KR20230099280A - 반려동물의 면역력 강화 및 염증 개선에 도움이 되는 영양간식 제조방법 - Google Patents

반려동물의 면역력 강화 및 염증 개선에 도움이 되는 영양간식 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 반려동물의 면역력 강화 및 염증 개선에 도움이 되는 영양간식 제조방법은 면역력 강화에 효과가 있는 익수영진고 재료에 면역증진 효과가 우수하다고 알려진 베타글루칸이 최대로 함유된 꽃송이버섯을 배합함으로 꽃송이버섯의 면역활성 작용과 익수영진고와 천연 항생작용의 재료 작용이 결합된 효능을 반려동물에 적용할 수 있도록 하고, 기존에 폐기 처분되던 꽃송이버섯을 활용함으로써 원가를 절감할 수 있는 동시에 제조 비용을 저비용으로 유지할 수 있으므로 인해 소비자로 하여금 저렴한 영양간식을 제공 받을 수 있게 하는데 그 특징이 있다.

Description

반려동물의 면역력 강화 및 염증 개선에 도움이 되는 영양간식 제조방법{Mnufacturing mathod of the nutrition snack with enhancing immune activity for companion dogs}
본 발명은 반려동물의 면역력 강화 및 염증 개선에 도움이 되는 영양간식 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 면역력 강화에 효과가 있는 익수영진고 재료에 면역증진 효과가 우수하다고 알려진 베타글루칸이 최대로 함유된 꽃송이버섯을 배합함으로 꽃송이버섯의 면역활성 작용과 익수영진고와 천연 항생작용의 재료 작용이 결합된 효능을 반려동물에 적용할 수 있도록 반려동물의 면역력 강화 및 염증 개선에 도움이 되는 영양간식 제조방법에 관한 것이다.
핵가족화, 미혼 독립 인구 증가, 노령층 인구 증가 등 사회현상으로 인해 반려견을 인간생활의 동반자로 인식하고 기르는 가정이 급속히 증가하고 있다.
이와 같은 반려견과 같은 반려동물은 사람이 먹다 남은 음식물을 먹이로 주던 종래와 달리 반려견용 사료를 먹이로 주는 것이 보편화되어 있다.
상기 반려견에게 위생적이고 필요한 영양을 공급해주는 사료, 예컨대 단백질, 지방, 탄수화물과 같은 필수 영양소 외에도 무기염류나 비타민과 같은 보조요소도 필요로 하고 있으며, 이에 부응하여 관련 상품들이 많이 개발되고 있는 중이다.
지금까지 시중에 나와 있는 사료를 분석하면, 먼저 반려견에 대한 사료중 가장 중요한 성분 중 하나는 단백질인데, 단백질에 대한 라벨에 표시내용만 본다면 생물학적가치(질소평형치수)와 소화흡수율에 대하여 간과하고 넘어가게 되는데, 이는 사료 제조과정 중 멸균을 위하여 장시간 고온에 노출시 생물학적 가치가 높은 유용한 단백질이 파괴되고 음식에서 발생하는 당과 단백질은 체내의 소화효소에 의해 파괴될 수 없는 새로운 화합물을 만들기 때문에 사료에 표시되는 단백질은 반려동물이 실제로 소화해서 흡수할 수 있는 양이 아닌 오로지 조단백의 양만 표시하며, 이러한 단백질은 반려동물에게 거의 무의미하다.
또한, 반려견 사료의 육류 부산물(meat by-products)에는 닭, 오리, 가금류의 날개나 결합조직(연골), 레더 미트(leather meat: 구두제조시 사용하는 가죽), 다른 동물의 배설물, 말이나 소의 털을 의미하는 것으로, 이러한 것이 포함되어 있다.
또한, 탄수화물은 단백질과 같이 영양을 공급해 주는 것으로, 이는 대체적으로 당(자당), 프로필렌글리콜, 옥수수시럽과 같은 식물(단백질이나 비타민 등을 포함하지 않은) 칼로리를 지칭하는 것이고, 결론적으로 반려동물이 사료를 통하여 얻을 수 있는 영양소는 당을 제외하고는 거의 없다는 의미이며, 실제로 라벨에 표기된 탄수화물에 대한 부분을 해석해보면, 미분은 매우 곱게 간 쌀가루로 분쇄의 마지막 단계로 영양분이 거의 없고, 사탕무우탕은 건조시킨 사탕무우 찌꺼기로 약간의 당분 외 영양가 없으며, 옥수수 글루텐가루는 옥수수에서 녹말 등 껍질을 제거후 건조시킨 찌꺼기로 영양가 없다.
이에 따라, 종래에 제공되는 사료는 반려견에게 먹이고 싶은 단백질, 지방, 비타민, 미네랄 등의 영양소가 부족하고, 도축장의 폐기물이나 부산물 등 반려견에게 먹이고 싶지 않은 재료를 포함하고 있기에, 반려견에게 먹이면서 반려견의 면역체계가 변이되고 파괴되며, 질 높은 영양소의 공급을 원하고 있는데 지속적으로 영양소가 부족한 사료를 주어 반려견이 질병에 노출되고 실정이어서, 전체적으로 반려견에게 면역체계를 바로 잡아 줄 수 있는 양질의 재료를 사용하여 변형되고 망가진 반려견의 면역체계를 복구시킬 수 있는 물질이 없는 실정이다.
한편, 미국 반려동물산업협회(American Pet Products Association, APPA)11 http://www.americanpetproducts.org/press_industrytrends.asp.에 따르면, 2017년 현재 미국의 반려동물 보유 가구 비중은 68%로 나타나고, 또한 미국의 반려동물을 위한 지출비용은 690억 달러로 지속적으로 증가하고 있는 추세이며, 2016년 중국의 반려동물산업 시장규모는 1,220억 위안으로 전년대비 24.7% 증가하였으며 지난 5년 동안 연평균 52.4%의 증가율을 보이며 급속도로 성장하고 있다.
국내의 경우도 최근 1인가구의 증가, 저출산 및 고령화 등으로 인해 반려동물 보유가구가 지속적으로 증가하고 있고, 농림축산식품부에 따르면 국내 반려동물 보유가구 비율은 2010년 17.4%에서 2015년 21.8%로 5년 동안 4.4%포인트 증가한 것으로 나타나 있으며, 반려동물 관련 시장규모도 2012년 9,000억원에서 2015년에는 두 배 증가한 1조 8,000억원을 기록함. 2020년에는 5조8,000억원으로 시장규모가 빠르게 확대될 것으로 예상되고, 반려동물에 대한 수요가 증가하면서 반려동물용품 관련 소매시장도 성장세를 보이고 있는 것이다.
화훼 및 애완동물서비스와 관련해서도 1인가구는 0.19%를 지출하였으나 4인가구는 그보다 적은 0.09%를 지출한 것으로 볼 때 반려동물에 의존하는 나홀로족이 많아졌기 때문이며, 현재 1인가구가 지속적으로 증가하고 있는 가운데 반려동물을 가족처럼 여기는 펫팸족(Pet+Family)이 확산되고, 이에 따라 반려동물 관련 시장의 트렌드도 빠르게 변화되고 있는 실정이다.
그러나, 반려동물의 면역력 저하 상태에서는 재발성 혹은 만성 감염(특히, 호흡기, 피부, 위장관, 비뇨기)과 미생물에 대항할 수 있는 반응성의 불완전성, 정상적으로는 무해한 병원균에 대한 기회감염, 종양 발생빈도 증가 등의 위험성이 높아지고 있고, 개와 고양이에서 알려진 면역관련 질환으로는 대표적으로 아토피 피부염, 염증성 장질환, 천포창, 면역 매개성 빈혈 등이 해당되며, 모두 개체의 면역력과 밀접한 관련이 있는 것이며, 이러한 질환은 체내 면역계가 자가 조직 항원을 부적절하게 인식하여 나타나는 자가면역질환으로, 세포독성 T세포 활성 증가와 Treg세포 기능의 감소와 관련이 있는 것이다.
이에, 아토피 질환에 이환된 개, 위장관계 질환에 이환된 개, 건강한 개 총 세 그룹에서 혈?? IgE와 IgG 농도를 측정하여 비교하였을 때, 아토피 질환군에서 IgE 수치가 유의적으로 가장 높았고, 위장관계 질환군에서 IgG 수치가 유의적으로 가장 높고, 아토피 질환군은 음식 알러젠에 대한 Th2 체액성 면역반응으로 알러젠 특이 IgE가 높으며, 위장관계 질환은 점막 투과성이 증가하여 항원 노출이 증가함에 따라 IgG가 증가된 것으로 판단된다.
또한, 반려동물에서 발생하는 염증성장질환(Inflammatory bowel disease)의 정확한 원인은 밝혀져 있지 않으나, 주요 가설로 장내 미생물 혹은 식이 항원에 대한 점막의 면역 반응 조절 장애일 것으로 추정되고, 노화 역시 면역력 저하와 관련이 높다고 알려져 있으며, 노화에 따른 면역계의 변화는 오래전부터 알려져 있고, 포유류는 나이가 들어감에 따라 면역 조절능력이 떨어지고 면역력이 약해지는 면역노화(Immunosenescence)가 일어날 수 있다고 알려져 있으며, 이는 질병의 이환율과 사망률의 증가, 미생물에 대한 기회감염 감수성 증가, 자가면역 현상, 더 나아가 암 발생을 초래할 수 있는 것이다.
따라서, 개와 고양이의 많은 면역 관련 질환에서 식이 조절이나 특정 식이 섭취가 도움을 줄 수 있다고 알려져 있고, 특히 아토피성 피부염, 만성 염증성 질환, 천포창 (pemphigus)과 같은 자가면역 질환 등에서 식이를 변경하는 것만으로도 필요한 면역억제나 항염증 약물의 양을 줄일 수 있다고 알려져 있으며, 또한 건강한 반려동물에게 특정 영양성분을 추가로 주었을 때 면역력을 유의적으로 증강시킬 수 있고, 정상 동물뿐만 아니라 면역 관련 질환에 이환되거나 이환될 가능성이 높은 반려동물, 또는 면역력 강화가 필요한 노령의 반려동물 등에 면역력 강화에 의한 염증성 피부질환 개선을 위한 한약재 적용의 필요성이 대두되고 있는 것이다.
한국등록특허 제10-0636389호(등록일: 2006.10.12.) 한국공개특허 제10-2018-0021983호(공개일: 2018.03.06.) 한국공개특허 제10-2019-0059063호(공개일: 2019.05.30.) 한국등록특허 제10-1856297호(등록일: 2018.05.02.) 한국등록특허 제10-1583874호(등록일: 2016.01.04.) 한국공개특허 제10-2013-0013424호(공개일: 2013.02.06.)
본 발명은 면역력 강화에 효과가 있는 익수영진고 재료에 면역증진 효과가 우수하다고 알려진 베타글루칸이 최대로 함유된 꽃송이버섯을 배합함으로 꽃송이버섯의 면역활성 작용과 익수영진고와 천연 항생작용의 재료 작용이 결합된 효능을 반려동물에 적용할 수 있도록 반려동물의 면역력 강화 및 염증 개선에 도움이 되는 영양간식 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적은 기존에 폐기 처분되던 꽃송이버섯을 활용함으로써 원가를 절감할 수 있는 동시에 제조 비용을 저비용으로 유지할 수 있으므로 인해 소비자로 하여금 저렴한 영양간식을 제공 받을 수 있게 하는 반려동물의 면역력 강화 및 염증 개선에 도움이 되는 영양간식 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 고지방 식단에 길들어진 반려동물의 체질을 개선할 수 있는 동시에 포만감을 높여 반려동물의 비만이 적절히 억제되면서 반려동물의 활동성을 증진시키고, 균형잡힌 영양소의 섭취가 가능하게 하는 반려동물의 면역력 강화 및 염증 개선에 도움이 되는 영양간식 제조방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 면역 활성 향상 작용을 위한 꽃송이버섯과 익수영진고의 재료들을 미세분쇄기를 통해 분쇄하여 미세 분말로 각각 준비하는 단계와, 상기에서 준비된 꽃송이버섯과 익수영진고의 재료들을 일정한 비율로 혼합하여 반죽하는 단계와, 상기에서 반죽된 혼합물을 옹기에 넣은 다음 상기 옹기를 물이 채워진 중탕기에 넣는 단계와, 상기 옹기가 투입된 중탕기를 일정한 온도를 유지하면서 일정한 시간동안 중탕을 실시하는 단계와, 상기에서 중탕이 완료되면 숙성기를 통해 일정한 시간동안 실온에서 숙성시키는 단계와, 상기의 숙성시킨 다음 영양간식 제품이 완성되는 단계로 이루어지는 것이다.
상기에서 준비된 꽃송이버섯과 익수영진고의 재료들을 일정한 비율로 혼합하여 반죽하는 단계에서, 상기 익수영진고의 재료들과 아토피 피부질환 예방 및 개선에 도움을 주는 천연 항생작용을 하는 재료인 금은화 및 황금을 혼합하는 단계를 더 이루어지는 것이다.
상기 익수영진고의 재료들은 인삼, 복령, 생지황, 봉밀, 천문동, 맥문동, 구기자로 이루어지고, 상기 천연 항생작용을 하는 재료들은 금은화 및 황금으로 이루어지며, 상기 꽃송이버섯 10중량%, 인삼 10중량%, 복령 10중량%, 생지황 10중량%, 봉밀 10중량%, 천문동 10중량%, 맥문동 10중량%, 구기자 10중량%, 금은화 10중량% 및 황금 10중량%의 비율로 이루어지는 것이다.
여기서, 상기의 중탕기를 통해 실시되는 중탕은 2시간 동안 온도측정기(KP3001, Ziraffe, China)로 온도를 측정하여 100±2℃로 유지하면서 실시하게 되고, 상기 중탕기에 채워진 물은 옹기가 80% 이상 잠길 수 있게 유지되도록 보충하는 것이다.
또한, 상기의 숙성은 최적의 맛과 기미를 지닌 제품으로 완성시키기 위해 중탕한 후에 숙성기를 통해 2일 동안 실온에서 숙성시키게 되는 것이다.
상기 숙성기에는 한약재의 혼합물과 접촉하여도 녹슬지 않도록 스텐레스 재질로 이루어져 저장된 숙성물의 숙성정도를 감지하는 센서단이 구비되고, 상기 센서단에 3개 이상의 주파수 신호를 공급하고 신호의 위상에 변위가 임계치 이상 발생하면 변환회로를 거쳐 관리자의 단말기로 신호를 전달하도록 이루어지는 것이다.
본 발명은 면역력 강화에 효과가 있는 익수영진고 재료에 면역증진 효과가 우수하다고 알려진 베타글루칸이 최대로 함유된 꽃송이버섯을 배합함으로 꽃송이버섯의 면역활성 작용과 익수영진고와 천연 항생작용의 재료 작용이 결합된 효능을 반려동물에 적용이 가능한 효과가 있다.
또한, 본 발명은 기존에 폐기 처분되던 꽃송이버섯을 활용함으로써 원가가 절감되는 동시에 제조 비용이 저비용으로 유지됨으로 인해 소비자로 하여금 저렴한 영양간식을 제공 받을 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 고지방 식단에 길들어진 반려동물의 체질을 개선시키게 하는 동시에 포만감을 높여 반려동물의 비만이 적절히 억제되면서 반려동물의 활동성이 증진되고, 균형잡힌 영양소의 섭취가 가능하게 되는 효과가 있다.
도 1은 한약재 배합물의 DPPH free radical 소거활성도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 L-Ascorbic acid의 DPPH free radical 소거활성율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 세포독성 평가를 나타낸 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 TNF-alpha 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 IL-6 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 시험 투여군에 대한 체중변화(Body weight of rats)의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 시험 투여군에 대한 체중변화(Body weight gain of rats)의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 시험 투여군의 사료 섭취량에 따라 측정된 결과 그래프이다.
도 9는 시험 투여군의 음수 섭취량에 따라 측정된 결과 그래프이다.
도 10은 시험 투여군 개체의 실험 전후 피부병변 비교하기 위한 사진이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 아래의 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래의 실시예들로 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시예는 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하며 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.　
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예들은 제조상 초래되는 형상의 변화를 포함하여야 한다.
본 발명에 따라 실시되는 익수영진고 재료들은 반려동물의 감염질환 예방을 위한 면역력 강화용으로 활용할 수 있고, 천연 항생작용을 하는 재료는 아토피 피부질환 예방 및 개선에 도움을 줄 수 있도록 최적의 배합비 분석하고 연구하여 반려동물을 위한 영양간식을 제조할 수가 있었다.
이를 위해, 상기 익수영진고 재료들과 천연 항생작용을 하는 재료들인 꽃송이버섯 10중량%, 인삼 10중량%, 복령 10중량%, 생지황 10중량%, 봉밀 10중량%, 천문동 10중량%, 맥문동 10중량%, 구기자 10중량%, 금은화 10중량% 및 황금 10중량%의 비율로 혼합되어 이루어지게 된다.
여기서, 꽃송이버섯은 건조된 상태인 100g당 베타글루칸(β-glucan)을 43.6% 함유하고 있어서 천연물 중 가장 많은 양을 함유하고 있고, 베타글루칸은 면역기능 활성성분으로 면역력을 증가시켜 항암작용에 우수한 효과를 보이고 있으며, 항염, 항산화, 미백 등의 효과도 있다고 알려져 있다.
인삼은 보기, 보양작용 강화의 대표 재료로, 자양강장, 노화방지, 항피로, 항스트레스 효과가 있고, 혈액순환 촉진, 면역기능 향상, 골다공증 예방 작용이 있으며, 빈혈, 고혈압, 당뇨 개선에 도움이 되는 것으로 알려져 있다.
복령(茯笭)은 건비삼습 작용의 강화 대표 재료로, 이뇨작용과 당뇨개선, 진정작용, 면역기능 향상이 있어서 부종, 설사, 건망증, 수면장애를 개선할 수 있고, 강장효과가 있어서 질병을 앓고 난 후 허약한 사람이나 만성 위장병 환자 등에 효과가 있다고 알려져 있다.
생지황(生地黃)은 보혈 기능 강화의 대표 재료로, 혈의 열을 식히고, 기혈을 고르게 하고, 통증을 완화시키고, 음혈을 보충함으로 빈혈 개선에 도움을 주며, 허약체질, 토혈, 코피, 자궁출혈, 생리불순, 변비 등을 개선하는 작용이 있다고 알려져 있다.
봉밀(蜂蜜)인 꿀은 오장을 편하게 하고, 부족한 것을 보충하고, 백가지약을 중화시킬 수 있고, 진통해독을 도움을 주고, 폐가 약해서 기침하거나 장이 약해서 오는 변비에 사용하며, 영양을 보충하고, 면역력을 향상시키고, 상처를 빠르게 아물게 하는 작용 및 항균 작용이 있다고 알려져 있다.
천문동(天門冬)은 보음기능 강화의 대표 재료로, 이뇨, 자양강장 효과 있고, 노인의 만성기관지염 등으로 객담이 잘 배출되지 않고 오래도록 해수가 지속되는 증상 및 천식에 유효하며, 건조한 피부를 윤택하게 하고, 성기능을 촉진시키는 작용도 있으며, 발열성 질환의 후기에 변비가 있고 미열에 사용한다고 알려져 있다.
맥문동(麥門冬)은 보음기능 강화의 대표 재료로, 이뇨, 자양강장, 진해거담 작용이 있어서 가래, 기침, 만성기관지염, 퇴행성관절질환에 활용된다고 알려져 있다.
구기자(枸杞子)는 치매와 기역력 개선에 도움이 되고, 만성 간염, 간견변증 등에 염증이 제거되고 간기능을 활성화하며, 구기자에 함유되어 있는 베타인은 세포가 손상되는 것을 억제하고 암 예방에 도움이 되고, 혈액순환을 잘 시키며, 허리와 다리에 힘이 강해지는 효과가 있다고 알려져 있다.
금은화는 카페인산, 클로로겐산 등 다양한 페놀산이 들어 있으며, 루테올린, 케르세틴 등의 플라보노이드, 이리도이드, 사포닌, 알카로이드, 구연산 등 다양한 활성 성분이 들어 있고, 이러한 성분들은 우리 몸에서 항산화제로 작용하여 세포의 노화 및 손상을 막으며 염증을 억제하는 등의 다양한 작용으로 몸의 건강을 도울 뿐만 아니라 비만, 아토피, 장 건강, 항균, 항바이러스 항염, 소염, 알러지 대응, 해열작용, 간 보호, 면역력 증진, 혈당수치 개선, 두통완화, 감기와 독감의 예방 효능이 있다고 알려져 있다.
황금(黃芩)은 주로 피부와 소화기의 질환에 효능이 있다고 알려져 있다.
이에 따라 본 발명은 상기에서 설명한 익수영진고의 재료들과 천연 항생작용을 위한 재료들을 미세분쇄기를 통해 분쇄하여 미세 분말로 준비하게 되는데, 이때 연구 및 분석에 의해 최적의 배합비율로 이루어지게 된다.
그리고, 봉밀인 꿀을 준비하고, 생지황 즙액을 준비하게 된다.
여지서, 생지황 즙액은 생지황을 세척기를 통해 흙의 잔사와 부유물을 깨끗이 씻어내도록 세척하고, 세척된 생지황을 분쇄기에 넣어 생지황을 마쇄하며, 마쇄된 생지황을 착즙기에 넣어 생지황 즙액으로 얻는 것이다.
상기에서 준비된 익수영진고의 재료들과 천연 항생작용을 위한 재료들을 일정한 비율로 혼합하여 반죽하게 되는데, 이는 꽃송이버섯 10중량%, 인삼 10중량%, 복령 10중량%, 생지황 10중량%, 봉밀 10중량%, 천문동 10중량%, 맥문동 10중량%, 구기자 10중량%, 금은화 10중량% 및 황금 10중량%의 비율로 혼합되어 반죽하게 된다.
상기에서 반죽된 혼합물을 옹기에 넣은 다음 상기 옹기를 물이 채워진 중탕기에 넣게 되고, 상기 옹기가 투입된 중탕기를 2시간 동안 온도측정기(KP3001, Ziraffe, China)로 온도를 측정하여 100±2℃로 유지하면서 중탕을 실시하게 되고, 상기 중탕기에 채워진 물은 옹기가 80% 이상 잠길 수 있게 유지되도록 보충하는 것이다.
상기에서 중탕이 완료되면 최적의 맛과 기미를 지니기 위해 숙성기를 통해 2일 동안 실온에서 숙성시키게 되고, 상기의 숙성이 완료되면 영양간식 제품인 고(膏)의 제형으로 제조될 수가 있고, 더욱이 최적의 맛과 기미를 지니기 위해 2일 동안 실온에서 2차로 숙성시킨 다음 영양간식 제품을 완성시킬 수가 있는 것이다.
여기서, 상기의 중탕기를 통해 실시되는 중탕은 2시간 동안 온도측정기(KP3001, Ziraffe, China)로 온도를 측정하여 100±2℃로 유지하게 되는데, 2시간 동안 이루어지지 않으면 제대로된 중탕이 이루어지지 못한 문제가 있고, 2시간 초과하여 중탕하게 되면 경제적 및 제품으로서의 효율성이는 저하되는 문제가 있으며, 상기 중탕기에 채워진 물은 옹기가 80% 이상 잠길 수 있게 유지되도록 보충하게 되는데, 이는 원할한 중탕을 위해 물을 보충하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 숙성기를 통해 2일 동안 실온에서 숙성하게 되는데, 2일이 되지 않거나 2일을 초과하게 되면 제품으로서의 맛과 기미가 떨어지는 문제가 있다.
이에, 상기 숙성기에는 센서단(미도시)이 구비되어 있는데, 이는 한약재의 혼합물과 접촉하여도 녹슬지 않도록 스텐레스 재질로 이루어져 있고, 저장된 숙성물의 숙성정도를 감지하게 되는 것으로, 숙성정도의 시기가 2일이 지났는지 아니면 지나지 않는지를 감지할 수 있는 것이다.
이를 위해, 상기 센서단에 3개 이상의 주파수 신호를 공급하고 신호의 위상에 변위가 임계치 이상 발생하면 변환회로(미도시)를 거쳐 관리자의 단말기(미도시)로 신호를 전달하게 되어 이루어지고, 숙성기와 관리자의 단말기는 무선 또는 유선 통신망을 통해 신호를 전달할 수가 있는 것이다.
이하, 본 발명에 의해 실시되는 재료들에 대한 실험을 통해 영양간식의 유효성 및 안정성을 검증하기 위한 것이다.
즉, 면역력 강화에 효과가 있는 익수영진고 재료에 면역증진 효과가 우수하다고 알려진 베타글루칸이 최대로 함유된 꽃송이버섯을 배합함으로 꽃송이버섯의 면역활성 작용과 익수영진고와 천연 항생작용의 재료 작용이 결합된 효능을 반려동물에 적용할 수 있도록 제조된 영양간식을 제공하기 위한 것이다.
먼저, 한약재 배합물에 함유된 베타글루칸과 진세노사이드 함량을 측정하기 위한 것으로, 베타글루칸 측정에 사용된 시험물질은 한약재 배합물이며, 표준물질은 D-(+)-Glucose(Sigma, USA)를 사용하였고, 표준용액의 조제는 표준물질 54.79 mg 채취하여 최종 부피가 100 ml이 되도록 증류수에 완전히 녹여 547.3521 ug/ml 농도의 표준원액으로 만들었으며, 검량선 작성을 위해 표준원액을 증류수로 희석하여 하기 표 1의 농도 표준용액으로 만들었다.
STD Working Solution (ug/ml)
Name 1 2 3 4 5
D-(+)-Glucose 11.0958 16.6437 33.2873 66.5747 133.1494
이를 통해, 시험은 두개의 시료 및 공시험을 동시에 실시하였다. 시료 일정량을 삼각플라스크에 넣어 지방이 10 %이상인 경우 탈지하고, 당을 많이 함유한 경우 85 % 에탄올 용액으로 시료 20 mg당 10 ml씩으로 세척하고 증류수 10 ml을 가한다. 이 후 아밀라아제(20,000 ~ 60,000 U/ml) 약 0.1 mg을 취하고, 0.1 N 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH 6.9로 한 후 20℃에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다. 0.1 N 염산용액으로 pH 5.0으로 맞추고 셀룰라아제(1,600 U/ml)를 0.1 ml 넣고 37℃에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다. 프로테아제(600~1,300 U/ml) 약 0.1 ml를 넣고 0.1 N 수산화나트륨 용액으로 pH 7.5로 한 후 37℃에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다. 아밀로글루코시다제(10,000 U/ml) 약 0.1 ml 넣고 0.1 N 염산용액으로 pH 4.8로 한 후 60℃에서 2시간동안 진탕하여 효소 분해시킨다. 효소분해물에 95 % 에탄올 40 ml를 가하여 4℃에서 12시간 동안 침전시킨 후 용액을 원심분리(3,000 rpm, 20분)하여 시료의 침전물을 취한다. 시료의 침전물에 80 % 에탄올 50 ml를 가하여 4℃에서 1 시간동안 침전시켜 용액을 원심분리(3,000 rpm, 20분) 하고, 원심분리된 침전물에 증류수 10 ml를 가한 후 침전물을 혼합하여 균질화시킨다. 균질화된 용액을 증류수로 50 ml가 되도록 한 후，이를 적정농도가 되도록 희석하여 시험용액으로 한다.
발색 과정은 25 ml 시험관을 농도별 표준용액과 시험용액(공시험포함)으로 구분하여 각각 5 % 페놀용액 1 ml를 넣는다. 농도별 표준용액을 각각 1 ml씩 가하고, 시험용액은 시험용액 0.1 ml과 증류수 0.9 ml를 가한다. 공시험은 증류수 1 ml을 가하여 용액들을 10초간 잘 흔들어 섞는다. 시험관에 각각 황산 5 ml을 가하여 혼합하고 실온에서 20분간 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 470 nm에서 홉광도를 측정한다. 분석결과는 하기 표 2의 계산식을 이용하여 산출하였다.
베타글루칸 =
(mg/g) 		시험용액의 농도(ug/ml) × 최종부피(ml) × 희석배수 × 0.9 × 10 × 규격
시료채취량(g) × 1000
* 베타글루칸 전환계수 (162/180) = 0.9
그리고, 진세노사이드 측정에 사용된 시험물질은 한약재 배합물을 사용하였으며, 표준물질은 Ginsenoside Rb1(Wako, Japan), Ginsenoside Rg1(Wako, Japan), Ginsenoside Rg3(Chromadex, USA)를 사용하였다.
표준용액의 조제는 각 표준물질을 Rg1 9.13 mg, Rb1 7.08 mg, Rg3 9.04 mg을 채취하여 최종 부피가 10 ml이 되도록 완전히 녹여 Rg1 911.17 ug/ml, Rb1 700.21 ug/ml, Rg3 812.69 ug/ml 농도의 표준원액으로 만들었으며, 검량선 작성을 위해 표준원액을 25ml 70 % 메탄올에 완전히 용해시키고 25 ml 총 50 ml로 정용한 후 멤브레인 필터(0.45 um)로 여과한 것을 하기 표 3의 농도의 시험용액으로 만들어 사용하였다.
STD Working Solution (ug/ml)
Name 1 2 3 4 5
Ginsenoside Rg1 1.2149 6.0745 30.3725 151.8623 303.7247
Ginsenoside Rb1 0.9336 4.6681 23.3404 116.7020 233.4040
Ginsenoside Rg3 1.0836 5.4180 27.0899 135.4493 270.8987
시료 일정량을 70 % 메탄올 25 ml로 완전히 용해시키고 총 50 ml로 맞춘 후 멤브레인 필터(0.45 um)로 여과한 것을 시험용액으로 하였다.
분석을 위해 S-DAD/FLD HPLC system(Shimadzu, Japan)를 활용하였으며, Supelco discovery C18 column(4.6 mm x 250 mm, Sigma, USA)을 장착하여 분석을 진행하였다. 주입된 시료는 10 μL였으며, 온도는 40℃로 유지되었으며 1 ml/min 속도로 70분간 진행되었다. 이동상은 acetonitrile과 증류수가 사용되었으며, 5 min(20 : 80), 20 min(23 : 77), 25 min(30 : 70), 30 min(40 : 60), 35 min(50 : 50), 60 min(85 : 15), 62 min(85 : 15), 65 min(20 : 80), 70 min(20 : 80) 로 설정되었으며 분석결과는 하기 표 4의 계산식을 이용하여 산출하였다.
Ginsenoside =
(mg/g) 		시험용액의 농도(ug/ml) × 최종부피(ml) × 희석배수 × 1
시료채취량(g) × 1000 1000
한약재 배합물의 베타글루칸 성분을 분석한 결과 하기 표 5에 나타난 바와 같이, 362.3 mg/g의 함유량이 관찰되었다
β-glucan Concentration
(ug/ml) 		Volume
(ml) 		Sampling
(g) 		Dilution Result
(mg/g)
1 97.0510 50 0.1178 10 363.10
2 84.8330 50 0.1056 10 361.50
Average 362.30
한약재 배합물의 진세노사이드 Rg1, Rb1, Rg3 성분을 분석한 결과 하기 표 6에 나타난 바와 같이, Rg1, Rb1 성분은 검출되지 않았으며, Rg3 0.4184 mg/g 함유량이 관찰되었다.
Ginsenoside Concentration
(ug/ml) 		Volume
(ml) 		Sampling
(g) 		Dilution Result
(mg/g)
Rg1 0.0000 50 3.3743 1 0.0000
Rb1 0.0000 50 3.3743 1 0.0000
Rg3 28.2331 50 3.3743 1 0.4184
Rb1, Rg1, Rg3 total 0.4184
생물체내에서 생성되는 활성산소는 생체조직 및 세포를 손상시키는 산화력이 강한 독성물질로서 활성산소내에 free radical이 포함되어 있는데 이러한 free radical을 제거하게 되는 작용을 항산화작용이라고 한다. 본 시험에서는 한약재 배합물에 대한 항산화 효과를 평가하기 위해 DPPH를 이용하여 free radical소거 활성 측정시험을 실시하였다.
한약재 배합물에 대한 항산화 효과 중 하나인 활성 산소에 포함된 free radical 소거효과를 평가하기 위해 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)을 이용한 free radical 소거활성 측정 시험을 실시하였다.
한약재 배합물 0.05%，0.5%，1% 및 5% 농도의 DPPH free radical 소거 활성도를 측정한 결과 39.51%, 88.28%, 81.51% 및 90.61% 의 활성을 보였다.
이상의 결과로부터 DPPH free radical 소거활성 측정시험에서 시험물질인 한약재 배합물은 0.05%，0.5%，1% 및 5%의 농도에서 DPPH free radical 소거 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
본 시험에 사용된 시험물질은 한약재 배합물이며, 시험 기간동안 실온(1~30℃)에 보관하였고, 멸균증류수를 이용하여 조제하였다.
항산화 측정을 위한 양성대조물질은 L-Ascorbic acid(Sigma, USA)를 사용하였으며, 시험에 사용된 시약은 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(Alfa aesar)와 Ethanol(DUKSAN)이 사용되었다.
한약재 배합물을 순도 환산하지 않고 그대로 이용하였으며, 한약재 배합물은 0.05%, 0.5%, 1%, 5%, L-Ascorbic은 0.0005%, 0.001%, 0.0015%, 0.002% 농도로 각 각 멸균증류수를 이용하여 조제하였다. DPPH는 Ethanol을 이용하여 0.2 mM 농도로 조제하였다.
시험군은 한약재 배합물과 L-Ascrobic acid의 각 처리농도로 구성되었다(ㅎTab하기 표 7 참조).
Group Name Concentration (%)
G1
(TS)		 Herbal medicine mix. 0.05, 0.5, 1, 5
G2
(PC)		 L-Ascorbic 0.0005, 0.001, 0.0015, 0.002
TS : Test substance, PC : Positive control
96 well plate에 각 농도별 조제물과 0.2 mM DPPH 및 Ethanol을 1:1로 혼합하여 넣은 후 실온에서 30분간 차광상태로 반응시키고 원심분리하여 상층액을 취한 뒤 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. DPPH free radical 소거활성율(%)은 아래의 식을 이용하여 산출하였다.
DPPH free radical scavenger activity (%) = 1- A/B × 100
A : 시험물질의 흡광도, B : 공시료의 흡광도
각 실험 결과는 3회 반복 측정하여 평균과 표준편차를 나타내었으며, SPSS 통계 프로그램(Ver. 19.0)을 이용하여 통계분석을 수행하였다. 먼저, Levene`s test를 수행한 후, one way ANOVA test를 실시하여, 실험군간 유의성이 확인되면 분산의 동질성 유무에 따라 사후검점(분산이 동질한 경우, Duncan`s 다중검정, 분산이 이질한 경우, Dunnett`s T3)을 실시하였으며, 신뢰구간은 95 %로 설정하였다.
시험물질 가미방(G1)을 농도별 (0.05%, 0.5%, 1% 및 5%)로 처리하여 DPPH free radical 소거활성도를 측정한 결과, 39.51%, 88.28%, 81.51% 및 90.61% 의 활성을 보였으며, IC50(50 % 활성율을 나타내는 농도)을 산출한 결과, 0.146%의 농도로 산출되었고, 양성대조 L-Ascorbic acid (G2)을 농도별 (0.05%, 0.5%, 1% 및 5%)로 처리하여 DPPH free radical 소거활성도를 측정한 결과, 20.02%, 44.25%, 68.20% 및 88.88% 의 활성을 보였으며, IC50 (50% 활성율을 나타내는 농도)을 산출한 결과, 0.0011% 의 농도로 산출되었다(하기 표 8, 도 1 및 도 2 참조).
Group N Concentration OD715 DPPH free radical scavenger activity (%)
Mean±SD Mean±SD
G1
(TS)		 3 0 0.755±0.006 -
3 0.05 0.457±0.003 39.51±0.90*
3 0.5 0.088±0.010 88.28±1.44*
3 1 0.140±0.008 81.51±1.02*
3 5 0.071±0.033 90.61±4.27*
G2
(PC)		 3 0 0.715±0.027 -
3 0.0005 0.572±0.028 20.02±1.24*
3 0.001 0.398±0.007 44.25±3.12*
3 0.0015 0.227±0.010 68.20±0.64*
3 0.002 0.080±0.008 88.88±0.67*
TS : Test substance, PC : Positive control, - : Not applicable, N : Number of well, S.D. : Standard deviation, * : Significantly difference from Control at p<0.05
한약재 배합물에 대한 free radical 소거 효과를 평가하기 위해 DPPH를 이용한 free radical 소거활성 측정시험을 실시하였다.
시험물질 한약재 배합물를 0.05 %，0.5 %，1 % 및 5 % 농도에서 free radical 소거 효과를 살펴보기 위해 DPPH free radical 소거활성율을 측정한 결과，39.51 %, 88.28 %, 81.51 % 및 90.61 % 의 활성을 나타냈다. 양성대조물질은 0.0005 %, 0.001 %, 0.0015 % 및 0.002 % 농도에서 free radical 소거 효과가 20.02 %, 44.25 %, 68.20 % 및 88.88 % 로 나타났고， IC5o (50 % 활성율을 나타내는 농도)을 산출한 결과，0.0011 % 의 농도로 산출되었다.
이상의 결과로부터 DPPH free radical 소거활성 측정시험에서 시험물질인 한약재 배합물은 0.05 %，0.5%，1% 및 5% 의 농도에서 DPPH free radical 소거 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
본 시험은 한약재 배합물에 대해서 염증 유발된 마우스 대식세포에서의 염증억제 유효성을 평가하기 위하여 세포 내 염증성 cytokine 발현 확인 시험을 실시하였다.
세포 내 염증성 cytokine 발현 확인 시험을 진행하기에 앞서 한약재 배합물의 세포독성 시험을 진행하였다. 한약재 배합물을0.25, 0.5, 1, 2.5mg/mL 및 5mg/mL의 농도로 처리한 결과, 5mg/mL 이하 농도에서 70% 이상의 세포생존율이 관찰되었다. 이 결과를 토대로 의뢰자와 협의 하에 한약재 배합물의 최고농도는 5mg/mL로 선택하였다.
세포 내 염증성 cytokine 발현 확인시험에 적용된 한약재 배합물의 농도는 0.625, 1.25, 2.5 mg/mL 및 5 mg/mL로 설정하여 시험을 진행하였다. LPS로 염증 자극이 유발된 RAW 264.7 세포주에 한약재 배합물을 농도별로 처리한 후 발현된 cytokine 결과는 다음과 같다.
TNF-alpha의 경우 유발대조군과 비교하여 1.25, 2.5 mg/mL 및 5 mg/mL 시험물질 처리군에서 통계적으로 유의한 감소결과가 관찰되어 염증 억제에 관여하는 것으로 사료된다.
IL-6의 경우 유발대조군과 비교하여 0.625, 1.25, 2.5 mg/mL 및 5 mg/mL 시험물질 처리군에서 통계적으로 유의한 감소결과가 관찰되어 염증 억제에 관여하는 것으로 사료된다.
이상의 결과로부터 시험물질인 한약재 배합물에 대해서 염증성 cytokine 발현을 확인한 결과, 염증 cytokine 발현 억제에 영향을 미치는 것으로 사료되며, 추가적인 기전연구를 통해 이를 뒷받침할 수 있는 연구결과가 필요할 것으로 사료된다.
본 시험은 한약재 배합물의 염증억제에 대한 유효성을 평가하기 위하여 마우스 대식세포를 이용하여 세포 내 염증지표 발현을 확인하였다.
시험물질은 5 개 농도(0.25, 0.5, 1, 2.5 mg/mL 및 5 mg/mL)로 희석하여 하기 표 9와 같이 실시하였다.
시험군 물질명 투여농도
G1 음성대조군 - -
G2 시험물질 처리군 한약재 배합물 0.25 mg/mL
G3 0.5 mg/mL
G4 1 mg/mL
G5 2.5 mg/mL
G6 5 mg/mL
96 well plate에 세포를 1×105 (200 μL/well)개로 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 시험물질이 농도별로 포함된 무혈청배지로 교체하여 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다. MTT 시약(0.5 mg/mL)을 200 μL/well 분주하고 5 % CO2 배양기에서 3 시간 배양하였다. 배양이 끝나면 배지를 제거해주고 DMSO 용액을 200 μL/well 넣고 plate shaker에서 10~20 분 추출하였다. 추출이 끝나고 570 nm 파장에서 ELISA 측정하였다.
세포 생존율은 하기 식에 따라 산출하였다.
세포 생존율(%) = 시료 첨가군의 O.D. at 570nm / 시료 무첨가군의 O.D. at 570nm × 100
염증성 Cytokine 발현 확인 시험을 위해 시험물질은 4 개 농도(0.625, 1.25, 2.5 mg/mL 및 5 mg/mL)로 희석하여 하기 표 10과 같이 실시하였다.
시험군 물질명 투여농도
G1 음성대조군 -
G2 유발대조군 LPS 200 ng/mL
G3 시험물질 처리군 한약재 배합물 0.625 mg/mL
G4 1.25 mg/mL
G5 2.5 mg/mL
G6 5 mg/mL
24 well plate에 세포를 2×105 (1 mL/well)개로 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 24 시간 배양이 끝난 후, 시험물질이 농도별로 포함된 무혈청배지로 교체하여 37℃, 5 % CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다. 유발대조군 및 시험물질 처리군에는 LPS를 처리하여 염증을 인위적으로 유발시켰다.
배양이 끝난 후 모든 군의 세포 배양액을 수거하고, enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) kit(R&D SYSTEMS, USA)를 이용하여 cytokine 발현을 확인하였으며 제품 정보는 하기 표 11과 같다.
제품명 제품번호
TNF-alpha MTA00B
IL-6 M6000B
본 시험에서는 염증성 cytokine 발현 측정 결과에 대해서 SPSS 통계 프로그램(Ver. 19.0)을 이용하여 통계분석을 수행하였다. 먼저, 분산의 동질성을 평가하기 위해 Levene's test를 수행한 후, one way ANOVA test를 실시하여 각 시험군간 유의성을 확인하였다. One way ANOVA test 수행한 결과, 시험군간 유의성이 확인되지 않으면, 추가적인 통계처리를 수행하지 않았다. 시험군 간의 유의성이 확인될 경우, 분산의 동질성 유무에 따라 사후검정 (분산이 동질한 경우 Scheffe 다중검정, 분산이 이질한 경우, Dunnett's T3)을 실시하였다.
하기 표 12와 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 시험물질을 0.25, 0.5, 1, 2.5 mg/mL 및 5 mg/mL의 농도로 처리한 결과, 각각의 농도에서 101.58 ± 2.57, 100.75 ± 3.40, 99.19 ± 4.15, 94.66 ± 3.59 % 및 83.22 ± 1.34 %로 세포생존율이 관찰되었다.
Group Subtance Dose OD Value (507 nm) % of Control
(%)
G1 Control - Mean 2.663 100.00
S.D. 0.092 3.46
N 9 9
G1 한약재 배합물 0.25 mg/mL Mean 2.705 101.58
S.D. 0.068 2.57
N 9 9
G2 0.5 mg/mLL Mean 2.683 100.75
S.D. 0.091 3.40
N 9 9
G3 1 mg/mL Mean 2.642 99.19
S.D. 0.111 4.15
N 9 9
G4 2.5 mg/mL Mean 2.521 94.66
S.D. 0.096 3.59
N 9 9
G5 5 mg/mL Mean 2.216 83.22
S.D. 0.036 1.34
N 9 9
G1 : 음성대조군, G2 : 유발대조군, G3~G6 : 시험물질 처리군, S.D. : Standard deviation, LPS :　Lipopolysaccharide, *: Significant differences as compared with G2 (P<0.0５
하기 표 13과 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 시험물질을 0.625, 1.25, 2.5 mg/mL 및 5 mg/mL의 농도로 처리한 결과, 각각의 농도에서 608.21 ± 13.91, 591.59 ± 13.32, 581.10 ± 13.72 pg/mL 및 508.36 ± 19.94 pg/mL로 TNF-alpha 발현 결과가 관찰되었다. 염증 유발물질을 200 ng/mL의 농도로 처리한 결과, 626.40 ± 19.12 pg/mL로 TNF-alpha 발현 결과가 관찰되었다.
Group Substance Dose IL-6 (pg/mL)
Mean ± S.D.
G1 Control 4９.１４±1.86
G2 LPS 200 ng/mL 626.40±19.12
G3 한약재 배합물 0.625 mg/mL 608.21±13.91
G4 1.25 mg/mLL 591.59*±13.32
G5 2.5 mg/mL 581.10*±13.72
G6 5 mg/mL 508.36*±19.94
G1 : 음성대조군, G2 : 유발대조군, G3~G6 : 시험물질 처리군, S.D. : Standard deviation, LPS :　Lipopolysaccharide, *: Significant differences as compared with G2 (P<0.0５
하기 표 14와 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 시험물질을 0.625, 1.25, 2.5 mg/mL 및 5 mg/mL의 농도로 처리한 결과, 각각의 농도에서 375.71 ± 6.03, 310.39 ± 3.35, 168.53 ± 4.30 pg/mL 및 14.20 ± 1.67 pg/mL로 IL-6 발현 결과가 관찰되었다. 염증 유발물질을 200 ng/mL의 농도로 처리한 결과, 458.44 ± 15.64 pg/mL로 IL-6 발현 결과가 관찰되었다.
Group Substance Dose IL-6 (pg/mL)
Mean ± S.D.
G1 Control 11.50±1.28
G2 LPS 200 ng/mL 458.44±15.64
G3 한약재 배합물 0.625mg/mL 375.71*±6.03
G4 mg1.25/mL 310.39*±3.35
G5 mg/2.5mL 168.53*±4.30
G6 mg/m5L 14.20*±1.67
G1 : 음성대조군, G2 : 유발대조군, G3~G6 : 시험물질 처리군, S.D. : Standard deviation, LPS :　Lipopolysaccharide, *: Significant differences as compared with G2 (P<0.0５
본 시험은 시험물질인 한약재 배합물의 염증억제에 대한 유효성을 평가하기 위하여 세포 내염증성 cytokine 발현 확인시험을 실시하였다.
한약재 배합물의 세포독성을 확인한 결과, 한약재 배합물을 0.25, 0.5, 1, 2.5 mg/mL 및 5 mg/mL의 농도로 처리하였더니 5 mg/mL 이하 농도에서 70 % 이상의 세포생존율이 관찰되었다. 이 결과를 토대로 의뢰자와 협의 하에 RAW 264.7 세포를 이용한 세포 내염증성 cytokine 발현 확인시험에서 사용되는 시험물질의 최고 농도는 5 mg/mL로 선택하였다.
LPS로 염증 자극이 유발된 RAW 264.7 세포주에 한약재 배합물을 농도별로 처리한 후발현된 cytokine 결과는 다음과 같다.
TNF-alpha의 경우 유발대조군(626.40 ± 19.12 pg/mL)과 비교하여 1.25 mg/mL(608.21 ±13.91 pg/mL), 2.5 mg/mL(591.59 ± 13.32 pg/mL) 및 5 mg/mL(581.10 ± 13.72 pg/mL) 시험물질 처리군에서 통계적으로 유의한 감소결과가 관찰되어 염증 억제에 관여하는 것으로 사료된다.
IL-6의 경우 유발대조군(458.44 ± 15.64 pg/mL)과 비교하여 0.625 mg/mL(375.71 ± 6.03 pg/mL), 1.25 mg/mL(310.39 ± 3.35 pg/mL), 2.5 mg/mL(168.53 ± 4.30 pg/mL) 및 5 mg/mL(14.20 ± 1.67 pg/mL) 시험물질 처리군에서 통계적으로 유의한 감소결과가 관찰되어 염증 억제에 관여하는 것으로 사료된다.
이상의 결과로부터 시험물질인 한약재 배합물에 대해서 염증성 cytokine 발현을 확인한 결과, 염증 cytokine 발현 억제에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
한편, 한약재 배합물에 대한 단회경구투여독성시험을 실시하기 위해 SD계 rat를 사용하여 식품의약품안전처고시 중“의약품등의 독성시험기준”에 따라 2000 mg/kg B.W. 용량을 고용량으로 설정하고, 공비를 2 로 두어 1000 및 500 mg/kg B.W. 으로 중용량 및 저용량을 설정하여 암·수 각각에 단회경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 14 일간 사망률, 일반증상, 체중변화를 관찰하였으며, 생존동물은 부검하여 육안적으로 장기의 이상 유무를 검사하였다.
본 시험은 한약재 배합물을 대상으로 rat을 이용한 단회경구투여 시 나타나는 독성 징후를 관찰하며, 개략의 치사량을 알아보기 위해 실시하였다.
이에, 본 실험은 SD(Sprague Dawley) Rat를 이용하였으며, 투여 시 성별 및 동물 수는 수컷 22마리, 암컷 22 마리 5주령 rat로 체중범위는 수컷 142.2 g ~ 156.1 g / 암컷 124.3 g ~ 135.3 g 이었다. 본 시험은 동물보호법 [법률 제16977호 (2020-02-11, 일부개정)] 및 실험동물에 관한 법률 [법률 제15944호 (2018-12-11, 일부개정)]에 근거한 (재)한국화학융합시험연구원 화순의 동물윤리위원회에 의해 승인되었다(IAC-2021-2415).
본 실험에 사용된 시험물질은 한약재 배합물이며, 본 시험물질을 칭량한 후 부형제로는 멸균증류수(주사용수)를 사용하였다.
각 Stainless steel cage (310W×500D×200H) 당 3마리 이하를 사육하였으며, 평균 온도 21.4~23.3℃, 상대습도 51.9~62.1%, 환기횟수 10~20회/h, 조명주기 12시간 간격으로 광암 조건을 주었으며(광 08:00~20:00/암 20:00~08:00), 조도150~300 Lux를 유지 하였고, 사료는 방사선 멸균된 Rodent Diet 20 5053 [Labdiet, USA]를, 음수는 R/O수를 자유롭게 섭취시켰다.
한약재 배합물을 순도환산하지 않고 그대로 이용하여 본 시험물질을 칭량한 후 부형제인 멸균증류수에 50 mg/ml, 100 mg/ml 및 200 mg/ml 농도로 조제하여 사용하였다.
본 시험의 시험물질 투여량은 식품의약품안전처 고시 중 “의약품 등의 독성시험기준19”에 근거하여 고용량 투여군을 2000 mg/kg B.W. 로 설정하고, 공비를 2 로 하여 중용량은 1000 mg/kg B.W., 저용량은 500 mg/kg B.W. 으로 각각 설정하였다. 대조군으로는 시험물질 투여군과 동일한 액량의 부형제를 투여하는 부형제 대조군을 두었다(하기 표 15 참조).
Group Sex Number Number of animals Injection volume
(mg/kg B.W.) 		Injection liquid measure
(ml/kg B.W.) 		Injection route
G1 male 1101 -1105 5 0 10 oral
female 2101-2105 5
G2 male 1201-1205 5 500
female 2201-2205 5
G3 male 1301-1305 5 1,000
female 2301-2305 5
G4 male 1401-1405 5 2,000
female 2401-2405 5
G1: control group, G2-G4: injected Herbal medicine mix. group. Four different dosages of Herbal medicine mix. were orally administered in this study respectively(G1:0 mg/kg, G2:500 mg/kg, G3:1,000 mg/kg G4:2,000 mg/kg). B.W. : Body weight
모든 동물에 대하여 1일 1회 관찰하였으며 투여 후 14일간 관찰하였다. 단, 투여 당일에는 투여 후 0.5, 1, 2, 3 및 4시간에 관찰하였다.
체중은 도입 시, 군 분리 시, 시험물질 투여 개시 직전, 투여 개시 후 7일 및 14일째에 측정하였다.
투여 후 14일째 모든 생존동물의 외관 검사를 실시한 후, Isoflurane(아이프란액, 하나제약) 마취하에 방혈치사 하여 육안으로 장기를 검사하였다. 이상 장기는 발생하지 않아 조직병리학적 검사는 실시하지 않았다.
이에, 본 시험에서는 체중 데이터에 대해 SPSS(ver 19.0)통계 프로그램을 이용하여 통계처리를 하였다. 먼저, Levene’s test를 통해 동질성 검정을 수행하였고, 이후, one way ANOVA 검사를 수행하였다. one-way ANOVA 검사에서 유의적인 차이가 관찰되지 않아, 사후검정은 수행하지 않았다.
이에, 식품의약품안전처 고시 제2018-93호 (2018-1-21) “비임상시험관리기준”과 OECD“Principles of God Laboratory Practice, ENV/MC/CHEM (98)17 (as revised in 197)”을 따라 진행되었으며, 시험방법은 식품의약품안전처 고시 제2017-71호(2017-08-30) “의약품 등의 독성시험기준” 단회투여독성시험을 기준으로 시행되었다.
실험기간 중 시험물질 투여에 의한 사망동물은 관찰되지 않았다. 일반증상 관찰결과, 모든 투여군에서 이상소견은 관찰되지 않았다(하기 표 16 및 표 17 참조).
Group Dose
(mg/kg B.W.) 		Mortality
Male Female
G1 0 0 %
(0/5)a 		0 %
(0/5)
G2 500 0 %
(0/5)		 0 %
(0/5)
G3 1000 0 %
(0/5)		 0 %
(0/5)
G4 2000 0 %
(0/5)		 0 %
(0/5)
G1: control group, G2-G4: injected Herbal medicine mix.. Four different dosages of Herbal medicine mix. were orally administered in this study respectively(G1:0 mg/kg, G2:500 mg/kg, G3:1,000 mg/kg G4:2,000 mg/kg).
B.W. : Body weight, a : Number of dead animals/Number of tested animals
Group Dose
(mg/kg B.W.) 		Sex Number
of animals 		Clinical signs
G1 0 Male 5 Normal
Female 5 Normal
G2 500 Male 5 Normal
Female 5 Normal
G3 1000 Male 5 Normal
Female 5 Normal
G4 2000 Male 5 Normal
Female 5 Normal
G1: control group, G2-G4: injected Herbal medicine mix. group. Four different dosages of Herbal medicine mix. were orally administered in this study respectively(G1:0 mg/kg, G2:500 mg/kg, G3:1,000 mg/kg G4:2,000 mg/kg).
하기 표 18에서 확인할 수 있는 바와 같이, 체중측정 결과, 모든 투여군에서 정상적인 체중증가가 관찰되었다.
Group Dose
(mg/kg B.W.) 		Sex Day(s) after administration
0 7 14
G1 0 Male Mean 196.2 291.9 345.9
S.D. 6.0 9.1 9.1
N 5 5 5
Female Mean 157.0 210.6 230.0
S.D. 6.7 13.6 10.5
N 5 5 5
G2 500 Male Mean 192.6 288.6 341.2
S.D. 3.9 13.4 18.6
N 5 5 5
Female Mean 156.1 203.7 225.9
S.D. 5.2 14.3 15.8
N 5 5 5
G3 1000 Male Mean 199.2 295.7 354.9
S.D. 7.4 10.7 16.1
N 5 5 5
Female Mean 155.9 202.7 230.2
S.D. 7.5 12.3 13.0
N 5 5 5
G4 2000 Male Mean 195.3 292.7 345.3
S.D. 5.7 10.1 15.1
N 5 5 5
Female Mean 155.7 206.2 228.7
S.D. 4.5 14.9 22.6
N 5 5 5
G1: control group, G2-G4: injected Herbal medicine mix. group. Four different dosages of Herbal medicine mix. were orally administered in this study respectively(G1:0 mg/kg, G2:500 mg/kg, G3:1,000 mg/kg G4:2,000 mg/kg).
B.W. : Body weight, N：Number of animals, S.D. : Standard deviation
하기 표 19에서 확인할 수 있는 바와 같이, 주요 장기에 대한 육안적 검사결과, 모든 투여군에서 이상소견은 관찰되지 않았다.
Group Dose
(mg/kg B.W.) 		Sex Removal reason Necropsy findings
External findings Internal findings
G1 0 Male Terminal sacrifice(5)a No gross findings (5) No gross findings (5)
Female Terminal sacrifice(5) No gross findings (5) No gross findings (5)
G2 500 Male Terminal sacrifice(5) No gross findings (5) No gross findings (5)
Female Terminal sacrifice(5) No gross findings (5) No gross findings (5)
G3 1000 Male Terminal sacrifice(5) No gross findings (5) No gross findings (5)
Female Terminal sacrifice(5) No gross findings (5) No gross findings (5)
G4 2000 Male Terminal sacrifice(5) No gross findings (5) No gross findings (5)
Female Terminal sacrifice(5) No gross findings (5) No gross findings (5)
G1: control group, G2-G4: injected Herbal medicine mix. group. Four different dosages of Herbal medicine mix. were orally administered in this study respectively(G1:0 mg/kg, G2:500 mg/kg, G3:1,000 mg/kg G4:2,000 mg/kg).
B.W. : Body weight, a：Number of animals
한약재 배합물에 대한 단회경구투여독성시험을 실시하기 위해 SD계 rat를 사용하여 식품의약품안전처고시 중 “의약품등의 독성시험기준”에 따라 2000 mg/kg B.W. 용량을 고용량으로 설정하였고, 공비를 2 로 두어 1000 및 500 mg/kg B.W. 으로 중용량 및 저용량을 설정하여 암·수 각각에 단회경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 14 일간 사망률, 일반증상, 체중변화를 관찰하였으며, 생존동물은 부검하여 육안적으로 장기의 이상 유무를 검사한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
실험기간 중 시험물질 투여에 의한 사망동물 및 이상소견은 관찰되지 않았ㄱ고, 체중측정 결과 부형제 대조군과 비교하였을 때, 모든 시험물질 투여군에서 통계학적으로 유의적인 차이는 관찰되지 않았으며, 부검소견 결과, 모든 투여군에서 이상소견은 관찰되지 않았다.
이상의 결과로부터 rat에 한약재 배합물를 단회경구투여 시 시험물질 투여와 관련된 독성학적 소견이 인정되지 않았으므로 개략의 치사량은 암·수 모두 2000 mg/kg B.W. 이상으로 사료된다.
또한, 본 시험은 rat를 이용한 면역기능 억제 동물 모델에 시험물질인 한약재 배합물을 28 일간 경구로 반복 투여하여 면역기능 개선 효과를 평가하기 위하여 실시하였다. 일반증상 관찰, 체중(증체량) 측정, 사료 및 음수 섭취량 측정, 장기중량 측정, 혈액학적 검사 및 Serum cytokine 측정 등을 실시하여 그에 대한 결과를 평가하였다.
투여기간 동안 시험물질 투여에 의한 사망 및 빈사동물은 관찰되지 않았다. 투여기간 동안 관찰된 하복부오염, 피모오염, 탈모의 증상은 시험물질 투여에 의한 영향이 아닌 면역억제물질 (cyclophosphamide monohydrate)의 투여에 의한 영향으로 사료되었다. 이러한 증상은 모든 시험물질 투여군에서 관찰되었으나 고용량 투여군의 경우, 관찰된 증상의 정도 (grade)가 경도 (slight)의 증상으로 관찰된 점을 고려할 때 시험물질 투여가 증상의 정도에 영향을 준 것으로 사료되었다.
체중 측정결과, 면역억제물질의 투여에 의한 체중의 감소가 지속되었으나 증체의 경우, 중용량 및 고용량군 투여군에서 면역억제군과 비교하였을 때, 증체량이 증가하는 경향이 관찰되었고 이러한 변화는 시험물질 투여에 의한 영향으로 사료되었다. 사료 섭취량, 음수 섭취량, 부검 시 육안소견 관찰결과, 모든 시험물질 투여군에서 유의적인 변화 및 소견은 관찰되지 않았다.
혈액학적 검사 결과, MCV (적혈구 평균 용적), MCH (평균혈구혈색소)에서 유의적인 증가가 관찰되었고 WBC (백혈구)에서 시험물질 투여용량에 비례하여 증가하는 경향이 관찰되었다. 이러한 변화는 Cyclophosphamide는 면역억제 작용과정에 대하여 시험물질이 면역기능과 관련된 영향을 미치는 것으로 사료되었다. 다만, Serum cytokine을 측정한 결과, INF alpha, IL1 beta 및 TNF alpha에서 유의적인 변화는 관찰되지 않았다.
이상의 결과로부터, cyclophosphamide에 의한 면역억제 유발모델에서 일반증상 정도의 개선, 증체량의 증가, 면역관련 혈액학적 항목의 증가 관찰되었으며 이러한 변화는 시험물질인 한약재 배합물의 투여에 의한 영향으로 사료되었다.
이에, 본 시험은 rat를 이용한 면역기능 억제 동물 모델에서 시험물질인 한약재 배합물을 28 일간 경구로 반복 투여하여 면역기능 개선 효과를 평가하기 위하여 실시하였다.
본 시험에 사용되는 Crl:CD(SD) rat는 유효성평가 시험에 많이 사용되고 있으며, 비교할 많은 기초자료가 축적되어 있어 선택하였고, 실험동물 도입 시 모든 개체의 건강상태에 대한 외관검사를 실시하고 순화기간을 거쳐 체중변화 및 일반 건강상태를 관찰한 후 건강한 개체를 선별하여 시험에 사용하였으며, 유성펜을 이용하여 꼬리에 표시하였고, Cage는 개체식별카드를 부착하여 식별하였으며, 순화 후 건강한 개체를 선별하여, 각 군간 평균체중 및 표준편차가 균일하도록 무작위법으로 군 분리를 실시하였다.
그리고, 동물실의 온·습도는 자동 온습도 측정기에 의하여 매 30 분마다 측정 되었으며, 조도 등의 환경조건은 표준작업지침서에 따라 측정하였다. 동물실의 환경 측정 결과, 시험에 영향을 미치는 요인은 발견되지 않았다.
사료는 방사선 멸균된 Rodent Diet 20 5053 [Labdiet, USA]를, 음수는 R/O수를 자유 섭취시켰다. 사료는 제조업체의 정기적 검사에 따른 분석성적서를 사료공급자로부터 받아 확인하였고, 음수는 (재)한국화학융합시험연구원 화순의 표준작업지침서에 따른 정기적 검사를 통해 확인한 결과 시험에 영향을 미치는 요인은 발견되지 않았다.
본 발명에 따라 제조된 제품의 시험물질 칭량한 후, 투여 시 필요한 농도인 7.5 mg/mL, 15.0 mg/mL 및 30.0 mg/mL의 용량 (w/v)으로 부형제 [멸균증류수 (주사용수)]를 가해 조제하였다.
하기 표 20에 나타난 바와 같이 군을 구성하였다.
군 물질명 동물번호 성 투여량
(mg/kg·B.W./day)		 투여액량
(mg/kg·B.W./day)		 투여경로
G1 부형제대조군 1101 - 1107 수컷 0 10 경구
G2 면역억제물질투여군 1201 - 1207 수컷 0 10
G3 저용량투여군 1301 - 1307 수컷 75 10
G4 중용량투여군 1401 - 1407 수컷 150 10
G5 고용량투여군 1501 -1507 수컷 300 10
G1 : 부형제대조군, G2 : 면역억제물질 및 부형제 투여군, G3 - G5 : 면역억제물질 및 시험물질 투여군
시험의뢰자의 요청에 따라 300 mg/kg·B.W.를 고용량으로 설정하고, 공비를 2 로 적용하여 150 mg/kg·B.W., 75 mg/kg·B.W.를 중용량, 저용량의 투여용량으로 각각 설정하였다. 부형제 대조군과 면역억제물질 및 부형제 투여군에는 동일한 액량의 부형제를 투여하였다.
투여경로는 시험물질의 임상예정경로인 경구로 투여하였다. 조제된 시험물질은 투여 전 및 투여 중에 magnetic stirrer를 이용하여 지속적으로 교반하고, sonde를 부착한 주사기를 이용하여 위내에 직접 투여하였다. 7 일/주, 1 회/일로 하여 28 일간 매일 투여하였다.
투여 시 가장 최근에 측정한 체중을 기준으로 투여액량 (10 mL/kg B.W.)을 계산하였다. 예비실험을 통해 Cyclophosphamide monohydrate를 투여 7 일 후 혈액검사를 통해 면역기능의 억제를 확인하였다.
실험기간 중, 모든 동물에 대하여 매일 1 회 이상 일반증상의 변화, 독성증상 및 사망유무의 관찰을 실시하였다.
체중은 도입 시, 군 분리 시, 투여일 (투여 전), 투여 개시 후 매주 1 회 및 부검 당일에 측정하였다. 사료 섭취량은 투여 기간동안 매주 1 회 측정하였다. 측정방법은 사료를 급여한 후 당일 급여량과 익일 잔량을 측정하였다.
음수 섭취량은 투여 기간동안 매주 1 회 측정하였다. 측정방법은 사료를 급여한 후 당일 급여량과 익일 잔량을 측정하였다.
모든 생존동물은 Isoflurane으로 마취하여 채혈 및 안락사 시킨 다음 체표 및 모든 체공(external surface & all orifices), 두개강(cranial cavity), 흉강 및 복강의 모든 장기(thoracic and abdominal cavities & their contents)에 대하여 육안적 검사를 실시하였다.
모든 동물에 대하여 부검 시 육안적 검사를 실시한 후에 간장, 비장, 심장, 신장 및 폐의 장기에 대한 습중량을 측정하였고, 절식체중에 대한 상대 장기중량비를 측정하였다. 좌우가 있는 신장은 좌우를 별도로 측정하여 무게를 합산 산출하였다.
모든 동물에 대하여 채혈 전에 약 18 시간이상 절식시킨 실험동물을 isoflurane (아이프란액, 하나제약)를 이용하여 마취시킨 후 복대동맥으로부터 채혈하였다. 채취한 혈액 중 약 2 mL의 혈액은 EDTA가 함유된 CBC bottle (EDTA 2K, BD vacutainer)에 취하여 혈액분석기 (ADVIA 2120i, Siemens, Germany)를 이용하여 다음의 항목들을 측정하였다. 남은 혈장은 serum cytokine 측정에 사용하였다
본 시험에서는 체중, 사료 섭취량, 음수 섭취량, 장기 중량, 혈액학적 검사, serum cytokine 측정 결과에 대해서 SPSS 통계 프로그램(Ver. 19.0)을 이용하여 통계분석을 수행하였다. 먼저, 분산의 동질성을 평가하기 위해 Levene's test를 수행한 후, one way ANOVA test를 실시하여 각 시험군간 유의성을 확인하였다. One way ANOVA test 수행한 결과, 시험군간 유의성이 확인되지 않으면, 추가적인 통계처리를 수행하지 않았다. 시험군 간의 유의성이 확인될 경우, 분산의 동질성 유무에 따라 사후검정 (분산이 동질한 경우 Scheffe 다중검정, 분산이 이질한 경우, Dunnett's T3)을 실시하였다.
또한, 투여기간 동안, 사망 및 빈사 동물은 관찰되지 않았다. 일반증상 관찰결과, 면역기능을 억제한 시험군 (면역억제물질투여군, 저용량군, 중용량군, 고용량군)에서 하복부오염 (soiled perineal region), 피모오염 (Soiled fur), 탈모 (loss of fur) 증상이 관찰되었다.
하복부오염 증상은 투여 2 일차부터 투여 5 일차까지 관찰되었으며 증상의 정도 (grade)는 면역억제물질투여군과 저용량군에서 경도 (slight) 및 고도 (severer), 중용량군에서 경도, 중등도 (modereate) 및 고도, 고용량군에서 경도로 관찰되었다.
피모오염 증상은 면역억제물질투여군에서 투여 6 일차부터 투여 14 일차까지 경도, 중등도 및 고도의 정도로 관찰되었다. 저용량군에서는 투여 6 일차부터 투여 14 일차까지 경도, 중등도 및 고도의 정도로 관찰되었다. 중용량투여군에서는 투여 6 일차부터 투여 8 일차까지 경도 및 고도의 정도로 관찰되었다. 고용량투여군에서는 관찰되지 않았다. 탈모의 증상은 면역기능을 억제한 시험군에서 투여 9 일차부터 투여 21 일까지 경도의 정도로 관찰되었으며 투여 22 일차부터는 관찰되지 않았다.
하기 표 21, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 체중변화를 보여주는 결과로서, 시험물질투여군 (저용량, 중용량, 고용량)과 부형제 대조군을 비교한 결과는 다음과 같다.
면역억제물질투여군의 경우 투여 1 주차, 2 주차, 4 주차의 체중과 투여 1 주차의 증체량이 유의적으로 감소 (체중; 12.4 - 13.7 %, 증체량 : 62.1 %, p<0.05) 하였다. 저용량군의 경우 투여 1 주차부터 투여 4 주차까지의 체중과 투여 1 주차의 증체량이 유의적으로 감소 (체중; 14.7 - 16.8 %, 증체량; 25.4 %, p<0.05) 하였다. 중용량군의 경우 투여 1 주차, 2 주차의 체중과 투여 1 주차의 증체량이 유의적으로 감소 (체중; 11.8 - 13.2 %, p<0.05) 하였다. 고용량군의 경우, 투여 1 주차, 2 주차의 체중과 투여 1 주차의 증체량이 유의적으로 감소 (체중; 12.2 - 13.3 %, p<0.05) 하였다.
시험물질투여군과 면역억제물질투여군을 비교한 결과, 유의적인 변화는 관찰되지 않았다. 다만, 중용량군 및 고용량군에서 투여 1 주차부터 투여 4 주차까지 체중 및 증체량이 증가하는 경향이 관찰되었다. 그 변화량은 다음과 같다.
　week

Group
(Dose)		 Body weight compared with G2 (%) Body weight gain compared with G2 (%)
0 wk 1 wk 2 wk 3wk 4wk 1 wk 2 wk 3wk 4wk
G3
(Low)		 -0.9 -1.2 -4.5 -3.7 -4.2 -4.1 -20.6 0.7 -12.0
G4
(Middle)		 -1.2 0.6 0.7 1.0 1.9 15.3 1.3 2.5 14.9
G5
(High)		 -1.1 0.4 0.3 0.4 1.2 13.4 -0.6 0.8 12.4
첨부도면 도 8 도 9에 나타난 그래프와 같이, 사료 및 음수 섭취량 측정결과, 모든 시험군에서 유의적인 변화는 관찰되지 않았다.
부검 시 모든 개체의 외관 및 주요장기에 대한 육안적 검사를 실시한 결과, 시험물질 투여와 관련된 육안적 소견은 관찰되지 않았다.
하기 표 22는 혈액학적 검사 결과로서, 부형제 투여군과 비교하여 면역억제물질투여군, 저용량군, 중용량군 및 고용량군에서 MCV (적혈구 평균 용적, Mean Corpuscular Volume, fL), MCH (평균혈구혈색소, Mean Corpuscular Hemoglobin, pg)의 유의적인 증가 (p<0.05)가 관찰되었다.
시험물질투여군과 면역억제물질투여군을 비교한 결과, 유의적인 변화는 관찰되지 않았으나 WBC (백혈구, White blood cell count, 103 cell/μL), MCV 및 MCH에서 투여용량에 비례하여 증가하는 경향이 관찰되었다.
　Group (Dose) Compared with G2 (%)
WBC (103 cells/uL) MCV (fL) MCH (pg)
G3 (Low) -0.9 1.7 1.7
G4 (Middle) 3.2 2.2 2.3
G5 (High) 16.6 2.4 2.5
부형제 투여군과 비교한 장기중량 측정결과는 다음과 같다.
절대중량 측정결과, 면역억제물질투여군, 저용량군, 고용량군에서 간의 절대중량의 유의적인 감소 (p<0.05)가 관찰되었다. 중용량군의 경우 유의성은 관찰되지 않았으나 감소하는 경향이 관찰되었다. 간 이외의 장기 (비장, 심장, 신장, 폐, 흉선)의 경우, 유의성은 관찰되지 않았으나 대부분 감소하는 경향이 관찰되었다. 상대중량 측정결과, 모든 장기에서 유의적인 변화는 관찰되지 않았으나 투여용량에 비례하여 상대중량이 증가하는 경향이 관찰되었다.
시험물질 투여군과 면역억제물질투여군을 비교한 결과는 다음과 같다.
절대중량 측정결과, 유의적인 변화는 관찰되지 않았다. 상대중량 측정결과, 중용량군의 간 중량이 유의적으로 증가 (21.4 %, p<0.05)가 관찰되었다. 또한 모든 장기에서 상대중량이 증가하는 경향이 관찰되었다.
하기 표 23은 Serum cytokine 측정 결과를 나타낸 것으로, Rat INF gamma ELISA Kit (ab239425, ABCAM, UK), Rat IL1 beta ELISA Kit (ab255730, ABCAM, UK), Rat TNF alpha ELISA Kit (ab46070, ABCAM, UK)를 이용하여 serum cytokine을 측정한 결과, 모든 시험물질 투여군에서 유의적인 변화는 관찰되지 않았다.
Dose
(mg/kg)		 INF alpha IL1 beta TNF alpha
Mean S.D. N Mean S.D. N Mean S.D. N
G1
(0)		 0.051 0.009 7 0.046 0.002 7 0.047 0.002 7
G2
(0)		 0.046 0.004 7 0.044 0.001 7 0.046 0.001 7
G3
(75)		 0.046 0.001 7 0.045 0.002 7 0.047 0.003 7
G4
(150)		 0.048 0.005 7 0.044 0.002 7 0.045 0.001 7
G5
(300)		 0.047 0.003 7 0.045 0.002 7 0.046 0.003 7
이와 같이, 본 시험은 rat를 이용한 면역기능 억제 동물 모델에 시험물질인 한약재 배합물을 28 일간 경구로 반복 투여하여 면역기능 개선 효과를 평가하기 위하여 실시하였다. 일반증상 관찰, 체중(증체량) 측정, 사료 및 음수 섭취량 측정, 장기중량 측정, 혈액학적 검사 및 Serum cytokine 측정 등을 실시하여 그에 대한 결과를 평가하였다.
투여기간 동안 시험물질 투여에 의한 사망 및 빈사동물은 관찰되지 않았다. 투여기간 동안 관찰된 하복부오염, 피모오염, 탈모의 증상은 면역력을 억제한 시험군에서만 관찰되었으며 부형제투여군에서 관찰되지 않은 점을 고려할 때, 시험물질 투여에 의한 영향이 아닌 면역억제물질 (cyclophosphamide monohydrate)의 투여에 의한 영향으로 사료되었다. 이러한 증상은 모든 시험물질 투여군에서 관찰되었으나 고용량 투여군의 경우, 관찰된 증상의 정도 (grade)가 경도 (slight)의 증상으로 관찰된 점을 고려할 때 시험물질 투여가 증상의 정도에 영향을 준 것으로 사료되었다.
체중 측정결과, 면역억제물질의 투여에 의한 체중의 감소가 관찰되었다. 이러한 체중의 감소는 투여기간동안 지속되었으나 증체의 경우, 중용량 및 고용량군 투여군에서 면역억제군과 비교하였을 때, 증체량이 증가 (중용량; 1.3 - 15.3 %, 고용량; 0.8 - 13.4 %)하는 경향이 관찰되었다. 이러한 변화는 저용량 투여군에서는 관찰되지 않았으나 중용량 및 고용량 투여군에서 대부분의 투여기간 동안 지속된 점을 고려할 때, 시험물질 투여에 의한 영향으로 사료되었다.
사료 섭취량, 음수 섭취량, 부검 시 육안소견 관찰결과, 모든 시험물질 투여군에서 유의적인 변화 및 소견은 관찰되지 않았다.
혈액학적 검사 결과, MCV (적혈구 평균 용적, Mean Corpuscular Volume), MCH (평균혈구혈색소, Mean Corpuscular Hemoglobin)에서 유의적인 증가가 관찰되었고 WBC (백혈구, White blood cell count)에서 시험물질 투여용량에 비례하여 증가하는 경향이 관찰되었다. 기존의 연구결과, Cyclophosphamide는 면역억제 작용과정에서 혈중 백혈구 및 적혈구의 감소를 일으킨다고 알려져 있으며 본 실험결과에서도 시험물질 투여용량에 비례하여 모든 시험물질 투여군에서 WBC, MCV 및 MCH 수치가 증가한 점을 고려할 때, 시험물질이 면역기능과 관련된 영향을 미치는 것으로 사료되었다. 다만, Serum cytokine을 측정한 결과, INF alpha, IL1 beta 및 TNF alpha에서 유의적인 변화는 관찰되지 않았다.
이상의 결과로부터, cyclophosphamide에 의한 면역억제 유발모델에서 일반증상 정도의 개선, 증체량의 증가, 면역관련 혈액학적 항목의 증가 관찰되었으며 이러한 변화는 시험물질인 한약재 배합물의 투여에 의한 영향으로 사료되었다.
한편, 반려동물 중 반려견의 아토피 피부질환은 일반적으로 유전적 소인을 가진 개체에서 발생하는 소양성 및 염증성 피부질환으로 정의되며, 반려견에서 많이 발생하는 피부 질환이다. 보통 6개월에서 3세이전에 발병하며, 가려움증이 특징으로 지속적인 가려움증과 피부 염증으로 인하여 반려동물과 보호자의 삶의 질을 악화시킨다. 이런 아토피 피부질환에 이환된 개체는 일반적으로 급여 되는 사료를 특수처방 사료로 제한하게 되며, 같이 급여하는 간식이나 껌 등을 먹지 못하게 된다.
이에 따라, 본 발명은 반려동물의 아토피성 피부질환 예방에 익수영진고 및 천연항생작용 재료를 기반으로 한 영양간식 소재를 발굴하고 이를 활용하여 반려동물 면역력 조절 배합제의 유효성과 안정성을 검증하는 것에 있다.
이에, 임상연구에는 아토피성 피부질환으로 진단된 반려견 10마리가 선발되었고, 연구에 포함된 개체의 기본 개체 특성 및 생체지표 특성은 하기 표 24 및 표 25에 제시한다.
Characteristics Control group(n=5) Treatment group (n=5)
Gender Spayed female 3 4
Castrated male 2 1
Age (years) 8.2 ± 2.9 6.6 ± 3.8
Breeds Maltese (4) Maltese (2)
Shih tzu (1) Golden retriever (2)
Poodle (1)
Characteristics Control group(n=5) Treatment group (n=5) P
Body weight (Kg), 4.1 ± 0.4 12.7 ± 12 0.184
Body condition score (BCS, 9 scale) 5.8 ± 0.8 5.4 ± 0.9 0.486
Heart rate (bpm) 152.0 ± 30.3 92.4 ± 53.3 0.061
Respiratory rate (/min) 20.8 ± 8.7 31.6 ± 16.3 0.142
Body temperature (℃) 38.6 ± 0.7 38.9 ± 0.3 0.434
본 실험은 아토피성 피부질환으로 진단된 10마리의 반려견을 모집하고, 무작위 배정하여 대조군과 투여군으로 나눈 뒤 대조군에서는 12주간 표준치료 (약물치료)를 진행하고, 투여군에서는 12주간 표준치료와 한약재 배합 간식 급여(10~15 kg의 반려견에 매일 5~10g 투여)를 함께 진행한 후 12주 뒤에 그 결과를 비교 평가하였다.
평가항목으로는 투여기간 개체의 안정성을 보기위한 기본적인 생체지표 (몸무게, BCS, 심박수, 호흡수, 체온), 혈액검사 및 혈청화학 검사와 급여한 한약재 배합 간식의 유효성을 확인하기 위한 피부검사 지표 (CADESI score, 가려움증 지표), 그리고 보호자 만족도 등이 포함되어 있다.
모든 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내며, 각 데이터들의 정규성 검정은 Kolmogorov-Smirnov test (정규분포검정)를 이용하여 진행하였다. 정규성 검정 결과에 따라, 대조군과 투여군의 실험 진행 전 각 평가 항목들의 비교는 Student t-test를 이용하여 진행하였다. 대조군 및 투여군의 실험 전과 후의 각 평가 항목들의 비교는 Paired t-test를 이용하여 진행하였으며, 평가 항목 중 정규분포를 하지 않는 TNF-a의 경우는 Wilcoxon signed rank test를 이용하여 평가하였다. 통계학적으로 p<0.05 인 경우 유의적인 것으로 평가하였다. 통계적 분석에는 SPSS version 20 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)이 이용되었다.
이에, 전체 10마리 개체는 모두 중성화 된 개체로 대조군에는 암컷이 3마리, 투여군에는 4마리가 배정되었다. 포함된 개체의 평균 연령은 각각 대조군과 투여군에서 8.2 ± 2.9 년과 6.6 ± 3.8년이었으며, 포함된 개체 중에는 소형견 품종인 말티즈가 가장 많았다 (총 6마리). 투여군에 대형견 품종인 골든 리트리버가 2마리 포함되었으나, 전체적으로 말티즈, 시츄 및 푸들과 같은 소형견이 주된 품종이었다.
실험 시작 전 무작위 분류된 대조군과 투여군의 생체지표 특성에 대한 차이를 평가하였으며, 두 군에서 체중, BCS, 심박수, 호흡수 및 체온 등의 생체 지표는 유의적으로 차이가 나지 않는 것으로 확인되었다.
아토피성 피부질환으로 진단된 반려 견 10마리 중 대조군은 약물을 이용한 아토피성 피부질환 표준치료를 시행하였으며, 투여군은 표준치료에 한약 배합제 성분의 간식을 함께 급여하였다. 대조군과 투여군은 실험 전행 전 피부의 상태에 대해 아토피 평가지표인 CADESI수치와 가려움증 지표를 비교하였다. 무작위 배정된 두 군의 실험 진행 전 CADESI (P = 0.975)및 가려움증 지표는 (P = 0.636)는 유의적인 차이가 없는 것이 확인되었다(하기 표 26 참조).
Characteristics Control group(n=5) Treatment group (n=5) P
CADESI at study onset 30.4 ± 10.3 30.2 ± 9.5 0.975
Pruritus at study onset (5 scale) 2.0 ± 1.6 2.4 ± 0.9 0.636
CADESI, Canine atopic dermatitis extent and severity index
대조군과 투여군에 12주간 각각 표준치료 및 표준치료와 한약재 배합 간식 급여를 진행한 후 실험전과 12주 후 시점에 따른 혈액수치 및 혈청화학적 변화는 표 27(대조군)와 표 28(투여군)에 각각 제시하였다.
대조군과 투여군 모두에서 혈액검사 상 백혈구, 적혈구, 혈색소, 적혈구 용적 및 혈소판과 관련된 혈액수치는 실험기간 동안 특이할 만한 변화가 관찰되지 않았으며, 모든 수치는 참고범위 이내에 존재하였다(하기 표 27 및 표 28 참조).
대조군과 투여군 모두에서 간효소수치, 신장관련 효소수치 및 단백질 수치의 변화를 관찰하였다. 대조군과 투여군 모두 아토피치료를 위하여 기존 표준치료 방법인 경구 약물을 투여 받고 있었으며, 이때 사용하는 약물로 인하여 간효소 수치인 ALT와 ALP수치가 실험진행 전부터 정상범위보다 높게 측정되었다. 실험이 진행되는 12주 동안 두가지 수치는 대조군과 투여군에서 모두 감소하는 패턴을 보였으나, 통계적 유의성을 확인할 수는 없었다. 그외 다른 혈청화학 검사 수치는 실험기간 동안 참고범위 이내에 존재하였으며, 실험 전후 특이할 만한 변화가 관찰되지 않았다(하기 표 27 및 표 28 참조).
하기 표 27은 대조군의 실험 전과 12주 후의 혈액검사 및 혈청화학 검사 지표 변화 평가한 결과이다.
Hematologic evaluations Pre-treatment
(0 weeks) 		Post-treatment
(12 weeks) 		P
WBC (x10 3 /ul) 9.2 ± 2.2 10.6±2 0.145
RBC (x10 6 /ul) 6.9± 0.7 6.6±0.7 0.384
Hb (gm/dl) 16.9 ± 1.7 16.2±1.1 0.205
PCV (%) 45.5 ± 4.6 45.2±2.3 0.706
MCV (fL) 61.5 ± 10.9 64.9±12.7 0.138
MCH (pg) 24.8 ± 2.4 24.5±1.2 0.805
MCHC (g/dl) 37.4 ± 3.2 35.8±1.9 0.113
PLT (x 10^3/ul) 433.0 ±24.2 425.8±86.3 0.864
S-chem evaluations
BUN (mg/dl) 17.8 ± 15.3 20.6±21.2 0.422
CREA (mg/dl) 0.7± 0.6 0.9±1.1 0.413
ALT(U/L) 87.0 ± 42.4 72.6±29.1 0.249
AST (U/L) 35.8 ± 16.8 25.2±5 0.158
ALP (U/L) 1845.8 ± 1488.0 1542.6±1368.5 0.188
TP (g/dl) 6.7 ± 0.5 6.7±0.2 0.763
ALB (g/dl) 3.5 ± 0.4 3.6±0.3 0.625
WBC, white blood cell; RBC, red blood cell; Hb, haemoglobin; PCV, packed cell volume; MCV, mean corpuscular volume; MCH, mean corpuacular haemoglobin; MCHC, mean corpuscular haemoglobin concentration; PLT, platelets; BUN, blood urea nitrogen; CREA, creatinine; ALT, alanine transaminase; AST, Aspartate Aminotransferase; ALP, Alkaline phosphatase; TP, Total protein; ALB, albumin.
하기 표 28은 투여군의 실험 전과 12주 후의 혈액검사 및 혈청화학 검사 지표 변화 평가한 결과이다.
Hematologic evaluations Pre-treatment
(0 weeks) 		Post-treatment
(12 weeks) 		P
WBC (x10 3 /ul) 9.0±1.6 7.8±2 0.320
RBC (x10 6 /ul) 6.6±0.6 6.4±0.8 0.325
Hb (gm/dl) 15.4±1 15.4±1.2 0.951
PCV (%) 44±0.9 42.7±3.9 0.426
MCV (fL) 63.8±11.9 62.8±10.8 0.394
MCH (pg) 23.5±1.7 24.1±2.3 0.183
MCHC (g/dl) 34.8±2.3 36.1±2.7 0.236
PLT (x 10^3/ul) 278.2±89.9 301.6±132.1 0.551
S-chem evaluations
BUN (mg/dl) 26.5±17.9 20.3±3.9 0.444
CREA (mg/dl) 1.2±0.9 0.8±0.1 0.559
ALT(U/L) 52.6±52.6 52.4±12.7 0.983
AST (U/L) 24.4±4 27.4±5.9 0.199
ALP (U/L) 620±1027.6 452±680.4 0.358
TP (g/dl) 6.4±0.3 6.2±0.4 0.051
ALB (g/dl) 3.5±0.2 3.4±0.1 0.405
WBC, white blood cell; RBC, red blood cell; Hb, haemoglobin; PCV, packed cell volume; MCV, mean corpuscular volume; MCH, mean corpuacular haemoglobin; MCHC, mean corpuscular haemoglobin concentration; PLT, platelets; BUN, blood urea nitrogen; CREA, creatinine; ALT, alanine transaminase; AST, Aspartate Aminotransferase; ALP, Alkaline phosphatase; TP, Total protein; ALB, albumin.
하기 표 29 및 도 10은 대조군과 투여군에 12주간 각각 표준치료 및 표준치료와 한약재 배합 간식 급여를 진행한 후 실험전과 12주 후 시점의 피부의 상태에 대해 아토피 평가지표인 CADESI수치와 가려움증 지표를 비교하였다.
대조군과 투여군 모두에서 아토피 평가지표인 CADESI 수치는 투여 전과 비교하였을 때 감소하는 패턴을 보였으나 유의성이 확인되지 않았다 (각, P=0.554, P=0.772). 가려움증 지표의 경우 대조군은 12주의 관찰기간 동안 큰 변화를 보이지 않은 반면, 투여군의 경우 가려움증 수치가 2.4 ± 0.9에서 1.8 ± 1.1로 감소하는 패턴이 확인되었다. 하지만, 역시 변화에 대한 통계적 유의성이 확인되지는 않았다 (P=0.070).
하기 표 29는 대조군과 투여군의 피부상태 검사 지표의 비교 결과이다.
Characteristics Control group(n=5) Treatment group (n=5)
Pre-treatment Post-treatment P Pre-treatment Post-treatment P
CADESI score 30.4 ± 10.3 28.2 ± 9.4 0.554 30.2 ± 9.5 29.8 ± 7.6 0.772
Pruritus
(5 scale)		 2.0 ± 1.6 2.0 ± 0.7 1.000 2.4 ± 0.9 1.8 ± 1.1 0.070
CADESI, Canine atopic dermatitis extent and severity index
첨부도면 도 10은 투여군 개체의 실험 전후 피부병변 비교 사진으로, 시험물질(한약재 배합 간식) 투여 전 (A, C, E)과 비교해, 투여 후 (B, D, F) 아토피 피부염과 관련된 주요 피부 병변 인 발적(erythema), 가피(scale) 등이 육안평가상 감소함을 확인할 수가 있고, A, B는 귓바퀴 부분이고, C, D는 액와부 이며, E, F는 서혜부를 나타낸 사진이다.
대조군과 투여군에 12주간 각각 표준치료 및 표준치료와 한약재 배합 간식 급여를 진행한 후 실험전과 12주 후 시점에 혈액을 채취하여, 혈청에서 면역조절 및 염증과 관련된 4가지의 사이토카인을 비교 평가하였다.
본 발명에서는 도움 T세포인 Th2와 관련된 사이토카인 중 IL-4, IL-13 및 IL-31, 급성기 염증반응에 관여하는 TNF-alpha(TNF-a)를 함께 평가하였다.
투여군과 대조군 모두에서 실험기간 동안 특이할 만한 사이토카인의 변화가 관찰되지 않았다(하기 표 30 참조).
Control group(n=5) Treatment group (n=5)
Pre-treatment Post-treatment P Pre-treatment Post-treatment P
IL-4 1546.2±2267.0 896.5±738.3 0.419 1288.9±470.8 1423.6±827.9 0.527
IL-31 286.4±165.9 285.1±177.3 0.979 675.9±692.3 534.8±383.6 0.999
IL-13 273.5±101.5 225.4±100.5 0.290 219.5±187.5 219.4±106.4 0.440
TNF-a 16.5±12.8 7.5±3.0 0.225 27.6±28.7 44.7±67.2 0.500
IL, interleukin; TNF-a, tumor necrosis factor-alpha
하기 표 31에 나타난 바와 같이, 대조군과 투여군에 12주간 각각 표준치료 및 표준치료와 한약재 배합 간식 급여를 진행한 후 실험전과 12주 후 시점에 보호자의 만족도에 대하여 조사하였다.
두 그룹 모두 실험 전과 비교하여 실험이 끝난 이후 보호자 만족도가 상승하는 경향을 보였으나 통계적 유의성을 확인할 수는 없었다 (각, P=0.374, P=0.208).
다만, 일반적으로 아토피 환자의 경우 식이에 대한 제한이 많은 편으로, 정해진 가수분해 사료 이외의 간식의 급여가 추천되지 않는다. 이 연구에서 제공된 한약재 배한 간식의 경우, 껌의 형태로 급여 시에 아토피 환자에서 가려움증의 증가나 피부상태 악화와 같은 임상적인 문제를 일으키지 않았다. 따라서, 한약재 배합 간식을 급여 받은 환자와 보호자 모두 치료효과와 상관없이, 아토피성 피부질환에 영향을 미치지 않으면서 환자에게 간식을 급여할 수 있다는 부분에 대하여 만족도가 높았다.
표 31은 대조군과 투여군에서 실험 진행 후 보호자 만족도 변화 평가를 나타난 결과이다.
Characteristics Control group(n=5) Treatment group (n=5)
Pre-treatment Post-treatment P Pre-treatment Post-treatment P
보호자 만족도
(0-5 점)		 2.0 ± 1.2 2.4 ± 0.9 0.374 1.0 ± 1.2 1.6 ± 1.3 0.208
본 발명에 따라 실시되어 제조된 영양간식은 반려동물의 아토피성 피부질환 예방에 익수영진고 및 천연항생작용 재료를 기반으로 하여 이를 활용하여 반려동물 면역력 조절 배합제의 유효성과 안정성이 검증되었다.
반려동물의 아토피 피부질환은 일반적으로 유전적 소인을 가진 개체에서 발생하는 소양성 및 염증성 피부질환으로 정의되며, 반려동물에서 많이 발생하는 피부 질환이다. 보통 6개월에서 3세이전에 발병하며, 가려움증이 특징으로 지속적인 가려움증과 피부 염증으로 인하여 반려동물과 보호자의 삶의 질을 악화시킨다. 이런 아토피 피부질환에 이환된 개체는 일반적으로 급여 되는 사료를 특수처방 사료로 제한하게 되며, 같이 급여하는 간식이나 껌 등을 먹지 못하게 된다.
이를 해결할 수 있도록 실험을 통해 아토피성 피부질환으로 진단된 10마리의 반려동물을 모집하고, 무작위 배정하여 대조군과 투여군으로 나눈 뒤 대조군에서는 12주간 표준치료 (약물치료)를 진행하고, 투여군에서는 12주간 표준치료와 한약재 배합 간식 급여를 함께 진행한 후 12주 뒤에 그 결과를 비교 평가하였다. 평가항목으로는 투여기간 개체의 안정성을 보기위한 기본적인 생체지표 (몸무게, BCS, 심박수, 호흡수, 체온), 혈액검사 및 혈청화학 검사와 급여한 한약재 배합 간식의 유효성을 확인하기 위한 피부검사 지표 (CADESI score, 가려움증 지표), 그리고 보호자 만족도 등이 포함되어 있다.
평가된 생체 지표, 혈액검사 및 혈청화학 검사 지표를 평가한 결과 대조군과 실험군 모두 연구기간 동안 특이할 만한 부작용이 확인되지 않았다. 한약제가 간에 부담을 주거나 간수치를 증가시킨다는 속설이 있으나, 실험이 진행된 3개월 동안 한약재 배합 간식 급여를 받은 개체의 간수치는 영향을 받지 않았다. 그 외 평가 지표들도 특이할 만한 점이 없어, 3개월 동안의 단기 안정성을 확인하였다.
실험 및 연구가 진행된 12주 동안, 투여군에서는 특이할 만한 이상증상이나 이상수치가 확인되지 않았습니다. 특히, 간식이나 껌의 급여에 민감한 아토피 피부질환 환자에 급여하였을 때 가려움증 증가나 피부상태 악화가 관찰되지 않은 부분은 급여한 한약 배합제의 장점이라 할 수 있다. 다만, 본 연구에서는 피부상태 개선에 대한 통계적 유의성이 확인되지 않았으며, 대조군과 뚜렷한 차이점도 관찰할 수는 없었다. 함께 평가한 면역조절과 관련된 사이토카인의 변화 또한 대조군과 투여군, 그리고 투여 전후에 유의적인 변화가 확인되지는 않았다. 보통 아토피 환자의 경우, 표준치료로 사용되는 약물이 대부분 면역억제 및 면역조절 약물로, 투여 받은 표준치료 약물들이 급여한 한약 배합제의 효능에 영향을 미쳤을 것으로 생각된다.
본 실험은 익수영진고 및 천연항생작용 재료를 기반으로 한 영양간식을 반려동물 아토피 피부질환 개체에 투여하여 안정성이 확인되었고, 표준치료로 사용되는 약물을 병용 투여로 투여군에서 뚜렷한 유효성이 확인되었으며, 아토피성 피부질환 개체에서 피부상태를 악화시키지 않으면서 급여할 수 있는 간식의 개발은 긍정적인 부분으로 판단된다.
상기의 실험을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명은 기술적 구성의 특성등을 고려한 기술의 구체적 적용에 따른 최적의 효과를 얻기 위해 상당한 연구개발을 실시하여 창작능력을 발휘한 것이다.
이상, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위에는 설명된 실시예에 국한되어 전해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (3)

  1. 면역 활성 향상 작용을 위한 꽃송이버섯과 익수영진고의 재료들을 미세분쇄기를 통해 분쇄하여 미세 분말로 각각 준비하는 단계;
    상기에서 준비된 꽃송이버섯과 익수영진고의 재료들을 일정한 비율로 혼합하여 반죽하는 단계;
    상기에서 반죽된 혼합물을 옹기에 넣은 다음 상기 옹기를 물이 채워진 중탕기에 넣는 단계;
    상기 옹기가 투입된 중탕기를 일정한 온도를 유지하면서 일정한 시간동안 중탕을 실시하는 단계;
    상기에서 중탕이 완료되면 일정한 시간동안 실온에서 숙성시키는 단계; 및
    상기의 숙성시킨 다음 영양간식 제품이 완성되는 단계;
    로 이루어지는 것을 특징으로 하는 반려동물의 면역력 강화 및 염증 개선에 도움이 되는 영양간식 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기에서 준비된 꽃송이버섯과 익수영진고의 재료들을 일정한 비율로 혼합하여 반죽하는 단계에서,
    상기 익수영진고의 재료들과 아토피 피부질환 예방 및 개선에 도움을 주는 천연 항생작용을 하는 재료인 금은화 및 황금을 혼합하는 단계를 더 이루어지는 것을 특징으로 하는 반려동물의 면역력 강화 및 염증 개선에 도움이 되는 영양간식 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 익수영진고의 재료들은 인삼, 복령, 생지황, 봉밀, 천문동, 맥문동, 구기자로 이루어지고, 상기 천연 항생작용을 하는 재료들은 금은화 및 황금으로 이루어지며, 상기 꽃송이버섯 10중량%, 인삼 10중량%, 복령 10중량%, 생지황 10중량%, 봉밀 10중량%, 천문동 10중량%, 맥문동 10중량%, 구기자 10중량%, 금은화 10중량% 및 황금 10중량%의 비율로 이루어지는 것을 특징으로 하는 반려동물의 면역력 강화 및 염증 개선에 도움이 되는 영양간식 제조방법.
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