수 126 132 126 126 132 /min 80-160
호흡수 36 30 30 30 30 /min <40
고용량3 D0 D1 D3 D7 D14 단위 reference
체중 10.3 10.2 10.3 10.8 10.6 Kg
체온 38.4 39.1 38.4 38.7 138.6 ℃ 37.8-39.1
심박수 138 126 132 126 128 /min 80-160
호흡수 30 30 36 36 36 /min <40
* 고용량1 = 500 mg/kg, 고용량2 = 1000 mg/kg, 고용량3 = 2000 mg/kg 투여
하기 표 7은 단회 경구 투여 독성시험에 참여한 개의 전혈구검사 결과를 나타낸 것이다.
고용량1 D0 D1 D3 D7 D14 단위 Reference
WBC 6.28 6.01 7.26 9.7 11.29 K/uL 5.2-13.9
RBC 8.08 8.65 6.75 7.66 8.66 M/mm³ 5.7-9.8
Hgb 18.9 20 16 19.3 20.4 g/dL 12.9-20.4
HCT 60.8 64.7 50.9 56.8 63.2 % 37.1-65.0
MCV 75.2 75.9 75.5 74.1 72.9 fl 58.8-76.2
MCH 23.3 23.1 23.7 24.1 23.5 pg 20.5-24.2
MCHC 31 31.5 31.4 33.9 32.3 g/dL 31.0-36.2
PLT 144 185 221 163 217 K/uL 143.3-400
고용량2 D0 D1 D3 D7 D14 단위 Reference
WBC 9.5 8.8 8.37 11.81 10.78 K/uL 5.2-13.9
RBC 8.65 9.35 6.78 7.08 9.06 M/mm³ 5.7-9.8
Hgb 20.2 20.3 15.8 15.8 20.4 g/dL 12.9-20.4
HCT 62.6 64.6 49.5 49.4 63.1 % 37.1-65.0
MCV 72.4 71.2 73 69.8 69.6 fl 58.8-76.2
MCH 23.3 21.7 23.4 22.4 22.5 pg 20.5-24.2
MCHC 32.2 31.4 32 32.1 32.3 g/dL 31.0-36.2
PLT 276 289 298 334 266 K/uL 143.3-400
고용량3 D0 D1 D3 D7 D14 단위 Reference
WBC 8.06 8.55 8.57 10.24 6.55 K/uL 5.2-13.9
RBC 8.15 9.41 7.96 7.82 6.86 M/mm³ 5.7-9.8
Hgb 17.9 20.4 18.1 16.8 15 g/dL 12.9-20.4
HCT 55.7 63.4 55.9 53.3 45.5 % 37.1-65.0
MCV 68.3 67.4 70.3 68.2 66.4 fl 58.8-76.2
MCH 22 21.7 22.7 21.4 21.9 pg 20.5-24.2
MCHC 32.2 32.2 32.3 31.4 33 g/dL 31.0-36.2
PLT 273 226 226 222 372 K/uL 143.3-400
* 고용량1 = 500 mg/kg,고용량2 = 1000 mg/kg, 고용량3 = 2000 mg/kg 투여.
WBC, white blood cell; RBC, red blood cell; Hgb, hemoglobin; HCT, hematocrit; MCV, mean corpuscular volume; MCH, mean corpuscular hemoglobin; MCHC, mean corpuscular hemoglobin concentration; PLT, platelet.
하기 표 8은 단회 경구 투여 독성 시험에 참여한 개의 혈액 화학 검사 결과를 나타낸 것이다.
고용량 1 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 단위 reference
TP 6.3 6.4 5.7 5.8 5.6 g/dL 5.4-7.4
ALB 2.7 2.7 2.5 2.6 2.5 g/dL 2.9-4.2
T.Bil 0 0 0 0 0 mg/dL 0-0.4
Glu 92 95 99 84 89 mg/dL 70-118
BUN 11.2 14.4 9.1 6.5 8.8 mg/dL 8.0-26.0
Creatinine 0.6 0.6 0.6 0.7 0.6 mg/dL 0.5-1.3
UA 0.2 0.2 0.3 0.2 0.2 mg/dL 0-2.0
AST 25 21 20 26 21 U/L 15-43
ALT 52 55 49 45 205 U/L 19-70
ALP 32 32 32 31 29 U/L 15-127
γ-GTP 6.1 6.1 5.3 5.8 5.9 U/L 0-6
LDH 48 46 69 124 67 U/L 0-200
CPK 77 72 101 190 99 U/L 46-320
Chol 165 177 164 150 152 mg/dL 135-345
TG 22 51 28 24 42 mg/dL 19-133
Amyl 664.4 586.7 577.1 726.7 614.9 U/L 180-900
Ca 10.4 10.2 10.1 10 9.9 mg/dL 7.8-12
Pi 5.6 5.2 4.6 4.6 3.8 mg/dL 3-6.2
Lipa 21 18 18 36 19 U/L 0-450
Glo 3.6 3.7 3.2 3.2 3.1 g/dL 2.3-4.4
Na 149.4 156.6 146.9 148.6 164.8 mmol/L 144-154
K 4.34 4.43 4.38 4.45 5.31 mmol/L 4.1-5.3
Cl 106.1 112.6 106.1 107.6 109.5 mmol/L 105-116
고용량 2 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 단위 reference
TP 6.9 6.6 5.8 6 6.1 g/dL 5.4-7.4
ALB 3 3 2.7 2.8 2.7 g/dL 2.9-4.2
T.Bil 0 0 0 0 0 mg/dL 0-0.4
Glu 92 99 106 79 93 mg/dL 70-118
BUN 16.4 18.2 10.3 10.3 11.7 mg/dL 8.0-26.0
Creatinine 0.7 0.7 0.6 0.7 0.6 mg/dL 0.5-1.3
UA 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 mg/dL 0-2.0
AST 20 26 18 21 18 U/L 15-43
ALT 94 92 64 46 43 U/L 19-70
ALP 52 46 47 45 40 U/L 15-127
γ-GTP 5 2.4 3.8 3.5 3.9 U/L 0-6
LDH 46 54 45 66 59 U/L 0-200
CPK 104 125 101 107 100 U/L 46-320
Chol 161 164 148 141 136 mg/dL 135-345
TG 26 54 50 25 38 mg/dL 19-133
Amyl 867.7 808.9 759.8 1122.5 970.5 U/L 180-900
Ca 10.4 10.6 9.7 10.3 10 mg/dL 7.8-12
Pi 5.5 5 3.9 4.2 4.1 mg/dL 3-6.2
Lipa 17 16 17 21 18 U/L 0-450
Glo 3.9 3.6 3.1 3.2 3.4 g/dL 2.3-4.4
Na 153.7 151.4 144 148.7 151.9 mmol/L 144-154
K 4.1 3.69 3.99 4.01 4.8 mmol/L 4.1-5.3
Cl 109.2 107.5 107.3 108.1 107.5 mmol/L 105-116
고용량 3 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 단위 reference
TP 5.4 5.4 5.6 5.8 5.6 g/dL 5.4-7.4
ALB 2.7 2.7 2.8 2.9 2.7 g/dL 2.9-4.2
T.Bil 0 0 0 0 0 mg/dL 0-0.4
Glu 95 97 98 88 93 mg/dL 70-118
BUN 13.6 11.5 11.3 10.5 12.2 mg/dL 8.0-26.0
Creatinine 0.6 0.6 0.6 0.7 0.6 mg/dL 0.5-1.3
UA 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 mg/dL 0-2.0
AST 120 36 27 29 27 U/L 15-43
ALT 226 184 134 87 78 U/L 19-70
ALP 40 38 44 44 41 U/L 15-127
γ-GTP 5.3 4.5 3.2 5.4 5.2 U/L 0-6
LDH 57 51 106 192 181 U/L 0-200
CPK 105 101 141 161 173 U/L 46-320
Chol 110 121 138 136 126 mg/dL 135-345
TG 20 24 38 27 37 mg/dL 19-133
Amyl 609.9 582.1 639.3 685.7 669.4 U/L 180-900
Ca 9.4 9.4 9.5 9.8 9.6 mg/dL 7.8-12
Pi 4.6 4.6 4.7 4.1 3.5 mg/dL 3-6.2
Lipa 27 22 24 22 21 U/L 0-450
Glo 2.7 2.7 2.8 2.9 2.9 g/dL 2.3-4.4
Na 145.8 146.2 146.2 148.8 151.2 mmol/L 144-154
K 4.5 4.48 4.57 4.62 4.69 mmol/L 4.1-5.3
Cl 107.2 107.4 105.3 108 107.5 mmol/L 105-116
고용량1 = 500 mg/kg,고용량2 = 1000 mg/kg, 고용량3 = 2000 mg/kg 투여.
TP, total protein; ALB, albumin; T.Bil, total bilirubin; Glu, glucose; BUN, blood urea nitrogen; UA, uric acid; AST, aspartate transaminase; ALT, alanine aminotransferase; ALP, alkaline phosphatase; γ-GTP, gamma-glutamyltranspeptidase; LDH,lactatedehydrogenase; CPK,creatine phosphokinase; Chol, cholesterol; TG, triglyceride; Ca, calcium; Pi, phosphate; Lipa, lipase; Glo, globulin; Na, sodium; K, potassium; Cl, chloride.
하기 표 9는 단회 경구 투여 독성 시험에 참여한 개의 말초 혈액 내 백혈구 감별 계산 결과를 나타낸 것이다.
고용량 1 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 단위 Reference
Nph (seg) 75 60 59 61 77 % 50~77
Nph (band) 0 2 1 2 0 % 0~3
LYM 15 26 31 30 22 % 12~35
MONO 10 11 4 6 1 % 3~10
EOS 0 1 5 1 0 % 0~10
PLT 7 13 10 11 22 /OIF 13~30
고용량 2 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 단위 Reference
Nph (seg) 58 64 62 79 63 % 50~77
Nph (band) 2 0 0 2 2 % 0~3
LYM 25 26 29 13 32 % 12~35
MONO 8 5 3 6 3 % 3~10
EOS 7 5 6 0 0 % 0~10
PLT 16 20 21 16 16 /OIF 13~30
고용량 3 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 단위 Reference
Nph (seg) 71 62 60 71 52 % 50~77
Nph (band) 2 0 0 0 0 % 0~3
LYM 12 23 28 20 36 % 12~35
MONO 7 6 3 2 3 % 3~10
EOS 8 9 9 6 9 % 0~10
PLT 16 11 15 21 13 /OIF 13~30
고용량1 = 500 mg/kg,고용량2 = 1000 mg/kg, 고용량3 = 2000 mg/kg 투여.
Nph(seg), segmented neutrophil; Neu(band), band neutrophil; LYM, lymphocyte; MONO, monocyte; EOS, eosinophil; PLT, platelet.
하기 표 10은 단회 경구 투여 독성시험에 참여한 개의 단백질 전기영동결과를 나타낸 것이다.
고용량 1 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 단위 Reference
ALBUMIN 3.37 3.36 3.12 3.26 3.12 g/dL 2.7-3.7
ALPHA 1 0.25 0.26 0.25 0.26 0.34 g/dL 0.25-0.60
ALPHA 2 1.03 1.02 0.98 0.88 0.82 g/dL 0.72-1.40
BETA 0.67 0.67 0.69 0.65 0.63 g/dL 0.63-0.89
GAMMA 0.83 0.82 0.79 0.79 0.82 g/dL 0.50-0.83
Total 6.5 6.5 6 6 6 g/dL 5.4-7.4
고용량 2 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 단위 Reference
ALBUMIN 3.62 3.67 3.32 3.35 3.45 g/dL 2.7-3.7
ALPHA 1 0.26 0.25 0.26 0.25 0.27 g/dL 0.25-0.60
ALPHA 2 0.92 0.88 0.78 0.79 0.92 g/dL 0.72-1.40
BETA 0.67 0.64 0.66 0.66 0.63 g/dL 0.63-0.89
GAMMA 0.83 0.77 0.83 0.75 0.83 g/dL 0.50-0.83
Total 7.1 6.8 5.9 6.1 6.6 g/dL 5.4-7.4
고용량 3 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 단위 Reference
ALBUMIN 3.47 3.25 3.43 3.59 3.59 g/dL 2.7-3.7
ALPHA 1 0.26 0.27 0.25 0.26 0.26 g/dL 0.25-0.60
ALPHA 2 0.72 0.73 0.83 0.76 0.78 g/dL 0.72-1.40
BETA 0.69 0.63 0.69 0.69 0.64 g/dL 0.63-0.89
GAMMA 0.82 0.89 0.81 0.83 0.78 g/dL 0.50-0.83
Total 5.6 5.5 5.9 5.9 5.9 g/dL 5.4-7.4
고용량1 = 500 mg/kg,고용량2 = 1000 mg/kg, 고용량3 = 2000 mg/kg 투여.
ALPHA1, alpha1 globulin; ALPHA2, alpha2 globulin; BETA, beta globulin; GaMMA, gamma globulin.
하기 표 11은 단회 경구 투여 독성 시험에 참여한 개의 지질단백질 전기영동결과를 나타낸 것이다.
고용량 1 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 단위 Reference
ALPHA 133.7 137.93 137.75 138.78 141.95 mg/dL 60-140
Pre-Beta 0 0 0 0 0 mg/dL
BETA 21.23 21.07 19.25 24.22 23.05 mg/dL <25
Chylomicron 0 0 0 0 0 mg/dL
Cholesterol 180 192 176 157 166 mg/dL 135-345
Triglyceride 19 47 21 26 39 mg/dL 19-133
고용량 2 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 단위 Reference
ALPHA 131.09 110.68 128.52 134.48 137.73 mg/dL 60-140
Pre-Beta 0 0 32.64 0 0 mg/dL
BETA 5.91 18.32 20.8 23.52 19.27 mg/dL <25
Chylomicron 0 0 0 0 0 mg/dL
Cholesterol 174 176 156 149 151 mg/dL 135-345
Triglyceride 23 53 48 19 36 mg/dL 19-133
고용량 3 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14 단위 Reference
ALPHA 121.03 133.2 131.36 134.3 131.67 mg/dL 60-140
Pre-Beta 0 0 0 0 0 mg/dL
BETA 11.97 14.8 24.64 23.7 19.33 mg/dL <25
Chylomicron 0 0 0 0 0 mg/dL
Cholesterol 141 139 147 143 140 mg/dL 135-345
Triglyceride 22 19 29 25 31 mg/dL 19-133
* 고용량1 = 500 mg/kg,고용량2 = 1000 mg/kg, 고용량3 = 2000 mg/kg 투여.
하기 표 12는 단회 경구 투여 독성 시험에 참여한 개의 지질단백질 뇨 검사 결과를 나타낸 것이다.
고용량 1 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14
USG 1.06 1.066 1.058 1.042 1.06
pH 6 6 6 7 6
LEU neg neg neg neg neg
PRO 1+ 1+ 2+ 2+ 1+
BIL neg neg neg neg neg
ERY 1+ neg 1+ neg neg
고용량 2 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14
USG 1.067 1.057 1.057 1.05 1.06
pH 6 7 5 6 6
LEU neg neg neg neg neg
PRO 1+ 2+ 1+ neg neg
BIL neg neg neg neg neg
ERY 1+ 1+ 1+ neg neg
고용량 3 Day 0 Day 1 Day 3 Day 7 Day 14
USG 1.055 1.035 1.035 1.06 1.065
pH 6 5 6 7 6
LEU neg 1+ neg neg neg
PRO neg 1+ 1+ neg 1+
BIL neg neg neg neg neg
ERY 1+ 1+ 1+ 1+ neg
고용량1 = 500 mg/kg,고용량2 = 1000 mg/kg, 고용량3 = 2000 mg/kg 투여.
USG, urine specific gravity; pH, potential of hydrogen; LEU, leukocyte; PRO, protein; BIL, bilirubin; ERY, erythrocyte.
하기의 표 13 내지 표 18은 반복투여를 통한 안정성 시험 결과를 나타낸 것으로, 총 9 마리의 시험견에게 8주간 생리식염수 혹은 시험물질을 반복투여하여 신체검사와 전혈구검사, 혈액 화학검사, 단백질 및 지질단백 전기영동 검사, 뇨검사를 실시하였다. 모든 수치는 시험 기간 동안 정상범위 내에 존재하였으며, 시험물질 투여에 의한 것으로 생각되는 이상수치는 관찰되지 않았다.
하기 표 13은 반복투여 안전성 평가시험에 참여한 개의 신체검사 결과를 나타낸 것이다.
대조군 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
체중 10.07 ± 0.12 10.93 ± 0.21 11.27 ± 0.21 11.20 ± 0.35 11.63 ± 0.46 Kg
체온 38.20 ± 0.10 38.30 ± 0.20 38.53 ± 0.15 38.50 ± 0.10 38.37 ± 0.21 ℃ 37.8-39.1
심박수 134.00 ± 3.46 130.00 ± 3.46 128.00 ± 3.46 128.00 ± 3.46 136.00 ± 3.46 /min 80-160
호흡수 34.00 ± 3.46 32.00 ± 3.46 32.00 ± 3.46 32.00 ± 3.46 34.00 ± 3.46 /min <40
투여군1 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
체중 9.70 ± 0.20 10.93 ± 0.21 11.43 ± 0.35 11.60 ± 0.56 12.20 ± 0.46 Kg
체온 38.40 ± 0.26 38.30 ± 0.26 38.63 ± 0.12 38.50 ± 0.10 38.27 ± 0.15 ℃ 37.8-39.1
심박수 132.00 ± 6.00 134.00 ± 6.93 132.00 ± 6.00 132.00 ± 6.00 130.00 ± 3.46 /min 80-160
호흡수 32.00 ± 3.46 32.00 ± 3.46 34.00 ± 3.46 34.00 ± 3.46 32.00 ± 3.46 /min <40
투여군2 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
체중 9.70 ± 0.26 10.87 ± 0.29 11.43 ± 0.31 11.20 ± 0.56 11.87 ± 0.23 Kg
체온 38.30 ± 0.26 38.40 ± 0.10 38.40 ± 0.20 38.37 ± 0.15 38.50 ± 0.20 ℃ 37.8-39.1
심박수 128.00 ± 3.46 128.00 ± 3.46 132.00 ± 6.00 134.00 ± 6.93 132.00 ± 6.00 /min 80-160
호흡수 34.00 ± 3.46 34.00 ± 3.46 34.00 ± 3.46 30.00 ± 0.00 34.00 ± 3.46 /min <40
평균 ± 표준편차로 표기
대조군 = 생리식염수, 투여군1 = 1g/5Kg, 투여군2 = 5g/5Kg 투여
하기 표 14는 반복투여 안전성 평가시험에 참여한 개의 전 혈구 검사 결과를 나타낸 것이다.
대조군 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
WBC 8.05 ± 2.31 8.55 ± 2.06 7.00 ± 0.38 6.53 ± 0.42 7.97 ± 1.49 K/uL 5.2-13.9
RBC 7.47 ± 1.12 6.94 ± 0.97 7.37 ± 1.08 8.27 ± 0.29 8.23 ± 0.70 M/mm³ 5.7-9.8
Hgb 17.27 ± 2.64 15.93 ± 2.41 16.83 ± 2.14 18.50 ± 0.75 18.70 ± 1.35 g/dL 12.9-20.4
HCT 53.87 ± 8.56 48.93 ± 7.52 53.27 ± 7.44 58.77 ± 3.69 59.23 ± 5.70 % 37.1-65.0
MCV 72.10 ± 1.99 70.53 ± 2.63 72.37 ± 2.49 71.07 ± 2.62 72.03 ± 2.74 fl 58.8-76.2
MCH 23.13 ± 0.29 22.97 ± 1.02 22.87 ± 0.70 22.40 ± 0.75 22.73 ± 1.07 pg 20.5-24.2
MCHC 32.03 ± 0.49 32.57 ± 0.38 31.60 ± 0.52 31.50 ± 0.85 31.57 ± 0.85 g/dL 31.0-36.2
PLT 250.67 ± 58.52 273.00 ± 36.66 233.67 ± 20.40 226.67 ± 17.90 202.33 ± 35.23 K/uL 143.3-400
투여군1 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
WBC 5.73 ± 1.25 7.04 ± 1.80 7.19 ± 0.63 6.25 ± 0.80 8.70 ± 0.30 K/uL 5.2-13.9
RBC 7.93 ± 0.43 7.88 ± 0.66 7.24 ± 0.39 7.69 ± 0.41 7.00 ± 0.37 M/mm³ 5.7-9.8
Hgb 17.97 ± 1.53 17.97 ± 1.89 16.57 ± 1.18 17.57 ± 1.20 16.10 ± 1.01 g/dL 12.9-20.4
HCT 56.93 ± 4.22 55.03 ± 5.92 50.77 ± 2.75 54.33 ± 3.17 49.67 ± 3.15 % 37.1-65.0
MCV 71.70 ± 1.37 69.67 ± 1.65 70.20 ± 2.52 70.63 ± 1.25 70.97 ± 1.00 fl 58.8-76.2
MCH 22.60 ± 0.69 22.73 ± 0.49 22.87 ± 0.51 22.80 ± 0.66 22.97 ± 0.55 pg 20.5-24.2
MCHC 31.53 ± 0.45 32.63 ± 0.15 32.60 ± 1.32 32.27 ± 0.47 32.37 ± 0.32 g/dL 31.0-36.2
PLT 200.00 ± 23.39 238.00 ± 76.96 235.33 ± 7.64 257.67 ± 58.53 274.00 ± 21.66 K/uL 143.3-400
투여군2 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
WBC 6.29 ± 0.79 8.31 ± 4.24 7.07 ± 1.19 5.87 ± 1.19 10.18 ± 3.92 K/uL 5.2-13.9
RBC 8.30 ± 0.14 6.51 ± 0.45 6.52 ± 0.41 7.71 ± 0.88 6.56 ± 0.40 M/mm³ 5.7-9.8
Hgb 18.57 ± 0.81 14.80 ± 1.42 14.80 ± 1.22 17.00 ± 1.71 14.97 ± 1.21 g/dL 12.9-20.4
HCT 60.63 ± 1.57 45.80 ± 3.67 46.10 ± 3.32 54.80 ± 6.70 46.53 ± 3.11 % 37.1-65.0
MCV 73.07 ± 0.64 70.30 ± 1.01 70.63 ± 0.72 70.97 ± 1.29 70.93 ± 0.55 fl 58.8-76.2
MCH 22.40 ± 0.70 22.70 ± 0.62 22.63 ± 0.60 22.07 ± 0.76 22.80 ± 0.62 pg 20.5-24.2
MCHC 30.63 ± 0.72 32.30 ± 0.56 32.07 ± 0.50 31.13 ± 0.91 32.17 ± 0.65 g/dL 31.0-36.2
PLT 254.33 ± 37.61 200.67 ± 150.98 287.33 ± 30.89 238.67 ± 21.13 309.33 ± 39.25 K/uL 143.3-400
대조군 = 생리식염수, 투여군1 = 1g/5Kg, 투여군2 = 5g/5Kg 투여
WBC, white blood cell; RBC, red blood cell; Hgb, hemoglobin; HCT, hematocrit; MCV, mean corpuscular volume; MCH, mean corpuscular hemoglobin; MCHC, mean corpuscular hemoglobin concentration; PLT, platelet.
하기 표 15는 반복투여 안전성 평가시험에 참여한 개의 혈액 화학 검사 결과를 나타낸 것이다.
대조군 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
TP 6.03 ± 0.21 5.80 ± 0.26 5.93 ± 0.49 6.10 ± 0.10 6.07 ± 0.12 g/dL 5.4-7.4
ALB 2.77 ± 0.06 2.80 ± 0.17 3.03 ± 0.35 3.20 ± 0.00 3.33 ± 0.23 g/dL 2.9-4.2
T.Bil 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 mg/dL 0-0.4
Glu 82.00 ± 1.00 91.67 ± 1.53 81.33 ± 12.01 80.00 ± 4.58 89.00 ± 2.00 mg/dL 70-118
BUN 10.33 ± 0.47 13.10 ± 3.05 12.93 ± 1.36 11.17 ± 1.61 14.07 ± 2.05 mg/dL 8.0-26.0
CRE 0.70 ± 0.10 0.60 ± 0.10 0.67 ± 0.12 0.67 ± 0.06 0.67 ± 0.06 mg/dL 0.5-1.3
UA 0.27 ± 0.06 0.23 ± 0.06 0.30 ± 0.00 0.27 ± 0.06 0.30 ± 0.00 mg/dL 0-2.0
AST 25.67 ± 4.16 25.00 ± 3.61 33.33 ± 5.69 24.33 ± 2.08 38.67 ± 7.77 U/L 15-43
ALT 67.33 ± 15.89 69.33 ± 10.69 66.00 ± 12.49 68.00 ± 13.08 63.33 ± 17.79 U/L 19-70
ALP 26.67 ± 2.52 26.67 ± 4.73 31.67 ± 9.02 22.67 ± 4.51 18.00 ± 5.29 U/L 15-127
γ-GTP 3.87 ± 0.96 3.93 ± 0.81 4.00 ± 1.25 3.47 ± 0.32 3.70 ± 0.72 U/L 0-6
LDH 109.33 ± 50.05 70.00 ± 26.51 199.33 ± 15.89 83.33 ± 18.50 82.33 ± 16.26 U/L 0-200
CPK 141.00 ± 81.80 103.33 ± 10.41 183.00 ± 30.27 111.33 ± 14.64 117.00 ± 17.09 U/L 46-320
Chol 113.33 ± 21.22 122.33 ± 17.62 126.33 ± 14.50 119.00 ± 21.66 108.67 ± 20.43 mg/dL 135-345
TG 29.00 ± 3.46 28.00 ± 4.58 35.00 ± 3.46 26.67 ± 1.15 22.00 ± 1.73 mg/dL 19-133
Amyl 856.43 ± 214.31 1020.53 ± 177.27 880.47 ± 285.80 840.30 ± 183.67 983.10 ± 225.82 U/L 180-900
Ca 10.10 ± 0.10 9.83 ± 0.25 9.93 ± 0.42 9.77 ± 0.15 9.83 ± 0.15 mg/dL 7.8-12
Pi 5.20 ± 0.87 3.90 ± 0.17 3.63 ± 0.15 3.67 ± 0.42 3.83 ± 0.25 mg/dL 3-6.2
Lipa 17.67 ± 7.37 17.33 ± 14.43 20.00 ± 7.55 21.33 ± 15.01 28.33 ± 7.09 U/L 0-450
Glo 3.27 ± 0.25 3.20 ± 0.10 2.90 ± 0.20 2.90 ± 0.10 2.73 ± 0.12 g/dL 2.3-4.4
Na 148.37 ± 0.72 152.53 ± 3.30 150.87 ± 1.33 145.53 ± 2.05 144.23 ± 0.67 mmol/L 144-154
K 4.65 ± 0.38 4.77 ± 0.31 4.52 ± 0.48 4.38 ± 0.50 4.57 ± 0.52 mmol/L 4.1-5.3
Cl 109.53 ± 0.06 109.67 ± 1.68 107.87 ± 1.00 112.47 ± 1.21 111.07 ± 0.93 mmol/L 105-116
투여군2 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
TP 5.47 ± 0.38 5.63 ± 0.25 5.93 ± 0.25 6.07 ± 0.31 5.73 ± 0.40 g/dL 5.4-7.4
ALB 2.70 ± 0.00 3.40 ± 0.10 2.90 ± 0.17 3.10 ± 0.17 3.00 ± 0.20 g/dL 2.9-4.2
T.Bil 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 mg/dL 0-0.4
Glu 89.00 ± 3.00 90.33 ± 9.07 73.00 ± 5.29 91.67 ± 9.50 94.33 ± 7.64 mg/dL 70-118
BUN 20.30 ± 6.02 12.37 ± 0.57 11.13 ± 0.95 14.00 ± 2.70 11.50 ± 3.60 mg/dL 8.0-26.0
CRE 0.67 ± 0.06 0.60 ± 0.00 0.60 ± 0.00 0.70 ± 0.00 0.60 ± 0.10 mg/dL 0.5-1.3
UA 0.30 ± 0.00 0.23 ± 0.06 0.33 ± 0.06 0.27 ± 0.06 0.37 ± 0.06 mg/dL 0-2.0
AST 40.00 ± 9.54 22.33 ± 4.16 34.67 ± 7.77 26.33 ± 6.66 34.00 ± 7.21 U/L 15-43
ALT 58.00 ± 23.07 41.67 ± 29.84 35.67 ± 12.50 53.00 ± 21.17 48.67 ± 21.22 U/L 19-70
ALP 20.33 ± 7.51 27.33 ± 11.68 27.00 ± 7.94 22.67 ± 4.73 19.33 ± 5.86 U/L 15-127
γ-GTP 5.17 ± 0.45 4.43 ± 0.25 4.20 ± 0.26 4.17 ± 0.60 4.33 ± 0.68 U/L 0-6
LDH 126.33 ± 33.38 50.00 ± 9.85 155.33 ± 58.48 51.00 ± 4.36 52.33 ± 8.50 U/L 0-200
CPK 125.67 ± 31.37 92.00 ± 26.51 179.67 ± 51.94 101.33 ± 19.60 111.00 ± 21.17 U/L 46-320
Chol 126.33 ± 27.50 153.33 ± 41.48 145.00 ± 37.64 141.33 ± 44.74 115.67 ± 29.96 mg/dL 135-345
TG 25.33 ± 1.15 30.33 ± 7.02 28.00 ± 14.73 26.33 ± 3.79 21.67 ± 6.11 mg/dL 19-133
Amyl 985.93 ± 752.16 834.60 ± 360.40 830.43 ± 293.95 1698.1± 1803.27 853.73 ± 412.08 U/L 180-900
Ca 9.90 ± 0.10 9.50 ± 0.20 9.77 ± 0.25 9.70 ± 0.35 9.60 ± 0.17 mg/dL 7.8-12
Pi 5.40 ± 0.36 3.63 ± 0.45 3.37 ± 0.32 3.47 ± 0.38 3.37 ± 0.15 mg/dL 3-6.2
Lipa 33.33 ± 23.80 15.00 ± 5.29 15.33 ± 3.79 47.00 ± 40.85 28.67 ± 7.57 U/L 0-450
Glo 2.77 ± 0.38 3.23 ± 0.21 3.03 ± 0.40 2.97 ± 0.38 2.73 ± 0.51 g/dL 2.3-4.4
Na 152.57 ± 3.40 150.17 ± 0.47 151.40 ± 0.17 148.93 ± 4.19 143.80 ± 0.92 mmol/L 144-154
K 4.86 ± 0.33 4.64 ± 0.18 4.24 ± 0.29 4.60 ± 0.06 4.46 ± 0.16 mmol/L 4.1-5.3
Cl 113.83 ± 2.86 109.27 ± 0.45 109.37 ± 0.29 115.67 ± 3.20 111.03 ± 1.42 mmol/L 105-116
대조군 = 생리식염수, 투여군1 = 1g/5Kg, 투여군2 = 5g/5Kg 투여.
TP, total protein; ALB, albumin; T.Bil, total bilirubin; Glu, glucose; BUN, blood urea nitrogen; CRE, creatinine; UA, uric acid; AST, aspartate transaminase; ALT, alanine aminotransferase; ALP, alkaline phosphatase; γ-GTP,gamma-glutamyltranspeptidase;LDH,lactatedehydrogenase;CPK,creatine phosphokinase; Chol, cholesterol; TG, triglyceride; Amyl, amylase; Ca, calcium; Pi, phosphate; Lipa, lipase; Glo, globulin; Na, sodium; K, potassium; Cl, chloride.
하기 표 16은 반복투여 안전성 평가시험에 참여한 개의 단백질 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
대조군 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
ALBUMIN 3.53 ± 0.17 3.26 ± 0.15 3.41 ± 0.29 3.53 ± 0.06 3.48 ± 0.07 g/dL 2.7-3.7
ALPHA 1 0.23 ± 0.01 0.31 ± 0.04 0.25 ± 0.01 0.25 ± 0.02 0.24 ± 0.03 g/dL 0.25-0.60
ALPHA 2 0.71 ± 0.12 0.82 ± 0.10 0.76 ± 0.05 0.73 ± 0.06 0.68 ± 0.07 g/dL 0.72-1.40
BETA 0.67 ± 0.21 0.71 ± 0.12 0.64 ± 0.02 0.61 ± 0.06 0.63 ± 0.07 g/dL 0.63-0.89
GAMMA 1.23 ± 0.05 1.24 ± 0.06 1.18 ± 0.09 1.14 ± 0.02 1.11 ± 0.08 g/dL 0.50-1.83
Total Protein 6.37 ± 0.25 6.33 ± 0.06 6.23 ± 0.32 6.27 ± 0.06 6.13 ± 0.06 g/dL 5.4-7.4
투여군1 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
ALBUMIN 3.63 ± 0.30 3.31 ± 0.14 3.49 ± 0.17 3.54 ± 0.22 3.38 ± 0.14 g/dL 2.7-3.7
ALPHA 1 0.22 ± 0.04 0.28 ± 0.01 0.25 ± 0.03 0.24 ± 0.02 0.27 ± 0.01 g/dL 0.25-0.60
ALPHA 2 0.84 ± 0.11 0.86 ± 0.06 0.85 ± 0.12 0.74 ± 0.01 0.71 ± 0.05 g/dL 0.72-1.40
BETA 0.73 ± 0.15 0.67 ± 0.10 0.69 ± 0.16 0.67 ± 0.10 0.64 ± 0.06 g/dL 0.63-0.89
GAMMA 1.55 ± 0.37 1.57 ± 0.30 1.55 ± 0.35 1.41 ± 0.31 1.42 ± 0.27 g/dL 0.50-1.83
Total Protein 6.97 ± 0.55 6.70 ± 0.44 6.83 ± 0.67 6.60 ± 0.26 6.43 ± 0.25 g/dL 5.4-7.4
투여군2 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
ALBUMIN 3.50 ± 0.12 3.06 ± 0.19 3.19 ± 0.33 3.42 ± 0.15 3.24 ± 0.27 g/dL 2.7-3.7
ALPHA 1 0.25 ± 0.02 0.25 ± 0.03 0.27 ± 0.01 0.22 ± 0.02 0.25 ± 0.01 g/dL 0.25-0.60
ALPHA 2 0.79 ± 0.15 0.86 ± 0.14 0.77 ± 0.06 0.71 ± 0.12 0.66 ± 0.15 g/dL 0.72-1.40
BETA 0.60 ± 0.11 0.63 ± 0.13 0.63 ± 0.15 0.60 ± 0.17 0.59 ± 0.20 g/dL 0.63-0.89
GAMMA 1.27 ± 0.23 1.20 ± 0.30 1.41 ± 0.44 1.31 ± 0.34 1.26 ± 0.35 g/dL 0.50-1.83
Total Protein 6.40 ± 0.35 6.00 ± 0.30 6.27 ± 0.35 6.27 ± 0.38 6.00 ± 0.40 g/dL 5.4-7.4
대조군 = 생리식염수, 투여군1 = 1g/5Kg, 투여군2 = 5g/5Kg 투여.
ALPHA1, alpha1 globulin; ALPHA2, alpha2 globulin; BETA, beta globulin; GaMMA, gamma globulin.
하기 표 17은 반복투여 안전성 평가시험에 참여한 개의 지질단백질 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
대조군 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
ALPHA 116.44 ± 24.51 127.75 ± 24.71 114.24 ± 27.09 115.03 ± 24.37 113.07 ± 21.37 mg/dL 60-140
Pre-Beta 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 mg/dL
BETA 18.65 ± 3.56 33.78 ± 6.49 27.09 ± 8.43 27.64 ± 2.55 14.26 ± 0.92 mg/dL <25
Chylomicron 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 mg/dL
Cholesterol 123.33 ± 24.83 138.67 ± 24.34 125.00 ± 23.07 129.00 ± 24.43 114.67 ± 21.22 mg/dL 135-345
Triglyceride 11.33 ± 1.53 22.33 ± 6.66 16.33 ± 9.02 13.67 ± 1.53 12.67 ± 1.53 mg/dL 19-133
투여군1 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
ALPHA 143.79 ± 40.26 129.15 ± 24.84 114.97 ± 20.95 115.52 ± 16.62 113.66 ± 21.32 mg/dL 60-140
Pre-Beta 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 mg/dL
BETA 28.88 ± 13.03 36.18 ± 4.85 39.37 ± 4.27 28.48 ± 6.71 16.00 ± 3.59 mg/dL <25
Chylomicron 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 mg/dL
Cholesterol 153.00 ± 38.59 143.00 ± 30.61 136.67 ± 24.58 130.33 ± 20.26 117.67 ± 22.19 mg/dL 135-345
Triglyceride 19.67 ± 15.95 22.33 ± 4.04 17.67 ± 5.13 13.67 ± 4.93 12.00 ± 5.00 mg/dL 19-133
투여군2 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
ALPHA 127.17 ± 22.85 157.16 ± 40.58 133.21 ± 34.79 135.63 ± 48.34 112.74 ± 32.67 mg/dL 60-140
Pre-Beta 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 mg/dL
BETA 29.44 ± 9.94 39.18 ± 4.87 34.25 ± 2.39 31.70 ± 0.88 20.26 ± 3.56 mg/dL <25
Chylomicron 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 mg/dL
Cholesterol 137.67 ± 31.53 169.00 ± 43.21 152.67 ± 37.86 152.00 ± 47.47 122.33 ± 30.66 mg/dL 135-345
Triglyceride 18.33 ± 7.02 27.33 ± 6.81 14.33 ± 4.93 15.33 ± 1.15 10.67 ± 3.06 mg/dL 19-133
대조군 = 생리식염수, 투여군1 = 1g/5Kg, 투여군2 = 5g/5Kg 투여.
하기 표 18은 반복투여 안전성 평가시험에 참여한 개의 뇨검사 결과를 나타낸 것이다.
대조군 D0 D14 D28 D42 D56
USG 1.05 ± 0.02 1.02 ± 0.00 1.03 ± 0.01 1.04 ± 0.01 1.03 ± 0.00
pH 6.33 ± 0.58 7.33 ± 0.58 8.33 ± 0.58 7.67 ± 0.58 8.00 ± 1.00
LEU neg neg neg neg neg
PRO neg neg 1+　 1+ 1+
투여군1 D0 D14 D28 D42 D56
USG 1.06 ± 0.01 1.03 ± 0.01 1.03 ± 0.01 1.04 ± 0.01 1.03 ± 0.01
pH 6.67 ± 1.15 8.33 ± 0.58 9.00 ± 0.00 7.67 ± 0.58 8.33 ± 0.58
LEU neg neg neg neg neg
PRO 1+ 1+ 1+ 1+ 1+
투여군2 D0 D14 D28 D42 D56
USG 1.05 ± 0.01 1.02 ± 0.01 1.02 ± 0.01 1.05 ± 0.02 1.02 ± 0.01
pH 5.67 ± 1.15 8.00 ± 1.00 9.00 ± 0.00 8.00 ± 1.00 8.00 ± 1.00
LEU neg neg neg neg neg
PRO 1+ 1+ 1+ 1+ 1+
* 대조군 = 생리식염수, 투여군1 = 1g/5Kg, 투여군2 = 5g/5Kg 투여.
하기에는 반복투여를 통한 유효성 시험 결과를 나타낸 것으로, 이는 총 9 마리의 시험견에게 8주간 생리식염수 혹은 시험물질을 반복투여하고 면역력의 변화를 측정하기 위해 백혈구 감별계산, 유세포 분석, NK세포 활성도 및 혈중 사이토카인을 검사하고 분석하였다.
하기 표 19는 반복투여 유효성 평가시험에 참여한 개의 말초혈액 내 백혈구 감별계산 결과를 나타낸 것으로, 이는 백혈구 감별 계산을 통해 시험기간 동안 백혈구 종류별 세포 비율의 변화를 확인하였으며, 모든 종류의 백혈구에서 시험물질 투여 이후 유의적인 변화는 확인되지 않았다.
대조군 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
NE (Seg) 70.33 ± 8.50 69.00 ± 13.89 56.33 ± 9.29 52.00 ± 10.82 57.00 ± 10.54 % 50~77
NE (Band) 4.00 ± 3.46 1.33 ± 1.53 1.00 ± 1.73 0.33 ± 0.58 0.00 ± 0.00 % 0~3
LY 16.00 ± 3.61 21.67 ± 14.36 37.00 ± 11.27 41.33 ± 11.93 36.67 ± 9.29 % 12~35
MO 2.67 ± 1.15 4.00 ± 2.00 5.33 ± 2.52 2.33 ± 0.58 3.00 ± 1.00 % 3~10
EO 7.33 ± 5.51 3.33 ± 1.15 0.33 ± 0.58 4.00 ± 0.00 3.33 ± 4.16 % 0~10
PLT 16.67 ± 2.31 15.00 ± 5.29 16.33 ± 3.06 13.67 ± 2.31 20.67 ± 1.53 /OIF 13~30
투여군1 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
NE (Seg) 74.33 ± 12.66 48.00 ± 23.30 45.33 ± 23.46 66.33 ± 7.09 57.67 ± 10.26 % 50~77
NE (Band) 0.33 ± 0.58 2.67 ± 3.79 1.33 ± 2.31 0.33 ± 0.58 0.00 ± 0.00 % 0~3
LY 18.33 ± 7.37 35.00 ± 20.81 46.67 ± 24.13 25.67 ± 7.37 30.67 ± 6.11 % 12~35
MO 4.00 ± 2.00 6.67 ± 4.73 3.33 ± 1.53 4.67 ± 2.52 4.33 ± 2.52 % 3~10
EO 3.00 ± 3.00 7.67 ± 1.15 3.33 ± 0.58 2.67 ± 1.53 7.33 ± 2.08 % 0~10
PLT 12.67 ± 6.81 14.00 ± 4.58 17.00 ± 3.61 14.67 ± 1.53 17.00 ± 2.65 /OIF 13~30
투여군2 D0 D14 D28 D42 D56 단위 reference
NE (Seg) 71.33 ± 2.31 59.33 ± 11.02 58.67 ± 9.71 46.33 ± 13.32 67.67 ± 15.18 % 50~77
NE (Band) 3.00 ± 1.00 1.00 ± 1.00 1.67 ± 1.53 0.33 ± 0.58 0.00 ± 0.00 % 0~3
LY 19.67 ± 1.53 26.00 ± 11.14 35.67 ± 9.87 41.33 ± 4.62 25.00 ± 11.27 % 12~35
MO 2.00 ± 2.00 5.00 ± 5.29 3.33 ± 1.15 9.00 ± 9.17 3.33 ± 2.31 % 3~10
EO 4.00 ± 2.65 7.67 ± 4.73 1.00 ± 1.00 3.00 ± 2.65 4.33 ± 3.21 % 0~10
PLT 19.67 ± 5.69 11.33 ± 8.62 20.00 ± 2.65 17.33 ± 5.51 14.33 ± 1.15 /OIF 13~30
대조군 = 생리식염수, 투여군1 = 1g/5Kg, 투여군2 = 5g/5Kg 투여.
NE(seg), segmented neutrophil; NE(band), band neutrophil; LY, lymphocyte; MO, monocyte; EO, eosinophil; PLT, platelet
하기 표 20은 반복투여 유효성 평가시험에 참여한 개의 유세포 분석 결과를 나타낸 것으로, 이는 유세포 분석을 통해 B림프구, T림프구(보조, 세포독성), NK 세포 등 림프구 아집단의 비율을 확인하였으며, 유세포 분석 지표 중 NK 세포 (NK cell)의 비율이 0주차와 대비하여 대조군에서는 비슷하거나 감소하는 양상을 나타낸 반면 투여군1, 2에서 전반적으로 증가하는 양상이 확인되었다(첨부도면 도 1 참조). 8주차의 NK cell 개선율은 대조군에서 -45%, 투여군 1에서 175%, 투여군 2에서 48% 였다. 또한 세포독성 T 림프구 (Cytotoxic T cell)의 비율 역시 0주차와 대비하여 대조군에서는 비슷하거나 감소하는 양상을 나타낸 반면 투여군1, 2에서 전반적으로 증가하는 양상이 확인되었으며, 8주차에는 투여군 1에서만 0주차 대비 개선된 결과가 나타났다(첨부도면 도 2 참조). 8주차의 Cytotoxic T cell 개선율은 대조군에서 -11%, 투여군 1에서 17%, 투여군 2에서 -9% 였다.
대조군 D0 D14 D28 D42 D56 단위
Nk cell 6.29 ± 2.93 5.21 ± 4.12 7.23 ± 5.64 5.23 ± 4.08 3.85 ± 2.85 %
B cell 22.20 ± 6.77 27.00 ± 6.33 28.71 ± 12.80 26.07 ± 3.67 31.62 ± 9.06 %
T cell (immature) 64.49 ± 12.59 68.08 ± 6.62 67.90 ± 14.43 66.36 ± 3.28 60.62 ± 7.00 %
T cell (mature) 71.51 ± 5.17 67.88 ± 5.97 64.06 ± 16.67 68.70 ± 4.14 64.53 ± 7.45 %
Helper T 33.79 ± 1.06 34.91 ± 3.56 31.80 ± 7.35 32.19 ± 5.09 29.14 ± 2.73 %
Cytotoxic T 27.72 ± 3.68 27.01 ± 5.03 24.35 ± 8.66 25.62 ± 5.28 24.90 ± 5.43 %
투여군1 D0 D14 D28 D42 D56 단위
Nk cell 5.84 ± 2.43 6.92 ± 6.34 11.33 ± 4.50 7.61 ± 2.98 13.40 ± 2.19 %
B cell 16.16 ± 8.50 19.77 ± 7.55 19.92 ± 6.77 14.62 ± 3.17 14.51 ± 6.24 %
T cell (immature) 74.51 ± 9.21 72.81 ± 10.01 72.66 ± 7.83 74.92 ± 4.74 79.31 ± 6.38 %
T cell (mature) 78.00 ± 7.50 73.56 ± 9.75 68.75 ± 7.59 77.77 ± 1.66 72.09 ± 6.03 %
Helper T 38.59 ± 8.52 38.16 ± 6.54 34.49 ± 2.73 34.35 ± 5.86 27.03 ± 2.01 %
Cytotoxic T 27.29 ± 4.89 31.46 ± 4.63 26.10 ± 4.81 32.99 ± 7.69 30.57 ± 1.86 %
투여군2 D0 D14 D28 D42 D56 단위
Nk cell 13.07 ± 8.04 15.70 ± 17.66 22.55 ± 22.47 15.21 ± 16.85 23.05 ± 17.30 %
B cell 24.61 ± 12.22 23.72 ± 11.79 21.90 ± 10.50 21.81 ± 7.22 29.42 ± 18.97 %
T cell (immature) 50.99 ± 9.79 58.98 ± 3.37 47.57 ± 25.42 62.72 ± 7.76 52.73 ± 9.75 %
T cell (mature) 64.88 ± 12.81 60.58 ± 6.66 55.55 ± 12.03 62.98 ± 10.14 47.53 ± 17.93 %
Helper T 34.24 ± 10.34 33.65 ± 3.45 29.74 ± 6.13 32.61 ± 6.22 17.87 ± 8.08 %
Cytotoxic T 16.27 ± 5.27 20.49 ± 6.23 19.58 ± 7.09 21.90 ± 3.90 15.11 ± 7.34 %
전체 백혈구 중 비율 (%)로 표기.
대조군 = 생리식염수, 투여군1 = 1g/5Kg, 투여군2 = 5g/5Kg 투여.
첨부도면 도 1은 반복투여 유효성 평가에 참여한 개의 NK cell 개선율(0주차 대비)을 나타낸 그래프로서, NK 세포 (NK cell)의 비율이 0주차와 대비하여 대조군에서는 비슷하거나 감소하는 양상을 나타낸 반면 투여군1, 2에서 전반적으로 증가하는 양상이 확인되었다. 8주차의 NK cell 개선율은 대조군에서 -45%, 투여군 1에서 175%, 투여군 2에서 48% 였다.
또한, 첨부도면 도 2는 반복투여 유효성 평가에 참여한 개의 Cytotoxic T cell 변화량(0주차 대비)을 나타낸 그래프로서, 세포독성 T 림프구 (Cytotoxic T cell)의 비율이 0주차와 대비하여 대조군에서는 비슷하거나 감소하는 양상을 나타낸 반면 투여군1, 2에서 전반적으로 증가하는 양상이 확인되었다. 8주차의 Cytotoxic T cell 개선율은 대조군에서 -11%, 투여군 1에서 17%, 투여군 2에서 -9% 였다.
하기 표 21은 반복투여 유효성 평가시험에 참여한 개의 NK 세포 활성도 검사 결과를 나타낸 것으로, 이는 NK Vue kit (ATgen, Korea)를 사용하여 IFN-γ를 측정하고자 하였으며 이를 통해 NK 세포의 활성도를 분석하고자 하였고, 시험기간 중 NK 세포 활성도의 수치이며, NK 세포 활성도 지표에서는 시험기간 중 유의적인 변화가 확인되지 않았다.
NK세포 활성도 D0 D14 D28 D42 D56 단위
대조군 1645.03 ± 663.54 1467.93 ± 616.05 1315.53 ± 312.07 764.10 ± 255.10 578.40 ± 96.46 pg/ml
투여군1 2726.50 ± 1294.89 721.70 ± 282.89 950.30 ± 594.18 627.90 ± 283.90 352.40 ± 168.39 pg/ml
투여군2 2373.63 ± 1456.94 2158.37 ± 1925.51 2078.87 ± 1712.21 1388.40 ± 1238.43 616.50 ± 318.50 pg/ml
대조군 = 생리식염수, 투여군1 = 1g/5Kg, 투여군2 = 5g/5Kg 투여.
하기 표 22는 반복투여 유효성 평가시험에 참여한 개의 사이토카인 검사 결과를 나타낸 것으로, 이는 혈중 사이토카인 검사를 통해 인터루킨 (IL-2, IL-6, IL-8, IL-10), 인터페론 (IFN-γ), 종양괴사인자 (TNF-α)를 측정하였으며, IL-6의 경우, 혈중 농도가 매우 낮아 검출한계 (2.14 pg/ml) 보다 낮은 수치가 많은 수의 개체에서 확인되었다. TNF-α 의 경우 0주차와 대비하여 8주차에 투여군 1에서 기타 군에 비해 증가한 양상을 나타내었다(첨부도면 도 3 참조). 8주차의 TNF-α 개선율은 대조군에서 6%, 투여군 1에서 74%, 투여군 2에서 4%였다.
첨부도면 도 3은 반복투여 유효성 평가에 참여한 개의 혈중 TNF-α 변화량(0주차 대비)을 나타낸 그래프로서, 혈중 TNF-α 농도는 0주차와 대비하여 8주차에 투여군 1에서 기타 군에 비해 증가한 양상을 나타내었으며, 8주차의 TNF-α 개선율은 대조군에서 6%, 투여군 1에서 74%, 투여군 2에서 4% 였다.
대조군 D0 D14 D28 D42 D56 단위
IL-2 1.78 ± 0.16 1.88 ± 0.18 1.73 ± 0.12 1.60 ± 0.10 1.90 ± 0.27 pg/ml
IL-6 <2.14↓ 2.28 ± 0.24 3.97 ± 0.98 5.18 ± 3.44 <2.14↓ pg/ml
IL-8 20.69 ± 5.99 24.82 ± 11.71 23.71 ± 9.08 27.44 ± 12.64 17.18 ± 5.16 pg/ml
IL-10 6.42 ± 1.02 8.37 ± 1.34 7.91 ± 0.50 9.42 ± 1.40 7.06 ± 0.58 pg/ml
IFN-r 6.72 ± 0.76 5.87 ± 0.00 7.11 ± 0.76 7.70 ± 2.25 4.80 ± 0.93 pg/ml
TNF-a 11.03 ± 1.43 7.98 ± 1.69 13.44 ± 1.78 16.24 ± 2.05 11.20 ± 3.66 pg/ml
투여군1 D0 D14 D28 D42 D56 단위
IL-2 2.42 ± 0.30 1.74 ± 0.22 2.52 ± 0.36 2.05 ± 0.21 2.14 ± 0.32 pg/ml
IL-6 <2.14↓ <2.14↓ 2.42 ± 0.48 2.31 ± 0.30 <2.14↓ pg/ml
IL-8 22.89 ± 3.10 27.01 ± 10.01 28.73 ± 3.59 29.83 ± 12.38 16.40 ± 0.84 pg/ml
IL-10 6.79 ± 1.51 9.29 ± 1.88 7.45 ± 0.58 8.50 ± 1.66 11.38 ± 0.97 pg/ml
IFN-r 7.68 ± 0.75 6.74 ± 0.29 8.38 ± 0.38 6.27 ± 0.30 7.43 ± 1.44 pg/ml
TNF-a 9.98 ± 1.66 7.58 ± 0.70 10.62 ± 2.64 12.97 ± 1.27 17.15 ± 1.48 pg/ml
투여군2 D0 D14 D28 D42 D56 단위
IL-2 2.75 ± 0.34 2.01 ± 0.13 2.64 ± 0.19 2.07 ± 0.36 2.82 ± 0.19 pg/ml
IL-6 <2.14↓ <2.14↓ 5.36 ± 1.00 <2.14↓ 4.50 ± 2.27 pg/ml
IL-8 19.12 ± 2.00 17.73 ± 4.73 31.05 ± 6.27 16.40 ± 1.40 22.61 ± 4.50 pg/ml
IL-10 7.68 ± 1.09 7.05 ± 1.12 8.67 ± 0.26 12.46 ± 3.21 9.69 ± 0.67 pg/ml
IFN-r 9.45 ± 3.81 6.80 ± 0.65 7.64 ± 0.74 5.45 ± 0.51 7.21 ± 1.07 pg/ml
TNF-a 11.34 ± 0.90 8.52 ± 1.90 11.82 ± 0.75 15.18 ± 1.66 11.77 ± 0.65 pg/ml
대조군 = 생리식염수, 투여군1 = 1g/5Kg, 투여군2 = 5g/5Kg 투여.
IL-6의 경우, 혈중 농도가 매우 낮아 검출한계 (2.14 pg/ml) 보다 낮은 수치가 많은 수의 개체에서 확인되었으며, 이러한 경우 2.14 pg/ml로 계산하였다. 모든 개체의 결과가 2.14 pg/ml 보다 낮은 경우에는 <2.14↓로 표기하였다.
상기와 같은 실험을 통해 본 발명은 시험물질인 경옥고가미방 재료를 활용한 반려견 면역력 강화 배합제를 목적동물인 개에게 적용하여 그 안전성 및 유효성을 검증하고자 하였다.
먼저, 시험물질의 고용량 투여 시 안전성을 확인하기 위해 목적동물인 개에서 단회 투여 독성 시험을 실시하였다. 비글견을 대상으로 한 단회 투여 독성 시험에서 500mg/kg, 1000mg/kg, 2000mg/kg의 고용량의 시험물질을 3마리의 건강한 비글견에게 경구투여 하였으며, 14일간의 관찰기간 중 모든 시험견에서 신체검사, 전 혈구 검사, 혈청화학 검사, 전해질 검사, 뇨 검사, 전기영동검사 상 어떠한 이상 반응이나 부작용도 관찰되지 않았다.
따라서, 경옥고가미방인 고형재료를 활용한 반려견 영양간식은 개에게 고용량으로 투여하였을 때에 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었으며, 안전성 시험 평가지표인 임상증상 및 이상지표 미발현 기준을 충족하였다.
또한, 시험물질의 안전성 및 유효성을 장기간 반복투여 시 확인하기 위해 목적동물인 개에서 반복투여 안전성 평가를 실시하였다. 시험 물질을 대조군, 투여군1(1g/5Kg), 투여군2(5g/5Kg) 군으로 나누어 각 군당 3마리씩 총 9마리의 건강한 비글견에게 하루 2회 투여하였으며, 총 8주간 관찰하였다. 총 8주 간의 관찰기간 중 신체검사, 전혈구검사, 혈청화학검사, 전해질검사, 뇨검사및 전기영동검사를 실시하였으며, 모든 용량의 투여군에서 검사기간 중 어떠한 부작용이나 이상 반응도 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다.
따라서, 경옥고가미방인 고형재료를 활용한 반려견 영양간식은 개에게 다양한 용량으로 장기간 투여하였을 때에 안전하게 사용될 수 있을 것으로 판단되고 단백질 및 지질대사에 특별한 영향을 주지는 않는 것으로 보이며, 안전성 시험 평가지표인 임상증상 및 이상지표 미발현 기준을 충족하였다.
또한, 시험물질의 유효성을 평가하기 위해 앞에서 언급한 8주간의 반복투여를 통한 시험기간 중 면역력과 관련된 지표를 평가하였다. 평가지표로는 백혈구 감별계산, 유세포분석, NK세포 활성도 및 혈중 사이토카인 검사가 포함되었다. 총 8주간의 검사결과, 백혈구 감별계산의 경우 모든 종류의 백혈구에서 시험물질 투여 이후 유의적인 변화는 확인되지 않았다. 유세포분석(Flow cytometry) 결과, NK 세포(NK cell)의 비율이 0주차와 대비하여 대조군에서는 비슷하거나 감소하는 양상을 나타낸 반면 투여군1, 2에서 전반적으로 증가하는 양상이 확인되었다. 시험 종료 시 8주차의 NK cell 개선율은 대조군에서 -45%, 투여군 1에서 175%, 투여군 2에서 48%로 투여군 1, 2 모두에서 대조군에 비해 유의적인 수치 증가가 확인되었고, 유세포 분석에서 세포독성 T 림프구 (Cytotoxic T cell)의 비율 역시 0주차와 대비하여 대조군에서는 비슷하거나 감소하는 양상을 나타낸 반면 투여군1, 2에서 전반적으로 증가하는 양상이 확인되었으며, 8주차에는 투여군 1에서만 0주차 대비 개선된 결과가 나타났다. 시험 종료 시 8주차의 Cytotoxic T cell 개선율은 대조군에서 -11%, 투여군 1에서 17%, 투여군 2에서 -9%를 나타내어, 투여군 1에서 다른 군에 비해 유의적인 수치 증가가 확인되었으며 투여군 2의 경우에는 2,4,6 주차에는 증가 양상을 나타내었으나 8주차에는 미약한 감소 양상을 나타내어 장기 투여시 투여군 1에서 더욱 높은 개선율을 나타냄을 확인할 수 있었다. NK 세포 활성도 검사에서는 시험기간 중 유의적인 변화가 확인되지 않았다. 이는 해당 시험에서 사용된 NK Vue kit(ATgen, Korea)가 인의용 제품으로 우선 출시된 것으로 목적동물인 개에서 사용하였을 때 좀더 추가적인 개의 진단결과를 확인과정이 필요할 것으로 보이며, Canine specific marker를 사용하여 분석을 실시한 유세포분석에 비해 NK cell의 변화를 정확히 나타내지 못하였을 것으로 생각되며, 해당 시험은 incubation 이후 활성화된 혈중 인터페론 감마(interferon-γ)의 농도를 측정하는 방법으로, NK cell 외에도 T helper type 1 cell 등 다양한 세포에서 인터페론 감마를 분비할 수 있으며, 시험물질인 경옥고가미방인 고형재료를 활용한 반려견 영양간식의 유효 성분 중 하나인 베타 글루칸은 T helper type 1 세포의 작용을 감소시킬 수 있는 것으로 보고되어 있다(Chen et al.).
따라서, NK Vue kit를 통한 NK 세포 활성도 검사는 정확한 면역력의 변화를 나타내기 어려운 검사방법으로 판단된다. 혈중 사이토카인 검사에서는 인터루킨(IL-2, IL-6, IL-8, IL-10_), 인터페론(IFN-γ)의 농도 변화는 유의적인 변화를 나타내지 않았지만, 종양괴사인자 TNF-α의 경우 0주차와 대비하여 8주차에 투여군 1에서 기타 군에 비해 증가한 양상을 나타내었다. 8주차의 TNF-α 개선율은 대조군에서 6%, 투여군 1에서 74%, 투여군 2에서 4% 로, 투여군 1에서 다른 군에 비해 유의적인 수치 증가가 확인되었다.
그리고, 실험을 통해 실시한 유효성 평가 시험은 정상 개에게 시험물질인 경옥고가미방인 고형재료를 활용한 반려견 영양간식을 반복 투여한 후 면역력 지표의 변화를 확인한 시험으로, 면역력을 저하시키거나 감염을 유발한 개체가 아닌 건강한 정상 개체에서 시험을 실시하였기 때문에, 혈중 인터루킨 및 인터페론 등 여러 면역력 지표의 확연한 변화가 나타나지 않았을 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고 유세포 분석에서 NK cell 및 Cytotoxic T cell 의 증가, 혈중 사이토카인 검사에서 종양괴사인자 TNF-α 의 증가가 확인되어 본 연구의 목적인 감염성 질병 예방을 위해 건강한 개체에게 시험물질을 투여하였을 때 시험물질이 면역력 개선 및 감염성 질병 예방에 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다. 기존 연구결과에 따르면, 이번 시험물질의 유효성분 중 하나인 베타 글루칸은 종양괴사인자 TNF-α의 분비를 증가시킬 수 있는 것으로 보고되어 있으며(Gr
Figure 112020126765294-pat00001
ndemann et al.), 면역조절능력을 통해 항 감염 효과를 가질 수 있는 것으로 알려져 있다(Jin et al.).
따라서, 실험을 통해 평가한 시험물질은 이러한 기존 연구와 일치하는 결과를 나타내었음을 확인할 수 있었다. 또한 유세포 분석에서 투여군 2의 Cytotoxic T cell 의 비율이 8주차에 감소하였으며, 사이토카인 검사에서 8주차에 투여군 1에서만 유의적인 수치 개선이 나타난 것을 고려할 때, 실험의 시험물질인 경옥고가미방인 고형재료를 활용한 반려견 영양간식(영양제)은 8주 이상 장기간 투여하였을 때 5g/5Kg의 농도 보다는 1g/5Kg의 농도로 투여하는 것이 더욱 효과적으로 면역력을 개선시킬 가능성이 있다고 생각된다. 이러한 유효성 시험의 검사 결과들은 적은 개체 수(그룹당 3마리)로 인해 통계적 유의성을 확인할 수는 없었으나, 시험 종료 시 8주차에 NK cell, Cytotoxic T cell, TNF-α 의 지표에서 투여군의 확연한 수치 개선이 확인되어 유효성 평가지표인 0-10% 이내의 정량적 수치 개선 기준을 충족하였다.
이로 인해, 실험을 통해 경옥고가미방인 고형재료를 이용한 반려견 영양간식(영양제)은 목적동물인 개에게 투여하였을 때 해당 물질의 투여로 인한 것으로 생각되는 어떠한 부작용도 나타나지 않았고, 건강한 개체에게 투여하였을 때 면역력 지표에서 유의적인 개선이 확인되었기에, 경옥고가미방인 고형재료를 이용한 반려견 영양간식은 개에서 감염성 질환을 예방하는 효과적인 영양간식으로 안전하게 사용 될 수 있을 것으로 판단된다.
하기 표 23은 경옥고가미방인 고형재료에 포함된 베타글루칸을 분석한 결과로서, 베타글루칸 351.75mg/g가 검출되었음을 확인할 수가 있습니다.
항목 결과
베타글루칸(mg/g) 351.75mg/g
진세노사이드Rb1(mg/g) 0.03mg/g
진세노사이드Rg1(mg/g) 불검출
진세노사이드Rg3(mg/g) 0.08mg/g
한편, 하기에서는 본 발명에 따라 실시되는 경옥고가미방에 대한 DPPH free radical 소거활성을 측정한 결과를 살펴보기 위한 것으로, 이는 경옥고가미방에 대한 항산화 효과 중 하나인 활성산소에 포함된 free radical 소거효과를 평가하기 위해 제 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)을 이용한 free radical 소거활성 측정 시험을 실시하였다.
이에, 경옥고가미방 0.05%, 0.5%, 1% 및 5% 농도의 DPPH free radical 소거활성도를 측정한 결과, 5.49%, 89.66%, 94.68% 및 96.06%의 활성을 보였고, 이를 통해 DPPH free radical 소거활성 측정시험에서 시험물질인 경옥고가미방 0.05%, 0.5%, 1% 및 5% 농도에서 free radical 소거 효과가 나타난 것이다.
상기에서 나타난 시험 결과를 위해, 생물체 내에서 생성되는 활성산소는 생체 조직 및 세포를 손상시키는 산화력이 강한 독성물질로서 활성산소 내에 free radical이 포함되어 있는데 이러한 free radical을 제거하게 되는 작용을 항산화 작용이어서, 이 실험에서는 경옥고가미방에 대한 항산화 효과를 평가하기 위해 DPPH를 이용하여 free radical 소거활성 측정시험을 실시하였다.
먼저, 시험물질로는 본 발명에 따른 경옥고가미방이고, 양성대조물질은 L-Ascorbic acid(공급원:Sigma-Aldrich, Lot No.:SLBW5939)이며, 기타로는 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(공급원:Alfa Aesar, Lot No.:P19F002)와 Ethanol(공급원:DUKSAN, Lot No.:J2B112)이다.
시험방법으로는 본 발명에 따른 경옥고가미방에 대한 시험물질을 순도환산하지 않고 이용하였고, 증류수를 이용하여 해당 농도에 대해 조제하였으며, 양성대조물질은 L-Ascorbic acid를 칭량한 후 증류수를 이용하여 해당 농도에 대해 조제하였고, DPPH 조제는 Ethanol을 이용하여 0.2mM 농도로 조제하였다.
하기 표 24는 시험군 구성을 나타낸 것이다.
군 시험물질명 처리농도(%)
G1(시험물질) 경옥고가미방 0.05, 0.5, 1, 5
G2(양성대조물질) L-Ascorbic acid 0.0005, 0.001, 0.0015, 0.002
시험물질에 대한 적용은 96 well plate에 각 농도별 조제물과 0.2mM DPPH 및 Ethanol을 1:1로 혼합하여 넣었고, 시료액 반응 및 흡광도 측정은 실온에서 30분간 차광 상태로 반응시켜 원심분리하여 상층액을 취한 후 517nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
이에 따른 결과 산출은 아래 식에 의해 DPPH free radical 소거활성율(%)을 이용하여 산출하였다.
DPPH free radical scavenger activity(%) = 1 - A/B × 100
A는 시험물질 흡광도, B는 공시료의 흡광도를 나타낸 것이다.
각 실험 결과는 3회 반복 측정하여 평균과 표준편차를 나타내었고, SPSS 통계 프로그램(Ver. 19.0)을 이용하여 통계분석을 수행하였으며, 먼저 Levene's test를 수행한 후, one way ANOVA test를 실시하여 실험군간 유의성이 확인되면 분산의 동질성 유무에 따라 사후점검(분산이 동질일 경우, Duncan's 다중검정, 분산이 이질한 경우, Dunnett's T3)을 실시하였고, 신뢰구간은 95%로 설정하였다.
첨부도면 도 4 및 도 5에 도시되고, 표 25 및 표 26에 나타난 바와 같이, DPPH free radical 소거활성율(%)은 시험물질인 경옥고가미방(G1)을 농도별(0.05%, 0.5%, 1%, 5%)로 처리하여 DPPH free radical 소거활성도를 측정한 결과 5.49%, 89.66%, 94.68% 및 96.06%의 활성을 보였고, lC50(50% 활성율을 나타내는 농도)을 산출한 결과 0.2880%의 농도로 산출되었으며, 양성대조물질은 0.0005%, 0.001%, 0.0015% 및 0.002% 농도에서 free radical 소거 효과가 24.36%, 54.48%, 83.96% 및 95.17%로 나타났고, lC50(50% 활성율을 나타내는 농도)을 산출한 결과 0.0009%의 농도로 산출된 것으로, 이와 같은 결과로부터 DPPH free radical 소거활성 측정시험에서 시험물질인 경옥고가미방은 0.05%, 0.5%, 1%, 5%의 농도에서 free radical 소거 효과가 나타남을 알수가 있는 것이다.
Group N Concentration
(%)		 OD517 DPPH free radical
scavenger activity (%)
Mean S.D. Mean S.D.
G1(TS) 3 0 0.559 ± 0.010
3 0.05 0.528 ± 0.004 5.49* ± 1.84
3 0.5 0.058 ± 0.002 89.66* ± 0.09
3 1 0.030 ± 0.004 94.68* ± 0.70
3 5 0.022 ± 0.010 96.06* ± 1.79
G2(PC) 3 0 0.676 ± 0.009
3 0.0005 0.511 ± 0.000 24.36* ± 1.01
3 0.001 0.308 ± 0.011 54.48* ± 1.02
3 0.0015 0.108 ± 0.004 83.96* ± 0.59
3 0.002 0.033 ± 0.001 95.17* ± 0.17
TS : Test substance, PC : Positive control
- : Not applicable, N : Number of well, SD : Standard deviation
* : Significantly difference from Control at p<0.05
Group Concentration
(%)		 OD517 DPPH free radical
scavenger activity (%)
1st 2nd 3rd Mean
S.D.		 1st 2nd 3rd Mean S.D.
G1
(TS)		 0 0.557 0.569 0.550 0.559 ±
0.010
0.05 0.553 0.526 0.525 0.528 ±
0.004		 4.32 7.62 4.49 5.49±1.84
0.5 0.058 0.059 0.056 0.058 ± 0.002 89.65 89.57 89.75 89.66±0.09
1 0.032 0.026 0.031 0.030 ± 0.004 94.20 95.49 94.36 94.68±0.70
5 0.027 0.011 0.028 0.022 ± 0.010 95.15 98.13 94.91 96.06±1.79
G3
(PC)		 0 0.685 0.675 0.668 0.676 ± 0.009
0.0005 0.511 0.512 0.512 0.511 ± 0.000 25.44 24.20 23.44 24.36±1.01
0.001 0.320 0.304 0.299 0.308 ± 0.011 53.31 54.91 88.21 54.48±1.02
0.0015 0.109 0.113 0.104 0.108 ± 0.004 84.14 83.31 84.44 83.96±0.59
0.002 0.034 0.033 0.031 0.033 ± 0.001 95.09 95.06 95.36 95.17±0.17
TS : Test substance, PC : Positive control
- : Not applicable, SD : Standard deviation
하기에서는 경옥고가미방의 단회 경구투여 독성시험을 살펴보면, 경옥고가미방에 대한 단회 경구투여 독성시험을 실시하기 위해 SD계 rat를 사용하여 '의약품등의 독성시험기준'에 따라, 고용량을 2,000mg/kg BW 으로 설정하였고, 공비 2 로 두어 1,000 및 500mg/kg BW 으로 중용량 및 저용량을 설정하여 암·수 각각에 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 14 일간 사망률, 일반증상, 체중변화를 관찰하였으며, 생존동물은 부검하여 육안적으로 장기의 이상 유무를 검사하였다.
이에 따라, 시험물질 투여에 의한 사망동물은 관찰되지 않았고, 일반증상 관찰결과 모든 투여군에서 시험물질 투여에 의한 이상소견은 관찰되지 않았으며, 체중측정 결과 모든 시험물질 투여군에서 부형제 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의적인 변화는 관찰되지 않았고, 부검소견 결과 모든 투여군에서 시험물질 투여에 의한 이상소견은 관찰되지 않았기에, 이상의 결과로부터 rat에 경옥고가미방을 단회 경구투여 시 시험물질 투여와 관련된 독성학적 소견이 인정되지 않았으므로 개략의 치사량은 암·수 모두 2,000mg/kg BW 이상으로 나타내었다.
상기와 같은 실험 결과를 도출한 시험물질은 경옥고가미방이고, 부형제는 독성시험용으로 널리 사용하고 있고 시험개시전에 부형제 확인 결과 조제가 가능한 부형제로 선택하였으며, 이는 멸균증류수(주사용수)로 대한약품공업(주)에서 제조하였고, Batch No.는 C6V2B21이다.
그리고, 시험계체의 계통 및 종은 Crl:CD(SD), Rat, SPF이고, 공급원은 (주)오리엔트 바이오에서 제공받았으며, 도입 시 성별 및 동물 수는 수컷 22 마리와 암컷 22 마리이고, 도입 시 주령 및 체중범위는 5 주령, 수컷 132.95g~153.11g과 암컷 97.49g~108.51g이며, 투여 시 성별 및 동물 수는 수컷 20 마리와 암컷 20 마리이고, 투여 시 주령 및 체중범위는 6 주령, 수컷 168.6g~190.8g와 암컷 121.9g~ 134.9g이다.
상기와 같은 시험에 사용된 SD rat는 단회 투여독성 시험에 일반적으로 많이 사용되는 동물로서 비교할 많은 시험기초자료가 축적되어 있어 선택되었고, 도입 후 7 일 동안 동물 사육실의 환경 하에서 검역 및 순화시키면서 일반 건강상태를 관찰한 후, 건강한 개체를 선별하여 시험에 사용하였으며, 개체식별은 유성펜을 이용하여 꼬리에 표시하였고, cage는 개체식별카드를 부착하여 식별하였다.
또한, 순화 후 건강한 개체를 선별하여, 각 군간 평균체중 및 표준편차가 균일하도록 무작위법으로 군 분리를 실시하였고, 환경조건은 온도 213~223℃, 상대습도 45.5~53.8% R.H., 환기횟수 10~20회/h, 조명주기는 광조건 12시간(08:00~ 20:00), 암조건 12 시간(20:00~08:00), 조도 150~300 Lux, Cage 종류는 Stainless steel wire cage, Cage 크기는 310W × 500D × 200H mm, Cage당 수용마리 수는 3 마리 이하로서, 동물실의 온·습도는 자동 온습도 측정기에 의하여 매 30분마다 측정되었으며, 기타 환경조건은 표준작업지침서에 따라 측정하였고, 동물실의 환경측정 결과, 시험에 영향을 미치는 요인은 발견되지 않았다.
또한, 사료는 방사선 멸균된 Rodent Diet 20 5053 [Labdiet, USA]를, 음수는 R/O수를 자유섭취 시켰고, 사료는 제조업체의 정기적 검사에 따른 분석성적서를 사료공급자로부터 받아 확인하였으며, 음수는 정기적 검사를 통해 확인하였고, 이에 사료 및 음수 검사에서 시험에 영향을 미치는 요인은 발견되지 않았다.
그리고, 시험물질의 조제는 시험물질을 순도 환산하지 않고 그대로 이용하여 시험물질을 칭량한 후 부형제인 멸균증류수에 50mg/mL, 100mg/mL 및 200mg/mL 농도로 조제하여 사용하였고, 하기 표 27에 나타낸 바와 같이 시험물질 투여량은 식품의약품안전처 고시 중 '의약품등의 독성시험기준'에 근거하여 고용량 투여군을 2000mg/kg B.W. 로 설정하고, 공비를 2 로 하여 중용량은 1000mg/kg B.W., 저용량은 500mg/kg B.W. 으로 각각 설정하였으며, 대조군으로는 시험물질 투여군과 동일한 액량의 부형제를 투여하는 부형제 대조군을 두었다.
군 성 동물번호 마리수 투여량
(mg/kg B.W.)		 투여액량
(mg/kg B.W.)		 투여경로
G1 수컷 1101 ~ 1105 5 0 10 경구
암컷 2101 ~ 2105 5
G2 수컷 1201 ~ 1205 5 500
암컷 2201 ~ 2205 5
G3 수컷 1301 ~ 1305 5 1000
암컷 2301 ~ 2305 5
G4 수컥 1401 ~ 1405 5 2000
암컷 2401 ~ 2405 5
※ G1 : 부형제 대조군, G2 - G4 : 시험물질 투여군, BW : Body weight
그리고, 시험물질의 투여 경로 및 방법으로는 약 18 시간 절식시킨 실험동물에 시험물질 조제물을 경구투여용 sonde를 장착한 주사기를 이용하여 위내에 1회 강제 투여하였고, 모든 동물에 대 하여 1일 1회 관찰 하였으며, 시험물질 투여 후 14일간 관찰하였으며, 단 투여 당일에는 투여 후 0.5, 1, 2, 3 및 4시간에 관찰하였다.
그리고, 체중은 도입 시, 군 분리 시, 시험물질투여 개시 직전, 투여 개시 후 7 및 14일째에 측정하였고, 체중 데이터에 대해 SPSS(Ver 19.0) 통계 프로그램을 이용하여 통계처리를 하였으며, 먼저 Levene's test를 통해 동질성 검정을 수행하였고, 이후 one-way ANOVA 검사를 수행하였다.
상기에서 설명한 과정을 통해 실험을 실시한 결과로서, 하기의 표 28 내지 표 31에 나타난 바와 같이 사망률 및 일반증상에 대한 것으로, 실험기간 중 시험물질 투여에 의한 사망동물은 관찰되지 않았고, 일반증상 관찰결과, 모든 투여군에서 이상소견은 관찰되지 않았음을 알 수가 있다.
Group Dose
(mg/kg B.W.)		 Mortality
Male Female
G1 0 0%
(0/5)a 		0%
(0/5)
G2 500 0%
(0/5)		 0%
(0/5)
G3 1000 0%
(0/5)		 0%
(0/5)
G4 2000 0%
(0/5)		 0%
(0/5)
B.W. : Body weight, a : Number of dead animals/Number of tested animals
Group Dose
(mg/kg B.W.)		 성 Number
of animals		 Clinical signs
G1 0 Male 5 Normal
Female 5 Normal
G2 500 Male 5 Normal
Female 5 Normal
G3 1000 Male 5 Normal
Female 5 Normal
G4 2000 Male 5 Normal
Female 5 Normal
B.W. : Body weight
하기 표 30은 Clinical signs of male rats에 대해 나타낸 것이다.
Group Dose
(mg/kg B.W.)		 Animal
number		 Hour (s) after administration Day (s) after
administration
0.5 1 2 3 4 1 2 3 4
G1 0 1101 N N N N N N N N N
1102 N N N N N N N N N
1103 N N N N N N N N N
1104 N N N N N N N N N
1105 N N N N N N N N N
G2 500 1201 N N N N N N N N N
1202 N N N N N N N N N
1203 N N N N N N N N N
1204 N N N N N N N N N
1205 N N N N N N N N N
G3 1000 1301 N N N N N N N N N
1302 N N N N N N N N N
1303 N N N N N N N N N
1304 N N N N N N N N N
1305 N N N N N N N N N
G4 2000 1401 N N N N N N N N N
1402 N N N N N N N N N
1403 N N N N N N N N N
1404 N N N N N N N N N
1405 N N N N N N N N N
Group Dose
(mg/kg B.W.)		 Animal
number		 Day (s) after administration
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
G1 0 1101 N N N N N N N N N N
1102 N N N N N N N N N N
1103 N N N N N N N N N N
1104 N N N N N N N N N N
1105 N N N N N N N N N N
G2 500 1201 N N N N N N N N N N
1202 N N N N N N N N N N
1203 N N N N N N N N N N
1204 N N N N N N N N N N
1205 N N N N N N N N N N
G3 1000 1301 N N N N N N N N N N
1302 N N N N N N N N N N
1303 N N N N N N N N N N
1304 N N N N N N N N N N
1305 N N N N N N N N N N
G4 2000 1401 N N N N N N N N N N
1402 N N N N N N N N N N
1403 N N N N N N N N N N
1404 N N N N N N N N N N
1405 N N N N N N N N N N
B.W. : Body weight, N : Normal
하기 표 31은 Clinical signs of female rats에 대해 나타낸 것이다.
Group Dose
(mg/kg B.W.)		 Animal
number		 Hour (s) after administration Day (s) after
administration
0.5 1 2 3 4 1 2 3 4
G1 0 2101 N N N N N N N N N
2102 N N N N N N N N N
2103 N N N N N N N N N
2104 N N N N N N N N N
2105 N N N N N N N N N
G2 500 2201 N N N N N N N N N
2202 N N N N N N N N N
2203 N N N N N N N N N
2204 N N N N N N N N N
2205 N N N N N N N N N
G3 1000 2301 N N N N N N N N N
2302 N N N N N N N N N
2303 N N N N N N N N N
2304 N N N N N N N N N
2305 N N N N N N N N N
G4 2000 2401 N N N N N N N N N
2402 N N N N N N N N N
2403 N N N N N N N N N
2404 N N N N N N N N N
2405 N N N N N N N N N
Group Dose
(mg/kg B.W.)		 Animal
number		 Day (s) after administration
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
G1 0 1101 N N N N N N N N N N
1102 N N N N N N N N N N
1103 N N N N N N N N N N
1104 N N N N N N N N N N
1105 N N N N N N N N N N
G2 500 1201 N N N N N N N N N N
1202 N N N N N N N N N N
1203 N N N N N N N N N N
1204 N N N N N N N N N N
1205 N N N N N N N N N N
G3 1000 1301 N N N N N N N N N N
1302 N N N N N N N N N N
1303 N N N N N N N N N N
1304 N N N N N N N N N N
1305 N N N N N N N N N N
G4 2000 1401 N N N N N N N N N N
1402 N N N N N N N N N N
1403 N N N N N N N N N N
1404 N N N N N N N N N N
1405 N N N N N N N N N N
B.W. : Body weight, N : Normal
그리고, 하기의 표 32 내지 표 34에 나타난 바와 같이, 체중측정 결과, 모든 투여군에서 정상적인 체중증가가 관찰되었음을 알 수가 있다.
하기 표 32는 Body weight를 나타낸 것이고, 단위는 g이다.
Group Dose
(mg/kg B.W.)		 성 Day (s) after administration
0 7 14
G1 0 Male Mean 179.6 264.6 304.7
S.D. 7.0 21.9 36.0
N 5 5 5
Female Mean 131.2 187.7 215.9
S.D. 3.2 7.9 11.1
N 5 5 5
G2 500 Male Mean 182.9 275.0 335.1
S.D. 8.4 17.6 33.8
N 5 5 5
Female Mean 130.4 183.7 208.5
S.D. 2.9 12.5 16.8
N 5 5 5
G3 1000 Male Mean 175.5 264.3 317.0
S.D. 6.9 14.8 21.4
N 5 5 5
Female Mean 131.8 189.6 216.0
S.D. 3.2 7.4 12.5
N 5 5 5
G4 2000 Male Mean 181.8 267.4 318.5
S.D. 6.8 10.5 14.0
N 5 5 5
Female Mean 128.6 188.6 216.5
S.D. 4.8 11.6 14.2
N 5 5 5
B.W. : Body weight, N：Number of animals, S.D. : Standard deviation
하기 표 33은 Body weight of male rats를 나타낸 것이고, 단위는 g이다.
Group Dose
(mg/kg B.W.)		 Animal
number		 Day (s) after administration
0 7 14
G1 0 1101 186.9 287.1 338.6
1102 170.3 245.4 264.9
1103 186.3 286.8 343.5
1104 177.2 241.2 273.8
1105 177.4 262.6 302.5
Mean 179.6 264.6 304.7
S.D. 7.0 21.9 36.0
G2 500 1201 182.7 275.6 322.5
1202 189.0 271.4 327.4
1203 169.5 248.9 293.1
1204 190.8 297.5 384.2
1205 182.7 281.5 348.2
Mean 182.9 275.0 335.1
S.D. 8.4 17.6 33.8
G3 1000 1301 168.6 247.4 291.7
1302 186.1 285.0 349.0
1303 170.4 253.4 308.5
1304 177.1 265.1 310.9
1305 175.1 270.8 325.0
Mean 175.5 264.3 317.0
S.D. 6.9 14.8 21.4
G4 2000 1401 172.5 249.5 294.9
1402 186.5 269.5 320.3
1403 189.6 276.4 327.3
1404 178.0 268.4 320.4
1405 182.6 273.4 329.7
Mean 181.8 267.4 318.5
S.D. 6.8 10.5 14.0
B.W. : Body weight, SD : Standard deviation
하기 표 34는 Body weight of female rats를 나타낸 것이고, 단위는 g이다.
Group Dose
(mg/kg B.W.)		 Animal
number		 Day (s) after administration
0 7 14
G1 0 2101 133.3 182.8 212.9
2102 130.9 179.9 201.7
2103 134.1 194.7 228.4
2104 131.8 197.6 225.7
2105 126.0 183.7 210.8
Mean 131.2 187.7 215.9
S.D. 3.2 7.9 11.1
G2 500 2201 133.3 190.8 212.6
2202 133.7 201.9 236.1
2203 127.5 172.3 194.7
2204 128.7 174.4 200.8
2205 128.9 178.9 198.5
Mean 130.4 183.7 208.5
S.D. 2.9 12.5 16.8
G3 1000 2301 132.2 186.5 213.1
2302 134.6 180.8 202.6
2303 127.7 195.0 224.6
2304 134.9 199.3 232.8
2305 129.5 186.3 207.0
Mean 131.8 189.6 216.0
S.D. 3.2 7.4 12.5
G4 2000 2401 126.6 178.4 205.1
2402 129.1 188.1 212.8
2403 121.9 176.5 203.3
2404 134.8 203.8 237.3
2405 130.4 196.1 224.1
Mean 128.6 188.6 216.5
S.D. 4.8 11.6 14.2
B.W. : Body weight, SD : Standard deviation
또한, 하기의 표 35 내지 표 37에 나타난 바와 같이, 주요 장기에 대한 육안적 검사결과, 모든 투여군에서 이상소견은 관찰되지 않았음을 알 수가 있다.
하기 표 35는 Necropsy findings를 나타낸 것이다.
Group Dose
(mg/kg BW)		 성 Necropsy findings
External findings Internal findings
G1 0 Male No gross findings (5)a No gross findings (5)
Female No gross findings (5) No gross findings (5)
G2 500 Male No gross findings (5) No gross findings (5)
Female No gross findings (5) No gross findings (5)
G3 1000 Male No gross findings (5) No gross findings (5)
Female No gross findings (5) No gross findings (5)
G4 2000 Male No gross findings (5) No gross findings (5)
Female No gross findings (5) No gross findings (5)
B.W. : Body weight, a : Number of observed animals
하기 표 36은 Necropsy findings of male rats을 나타낸 것이다.
Group Dose
(mg/kg BW)		 Animal
number		 Necropsy findings
External Internal
G1 0 1101 No gross findings No gross findings
1102 No gross findings No gross findings
1103 No gross findings No gross findings
1104 No gross findings No gross findings
1105 No gross findings No gross findings
G2 500 1201 No gross findings No gross findings
1202 No gross findings No gross findings
1203 No gross findings No gross findings
1204 No gross findings No gross findings
1205 No gross findings No gross findings
G3 1000 1301 No gross findings No gross findings
1302 No gross findings No gross findings
1303 No gross findings No gross findings
1304 No gross findings No gross findings
1305 No gross findings No gross findings
G4 2000 1401 No gross findings No gross findings
1402 No gross findings No gross findings
1403 No gross findings No gross findings
1404 No gross findings No gross findings
1405 No gross findings No gross findings
B.W. : Body weight
하기 표 37은 Necropsy findings of female rats을 나타낸 것이다.
Group Dose
(mg/kg BW)		 Animal
number		 Necropsy findings
External Internal
G1 0 2101 No gross findings No gross findings
2102 No gross findings No gross findings
2103 No gross findings No gross findings
2104 No gross findings No gross findings
2105 No gross findings No gross findings
G2 500 2201 No gross findings No gross findings
2202 No gross findings No gross findings
2203 No gross findings No gross findings
2204 No gross findings No gross findings
2205 No gross findings No gross findings
G3 1000 2301 No gross findings No gross findings
2302 No gross findings No gross findings
2303 No gross findings No gross findings
2304 No gross findings No gross findings
2305 No gross findings No gross findings
G4 2000 2401 No gross findings No gross findings
2402 No gross findings No gross findings
2403 No gross findings No gross findings
2404 No gross findings No gross findings
2405 No gross findings No gross findings
B.W. : Body weight
상기의 실험을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명은 기술적 구성의 특성등을 고려한 기술의 구체적 적용에 따른 최적의 효과를 얻기 위해 상당한 연구개발을 실시하여 창작능력을 발휘한 것이다.
이상, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위에는 설명된 실시예에 국한되어 전해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (3)

  1. 경옥고가미방인 고형재료를 미세분쇄기를 통해 분쇄하여 미세 분말로 준비하고, 밀봉인 꿀을 준비하며, 생지황을 세척기를 통해 흙의 잔사와 부유물을 깨끗이 씻어내도록 세척하고, 세척된 생지황을 분쇄기에 넣어 생지황을 마쇄하며, 마쇄된 생지황을 착즙기에 넣어 생지황 즙액을 얻어 준비하는 단계; 상기에서 준비된 생지황 즙액을 42중량%와, 밀봉인 꿀을 40중량%와, 홍삼 10중량%, 백복령 50중량%, 맥문동 4중량%, 천문동 4중량%, 구기자 7중량%, 꽃송이버섯 5중량%, 노루궁뎅이버섯 16중량% 및 복령피 4중량%의 비율로 혼합되어 이루어져 있는 경옥고가미방인 고형재료를 18중량%의 비율로 혼합하여 반죽하는 단계; 상기에서 반죽된 혼합물을 옹기에 넣은 다음 상기 옹기를 물이 채워진 중탕기에 넣는 단계; 상기 옹기가 투입된 중탕기를 일정한 온도를 유지하면서 일정한 시간동안 1차로 중탕을 실시하는 단계; 상기에서 1차로 중탕이 완료되면 일정한 시간동안 실온에서 1차 숙성시키는 단계; 상기의 1차 숙성이 완료되면 상기 옹기가 투입된 중탕기를 일정한 온도를 유지하면서 일정한 시간동안 2차로 중탕을 실시하고, 상기에서 2차로 중탕이 완료되면 일정한 시간동안 실온에서 2차로 숙성시킨 다음 영양간식 제품이 완성되는 단계로 이루어지되,
    상기의 중탕기를 통해 실시되는 1차 및 2차의 중탕은 3일 동안 온도측정기(KP3001, Ziraffe, China)로 온도를 측정하여 100±2℃로 유지하면서 실시하게 되고, 상기의 1차 및 2차 숙성은 최적의 맛과 기미를 지닌 제품으로 완성시키기 위해 중탕한 후에 1일 동안 실온에서 숙성시키게 되는 것을 특징으로 하는 경옥고가미방인 고형재료를 포함한 반려견 바이러스성 감염질환 예방을 위한 면역력 강화 영양간식 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
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