KR20240040503A - 반려동물 감염질환 예방을 위한 한약재가 첨가된 면역 강화 영양간식 개껌 제조방법 - Google Patents

반려동물 감염질환 예방을 위한 한약재가 첨가된 면역 강화 영양간식 개껌 제조방법 Download PDF

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농업회사법인 유한회사 나우리
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Abstract

본 발명의 반려동물 감염질환 예방을 위한 한약재가 첨가된 면역 강화 영양간식 개껌 제조방법은 간식으로 높은 기호성을 갖게 하여 식욕 자극 및 스트레스 완화 효과를 통해 질병 회복을 돕도록 하고, 한약재의 재료를 첨가하기에 반려동물의 피부질환 및 관절질환을 예방하게 하여 반려동물의 안전성을 향상시키게 하는 등의 반려동물의 보호자로 하여금 전체적으로 삶의 질이 개선시키게 하는데 그 특징이 있다.

Description

반려동물 감염질환 예방을 위한 한약재가 첨가된 면역 강화 영양간식 개껌 제조방법{Mnufacturing mathod of the nutrition snack with enhancing immune activity for companion dogs}
본 발명은 반려동물 감염질환 예방을 위한 한약재가 첨가된 면역 강화 영양간식 개껌 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 간식으로 높은 기호성을 갖게 하여 식욕 자극 및 스트레스 완화 효과를 통해 질병 회복을 돕도록 하고, 한약재의 재료를 첨가하기에 반려동물의 피부질환 및 관절질환을 예방하게 하여 반려동물의 안전성을 향상시켜 반려동물의 보호자로 하여금 전체적으로 삶의 질이 개선하도록 하는 반려동물 감염질환 예방을 위한 한약재가 첨가된 면역 강화 영양간식 개껌 제조방법에 관한 것이다.
핵가족화, 미혼 독립 인구 증가, 노령층 인구 증가 등 사회현상으로 인해 반려견을 인간생활의 동반자로 인식하고 기르는 가정이 급속히 증가하고 있다.
이와 같은 반려견과 같은 반려동물은 사람이 먹다 남은 음식물을 먹이로 주던 종래와 달리 반려견용 사료를 먹이로 주는 것이 보편화되어 있다.
상기 반려견에게 위생적이고 필요한 영양을 공급해주는 사료, 예컨대 단백질, 지방, 탄수화물과 같은 필수 영양소 외에도 무기염류나 비타민과 같은 보조요소도 필요로 하고 있으며, 이에 부응하여 관련 상품들이 많이 개발되고 있는 중이다.
지금까지 시중에 나와 있는 사료를 분석하면, 먼저 반려견에 대한 사료중 가장 중요한 성분 중 하나는 단백질인데, 단백질에 대한 라벨에 표시내용만 본다면 생물학적가치(질소평형치수)와 소화흡수율에 대하여 간과하고 넘어가게 되는데, 이는 사료 제조과정 중 멸균을 위하여 장시간 고온에 노출시 생물학적 가치가 높은 유용한 단백질이 파괴되고 음식에서 발생하는 당과 단백질은 체내의 소화효소에 의해 파괴될 수 없는 새로운 화합물을 만들기 때문에 사료에 표시되는 단백질은 반려동물이 실제로 소화해서 흡수할 수 있는 양이 아닌 오로지 조단백의 양만 표시하며, 이러한 단백질은 반려동물에게 거의 무의미하다.
또한, 반려견 사료의 육류 부산물(meat by-products)에는 닭, 오리, 가금류의 날개나 결합조직(연골), 레더 미트(leather meat: 구두제조시 사용하는 가죽), 다른 동물의 배설물, 말이나 소의 털을 의미하는 것으로, 이러한 것이 포함되어 있다.
또한, 탄수화물은 단백질과 같이 영양을 공급해 주는 것으로, 이는 대체적으로 당(자당), 프로필렌글리콜, 옥수수시럽과 같은 식물(단백질이나 비타민 등을 포함하지 않은) 칼로리를 지칭하는 것이고, 결론적으로 반려동물이 사료를 통하여 얻을 수 있는 영양소는 당을 제외하고는 거의 없다는 의미이며, 실제로 라벨에 표기된 탄수화물에 대한 부분을 해석해보면, 미분은 매우 곱게 간 쌀가루로 분쇄의 마지막 단계로 영양분이 거의 없고, 사탕무우탕은 건조시킨 사탕무우 찌꺼기로 약간의 당분 외 영양가 없으며, 옥수수 글루텐가루는 옥수수에서 녹말 등 껍질을 제거후 건조시킨 찌꺼기로 영양가 없다.
이에 따라, 종래에 제공되는 사료는 반려견에게 먹이고 싶은 단백질, 지방, 비타민, 미네랄 등의 영양소가 부족하고, 도축장의 폐기물이나 부산물 등 반려견에게 먹이고 싶지 않은 재료를 포함하고 있기에, 반려견에게 먹이면서 반려견의 면역체계가 변이되고 파괴되며, 질 높은 영양소의 공급을 원하고 있는데 지속적으로 영양소가 부족한 사료를 주어 반려견이 질병에 노출되고 실정이어서, 전체적으로 반려견에게 면역체계를 바로 잡아 줄 수 있는 양질의 재료를 사용하여 변형되고 망가진 반려견의 면역체계를 복구시킬 수 있는 물질이 없는 실정이다.
한편, 미국 반려동물산업협회(American Pet Products Association, APPA)11 http://www.americanpetproducts.org/press_industrytrends.asp.에 따르면, 2017년 현재 미국의 반려동물 보유 가구 비중은 68%로 나타나고, 또한 미국의 반려동물을 위한 지출비용은 690억 달러로 지속적으로 증가하고 있는 추세이며, 2016년 중국의 반려동물산업 시장규모는 1,220억 위안으로 전년대비 24.7% 증가하였으며 지난 5년 동안 연평균 52.4%의 증가율을 보이며 급속도로 성장하고 있다.
국내의 경우도 최근 1인가구의 증가, 저출산 및 고령화 등으로 인해 반려동물 보유가구가 지속적으로 증가하고 있고, 농림축산식품부에 따르면 국내 반려동물 보유가구 비율은 2010년 17.4%에서 2015년 21.8%로 5년 동안 4.4%포인트 증가한 것으로 나타나 있으며, 반려동물 관련 시장규모도 2012년 9,000억원에서 2015년에는 두 배 증가한 1조 8,000억원을 기록함. 2020년에는 5조8,000억원으로 시장규모가 빠르게 확대될 것으로 예상되고, 반려동물에 대한 수요가 증가하면서 반려동물용품 관련 소매시장도 성장세를 보이고 있는 것이다.
화훼 및 애완동물서비스와 관련해서도 1인가구는 0.19%를 지출하였으나 4인가구는 그보다 적은 0.09%를 지출한 것으로 볼 때 반려동물에 의존하는 나홀로족이 많아졌기 때문이며, 현재 1인가구가 지속적으로 증가하고 있는 가운데 반려동물을 가족처럼 여기는 펫팸족(Pet+Family)이 확산되고, 이에 따라 반려동물 관련 시장의 트렌드도 빠르게 변화되고 있는 실정이다.
그러나, 반려동물의 면역력 저하 상태에서는 재발성 혹은 만성 감염(특히, 호흡기, 피부, 위장관, 비뇨기)과 미생물에 대항할 수 있는 반응성의 불완전성, 정상적으로는 무해한 병원균에 대한 기회감염, 종양 발생빈도 증가 등의 위험성이 높아지고 있고, 개와 고양이에서 알려진 면역관련 질환으로는 대표적으로 아토피 피부염, 염증성 장질환, 천포창, 면역 매개성 빈혈 등이 해당되며, 모두 개체의 면역력과 밀접한 관련이 있는 것이며, 이러한 질환은 체내 면역계가 자가 조직 항원을 부적절하게 인식하여 나타나는 자가면역질환으로, 세포독성 T세포 활성 증가와 Treg세포 기능의 감소와 관련이 있는 것이다.
이에, 아토피 질환에 이환된 개, 위장관계 질환에 이환된 개, 건강한 개 총 세 그룹에서 혈?? IgE와 IgG 농도를 측정하여 비교하였을 때, 아토피 질환군에서 IgE 수치가 유의적으로 가장 높았고, 위장관계 질환군에서 IgG 수치가 유의적으로 가장 높고, 아토피 질환군은 음식 알러젠에 대한 Th2 체액성 면역반응으로 알러젠 특이 IgE가 높으며, 위장관계 질환은 점막 투과성이 증가하여 항원 노출이 증가함에 따라 IgG가 증가된 것으로 판단된다.
또한, 반려동물에서 발생하는 염증성장질환(Inflammatory bowel disease)의 정확한 원인은 밝혀져 있지 않으나, 주요 가설로 장내 미생물 혹은 식이 항원에 대한 점막의 면역 반응 조절 장애일 것으로 추정되고, 노화 역시 면역력 저하와 관련이 높다고 알려져 있으며, 노화에 따른 면역계의 변화는 오래전부터 알려져 있고, 포유류는 나이가 들어감에 따라 면역 조절능력이 떨어지고 면역력이 약해지는 면역노화(Immunosenescence)가 일어날 수 있다고 알려져 있으며, 이는 질병의 이환율과 사망률의 증가, 미생물에 대한 기회감염 감수성 증가, 자가면역 현상, 더 나아가 암 발생을 초래할 수 있는 것이다.
따라서, 개와 고양이의 많은 면역 관련 질환에서 식이 조절이나 특정 식이 섭취가 도움을 줄 수 있다고 알려져 있고, 특히 아토피성 피부염, 만성 염증성 질환, 천포창 (pemphigus)과 같은 자가면역 질환 등에서 식이를 변경하는 것만으로도 필요한 면역억제나 항염증 약물의 양을 줄일 수 있다고 알려져 있으며, 또한 건강한 반려동물에게 특정 영양성분을 추가로 주었을 때 면역력을 유의적으로 증강시킬 수 있고, 정상 동물뿐만 아니라 면역 관련 질환에 이환되거나 이환될 가능성이 높은 반려동물, 또는 면역력 강화가 필요한 노령의 반려동물 등에 면역력 강화에 의한 염증성 피부질환 개선을 위한 한약재 적용의 필요성이 대두되고 있는 것이다.
한국등록특허 제10-0636389호(등록일: 2006.10.12.) 한국공개특허 제10-2018-0021983호(공개일: 2018.03.06.) 한국공개특허 제10-2019-0059063호(공개일: 2019.05.30.) 한국등록특허 제10-1856297호(등록일: 2018.05.02.) 한국등록특허 제10-1583874호(등록일: 2016.01.04.) 한국공개특허 제10-2013-0013424호(공개일: 2013.02.06.)
본 발명은 간식으로 높은 기호성을 갖게 하여 식욕 자극 및 스트레스 완화 효과를 통해 질병 회복을 돕도록 하고, 한약재의 재료를 첨가하기에 반려동물의 피부질환 및 관절질환을 예방하게 하여 반려동물의 안전성을 향상시키게 하는 등의 반려동물의 보호자로 하여금 전체적으로 삶의 질이 개선시키게 하는 반려동물 감염질환 예방을 위한 한약재가 첨가된 면역 강화 영양간식 개껌 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적은 기존에 폐기 처분되던 꽃송이버섯을 활용함으로써 원가를 절감할 수 있는 동시에 제조 비용을 저비용으로 유지할 수 있으므로 인해 소비자로 하여금 저렴한 영양간식을 제공 받을 수 있게 하는 반려동물 감염질환 예방을 위한 한약재가 첨가된 면역 강화 영양간식 개껌 제조방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 감염질환 예방을 위해서 면역 강화시키는 한약재의 재료들을 준비하고, 개껌의 기능성을 유지시키기 위한 기호재료를 준비하는 단계와, 상기 준비된 한약재의 재료들과 기호재료들을 각각 분쇄기를 이용하여 분쇄시키는 단계와, 상기 분쇄된 한약재의 재료들과 기호재료들을 일정한 비율로 배합하는 단계와, 상기 배합된 재료들에 대해 일정한 온도 및 시간에서 가열하는 단계와, 상기 가열된 배합 재료들에 대해 성형기를 통해 일정한 형태로 성형시키는 단계와, 상기 성형된 배합 재료들에 대해서 제품 포장 규격에 맞도록 일정하게 컷팅하는 단계와, 상기 컷팅된 제품에 대해 상기의 과정에서 포함될 수 있는 금속이 있는지 검출하는 단계와, 상기 금속이 검출되지 않으면 제품으로 출하시킬 수 있는 완제품을 완성시키는 단계를 포함하여 이루어진다.
이에, 상기 한약재의 재료들은 홍삼 5.5중량%, 백복령 46.4중량%, 맥문동 2.5중량%, 천문동 2.5중량%, 구기자 5.3중량%, 꽃송이버섯 1.0중량%, 노루궁뎅이버섯 5.5중량%, 황금 7.6중량%, 어성초 22.7중량%, 꿀 1중량% 비율로 배합되어 이루어진다.
또한, 상기 배합된 한약재의 재료에 대해 일정한 온도 및 시간에서 가열하는 단계에서, 가열 온도는 75℃ 이상, 가열 시간은 30분 ~ 1시간 이루어진다.
여기서, 상기 분쇄된 한약재의 재료들과 기호재료들을 일정한 비율로 배합하는 단계에서, 상기 한약재의 재료들과 기호재료들은 1:99 비율로 배합되어 이루어진다.
또한, 상기 배합되어 건조된 한약재의 재료들은 최적의 맛과 기미를 지닌 제품으로 완성시키기 위해 숙성기를 통해 1일 동안 숙성시키는 단계를 더 포함하여 이루어진다.
상기 숙성기에는 한약재의 배합물과 접촉하여도 녹슬지 않도록 스텐레스 재질로 이루어져 저장된 숙성물의 숙성정도를 감지하는 센서단이 구비되고, 상기 센서단에 3개 이상의 주파수 신호를 공급하고 신호의 위상에 변위가 임계치 이상 발생하면 변환회로를 거쳐 관리자의 단말기로 신호를 전달하도록 이루어지는 것이다.
본 발명은 간식으로 높은 기호성을 갖게 하여 식욕 자극 및 스트레스 완화 효과를 통해 질병 회복을 돕게하는 효과가 있고, 한약재의 재료를 첨가하기에 반려동물의 피부질환 및 관절질환을 사전에 예방할 수 있어 반려동물의 안전성이 향상되는 등의 반려동물의 보호자로 하여금 전체적으로 삶의 질이 개선되는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 기존에 폐기 처분되던 꽃송이버섯을 활용함으로써 원가가 절감되는 동시에 제조 비용이 저비용으로 유지됨으로 인해 소비자로 하여금 저렴한 영양간식 개껌을 제공 받을 수 있는 효과가 있다.
도 1은 한약재 배합물의 DPPH free radical 소거활성도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 L-Ascorbic acid의 DPPH free radical 소거활성율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 급여군 개체의 시험 전후 피부병변 비교하기 위한 사진이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 아래의 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래의 실시예들로 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시예는 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하며 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.　
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예들은 제조상 초래되는 형상의 변화를 포함하여야 한다.
본 발명에 따라 실시되는 한약재 재료들은 반려동물의 감염질환 예방을 위한 면역력 강화용으로 활용할 수 있고, 아토피 피부질환 예방 및 개선에 도움을 줄 수 있도록 최적의 배합비 분석하고 연구하여 반려동물을 위한 영양간식 개껌을 제조할 수가 있었다.
이를 위해, 일명 상기 한약재 재료들은 홍삼 5.5중량%, 백복령 46.4중량%, 맥문동 2.5중량%, 천문동 2.5중량%, 구기자 5.3중량%, 꽃송이버섯 1.0중량%, 노루궁뎅이버섯 5.5중량%, 황금 7.6중량%, 어성초 22.7중량%, 꿀 1중량% 비율로 배합되어 이루어진다.
여기서, 꽃송이버섯은 건조된 상태인 100g당 베타글루칸(β-glucan)을 43.6% 함유하고 있어서 천연물 중 가장 많은 양을 함유하고 있고, 베타글루칸은 면역기능 활성성분으로 면역력을 증가시켜 항암작용에 우수한 효과를 보이고 있으며, 항염, 항산화, 미백 등의 효과도 있다고 알려져 있다.
꿀은 오장을 편하게 하고, 부족한 것을 보충하고, 백가지약을 중화시킬 수 있고, 진통해독을 도움을 주고, 폐가 약해서 기침하거나 장이 약해서 오는 변비에 사용하며, 영양을 보충하고, 면역력을 향상시키고, 상처를 빠르게 아물게 하는 작용 및 항균 작용이 있다고 알려져 있다.
천문동(天門冬)은 보음기능 강화의 대표 재료로, 이뇨, 자양강장 효과 있고, 노인의 만성기관지염 등으로 객담이 잘 배출되지 않고 오래도록 해수가 지속되는 증상 및 천식에 유효하며, 건조한 피부를 윤택하게 하고, 성기능을 촉진시키는 작용도 있으며, 발열성 질환의 후기에 변비가 있고 미열에 사용한다고 알려져 있다.
맥문동(麥門冬)은 보음기능 강화의 대표 재료로, 이뇨, 자양강장, 진해거담 작용이 있어서 가래, 기침, 만성기관지염, 퇴행성관절질환에 활용된다고 알려져 있다.
구기자(枸杞子)는 치매와 기역력 개선에 도움이 되고, 만성 간염, 간견변증 등에 염증이 제거되고 간기능을 활성화하며, 구기자에 함유되어 있는 베타인은 세포가 손상되는 것을 억제하고 암 예방에 도움이 되고, 혈액순환을 잘 시키며, 허리와 다리에 힘이 강해지는 효과가 있다고 알려져 있다.
이에 따라, 본 발명은 상기에서 설명한 한약재의 재료들을 미리 준비하게 되고, 개껌의 기능성을 유지시키기 위한 기호재료를 준비하게 되며, 상기 준비된 한약재의 재료들과 기호재료들을 각각 분쇄기를 이용하여 분쇄시킨 다음 상기 분쇄된 한약재의 재료들과 기호재료들을 1:99 비율로 배합하게 된다.
상기 배합된 재료들에 대해 일정한 온도 및 시간으로 가열하게 되는데, 상기 가열 온도는 75℃ 이상, 가열 시간은 30분 ~ 1시간 정도 이루어지는 것이 바람직하다.
여기서, 상기 가열 온도가 75℃ 이상이고, 가열 시간이 30분 ~ 1시간 정도 이루어져야 배합물이 떡을 찌듯 익어서 성형되어지는데, 만약 상기 가열 온도가 75℃ 미만이거나 가열 시간이 30분 ~ 1시간 정도에서 이루어지지 않으면 배합물이 제대로 익지 않아 원하는 성형이 될 수 없을 뿐더러 제품 유통시 곰팡이 발생으로 인한 유통기간이 짧아지는 문제가 있는 것이다.
상기 가열된 배합 재료들에 대해 성형기를 통해 일정한 형태로 성형시킨 다음 상기 성형된 배합 재료들에 대해서 제품 포장 규격에 맞도록 일정하게 컷팅하게 되고, 상기 컷팅된 제품에 대해 상기의 과정에서 포함될 수 있는 금속이 있을 수 있기에, 상기 금속을 검출하는 과정을 실시한 후에 상기 금속이 검출되지 않으면 제품으로 출하시킬 수 있는 완제품을 완성시키게 되는 것이다.
또한, 상기 배합되어 건조된 한약재의 재료들은 최적의 맛과 기미를 지닌 제품으로 완성시키기 위해 숙성기를 통해 1일 동안 숙성시킬 수 있고, 상기 숙성기를 통해 1일 동안 숙성하게 되는데, 1일이 되지 않거나 1일을 초과하게 되면 제품으로서의 맛과 기미가 떨어지는 문제가 있다.
그리고, 상기 숙성기에는 센서단(미도시)이 구비되어 있는데, 이는 한약재의 배합물과 접촉하여도 녹슬지 않도록 스텐레스 재질로 이루어져 있고, 저장된 숙성물의 숙성정도를 감지하게 되는 것으로, 숙성정도의 시기가 1일이 지났는지 아니면 지나지 않는지를 감지할 수 있는 것이다.
이를 위해, 상기 센서단에 3개 이상의 주파수 신호를 공급하고 신호의 위상에 변위가 임계치 이상 발생하면 변환회로(미도시)를 거쳐 관리자의 단말기(미도시)로 신호를 전달하게 되어 이루어지고, 숙성기와 관리자의 단말기는 무선 또는 유선 통신망을 통해 신호를 전달할 수가 있는 것이다.
한편, 반려동물을 위한 개껌을 제조하는 것이기에, 개껌의 기능성을 유지시키기 위한 기호재료와 한약재 재료를 99:1의 비율로 배합 또는 혼합하여 이룰 수가 있는 것이다.
여기서, 상기 기호재료는 반려동물의 면역과 피부에 도움을 줄 수 있는 재료와, 면역과 관절에 도움을 줄 수 있는 재료로 각각 선택하여 제품을 완성시킬 수가 있는 것이다.
즉, 상기 기호재료 중 반려동물의 면역과 피부에 도움을 줄 수 있는 재료는 쌀가루, 셀룰로오스, 가수분해연어, 정제포도당, SHMP(핵사메타인산염), 소르빈산칼륨, 아마씨, 스피루리나, 베타글루칸, 콜라겐, 글루코사민, 히알루론산, 마리골드추출분말, 어유분말, 블루베리분말, 유카추출물, 후코이단, L-아르기닌, 프로폴리스, 프락토올리고당, 만난올리고당, 차전자피, 비타민합제, 미네랄합제, 아미노산합제, 글리세린, 프로필렌글리콜, 솔비톨, 물로 혼합되어 상기의 한약재 재료들과 배합되어 이루어지게 된다.
또한, 상기 기호재료 중 반려동물의 면역과 관절에 도움을 줄 수 있는 재료는 쌀가루, 셀룰로오스, 가수분해연어, 정제포도당, SHMP(핵사메타인산염), 소르빈산칼륨, 스피루리나, 베타글루칸, 글루코사민, MSM(식이유황), 녹색입홍합 분말, 콘드로이친, 마리골드추출분말, 히알루론산, 어유분말, 블루베리분말, 유카추출물, 후코이단, L-아르기닌, 프로폴리스, 프락토올리고당, 만난올리고당, 차전자피, 비타민합제, 미네랄합제, 아미노산합제, 글리세린, 프로필렌글리콜, 솔비톨, 물로 혼합되어 상기의 한약재 재료들과 배합되어 이루어지게 된다.
이에, 하기의 표는 반려동물의 면역과 피부에 도움을 줄 수 있는 기호재료와 한약재 재료에 대한 배합 비율, 또한 면역과 관절에 도움을 줄 수 있는 기호재료와 한약재 재료에 대한 배합 비율에 대해 바람직하게 각각 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 의해 실시되는 재료들에 대한 실험을 통해 영양간식의 유효성 및 안정성을 검증하기 위한 것이다.
즉, 면역력 강화에 효과가 있는 한약재 재료에 면역증진 효과가 우수하다고 알려진 베타글루칸이 최대로 함유된 꽃송이버섯을 배합함으로 꽃송이버섯의 면역활성 작용과 익수영진고와 천연 항생작용의 재료 작용이 결합된 효능을 반려동물에 적용할 수 있도록 제조된 영양간식 개껌을 제공하기 위한 것이다.
먼저, 한약재 배합물에 함유된 베타글루칸과 진세노사이드 함량을 측정하기 위한 것으로, 베타글루칸 측정에 사용된 시험물질은 한약재 배합물이며, 표준물질은 D-(+)-Glucose(Sigma, USA)를 사용하였고, 표준용액의 조제는 표준물질 54.79 mg 채취하여 최종 부피가 100 ml이 되도록 증류수에 완전히 녹여 547.3521 ug/ml 농도의 표준원액으로 만들었으며, 검량선 작성을 위해 표준원액을 증류수로 희석하여 하기 표 1의 농도 표준용액으로 만들었다.
STD Working Solution (ug/ml)
Name 1 2 3 4 5
D-(+)-Glucose 11.0958 16.6437 33.2873 66.5747 133.1494
이를 통해, 시험은 두개의 시료 및 공시험을 동시에 실시하였다. 시료 일정량을 삼각플라스크에 넣어 지방이 10 %이상인 경우 탈지하고, 당을 많이 함유한 경우 85 % 에탄올 용액으로 시료 20 mg당 10 ml씩으로 세척하고 증류수 10 ml을 가한다. 이 후 아밀라아제(20,000 ~ 60,000 U/ml) 약 0.1 mg을 취하고, 0.1 N 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH 6.9로 한 후 20℃에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다. 0.1 N 염산용액으로 pH 5.0으로 맞추고 셀룰라아제(1,600 U/ml)를 0.1 ml 넣고 37℃에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다. 프로테아제(600~1,300 U/ml) 약 0.1 ml를 넣고 0.1 N 수산화나트륨 용액으로 pH 7.5로 한 후 37℃에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다. 아밀로글루코시다제(10,000 U/ml) 약 0.1 ml 넣고 0.1 N 염산용액으로 pH 4.8로 한 후 60℃에서 2시간동안 진탕하여 효소 분해시킨다. 효*?*소분해물에 95 % 에탄올 40 ml를 가하여 4℃에서 12시간 동안 침전시킨 후 용액을 원심분리(3,000 rpm, 20분)하여 시료의 침전물을 취한다. 시료의 침전물에 80 % 에탄올 50 ml를 가하여 4℃에서 1 시간동안 침전시켜 용액을 원심분리(3,000 rpm, 20분) 하고, 원심분리된 침전물에 증류수 10 ml를 가한 후 침전물을 혼합하여 균질화시킨다. 균질화된 용액을 증류수로 50 ml가 되도록 한 후，이를 적정농도가 되도록 희석하여 시험용액으로 한다.
발색 과정은 25 ml 시험관을 농도별 표준용액과 시험용액(공시험포함)으로 구분하여 각각 5 % 페놀용액 1 ml를 넣는다. 농도별 표준용액을 각각 1 ml씩 가하고, 시험용액은 시험용액 0.1 ml과 증류수 0.9 ml를 가한다. 공시험은 증류수 1 ml을 가하여 용액들을 10초간 잘 흔들어 섞는다. 시험관에 각각 황산 5 ml을 가하여 혼합하고 실온에서 20분간 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 470 nm에서 홉광도를 측정한다. 분석결과는 하기 표 2의 계산식을 이용하여 산출하였다.
베타글루칸 =
(mg/g) 		시험용액의 농도(ug/ml) × 최종부피(ml) × 희석배수 × 0.9 × 10 × 규격
시료채취량(g) × 1000
* 베타글루칸 전환계수 (162/180) = 0.9
그리고, 진세노사이드 측정에 사용된 시험물질은 한약재 배합물을 사용하였으며, 표준물질은 Ginsenoside Rb1(Wako, Japan), Ginsenoside Rg1(Wako, Japan), Ginsenoside Rg3(Chromadex, USA)를 사용하였다.
표준용액의 조제는 각 표준물질을 Rg1 9.13 mg, Rb1 7.08 mg, Rg3 9.04 mg을 채취하여 최종 부피가 10 ml이 되도록 완전히 녹여 Rg1 911.17 ug/ml, Rb1 700.21 ug/ml, Rg3 812.69 ug/ml 농도의 표준원액으로 만들었으며, 검량선 작성을 위해 표준원액을 25ml 70 % 메탄올에 완전히 용해시키고 25 ml 총 50 ml로 정용한 후 멤브레인 필터(0.45 um)로 여과한 것을 하기 표 3의 농도의 시험용액으로 만들어 사용하였다.
STD Working Solution (ug/ml)
Name 1 2 3 4 5
Ginsenoside Rg1 1.2149 6.0745 30.3725 151.8623 303.7247
Ginsenoside Rb1 0.9336 4.6681 23.3404 116.7020 233.4040
Ginsenoside Rg3 1.0836 5.4180 27.0899 135.4493 270.8987
시료 일정량을 70 % 메탄올 25 ml로 완전히 용해시키고 총 50 ml로 맞춘 후 멤브레인 필터(0.45 um)로 여과한 것을 시험용액으로 하였다.
분석을 위해 S-DAD/FLD HPLC system(Shimadzu, Japan)를 활용하였으며, Supelco discovery C18 column(4.6 mm x 250 mm, Sigma, USA)을 장착하여 분석을 진행하였다. 주입된 시료는 10 μL였으며, 온도는 40℃로 유지되었으며 1 ml/min 속도로 70분간 진행되었다. 이동상은 acetonitrile과 증류수가 사용되었으며, 5 min(20 : 80), 20 min(23 : 77), 25 min(30 : 70), 30 min(40 : 60), 35 min(50 : 50), 60 min(85 : 15), 62 min(85 : 15), 65 min(20 : 80), 70 min(20 : 80) 로 설정되었으며 분석결과는 하기 표 4의 계산식을 이용하여 산출하였다.
Ginsenoside =
(mg/g) 		시험용액의 농도(ug/ml) × 최종부피(ml) × 희석배수 × 1
시료채취량(g) × 1000 1000
한약재 배합물의 베타글루칸 성분을 분석한 결과 하기 표 5에 나타난 바와 같이, 362.3 mg/g의 함유량이 관찰되었다
β-glucan Concentration
(ug/ml) 		Volume
(ml) 		Sampling
(g) 		Dilution Result
(mg/g)
1 97.0510 50 0.1178 10 363.10
2 84.8330 50 0.1056 10 361.50
Average 350.03
한약재 배합물의 진세노사이드 Rg1, Rb1, Rg3 성분을 분석한 결과 하기 표 6에 나타난 바와 같이, Rg1, Rb1 성분은 검출되지 않았으며, Rg3 0.4184 mg/g 함유량이 관찰되었다.
Ginsenoside Concentration
(ug/ml) 		Volume
(ml) 		Sampling
(g) 		Dilution Result
(mg/g)
Rg1 0.0000 50 3.3743 1 0.04
Rb1 0.0000 50 3.3743 1 0.15
Rg3 28.2331 50 3.3743 1 0.02
Rb1, Rg1, Rg3 total 0.21
상기 실험을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 한약재 배합물의 베타글루칸 성분을 분석한 결과 350.03 mg/g의 함유량이 관찰되고, 한약재 배합물의 진세노사이드 Rg1, Rb1, Rg3 성분을 분석한 결과 Rg1, Rb1, Rg3 성분은 총합 0.21 mg/g 함유량이 관찰되었다.
한편, 생물체내에서 생성되는 활성산소는 생체조직 및 세포를 손상시키는 산화력이 강한 독성물질로서 활성산소내에 free radical이 포함되어 있는데 이러한 free radical을 제거하게 되는 작용을 항산화작용이라고 한다. 본 시험에서는 한약재 배합물에 대한 항산화 효과를 평가하기 위해 DPPH를 이용하여 free radical소거 활성 측정시험을 실시하였다.
한약재 배합물에 대한 항산화 효과 중 하나인 활성 산소에 포함된 free radical 소거효과를 평가하기 위해 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)을 이용한 free radical 소거활성 측정 시험을 실시하였다.
한약재 배합물 0.05%，0.5%，1% 및 5% 농도의 DPPH free radical 소거 활성도를 측정한 결과 39.51%, 88.28%, 81.51% 및 90.61% 의 활성을 보였다.
이상의 결과로부터 DPPH free radical 소거활성 측정시험에서 시험물질인 한약재 배합물은 0.05%，0.5%，1% 및 5%의 농도에서 DPPH free radical 소거 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
본 시험에 사용된 시험물질은 한약재 배합물이며, 시험 기간동안 실온(1~30℃)에 보관하였고, 멸균증류수를 이용하여 조제하였다.
항산화 측정을 위한 양성대조물질은 L-Ascorbic acid(Sigma, USA)를 사용하였으며, 시험에 사용된 시약은 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(Alfa aesar)와 Ethanol(DUKSAN)이 사용되었다.
한약재 배합물을 순도 환산하지 않고 그대로 이용하였으며, 한약재 배합물은 0.05%, 0.5%, 1%, 5%, L-Ascorbic은 0.0005%, 0.001%, 0.0015%, 0.002% 농도로 각 각 멸균증류수를 이용하여 조제하였다. DPPH는 Ethanol을 이용하여 0.2 mM 농도로 조제하였다.
시험군은 한약재 배합물과 L-Ascrobic acid의 각 처리농도로 구성되었다(ㅎTab하기 표 7 참조).
Group Name Concentration (%)
G1
(TS)		 modified Kyungohkgo formulation 0.05, 0.5, 1, 5
G2
(PC)		 L-Ascorbic 0.0005, 0.001, 0.0015, 0.002
TS : Test substance, PC : Positive control
96 well plate에 각 농도별 조제물과 0.2 mM DPPH 및 Ethanol을 1:1로 혼합하여 넣은 후 실온에서 30분간 차광상태로 반응시키고 원심분리하여 상층액을 취한 뒤 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. DPPH free radical 소거활성율(%)은 아래의 식을 이용하여 산출하였다.
DPPH free radical scavenger activity (%) = 1- A/B × 100
A : 시험물질의 흡광도, B : 공시료의 흡광도
각 실험 결과는 3회 반복 측정하여 평균과 표준편차를 나타내었으며, SPSS 통계 프로그램(Ver. 19.0)을 이용하여 통계분석을 수행하였다. 먼저, Levene`s test를 수행한 후, one way ANOVA test를 실시하여, 실험군간 유의성이 확인되면 분산의 동질성 유무에 따라 사후검점(분산이 동질한 경우, Duncan`s 다중검정, 분산이 이질한 경우, Dunnett`s T3)을 실시하였으며, 신뢰구간은 95 %로 설정하였다.
시험물질 가미방(G1)을 농도별 (0.05%, 0.5%, 1% 및 5%)로 처리하여 DPPH free radical 소거활성도를 측정한 결과, 31.14%, 91.27%, 91.54% 및 92.45% 의 활성을 보였으며, IC50(50 % 활성율을 나타내는 농도)을 산출한 결과, 0.146%의 농도로 산출되었고, 양성대조 L-Ascorbic acid (G2)을 농도별 (0.05%, 0.5%, 1% 및 5%)로 처리하여 DPPH free radical 소거활성도를 측정한 결과, 11.38%, 36.91%, 58.83% 및 79.18% 의 활성을 보였으며, IC50 (50% 활성율을 나타내는 농도)을 산출한 결과, 0.0011% 의 농도로 산출되었다(하기 표 8, 도 1 및 도 2 참조).
Group N Concentration OD517 DPPH free radical scavenger activity (%)
Mean±SD Mean±SD
G1
(TS)		 3 0 0.635±0.016 -
3 0.05 0.437±0.005 31.14±2.67*
3 0.5 0.055±0.006 91.27±1.11*
3 1 0.054±0.005 91.54±0.87*
3 5 0.048±0.002 92.45±0.48*
G2
(PC)		 3 0 0.696±0.010 -
3 0.0005 0.617±0.005 11.38±0.81*
3 0.001 0.439±0.004 36.91±0.34*
3 0.0015 0.286±0.007 58.83±1.37*
3 0.002 0.145±0.003 79.18±0.42*
TS : Test substance, PC : Positive control, - : Not applicable, N : Number of well, S.D. : Standard deviation, * : Significantly difference from Control at p<0.05
또한, 하기에서는 한약재(일명 경옥고가미방) 배합제를 활용한 반려견의 개껌에 대한 기호도 및 임상적 유효성 평가를 하였다.
이에, 임상연구에는 감염성 피부질환 및 관절질환으로 진단된 반려견 30마리가 선발되었고, 선발된 개체들은 피부간식 급여군, 관절간식 급여군, 대조군으로 구성된 3개 군으로 분류하였으며, 관절간식 급여군은 피부질환 외에 관절염이 추가로 진단된 5마리의 개체가 포함되었다.
관절간식 급여군을 제외한 개체들은 피부간식 급여군에 10마리, 대조군에 15마리로 배정되었고, 연구에 포함된 개체의 기본 개체 특성 및 생체지표 특성은 표 9와 표 10에 제시하였다.
전체 30마리 개체는 모두 중성화 된 개체로 대조군에는 암컷이 13마리, 피부간식 급여군에는 9마리, 관절간식 급여군에는 3마리가 배정되었다. 품종 구성으로는 대조군에 치와와 6마리, 시츄 5마리, 그 외의 종 4마리로 구성되었으며, 피부간식 급여군의 경우 비글 4마리, 코카스파니엘 3마리, 그 외의 종이 3마리로 구성되었다. 관절간식 급여군의 경우 5마리 모두 코카스파니엘로 구성되었다.
시험 시작 전 대조군과 간식 급여군들의 생체지표 특성에 대한 차이를 평가하였으며, 세 군에서 심박수, 호흡수 및 체온 등의 생체 지표는 유의적인 차이를 보이지 않았다.
하기 표 9는 전체 개체 30마리의 시험 전(Day 0) 기본 개체 특성을 나타낸 것이다.
Characteristics Control group (n=15) Skin group
(n=10) 		Joint group
(n=5)
Gender Spayed female 13 9 3
Castrated male 2 1 2
Breeds Chihuahua (6) Beagle (4) Cocker spaniel (5)
Shih tzu (5) Cocker spaniel (3)
Others (4) Others (3)
하기 표 10은 전체 개체 30마리의 시험 전(Day 0) 생체지표 특성을 나타낸 것이다.
Characteristics Control group
(n=15) 		Skin group
(n=10) 		Joint group
(n=5) 		p
Heart rate (bpm) 113.9 ± 22.6 107.0 ± 22.3 102.0 ± 19.2 0.33
Respiratory rate (/min) 20.9 ± 7.7 28.6 ± 13.6 22.6 ± 11.8 0.36
Body temperature (℃) 37.6 ± 0.6 38.0 ± 0.7 38.0 ± 0.7 0.23
또한, 하기에서는 대조군과 피부간식 급여군으로 선정된 개체의 시험 전 피부상태를 비교하였다.
즉, 대조군은 약물을 이용한 피부 감염질환에 대한 표준치료를 시행하였으며, 간식 급여군은 표준치료에 경옥고가미방 재료 성분의 반려견 면역강화 간식을 함께 급여하였다. 대조군과 피부간식 급여군은 시험 진행 전 피부의 상태에 대해 소양감 (5점 만점)과 발적 점수 (3점 만점)를 평가하여 비교하였다. 두 군의 시험 진행 전 소양감(p = 0.322) 및 발적 점수(p = 0.292)는 유의적인 차이가 없는 것이 확인되었다(하기 표 11 참조).
이에, 하기 표 11은 대조군 15마리와 피부간식 급여군 10마리의 시험 전(Day 0) 소양감 및 발적 점수를 나타낸 것이다.
Characteristics Control group
(n=15) 		Skin group
(n=10) 		p
Pruritus at study onset 1.1 ± 0.8 1.4 ± 0.5 0.322
Erythema at study onset 1.3 ± 0.6 1.5 ± 0.5 0.292
또한, 하기에서는 대조군과 간식 급여군의 시험 전과 후의 혈액검사 및 혈청화학 검사 결과를 평가한 것이다.
즉, 대조군과 간식 급여군에 4주간 각각 표준치료 및 표준치료와 경옥고가미방 재료 성분의 간식 급여를 진행하였으며, 급여 전과 급여 4주 후 혈액수치 및 혈청화학적 변화를 표 12의 전혈구검사와 표 13의 혈청화학검사에 각각 제시하였다.
대조군과 간식 급여군 모두에서 혈액검사 상 백혈구, 적혈구, 혈색소, 적혈구 용적 및 혈소판과 관련된 혈액수치는 시험기간 동안 특이할 만한 변화가 관찰되지 않았으며, 혈소판을 제외한 모든 수치는 참고범위 이내에 존재하였다(표 12 참조). 혈소판 수치는 일부 개체에서 참고범위 이상으로 측정되었으나 임상적으로 유의미한 수준은 아니며 투약 전후로 유의미한 결과는 관찰되지 않았다.
또한, 대조군과 간식 급여군 모두에서 간효소수치, 신장관련 효소수치 및 단백질 수치의 변화를 관찰하였다. 대부분의 수치들은 참고범위 내에 포함되었으며, 대조군에서 투약 전 Aspartate Aminotransferase(ALT)가 참고범위보다 높았고, 관절간식 급여군에서 투약 전 Alkaline phosphatase(ALP) 수치가 참고범위보다 높았다. 대조군과 간식 급여군 모두 피부질환 감염 치료를 위하여 기존 표준치료 방법인 경구 약물을 투여 받고 있었으며, 이때 사용하는 약물로 인하여 간효소 수치인 ALT와 ALP수치가 시험진행 전부터 정상범위보다 높게 측정된 것으로 평가되었다. 시험이 진행되는 4주 동안 두 가지 수치는 대조군과 급여군에서 모두 감소하는 패턴을 보였으나, 통계적 유의성을 확인할 수는 없었다. 그 외 다른 혈청화학 검사 수치는 시험기간 동안 참고범위 이내에 존재하였으며, 시험 전후 특이할 만한 변화가 관찰되지 않았다(표 13 참조).
하기 표 12는 대조군과 간식 급여군의 시험 전과 4주 후의 전혈구 검사 지표 평가를 나타낸 것이다.
Hematologic evaluations Control group(n=15) Skin group(n=10) Joint group (n=5)
Day 0 Day 28 Day 0 Day 28 Day 0 Day 28
WBC (x10 3 /ul) 12.8 ± 5.3 13.6 ± 7.0 9.0 ± 2.9 8.1 ± 2.4 9.6 ± 1.4 9.7 ± 2.3
RBC (x10 6 /ul) 6.8 ± 0.5 6.3 ± 1.0 7.2 ± 1.2 7.1 ± 1.2 5.9 ± 0.4 6.2 ± 0.5
Hb (gm/dl) 15.8 ± 1.4 14.6 ± 2.1 16.5 ± 2.3 15.9 ± 2.3 13.8 ± 0.7 14.4 ± 1.1
PCV (%) 47.6 ± 3.4 43.2 ± 7.2 49.7 ± 7.3 48.2 ± 6.8 41.9 ± 2.1 43.2 ± 3.2
MCV (fL) 69.6 ± 2.3 68.7 ± 2.3 69.2 ± 2.7 68.7 ± 3.0 70.9 ± 1.3 69.3 ± 1.1
MCH (pg) 23.1 ± 1.0 23.4 ± 2.2 23.0 ± 1.2 22.7 ± 1.2 23.4 ± 0.6 23.0 ± 0.6
MCHC (g/dl) 33.1 ± 0.7 34.1 ± 3.6 33.1 ± 0.9 33.0 ± 0.8 33.0 ± 0.3 33.3 ± 0.6
PLT
(x 10^3/ul) 		526.9 ± 90.0 560.3 ± 180.8 375.5 ± 134.1 338.9 ± 155.3 533.2 ± 23.6 439.2 ± 88.8
WBC, white blood cell; RBC, red blood cell; Hb, haemoglobin; PCV, packed cell volume; MCV, mean corpuscular volume; MCH, mean corpuacular haemoglobin; MCHC, mean corpuscular haemoglobin concentration; PLT, platelets;
하기 표 13은 대조군과 간식 급여군의 시험 전과 4주 후의 혈청화학 검사 지표 평가를 나타낸 것이다.
S-chem evaluations Control group(n=15) Skin group(n=10) Joint group (n=5)
Day 0 Day 28 Day 0 Day 28 Day 0 Day 28
BUN (mg/dl) 25.2 ± 8.2 19.7 ± 8.0 24.1 ± 15.1 21.3 ± 21.4 19.3 ± 8.5 18.9 ± 4.7
CREA (mg/dl) 0.4 ± 0.1 0.5 ± 0.1 0.6 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.4 ± 0.1 0.5 ± 0.1
ALT(U/L) 84.7 ± 127.1 52.2 ± 43.7 40.2 ± 15.7 36.1 ± 13.5 57.0 ± 36.4 33.8±16.4
AST (U/L) 40.4 ± 26.8 30.3 ± 9.8 33.2 ± 9.4 31.2 ± 11.2 32.0 ± 5.3 28.2 ± 3.4
ALP (U/L) 68.8 ± 57.1 78.9 ± 58.0 71.1 ± 37.4 113.4 ± 122.3 287.6 ± 516.1 75.6 ± 55.8
GGT (U/L) 7.3 ± 3.3 9.1 ± 2.6 4.8 ± 0.8 5.8 ± 0.9 6.6 ± 1.5 5.4 ± 1.1
TP (g/dl) 6.4 ± 0.4 6.2 ± 0.5 6.5 ± 0.4 6.4 ± 0.3 6.6 ± 0.3 6.3 ± 0.4
ALB (g/dl) 3.3 ± 0.3 3.2 ± 0.4 3.5 ± 0.3 3.3 ± 0.3 3.0 ± 0.3 2.9 ± 0.4
BUN, blood urea nitrogen; CREA, creatinine; ALT, alanine transaminase; AST, Aspartate Aminotransferase; ALP, Alkaline phosphatase; GGT, Gamma glutamyl peptidase; TP, Total protein; ALB, albumin.
간식 외의 요인들을 제외하기 위하여, 간식 급여 전후 혈액검사 수치의 차이 값 (Δ value)을 각 군마다 비교하여 표 14(관절간식 급여군과 대조군의 비교)와 표 15(피부간식 급여군과 대조군의 비교)에 각각 제시하였다.
관절간식 급여군과 대조군에서 간식 급여 전후 빈혈 관련 수치, 간효소수치의 유의미한 변화를 관찰하였다(표 14 참조). 관절간식 급여군에서 간식 급여 4주 후 빈혈 지표인 Red blood cell(RBC), Haemoglobin(Hb), Packed cell volume(PCV)이 대조군에 비해 증가하였으며, 이는 통계적으로 유의미한 차이를 보였다(각각 p=0.032, 0.026, 0.032). 또한 간효소수치인 Gamma glutamyl peptidase(GGT)의 경우도 관절간식 급여군에서 간식 급여 4주 후 대조군에 비해 감소하였으며, 이는 통계적으로 유의미한 차이를 보였다(p=0.007).
피부간식 급여군과 대조군에서는 각 군 별로 유의미한 차이를 보이지 않았다 (표 15 참조).
하기 표 14는 관절간식 급여군과 대조군의 시험 전과 4주 후의 혈액학적 수치 차이 비교 평가를 나타낸 것이다.
Hematologic evaluations Δ value at Day 28 a
Joint group Control group p
WBC (x10 3 /ul) -0.1 ± 1.6 -0.8 ± 6.3 0.407
RBC (x10 6 /ul) -0.3 ± 0.4 0.5 ± 1.0 0.032*
Hb (gm/dl) -0.6 ± 0.8 1.2 ± 1.6 0.026*
PCV (%) -1.3 ± 2.5 4.4 ± 6.3 0.032*
MCV (fL) 1.7 ± 0.8 0.9 ± 1.1 0.149
MCH (pg) 0.3 ± 0.5 -0.3 ± 2.2 0.456
MCHC (g/dl) -0.3 ± 0.5 -0.98 ± 3.5 0.484
PLT (x 10^3/ul) 94.0 ± 73.6 -33.5 ± 195.0 0.106
S-chem
BUN (mg/dl) 0.4 ± 5.0 5.5 ± 11.5 0.190
CREA (mg/dl) -0.0 ± 0.1 -0.0 ± 0.1 0.359
ALT(U/L) 23.6 ± 32.7 32.5 ± 85.8 0.430
AST (U/L) 3.8 ± 5.2 10.1 ± 20.6 0.457
ALP (U/L) 212.0 ± 470.8 -10.1 ± 45.0 0.273
GGT (U/L) 1.2 ± 1.6 -1.8 ± 2.4 0.007**
TP (g/dl) 0.2 ± 0.4 0.2 ± 0.3 0.510
ALB (g/dl) 0.1 ± 0.1 0.1 ± 0.2 0.822
WBC, white blood cell; RBC, red blood cell; Hb, haemoglobin; PCV, packed cell volume; MCV, mean corpuscular volume; MCH, mean corpuacular haemoglobin; MCHC, mean corpuscular haemoglobin concentration; PLT, platelets; BUN, blood urea nitrogen; CREA, creatinine; ALT, alanine transaminase; AST, Aspartate Aminotransferase; ALP, Alkaline phosphatase; GGT, Gamma glutamyl peptidase; TP, Total protein; ALB, albumin.
aThe value is the change from Day 0 to Day 28.
* p < 0.05; ** p < 0.01
하기 표 15는 피부간식 급여군과 대조군의 시험 전과 4주 후의 혈액학적 수치 차이 비교 평가를 나타낸 것이다.
Hematologic evaluations Δ value at Day 28 a
Skin group Control group p
WBC (x10 3 /ul) 0.9 ± 1.3 -0.8 ± 6.3 0.052
RBC (x10 6 /ul) 0.2 ± 0.4 0.5 ± 1.0 0.267
Hb (gm/dl) 0.6 ± 0.7 1.2 ± 1.6 0.330
PCV (%) 1.5 ± 2.3 4.4 ± 6.3 0.233
MCV (fL) 0.5 ± 0.8 0.9 ± 1.1 0.389
MCH (pg) 0.3 ± 0.5 -0.3 ± 2.2 0.404
MCHC (g/dl) 0.12 ± 0.5 -0.98 ± 3.5 0.148
PLT
(x 10^3/ul) 		36.6 ± 73.8 -33.5 ± 195.0 0.331
S-chem
BUN (mg/dl) 2.8 ± 7.6 5.5 ± 11.5 0.437
CREA (mg/dl) 0.0 ± 0.1 -0.0 ± 0.1 0.072
ALT(U/L) 4.1 ± 7.0 32.5 ± 85.8 0.140
AST (U/L) 2.0 ± 4.9 10.1 ± 20.6 0.172
ALP (U/L) -42.3 ± 93.6 -10.1 ± 45.0 0.126
GGT (U/L) -1 ± 0.7 -1.8 ± 2.4 0.275
TP (g/dl) 0.1 ± 0.2 0.2 ± 0.3 0.955
ALB (g/dl) 0.1 ± 0.2 0.1 ± 0.2 0.800
WBC, white blood cell; RBC, red blood cell; Hb, haemoglobin; PCV, packed cell volume; MCV, mean corpuscular volume; MCH, mean corpuacular haemoglobin; MCHC, mean corpuscular haemoglobin concentration; PLT, platelets; BUN, blood urea nitrogen; CREA, creatinine; ALT, alanine transaminase; AST, Aspartate Aminotransferase; ALP, Alkaline phosphatase; GGT, Gamma glutamyl peptidase; TP, Total protein; ALB, albumin.
aThe value is the change from Day 0 to Day 28.
또한, 하기에서는 대조군과 피부간식 급여군의 시험 전과 후의 피부상태 검사 지표에 대해 비교한 것으로, 대조군과 피부간식 급여군에 4주간 각각 표준치료 및 표준치료와 경옥고가미방 재료 성분의 간식 급여를 진행한 후 시험전과 4주 후 시점의 피부의 상태에 대해 발적과 소양감 평가를 비교하였다(표 16 및 도 3 참조).
대조군과 급여군 모두에서 발적 평가점수는 급여 전과 비교하였을 때 유의적으로 감소하는 것으로 평가되었다(각, p=0.001, p=0.004). 소양감 평가점수의 경우에도 대조군과 급여군 모두에서 급여 전과 비교하였을 때 유의적으로 감소하는 것으로 평가되었다(각, p=0.001, p=0.014).
하기 표 16은 대조군과 피부간식 급여군의 피부상태 검사 지표의 비교를 나타낸 것이다.
Characteristics Control group
(n=15) 		Skin group
(n=10)
Day 0 Day 28 p Day 0 Day 28 p
Erythema 1.3 ± 0.6 0.6 ± 0.7 0.001*** 1.5 ± 0.5 0.5 ± 0.5 0.004**
Pruritus
(5 scale)		 1.1 ± 0.8 0.3 ± 0.6 0.001*** 1.4 ± 0.5 0.8 ± 0.8 0.014*
* p < 0.05; ** p< 0.01; *** p < 0.001
첨부도면 도 3은 급여군 개체의 시험 전후 피부병변 비교 사진으로서, 시험물질(경옥고가미방 재료 성분의 간식) 급여 전(A)과 비교해, 급여 후(B) 감염성 피부염과 관련된 주요 피부 병변인 발적(erythema), 가피(scale) 등이 육안평가상 감소함을 확인할 수 있다.
또한, 하기에서는 대조군과 급여군의 사이토카인을 분석한 것으로, 대조군과 급여군에 4주간 각각 표준치료 및 표준치료와 경옥고가미방 재료 성분의 간식 급여를 진행한 후 시험전과 4주 후 시점에 혈액을 채취하여, 혈청에서 면역조절 및 염증과 관련된 7가지의 사이토카인을 비교 평가하였다.
즉, 개의 피부염 및 관절염의 면역기전과 관련된 사이토카인인 IFN-r, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, MCP-1, TNF-a를 간식 급여 전후 혈중에서 평가하였다. 피부간식 급여군에서 IL-2의 유의미한 감소가 관찰되었으며(p=0.032), 이는 피부 간식의 급여가 피부염과 관련된 염증 반응을 개선할 수 있음을 시사한다(표 18 참조). 이 외의 사이토카인에서는 간식 급여군과 대조군 모두에서 시험기간 동안 특이할 만한 변화가 관찰되지 않았다(표 17 및 표 18 참조).
하기 표 17은 대조군과 관절간식 급여군의 각 사이토카인 평가 결과 비교를 나타낸 것이다.
Characteristics Control group(n=15) Joint group(n=10)
Day 0 Day 28 p Day 0 Day 28 p
IFN-r 109.0 ± 253.3 14.3 ± 28.7 0.147 24.6 ± 50.6 77.2 ± 147.3 0.893
IL-2 97.0 ± 142.3 71.9 ± 90.9 0.570 39.2 ± 53.2 85.2 ± 111.6 0.686
IL-6 60.2 ± 67.4 70.3 ± 94.3 0.798 42.2 ± 48.2 89.8 ± 106.8 0.686
IL-8 14850.0 ± 15148.4 7610.5 ± 7356.0 0.173 11133.8 ± 6778.1 9733.2 ± 5791.5 0.500
IL-10 98.7 ± 202.9 148.9 ± 330.2 0.576 79.6 ± 87.3 313.0 ± 486.8 0.686
MCP-1 553.8 ± 208.2 512.7 ± 452.3 0.570 359.2± 179.0 536.0 ± 375.6 0.686
TNF-a 25.3 ± 41.4 53.3 ± 95.5 0.529 16.8 ± 34.2 57.2 ± 93.3 0.893
IFN-r, interferon-gamma; IL, interleukin; MCP, monocyte chemoattractant protein; TNF-a, tumor necrosis factor-alpha
하기 표 18은 대조군과 피부간식 급여군의 각 사이토카인 평가 결과 비교를 나타낸 것이다.
Characteristics Control group(n=15) Skin group(n=10)
Day 0 Day 28 p Day 0 Day 28 p
IFN-r 109.0 ± 253.3 14.3 ± 28.7 0.147 69.4 ± 208.6 1.4 ± 1.3 0.176
IL-2 97.0 ± 142.3 71.9 ± 90.9 0.570 125.5± 138.8 23.2 ± 26.7 0.032*
IL-6 60.2 ± 67.4 70.3 ± 94.3 0.798 62.2 ± 59.4 27.0 ± 29.8 0.241
IL-8 14850.0 ± 15148.4 7610.5 ± 7356.0 0.173 6279.0 ± 6147.0 8344.3 ± 5462.5 0.386
IL-10 98.7 ± 202.9 148.9 ± 330.2 0.576 226.5 ± 479.8 19.8 ± 13.1 0.213
MCP-1 553.8 ± 208.2 512.7 ± 452.3 0.570 461.9 ± 274.0 374.1 ± 143.4 0.333
TNF-a 25.3 ± 41.4 53.3 ± 95.5 0.529 37.4 ± 53.2 5.2 ± 12.7 0.441
* p < 0.05
IFN-r, interferon-gamma; IL, interleukin; MCP, monocyte chemoattractant protein; TNF-a, tumor necrosis factor-alpha
또한, 하기에서는 대조군과 급여군의 삶의 질을 평가한 것으로, 대조군과 급여군에 4주간 각각 표준치료 및 표준치료와 경옥고가미방 재료 성분의 간식 급여를 진행한 후 시험 전과 4주 후 시점에 삶의 질에 대하여 평가하였다.
대조군은 시험 전후로 삶의 질 점수의 유의미한 차이를 보이지 않았으나, 피부간식 급여군과 관절간식 급여군의 경우 시험 전과 비교하여 시험이 끝난 이후 삶의 질이 유의적으로 상승하였다(각, p=0.008, p=0.041; 표 19 참조).
하기 표 19는 대조군과 급여군에서 시험 진행 후 삶의 질 변화에 대해 평가한 것이다.
Characteristics Control group(n=15) Skin group(n=10) Joint group (n=5)
Day 0 Day 28 p Day 0 Day 28 p Day 0 Day 28 p
Quality of life
(0-70)		 59.7±7.9 60.5±6.4 0.242 59.8±5.9 63.7±4.1 0.008** 53.4±8.2 58.6±6.4 0.041*
* p < 0.05, ** p < 0.01
또한, 하기에서는 급여군에서 간식 기호성을 평가한 것으로, 급여군에 4주간 경옥고가미방 재료 성분의 간식 급여를 진행한 후 4주 간 기호성에 대하여 평가하였다. 기호성은 4분간 간식을 자발적으로 모두 삼키는 경우를 완전 섭취로 취급하고, 전체 급여시도 마리 수에서 완전섭취 마리 수의 비율을 백분율로 나타내었다.
관절간식 급여군의 경우 모든 개체가 완전섭취를 하여 100%의 기호성을 보였으며, 피부간식 급여군의 경우 한 개체가 부분 섭취를 하였고, 나머지 개체들은 완전섭취를 하여 90%의 기호성을 보였고(표 20 참조), 전반적으로 두 간식 모두 기호성이 좋은 것으로 판단된다.
하기 표 20은 간식 급여군에서 기호성을 평가한 것이다.
Characteristics Skin group (n=10) Joint group (n=5)
Palatability index(%) 90% 100%
상기의 모든 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내며, 각 데이터들의 정규성 검정은 Kolmogorov-Smirnov test (정규분포검정)를 이용하여 진행하였고, 정규성 검정 결과에 따라, 대조군과 급여군의 시험 진행 전 각 평가 항목들의 비교는 Mann-Whitney U test를 이용하여 진행하였으며, 대조군 및 급여군의 시험 전과 후의 각 평가 항목들의 비교는 Wilcoxon signed rank test를 이용하여 평가하였고, 통계학적으로 p < 0.05 인 경우 유의적인 것으로 평가하였으며, 통계적 분석에는 SPSS version 20 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)이 이용되었다.
상기와 같이 실시되는 시험은 반려동물의 피부질환 및 관절질환 예방에 경옥고가미방 재료를 기반으로 한 영양간식을 활용하여 반려동물 면역력 조절 배합제의 안전성과 유효성을 검증하는 것으로, 반려동물의 감염성 피부질환은 일반적으로 면역력이 떨어진 개체에서 세균, 곰팡이, 바이러스 등의 감염에 의해 유발되는 소양성 및 염증성 피부질환으로 정의되며, 반려동물에서 많이 발생하는 피부 질환이다. 소양감과 발적이 특징으로 피부 염증으로 인하여 반려동물과 보호자의 삶의 질을 악화시킬 수 있다.
이에, 이번 시험은 감염성 피부질환과 관절질환으로 진단된 30마리의 반려동물을 모집하고, 대조군과 피부간식 급여군, 관절간식 급여군으로 나눈 뒤 대조군에서는 4주간 표준치료 (약물치료)를 진행하고, 급여군에서는 4주간 표준치료와 한약재 배합 간식 급여를 함께 진행한 후 4주 뒤에 그 결과를 비교 평가하였다. 급여기간 동안의 개체의 임상적 안전성을 평가하기 위해 기본적인 생체지표(심박수, 호흡수, 체온)와 혈액검사 및 혈청화학 지표를 평가하였고, 급여한 한약재 배합 간식의 유효성을 확인하기 위해 피부검사 지표(발적, 소양감 지표), 삶의 질 지표 그리고 기호성 등이 포함되었다.
안전성 확인을 위하여 생체 지표, 혈액검사 및 혈청화학 검사 지표를 평가한 결과 대조군과 간식 급여군 모두 연구기간 동안 특이할 만한 부작용이 확인되지 않았고, 한약제가 간에 부담을 주거나 간수치를 증가시킨다는 속설이 있으나, 본 시험이 진행된 4주 동안 한약재 배합 간식 급여를 받은 개체의 간수치는 영향을 받지 않았으며, 그 외 평가 지표들도 특이할 만한 점이 없어, 4주 동안의 단기 안전성을 확인할 수 있었다.
유효성 확인을 위하여 피부상태 검사, 사이토카인 검사, 삶의 질 평가를 진행하였고, 피부 상태의 경우 대조군과 간식 급여군 모두 시험기간 동안 유의미한 피부상태의 개선을 보였으나, 대조군에 비교하여 간식 급여군에서 더 나은 개선을 보이지는 않았다. 반면 사이토카인 검사에서는 피부간식 급여군에서 대조군에 비해 IL-2의 유의적인 감소가 관찰되었다. IL-2는 Th1 도움T세포에서 분비되며, 높은 농도의 IL-2는 CD8과 NK 세포를 자극하여 염증을 촉진시킨다(Lin et al, 2010). 개에서는 만성 피부염, 특히 아토피성 피부염이 만성으로 진행되었을 때 Th1 도움T세포의 활성이 증가하여 IL-2가 상승한다(Mazrier et al, 2022). 이번 시험에서 피부 간식의 병용 급여가 IL-2의 유의적인 감소를 보였다는 점에서 만성 피부염 환자의 염증 조절 작용에 도움이 될 가능성이 있음을 시사한다. 관절간식 급여군에서는 사이토카인의 유의미한 변화는 보이지 않았다. 삶의 질 측면에서는 대조군에 비해 간식 급여 군에서 유의성 있게 개선이 된 부분을 확인할 수 있었다.
또한, 기호성 평가에서는 두 가지 형태의 간식 모두 90% 이상의 높은 기호성을 보였다. 심한 만성 피부염을 보이는 환자들은 소양감과 통증으로 인한 스트레스로 식욕 부진 및 기력 저하가 발생할 수 있다. 이로 인한 영양 불균형은 염증 상태를 지속시키고 질병 회복을 늦출 수 있는 요인으로 작용한다. 본 발명에 따른 간식의 높은 기호성은 만성 질환 환자에서 식욕 자극 및 스트레스 완화 효과를 통해 질병 회복을 도울 수 있을 것으로 판단된다.
또한, 본 시험은 경옥고가미방 재료를 기반으로 한 영양간식을 반려동물 피부질환 및 관절질환 개체에 급여하여 안전성, 유효성을 평가하고자 하였다. 표준치료로 사용되는 약물을 병용 투여하여 급여군에서 명확한 유효성의 증거를 확인할 수는 없었으나, 4주 간의 급여에서 안전성이 확보된 점, 피부간식 급여 시 일부 염증관련 사이토카인의 개선이 확인되는 점, 삶의 질의 개선 및 높은 기호성을 보이는 점은 기능성 간식으로써 긍정적인 부분으로 판단된다.
상기의 시험을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명은 기술적 구성의 특성등을 고려한 기술의 구체적 적용에 따른 최적의 효과를 얻기 위해 상당한 연구개발을 실시하여 창작능력을 발휘한 것이다.
이상, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위에는 설명된 실시예에 국한되어 전해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (3)

  1. 감염질환 예방을 위해서 면역 강화시키는 한약재의 재료들을 준비하고, 개껌의 기능성을 유지시키기 위한 기호재료를 준비하는 단계;
    상기 준비된 한약재의 재료들과 기호재료들을 각각 분쇄기를 이용하여 분쇄시키는 단계;
    상기 분쇄된 한약재의 재료들과 기호재료들을 일정한 비율로 배합하는 단계;
    상기 배합된 재료들에 대해 일정한 온도 및 시간에서 가열하는 단계;
    상기 가열된 배합 재료들에 대해 성형기를 통해 일정한 형태로 성형시키는 단계;
    상기 성형된 배합 재료들에 대해서 제품 포장 규격에 맞도록 일정하게 컷팅하는 단계;
    상기 컷팅된 제품에 대해 상기의 과정에서 포함될 수 있는 금속이 있는지 검출하는 단계; 및
    상기 금속이 검출되지 않으면 제품으로 출하시킬 수 있는 완제품을 완성시키는 단계;
    를 포함하는 반려동물 감염질환 예방을 위한 한약재가 첨가된 면역 강화 영양간식 개껌 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 한약재의 재료들은 홍삼 5.5중량%, 백복령 46.4중량%, 맥문동 2.5중량%, 천문동 2.5중량%, 구기자 5.3중량%, 꽃송이버섯 1.0중량%, 노루궁뎅이버섯 5.5중량%, 황금 7.6중량%, 어성초 22.7중량%, 꿀 1중량% 비율로 배합되어 이루어지는 반려동물 감염질환 예방을 위한 한약재가 첨가된 면역 강화 영양간식 개껌 제조방법.
  3. 제1항에 있어서.
    상기 배합된 한약재의 재료에 대해 일정한 온도 및 시간에서 가열하는 단계에서, 가열 온도는 75℃ 이상, 가열 시간은 30분 ~ 1시간 이루어지는 반려동물 감염질환 예방을 위한 한약재가 첨가된 면역 강화 영양간식 개껌 제조방법.
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