KR102468224B1 - 설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당의 제조방법 - Google Patents

설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당의 제조방법 Download PDF

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가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼
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Abstract

[해결해야 할 문제]
본 발명의 목적은 분자 내에 설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류, 또는 상기 당류를 포함하는 화합물을 균일하고 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
[해결책]
본 발명은 설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 제1 당류" 및 "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 제2 당류"를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 제조된 제1 당류 및 제2 당류를 서로 축합시키는 단계;를 포함한다.

Description

설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당의 제조방법
본 발명은 설페이트기(sulfate group) 및/또는 포스페이트기(phosphate group)를 갖는 당류(saccharide), 또는 상기 당류를 포함하는 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
분자 내에 설페이트기를 포함하는 당류는 다양한 생리적 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)의 일종인 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate) 및 더마탄 설페이트(dermatan sulfate)는 프로테오글리칸(proteoglycan)의 측쇄(side chain)로서 세포 표면 또는 세포외 기질(extracellular matrix)에 존재하고, 다양한 생리적 기능을 나타내기 위해 설페이트화 이당류 단위(sulfated disaccharide units)의 서열의 차이에 따라 다양한 기능성 도메인을 형성하는 것으로 알려져 있다. 설페이트화 당류(sulfated saccharide)는 생체 내에서 심지어 미량으로도 다양한 생리 활성을 나타내는 많은 사이토카인 및 성장 인자와 높은 친화성을 갖고, 상기 인자를 국재화(localize)하여 다양한 생리적 효과를 촉진시키는 것으로 고려된다.
지금까지, 이러한 설페이트화 당류의 제조방법으로서, 상어 연골과 같은 천연물로부터 채취하는 방법, 설페이트화 시약(sulfating reagent)을 사용하는 방법 (특허문헌 1 내지 4), 효소를 이용하는 방법(특허문헌 5 내지 7), 화학 합성을 이용하는 방법(특허문헌 8 및 9) 등이 개발되었다. 그러나, 이들 방법 모두는 생산 될 설페이트화 당류의 구조의 균일성, 생산 효율 등의 관점에서 반드시 적절하지는 않다.
예를 들면, 천연물로부터 설페이트화 당류를 수집하는 경우, 수득된 설페이트화 당류의 구조가 일반적으로 균일하지 않고, 그 내부에 혼입된 오염물의 관리가 어려운 것으로 고려된다. 설페이트화 시약을 사용하는 방법은 낮은 반응성을 나타내며, 효율적인 설페이트화는 어렵다.
효소를 사용하는 방법의 단점은 설페이트기를 도입하기 위한 위치 및 사용되는 기질이 제한되고, 또한 사용되는 효소가 고가라는 것이다. 따라서, 이것은 경제적인 방법이 아니다. 또한, 설페이트기를 갖는 당류로부터의 화학 합성에 의해 설페이트화 당류를 제조하는 경우, 설페이트기의 보호가 필수적인데, 반면 설페이트기의 보호 및 탈보호는 어렵다. 특히, 관심있는 당류가 고분자(higher polymer)이기 때문에, 설페이트기의 탈 보호가 더욱 어려워진다.
[특허문헌 1] 일본 특허 공개공보 제2008-007643호 [특허문헌 2] 일본 특허 공개공보 제2007-332226호 [특허문헌 3] 일본 특허 공개공보 제2005-232064호 [특허문헌 4] 일본 특허 공개공보 제평06-065273호 [특허문헌 5] PCT 국제 공개공보 제02/103025호의 재공개 [특허문헌 6] 일본 특허 공개공보 제2001-019698호 [특허문헌 7] 일본 특허 공개공보 제평09-263595호 [특허문헌 8] 일본 특허 공개공보 제2014-047155호 [특허문헌 9] PCT 국제 공개공보 제2013/141350의 재공개
[발명의 요약]
[기술적 문제]
본 발명의 목적은 분자 내에 설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류, 또는 상기 당류를 포함하는 화합물을 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분자 내에 설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 균일한 구조의 당류를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
특히, 본 발명의 목적은 지금까지 합성이 곤란하다고 여겨지던, 설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 장쇄(long-chain) 화합물을 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
[문제의 해결책]
본원 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭하였다. 화학 합성을 이용한 종래의 방법에서는, 원하는 위치에 설페이트기를 갖는 당류 공여체(donor) 및 당류 수용체(acceptor)를 제조하여 합성에 사용하였다. 따라서, 상기 방법은 제조되는 설페이트화 당류의 구조를 제어할 수 있고, 따라서 균일한 구조의 설페이트화 당류를 제조하는데 효과적이다. 그러나, 축합(글리코실화: glycosylation)을 위한 화학 합성에 당류 공여체나 당류 수용체 중 적어도 어느 하나에 설페이트기를 갖는 당류를 사용하는 경우에는, 설페이트기의 보호가 필수적이라고 고려되어왔다. 이것은 종래의 방법을 복잡하게하고, 설페이트화 당류를 포함하는 화합물에 대한 생산 경로의 변화(variation) 및 생산가능한 화합물에 제한을 두었다. 따라서, 제어된 구조를 갖는 장쇄 설페이트화 당류를 포함하는 화합물을 제조하는 것은 실질적으로 불가능 하였다. 또한, 보호된 설페이트기는 전자 구인성(electron withdrawing property)을 갖고 또한 이탈기(leaving group)로서의 기능을 가지기 때문에, 사용 가능한 보호기(protecting group) 및 반응 경로가 제한된다는 문제점이 있다.
이러한 상황 하에서, 본 출원의 발명자들은 분자 내에 비-보호된(non-protected) 설페이트기를 갖는 당류를 사용하여 축합 반응을 수행하기 위해 모험을 수행한 결과, 놀랍게도, 보호되지 않은(without protection) 설페이트기가 반응에 사용되더라도 제어된 구조를 갖는 설페이트화 당류, 또는 이를 포함하는 화합물이 제조될 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
보호된 설페이트기를 사용하는 종래의 방법과 비교하여, 본 발명의 제조방법은 설페이트기가 이탈기로서 기능을 갖지 않기 때문에, 사용 가능한 보호기 및 반응 경로를 극적으로 증가시킨다. 결과적으로, 설페이트화 당류 또는 이를 포함하는 화합물을 종래보다 더 용이하고 효율적으로 제조할 수 있고, 지금까지 합성이 곤란한 설페이트화 당류의 일종 또는 이를 포함하는 화합물을 합성할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법은, 균일한 구조의 장쇄(예를 들면, 10 당류 내지 100 당류) 설페이트화 당류 또는 이를 포함하는 화합물을 합성하는 데에도 유용하다.
설페이트기를 갖는 당류의 제조방법 이외에, 본 발명은 비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류 공여체 또는 당류 수용체로부터 포스페이트기를 갖는 당류의 제조방법에 직접 적용될 수 있다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류의 제조방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 제조방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로한다:
(a) "비-보호된(non-protected) 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 제1 당류(first saccharide)" 및 "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 제2 당류"를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 제조된 제1 당류 및 제2 당류를 서로 축합시키는 단계;.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 제1 당류 및 상기 제2 당류는 각각 상기 당류의 1-위치 탄소 원자에 이탈기를 갖고, 친핵성기(nucleophilic group)를 갖는 당류인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 제1 당류 및 상기 제2 당류는 동일한 당류인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 친핵성기는 히드록시기(hydroxy group), 아미노기(amino group) 및 티올기(thiol group)로부터 선택되는 것을 특징으로한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 제1 당류 및 상기 제2 당류는 각각 6-원 고리(6-membered ring)를 구성하는 당류이고, 상기 당류의 1-위치 탄소 원자에 이탈기를 갖고, 상기 당류의 2, 3, 4 또는 6 위치 중 적어도 어느 하나에 친핵성기를 가지며, 상기 당류의 2, 3, 4 또는 6 위치 중 적어도 어느 하나에 하나 이상의 비-보호된 설페이트기를 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 제1 당류 및 상기 제2 당류는 각각 6-원 고리를 구성하는 당류이고, 상기 당류의 1-위치 탄소 원자에 이탈기를 갖고, 상기 당류의 3 또는 4 위치 중 적어도 어느 하나에 친핵성기를 가지며, 상기 당류의 2, 4 또는 6 위치 중 적어도 어느 하나에 비-보호된 설페이트기를 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 제1 당류 및 상기 제2 당류는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다:
[화학식 1]
Figure 112018091824007-pct00001
상기 식에서,
L은 이탈기이고;
A는 수소 원자, 보호 또는 비-보호된 카르복실기, 보호 또는 비-보호된 아미드(amide)기, 및 -CH2-R4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소 원자, 비-보호된 설페이트기, 비-보호된 포스페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기, 보호 또는 비-보호된 아미노기, 보호 또는 비-보호된 티올(thiol)기 및 당류 잔기(residue)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1 내지 R4 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이며;
R1 내지 R4 중 하나 이상은 히드록시기, 아미노기 및 티올기로부터 선택되는 친핵성기이다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 식에서,
A는 -CH2-R4이고;
R2 내지 R4는 비-보호된 설페이트기, 비-보호된 포스페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기, 및 당류 잔기로부터 선택되고,
단, R2 내지 R4중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이며;
R1은 보호 또는 비-보호된 아미노기인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 당류 잔기는 글루쿠론산 잔기(glucuronic acid residue)인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 당류 잔기는 상기 당류의 2-위치 탄소 원자에 설페이트기를 갖는 글루쿠론산 잔기인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 당류 및 상기 제2 당류는 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 한다:
[화학식 2]
Figure 112018091824007-pct00002
상기 식에서,
L은 이탈기이고;
A 및 B는 각각 독립적으로 수소 원자, 보호 또는 비-보호된 카르복실기, 보호 또는 비-보호된 아미드기, 및 -CH2-R6로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1 내지 R6은 각각 독립적으로 수소 원자, 비-보호된 설페이트기, 비-보호된 포스페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기, 보호 또는 비-보호된 아미노기, 보호 또는 비-보호된 티올기, 및 당류 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1 내지 R6 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이며;
R1 내지 R6 중 하나 이상은 히드록시기, 아미노기 및 티올기로부터 선택되는 친핵성기이다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 식에서,
A는 -CH2-R6이고;
B는 보호 또는 비-보호된 카르복실기이고;
R2 내지 R6은 각각 독립적으로 비-보호된 설페이트기, 비-보호된 포스페이트기 및 보호 또는 비-보호된 히드록시기 및 당류 잔기로부터 선택되고,
단, R2 내지 R6 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이며;
R1은 보호 또는 비-보호된 아미노기인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명의 제조방법은 2개의 당(이당류: disaccharide) 내지 100개의 당(100당류: hectosaccharide)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명의 제조방법은 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate) 또는 헤파란 설페이트(heparan sulfate)의 제조방법인 것을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물의 제조방법에 관한 것이다. 상기 제조방법은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a1) "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 제1 당류"를 제조하는 단계; 및
(b1) 상기 단계 (a1)에서 제조된 제1 당류를 "친핵성기를 갖는 화합물"과 축합시키는 단계;.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 제1 당류는 상기 당류의 1 위치에 이탈기를 갖는 당류인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 방법은
(c1) 상기 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"을
"비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류", "친핵성기를 갖는 화합물" 및 상기 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"로부터 선택된 화합물과 추가로 축합시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 친핵성기는 히드록시기, 아미노기 및 티올기로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 친핵성기를 갖는 화합물은 당류, 아미노산, 펩타이드, 단백질 및 이들의 유도체로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류"는 6-원 고리를 구성하는 당류이고, 상기 당류의 1-위치 탄소 원자에 이탈기를 갖고, 상기 당류의 2, 3, 4 또는 6 위치 중 적어도 어느 하나에 친핵성기를 가지며, 상기 당류의 2, 3, 4 또는 6 위치 중 적어도 어느 하나에 하나 이상의 비-보호된 설페이트기를 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 제1 당류는 6-원 고리를 구성하는 당류이고, 상기 당류의 1-위치 탄소 원자에 이탈기를 갖고, 상기 당류의 3 또는 4 위치 중 적어도 어느 하나에 친핵성기를 가지며, 상기 당류의 2, 4 또는 6 위치 중 적어도 어느 하나에 비-보호된 설페이트기를 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 제1 당류는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조를 갖는 화합물인 것을 특징으로 한다:
[화학식 3]
Figure 112018091824007-pct00003
상기 식에서,
L은 이탈기이고;
A는 수소 원자, 보호 또는 비-보호된 카르복실기, 보호 또는 비-보호된 아미드기, 및 -CH2-R4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소 원자, 비-보호된 설페이트기, 비-보호된 포스페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기, 보호 또는 비-보호된 아미노기, 보호 또는 비-보호된 티올기 및 당류 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1 내지 R4 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이며;
R1 내지 R4 중 하나 이상은 히드록시기, 아미노기 및 티올기로부터 선택되는 친핵성기를 갖는다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 식에서,
A는 -CH2-R4이고;
R3은 비-보호된 설페이트기, 비-보호된 포스페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기 및 당류 잔기로부터 선택되고;
R4는 비-보호된 설페이트기, 비-보호된 포스페이트기 및, 보호 또는 비-보호된 히드록시기로부터 선택되고;
단, R4 및 R3 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이고;
R1은 보호 또는 비-보호된 아미노기이며;
R2는 비-보호된 히드록시기 또는 당류 잔기인 것을 특징으로 한다.
전술한 본 발명의 특징 중 하나 이상을 임의로 조합한 임의의 발명 또한 본 발명의 범위 내에 있음을 당업자라면 알 수 있을 것이다.
본 발명의 제조방법에 의하면, 설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류, 또는 상기 당류를 포함하는 화합물을 효율적으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에 의하면, 분자 내에 설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 균일한 구조의 당류를 효율적으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에 의하면, 설페이트화 당류 및/또는 포스포릴화 당류(phosphorylated saccharide)를 포함하는 화합물을 이전 보다 더 용이하고 효율적으로 제조할 수 있는데, 이는 설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류 또는 상기 당류를 포함하는 화합물을 제조하기 위한 반응 경로 및 사용 가능한 보호기가 극적으로 증가하기 때문이다. 본 발명의 제조방법은 지금까지 제조가 곤란하다고 여겨지던 장쇄의 균일한 구조를 갖는 설페이트화 당류 및/또는 포스포릴화 당류, 또는 이를 포함하는 화합물을 합성하는데 유용하다.
[실시양태의 설명]
본원에서 "당류" 또는 "당류 잔기"는 사슬(본원에서 "당류 사슬"로도 언급 됨) 형태로 연결된 하나 이상의 단위(unit) 당류(단당류 및/또는 이의 유도체)로 구성된 화합물을 의미한다. 2개 이상의 단위 당류가 연결되어 있는 경우, 단위 당류는 그 사이에 글리코시드 결합(glycosidic linkage)을 통한 탈수 축합(dehydration condensation)에 의해 결합되어있다. 이러한 당류 사슬의 예는, 생명체에 포함되어 있는 단당류 및 다당류(글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스(fucose), 자일로오스(xylose), N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine), N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine), 시알산(sialic acid) 및 복합체, 또는 이들의 유도체) 뿐만 아니라, 분해된 다당류 및, 글리코단백질(glycoprotein), 프로테오글리칸(proteoglycan), 글리코사미노글리칸 및 글리코지질(glycolipid)과 같은 복합 생체 분자로부터 분해되거나 유도된 당류 사슬을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 당류 사슬은 선형 또는 분지형일 수 있다.
또한, 본원에서 "당류" 또는 "당류 잔기"는 당류 유도체도 포함한다. 당류 유도체로서, 당류 중 임의의 탄소 원자의 히드록시기가 다른 치환기로 치환된 것, 또는 보호기 또는 다른 치환기와의 결합에 의해 유도체화된 당류가 포함된다. 이의 예는, 당류 사슬을 구성하는 당류가 카르복실기를 갖는 당류(예를 들면, C-1 위치가 카르복실산으로 산화된 알돈산(aldonic acid)(예: D-글루코스로부터 산화된 D- 글루콘산(D-gluconic acid))) 또는 말단 C 원자가 카르복실산으로 변경된 우론산(uronic acid)을 갖는 당류(예: D-글루코스로부터 산화된 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid)), 아미노기 또는 아미노기 유도체(예: 아세틸화 아미노기)를 갖는 당류(예를 들면, N-아세틸-D-글루코사민 및 N-아세틸-D-갈락토사민), 아미노기 및 카르복실기를 모두 갖는 당류(예를 들면, N-아세틸뉴라민산(시알산), N-아세틸 뮤라민산), 탈산화된(deoxidized) 당류(예를 들면, 2-디옥시-D-리보오스), 설페이트기를 포함하는 설페이트화 당류, 및 포스페이트기를 포함하는 포스포릴화 당류인 당류 사슬을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 설페이트기를 포함하는 당류는 또한 "설페이트화 당류"로 기술되고, 포스페이트기를 포함하는 당류는 또한 "포스포릴화 당류"로 기술된다. 또한, 설페이트기 및 포스페이트기 모두를 갖는 당류는 또한 "설페이트화/포스포릴화 당류"로 기술된다.
본 발명에서, 특히 제조 대상이 되는 설페이트화 당류, 포스포릴화 당류 및 설페이트화/포스포릴화 당류에 사용되는 "균일한 구조"란, 당류 또는 축합(또는 중합)되는 화합물의 구성 단위인, 당류 골격 중 설페이트기의 위치 및 수, 구성 당류의 종류(type), 및 당류사이의 결합 형태가 동일한 것을 의미한다.
"당류", "당류 잔기" 및 "아미노산"이 D-이성질체 및 L- 이성질체를 구별하지 않고 본원에 기재되어있는 경우, 임의의 입체이성질체가 포함되는 것으로 이해해야한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은 설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류의 제조방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 제1 당류" 및 "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 제2 당류"를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 제조된 제1 당류 및 제2 당류를 서로 축합시키는 단계.
본 발명의 제조방법에서 원료로 사용되는 "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류"는 임의의 탄소 원자에 치환기로서 보호기가 없는 하나 이상의 설페이트화 히드록시기(sulfated hydroxy group)(-O-SO3H, -O-SO3 -, -O-SO3Na, 또는 -O-SO3 금속) 또는 포스포릴화 히드록시기(phosphorylated hydroxy group)(-O-PO3H2 또는 -O-PO3 2-)를 갖는 임의의 당류를 지칭한다. "설페이트기" 와 "설페이트화 히드록시기", 및 "포스페이트기" 와 "포스포릴화 히드록시기"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명의 방법에서, 제1 당류 및 제2 당류는 어느 것이든 당류 공여체로서 기능하고 다른 하나는 당류 수용체로서 기능하도록 정의된다. 이와 관련하여, 제1 당류는 당류 공여체로서 작용할 수 있고, 제2 당류는 당류 수용체로서 작용할 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다. 또한, 제1 당류 및 제2 당류는 각각 단당류일 수 있거나, 이당류, 삼당류, 사당류 또는 그 이상의 당류 골격(saccharide skeleton)을 가질 수 있다.
당류가 임의의 탄소 원자 위치에 이탈기를 갖는 경우, 당류 공여체로서의 기능은 유지된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 당류 공여체로 기능하는 "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 (제1 또는 제2)당류"는 1-위치 탄소 원자의 위치에 이탈기를 갖는 당류이다. 본 실시양태에에서, 당류 공여체로서 기능하는 당류가 2개 이상의 당류를 갖는 당류 골격을 갖는 경우, 상기 당류 공여체는 환원 말단의 1-위치 탄소 원자의 위치에 이탈기를 갖는다.
한편, 당류가 임의의 탄소 원자 위치에 친핵성기를 갖는 경우, 당 수용체로서의 기능은 유지된다. 본 발명에 사용된 용어 "친핵성"은 루이스 산의 양이온성 원소와 쉽게 반응하는 성질을 지칭한다. 본 발명에서, 친핵성기는 이러한 성질을 갖는 작용기(functional group)이면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서, 친핵성기는 특히 히드록시기, 아미노기 또는 티올기에서 선택되는 작용기이다.
본 발명의 일 실시양태에서, "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 (제1 또는 제2) 당류"는 당류 공여체로서의 기능 및 당류 수용체로서의 기능을 모두 가질 수 있다. 이 경우, "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 (제1 또는 제2) 당류"는 이탈기 및 친핵성기를 모두 갖는다. 본 발명의 일 실시양태에서, "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 (제1 또는 제2) 당류"는 1-위치 탄소 원자의 위치에 이탈기를 갖고, 친핵성기를 갖는 당류이다.
본 발명에서, 제1 당류와 제2 당류는 동일한 당류 또는 상이한 당류일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 제1 당류 및 제2 당류는 각각 하기의 특성을 갖는다:
- 6-원 고리를 구성하고;
- 상기 당류의 1-위치 탄소 원자에 이탈기를 갖고;
- 상기 당류의 2, 3, 4 또는 6 위치 중 적어도 어느 하나에 친핵성기를 가지며;
- 상기 당류의 2, 3, 4 또는 6 위치 중 적어도 어느 하나에 하나 이상의 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는다.
바람직하게는, 제 1 당류 및 제 2 당류는 상기 당류의 3 또는 4 위치 중 어느 하나에 친핵성기, 및/또는 상기 당류의 2, 4 또는 6 위치 중 적어도 어느 하나에 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시양태에서, 제1 당류 및 제2 당류는 각각 하기 식으로 표시되는 당류이다:
[화학식 4]
Figure 112018091824007-pct00004
상기 식에서,
L은 이탈기이고;
A는 수소 원자, 보호 또는 비-보호된 카르복실기, 보호 또는 비-보호된 아미드기, 및 -CH2-R4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소 원자, 비-보호된 설페이트기, 비-보호된 포스페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기, 보호 또는 비-보호된 아미노기, 보호 또는 비-보호된 티올기 및 당류 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1 내지 R4 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이며;
R1 내지 R4 중 하나 이상은 히드록시기, 아미노기 및 티올기로부터 선택되는 친핵성기이다.
바람직한 실시양태에서, A는 -CH2-R4이고, R3 및 R4 중 하나는 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, A는 -CH2-R4이고, R3 및 R4 모두 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 식 중 R1은 보호 또는 비-보호된 아미노기이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 식 중 R2는 비-보호된 히드록시기 또는 당류 잔기이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 상기 식에서,
A는 -CH2-R4이고;
R3은 비-보호된 설페이트기, 비-보호된 포스페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기 및 당류 잔기로부터 선택되고;
R4는 비-보호된 설페이트기, 비-보호된 포스페이트기 및, 보호 또는 비-보호된 히드록시기로부터 선택되고,
단, R4 및 R3 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이고;
R1은 보호 또는 비-보호된 아미노기이며;
R2는 비-보호된 히드록시기 또는 당류 잔기이다.
이러한 당류의 예는 비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 글루코사민 및 갈락토사민, 뿐만 아니라 임의의 당 잔기가 임의의 글루코사민 및 갈락토사민에 결합된 화합물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, R2는 글루쿠론산 잔기이다. 이러한 당류의 예는 콘드로이틴-4-설페이트(콘드로이틴 설페이트 A), 콘드로이틴-6-설페이트(콘드로이틴 설페이트 C), 더마탄 설페이트(콘드로이틴 설페이트 B) 및 헤파란 설페이트로부터 선택되는 글리코사미노글리칸의 구성 단위(constituent unit)인 이당류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, R2는 당류의 2-위치 탄소 원자에 설페이트기를 갖는 글루쿠론산 잔기이다. 이러한 당류의 예는 콘드로이틴 설페이트 D와 같은 글리코사미노글리칸의 구성 단위인 이당류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 더 바람직한 실시양태에서, 제1 당류 및 제2 당류는 동일한 당류이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 제1 당류 및 제2 당류는 각각 하기 식으로 표시되는 당류이다:
[화학식 5]
Figure 112018091824007-pct00005
상기 식에서,
L은 이탈기이고;
A 및 B는 각각 독립적으로 수소 원자, 보호 또는 비-보호된 카르복실기, 보호 또는 비-보호된 아미드기, 및 -CH2-R6로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1 내지 R6은 각각 독립적으로 수소 원자, 비-보호된 설페이트기, 비-보호된 포스페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기, 보호 또는 비-보호된 아미노기, 보호 또는 비-보호된 티올기, 및 당류 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1 내지 R6 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이며;
R1 내지 R6 중 하나 이상은 히드록시기, 아미노기 및 티올기로부터 선택되는 친핵성기이다.
상기 실시양태에서, A 및 B 모두 -CH2-R6인 경우, A의 R6 및 B의 R6은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, A는 -CH2-R6이고, 및/또는 B는 보호 또는 비-보호된카르복실기이다. 바람직하게는, A는 -CH2-R6이고, R2, R3, 및 R6 중 임의의 하나 또는 두 개는 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이다. 바람직하게는, R4 및 R5는 보호 또는 비-보호된 히드록시기이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, A는 보호 또는 비-보호된 카르복실기이고, 및/또는 B는 -CH2-R6이다. 바람직하게는, B는 -CH2-R6이고, R1, R5 및 R6 중 임의의 하나 또는 두 개는 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이다. 바람직하게는, R4 또는 R5는 보호 또는 비-보호된 히드록시기이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 식에서,
A는 -CH2-R6이고;
B는 보호 또는 비-보호된 카르복실기이고;
R2 내지 R6은 각각 독립적으로 비-보호된 설페이트기, 비-보호된 포스페이트기 및 보호 또는 비-보호된 히드록시기, 뿐만 아니라 당류 잔기로부터 선택되고, 단, R2 내지 R6 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이며;
R1은 보호 또는 비-보호된 아미노기이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 식에서,
A는 보호 또는 비-보호된 카르복실기이고;
B는 -CH2-R6이고;
R2 내지 R6은 각각 독립적으로 비-보호된 설페이트기, 비-보호된 포스페이트기 및, 보호 또는 비-보호된 히드록시기, 뿐만 아니라 당류 잔기로부터 선택되고, 단, R2 내지 R6 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이며;
R3은 보호 또는 비-보호된 아미노기이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 상기 식에서,
A는 -CH2-R6이고;
B는 보호 또는 비-보호된 카르복실기이고;
R2, R3, 및 R6 중 임의의 하나 또는 두개는 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이고;
R4 및 R5는 보호 또는 비-보호된 히드록시기이며;
R1은 보호 또는 비-보호된 아미노기이다.
특히 바람직한 또 다른 실시양태에서, 상기 식에서,
A는 보호 또는 비-보호된 카르복실기이고;
B는 -CH2-R6이고;
R1, R5, 및 R6 중 하나 또는 두 개는 비-보호된 설페이트기 또는 비-보호된 포스페이트기이고;
R4 또는 R5는 보호 또는 비-보호된 히드록시기이며;
R3은 보호 또는 비-보호된 아미노기이다.
상기 당류의 예는 콘드로이틴-4-설페이트(콘드로이틴 설페이트 A), 콘드로이틴-6-설페이트(콘드로이틴 설페이트 C), 더마탄 설페이트(콘드로이틴 설페이트 B), 콘드로이틴 설페이트 D 및 헤파란 설페이트로부터 선택되는 글리코사미노글리칸의 구성 단위인 이당류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제조방법은 상기 단계 (b)에서 축합된 당류를 제3 당류와 추가로 축합시키는 단계 (c)를 포함할 수 있다. 상기 "제3 당류"는 당류 공여체 또는 당류 수용체로 사용될 수 있고, 단계 (b)에서 축합된 당류와 동일한 당류 또는 상이한 당류일 수 있다.
"단계 (b)에서 축합된 당류" 또는 "제3 당류" 중 어느것도 이탈기를 갖지 않는 경우, 추가 축합을 위해 어느 하나의 당류에 이탈기를 도입하는 처리를 수행할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 단계 (c)는 다수 회 수행된다. 상기 단계 (c)를 다수 회 수행함으로써, 구조를 제어하면서 원하는 길이의 당류를 제조할 수 있다.
본 발명의 제조방법이 1 회 또는 다수 회 수행되는 단계 (c)를 포함하는 경우, 단계 (b) 및, 1 회 또는 다수 회 수행되는 단계 (c)는 동시 또는 다른 시간에 수행될 수 있다. 단계 (b) 및 다수 회 수행되는 단계 (c)가 동시에 수행되는 경우, 연속 축합(중합)을 가능하게 하기위해, 환원 말단(reducing terminal)의 1-위치 탄소 원자의 위치에 이탈기를 갖고 친핵성기를 갖는 당류가 "제1 당류", "제2 당류" 및 제3 당류"로 바람직하게 사용된다. 본 실시양태에서, 제어된 구조를 갖는 당류의 제조라는 관점에서, "제1 당류", "제2 당류" 및 제3 당류"로 비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 동일한 당류를 사용하는 것이 더 바람직하다. 예를 들어, 비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기, 이탈기 및 친핵성기를 각각 동일한 위치에 갖는 동일한 구조의 단당류의 균일한 집단(uniform population)을 제조하고, 단당류를 각각 축합(중합)시킴으로써, 제어 된 구조를 갖는 장쇄 당류가 제조될 수 있다.
예시적인 실시양태에서, 본 발명의 제조방법은 "제1 당류", "제2 당류" 및 제3 당류"의 당류로서, 콘드로이틴 A, 콘드로이틴 C, 콘드로이틴 D, 콘드로이틴 E 또는 헤파란 설페이트의 구성 단위인 이당류 골격으로 구성된 균일한 집단을 제조하고, 축합(중합)하여 하기 식으로 표시되는 콘드로이틴 설페이트 또는 헤파란 설페이트를 제조한다.
[화학식 6]
Figure 112018091824007-pct00006
[화학식 7]
Figure 112018091824007-pct00007
[화학식 8]
Figure 112018091824007-pct00008
[화학식 9]
Figure 112018091824007-pct00009
[화학식 10]
Figure 112018091824007-pct00010
콘드로이틴 A, 콘드로이틴 C, 콘드로이틴 D, 콘드로이틴 E 또는 헤파란 설페이트의 구성 단위인 상기 이당류 골격에서, 이당류 골격을 구성하는 아미노당류(aminosaccharide) 및 우론산의 위치가 역전될 수 있음은 물론이다.
예로써, 본 발명의 제조방법이 하기에 나타낸 헤파란 설페이트의 제조방법을 포함하는 것은 당연하다.
[화학식 11]
Figure 112018091824007-pct00011
상기 식에서, n은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 25, 보다 바람직하게는 1 내지 10이다.
따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 제조방법은 설페이트화 당류, 포스포릴화 당류 또는, 2 당류 내지 100 당류, 바람직하게는 2 당류 내지 50 당류 및 보다 바람직하게는 2 당류 내지 20 당류를 포함하는 설페이트화/포스포릴화 당류의 제조방법이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 제조방법은 설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물의 제조방법에 관한 것이다. 이 측면에서, "친핵성기를 갖는 화합물"은 "제2 당류" 대신에 사용되고, "제1 당류"와 축합된다.
따라서, 이 측면에서, 본 발명의 제조방법은,
(a1) "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류"를 제조하는 단계; 및
(b1) 상기 단계 (a1)에서 제조된 "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류" 및 "친핵성기를 갖는 화합물"을 축합시키는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이 측면에서, "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류"는 "친핵성기를 갖는 화합물"에 대해 당류 공여자로 사용된다. 따라서, "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류"는 이탈기를 갖는 당류이고, 전형적으로 상기 당류의 1-위치 탄소 원자의 위치에 이탈기를 갖는 당류이다.
"친핵성기를 갖는 화합물"의 "친핵성기"는 상기 정의된 바와 동일하고, 루이스 산의 양이온성 원소와 쉽게 반응하는 성질을 갖는 임의의 작용기를 지칭한다. 일 실시양태에서, 이러한 작용기는 히드록시기, 아미노기 및 티올기로부터 선택된다. "친핵성기를 갖는 화합물"은 친핵성기를 갖는 화합물이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 당류, 아미노산, 펩타이드 및 단백질을 포함한다.
본 발명에서, "아미노산"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 세린 (Ser), 아스파라긴 (Asn), 발린 (Val), 류신 (Leu), 이소류신 (Ile), 알라닌 (Ala), 티로신 (Tyr), 글라이신 (Gly), 라이신 (Lys), 아르기닌 (Arg), 히스티딘 (His), 아스파트 산 (Asp), 글루탐산 (Glu), 글루타민 (Gln), 트레오닌 (Thr), 시스테인 (Cys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 트립토판 (Trp) 및 프롤린 (Pro)과 같은 천연 아미노산; 뿐만 아니라, 아미노산 변이체 및 유도체와 같은 비-천연 아미노산;도 포함한다. 넓은 정의의 관점에서, 당업자는 본 발명의 아미노산이 예를 들어 L-아미노산; D-아미노산; 아미노산 변이체 및 유도체와 같은 화학적으로 변형된 아미노산; 노르류신(norleucine), β-알라닌 및 오르니틴(ornithine)과 같은 생체 내에서 단백질을 구성하는 물질이 될 수 없는 아미노산; 및 아미노산의 성질을 갖는 당업자에게 공지된 화학적으로 합성된 화합물을 포함한다는 것을 인식할 것이다.
본원에서 아미노산 유도체는 아미노산의 측쇄(side-chain) 치환기가 다른 치환기로 더 치환된 화합물 및, 보호기 또는 다른 치환기를 아미노기 및 카르복실기와 같은 작용기에 결합시킴으로써 유도체화된 화합물을 포함한다. 환언하면, 본원에서 아미노산 유도체는 이들 예처럼 유도체화된 아미노산을 포함하는 아미노산을 일반적으로 표현하는데 사용되지만, 유도체화되지않은 아미노산을 배제하는것은 아니다.
본원에서 펩타이드 또는 단백질의 유도체는 아미노산 유도체를 포함하는 펩타이드 또는 단백질 외에, 또한 펩타이드 또는 단백질을 산, 알칼리 또는 효소로 부분 가수분해하여 수득한 단백질의 가수분해 생성물; 및 양이온화된 생성물, 아실화 된 생성물, 알킬 에스테르화된 생성물 및 실리콘화된 생성물과 같은 이의 유도체;를 포함한다.
본 발명의 예시적인 실시양태에서, 상기 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"을 구성하는 분자의 수는 2, 3, 4, 5 또는 그 이상일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제조방법은,
(c1) 상기 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"을
"비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류", "친핵성기를 갖는 화합물" 및 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"로부터 선택된 화합물과 추가로 축합시키는 단계를 포함한다. 이 실시양태에서, 추가의 축합이 행해진 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"의 설페이트기 및/또는 포스페이트기는 비-보호된다.
단계 (c1)이, 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"을 "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류"와 축합시키는 단계인 경우, "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"은 당류 공여체 또는 당류 수용체로 사용될 수 있다. "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물" 또는 "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류" 중 어느것도 이탈기를 갖지 않는 경우, 추가 축합을 위해 이들 중 어느 하나에 이탈기를 도입하는 처리를 수행할 수 있다.
단계 (c1)이, 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"을 "친핵성기를 갖는 화합물"과 축합시키는 단계인 경우, "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"은 당류 공여체로 사용될 수 있다. "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"이 이탈기를 갖지 않는 경우, 추가 축합을 위해 이탈기를 도입하는 처리를 수행할 수 있다.
단계 (c1)이, 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"을 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"과 축합시키는 단계인 경우, 이탈기 및 친핵성기를 갖는 화합물이 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"로 사용된다. "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"이 이탈기를 갖지 않는 경우, 추가 축합을 위해 이탈기를 도입하는 처리를 수행할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 단계 (c1)은 다수 회 수행된다. 단계 (c1)을 다수 회 수행함으로써, 제어된 구조를 갖는 원하는 길이의 화합물을 제조할 수있다. 단계 (c1)은 동시에 또는 다른 시간에 다수 회 수행될 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, 단계 (c1)을 동시에 다수 회 수행하는 경우, 제어 된 구조를 갖는 화합물을 제조하는 관점에서, 단계 (c1)은 바람직하게는, 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"을 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"과 축합시키는 단계이다. 예를 들어, 비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기, 이탈기 및 친핵성기를 각각 동일한 위치에 갖는 동일한 구조의 화합물의 균일한 집단을 제조하고, 화합물을 각각 축합(중합)시킴으로써, 제어된 구조를 갖는 장쇄 화합물이 제조될 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시양태에서, 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"은 이당류, 사당류(tetrasaccharide), 육당류(hexasaccharide), 팔당류(octasaccharide), 십당류(decasaccharide) 또는 고당류(higher saccharide)이다.
본 발명의 다른 예시적인 실시양태에서, 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"은 콘드로이틴 A, 콘드로이틴 C, 콘드로이틴 D, 콘드로이틴 E 또는 헤파란 설페이트의 구성 단위인 이당류 골격이다.
본 발명의 예시적인 실시양태에서, 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"은 2 분자 골격을 갖는 설페이트화 당류, 포스포릴화 당류 또는 설페이트화/포스포릴화 당류를 포함하는 화합물이고, 단계 (c1)에서, 축합 또는 중합 단위로서 2 분자 골격에 기초하여, 4 분자, 6 분자, 8 분자, 10 분자 또는 그 이상의 길이의 화합물이 생성된다.
본 발명의 다른 예시적인 실시양태에서, 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"은 콘드로이틴 A, 콘드로이틴 C, 콘드로이틴 D, 콘드로이틴 E 또는 헤파란 설페이트의 구성 단위인 이당류, 사당류, 육당류, 팔당류, 십당류 또는 고당류이고, 단계 (c1)에서, 축합 또는 중합 단위로서 이들 당류에 기초하여, 장쇄(longer-chain) 글리코사미노글리칸이 생성된다.
본 발명의 다른 예시적인 실시양태에서, 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"은 콘드로이틴 A, 콘드로이틴 C, 콘드로이틴 D, 콘드로이틴 E 또는 헤파란 설페이트의 구성 단위인 이당류이고, 단계 (c1)에서, 축합 또는 중합 단위로서 이당류에 기초하여, 사당류, 육당류, 팔당류, 십당류 또는 그 이상의 길이의 글리코사미노글리칸이 생성된다.
본 발명의 원료인 "비-보호된 설페이트기를 갖는 당류"는 당업자에게 공지 된 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 비-보호된 히드록시기를 갖는 주어진 당류에 설페이트화 제(sulfating agent)를 작용시킴으로써 제조할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 히드록시기가 설페이트화된 당류는, 비-보호된 히드록시기를 갖는 주어진 당류를 원료로하여 설페이트화 제와 DMF와 같은 적정 용매 중에서, 적정 당량(1 내지 100 당량), 적정 반응온도(0 내지 100 ℃) 및 반응 시간(10 분 내지 2 일)의 조건에서 반응시켜 합성할 수 있다.
설페이트화 제는 당류 화합물의 설페이트화에 사용되는 것이면 모두 사용할 수 있으며, 이의 예는 설퍼 트리옥시드-피리딘 복합체(sulfur trioxide-pyridine complex), 설퍼 트리옥시드-트리메틸아민 복합체(sulfur trioxide-trimethylamine complex), 클로로술폰산-피리딘 복합체(chlorosulfonic acid-pyridine complex) 및 디사이클로헥실 카르보디이미드-설페이트(dicyclohexyl carbodiimide-sulfuric acid)을 포함한다. 바람직한 예는 설퍼 트리옥시드-피리딘 복합체 및 설퍼 트리옥시드-트리메틸아민 복합체를 포함한다.
설페이트기를 선택된 위치에 도입시키는 방법은 또한 당업자에게 공지되어있다. 예를 들면, 특정 히드록시기만 설페이트화된 당류는 설페이트화 제와의 반응에 앞서 설페이트화되지 않을 히드록시기를 선택적으로 보호함으로써 제조할 수있다. 또한, 당류의 특정 위치에 설페이트기를 도입할 수 있는 효소를 사용함으로써, 특정 위치에 설페이트기를 도입할 수도 있다.
본 발명의 원료인 "비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류"는 일반적으로 설페이트화와 동일한 방식으로 수행될 수 있다. 즉, 비-보호된 히드록시기를 갖는 주어진 당류에 포스포릴화 제(phosphorylating agent)를 작용시킴으로써 제조할 수 있다. 적합한 포스포릴화 제의 예는 인산(phosphoric acid), 폴리인산(polyphosphoric acid), 오산화 인(phosphorus pentoxide) 및 POCl3를 포함하나, 이에 제한되는것은 아니다.
수득한 화합물은 필요에 따라 실리카 겔 등을 이용한 고성능 박층 크로마토그래피 또는 아미드 컬럼 등을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피로 분리 및 정제 할 수 있다.
본 발명에서, 축합 반응은 당업자에게 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서, 당류 공여체와 당류 수용체를 산의 존재하에서 반응시키는 방법을 사용하여 축합 반응을 수행할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 사용될 수 있는 산의 예는, 황산과 같은 무기산, 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테르(boron trifluoride diethyl ether: BF3-OEt2), 디메틸(메틸티오)설포늄 트리플루오로메탄설포네이트(dimethyl(methylthio)sulfonium trifluoromethanesulfonate: DMTST), 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate), 트리에틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(triethylsilyl trifluoromethanesulfonate), 트리프로필실릴 트리플루오로메탄설포네이트(tripropylsilyl trifluoromethanesulfonate), 디메틸에틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(dimethylethylsilyl trifluoromethanesulfonate), 트리벤질실릴 트리플루오로메탄설포네이트(tribenzylsilyl trifluoromethanesulfonate), 트리나프틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트 (trinaphthylsilyl trifluoromethanesulfonate) 또는 트리벤질메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(tribenzylmethylsilyl trifluoromethanesulfonate), 실버 트리플루오로메탄설포네이트(silver trifluoromethanesulfonate), 사이클로펜타디에닐 하프늄 클로라이드(cyclopentadienyl hafnium chloride), 사이클로펜타디에닐 지르코늄 클로라이드(cyclopentadienyl zirconium chloride), 염화 주석(tin chloride)과 같은 루이스 산 및, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), 무수 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic anhydride), 트리플루오로메탄 술폰산(trifluoromethanesulfonic acid) 및 테트라플루오로메탄술폰산(tetrafluoromethanesulfonic acid)과 같은 유기산을 포함하나, 이제 제한되는것은 아니다.
이들 산은 1 종 단독으로 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 사용되는 산의 양은 당류 공여체에 대해 0.1 내지 5 당량, 예를 들어 0.2 내지 1.5 당량일 수 있다. 당류 공여체로 사용되는 당류 또는 화합물과 당류 수용체로 사용되는 당류 또는 화합물이 서로 다른 화합물인 경우, 당류 수용체에 대한 당류 공여체의 사용 비율은 임의의 비율일 수 있다. 예를 들면, 당류 수용체의 사용 비율은 당류 공여체 1 몰당 0.2 내지 10 몰, 바람직하게는 0.7 내지 4 몰일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 축합 반응에서 N-아이오도숙신이미드(N-iodosuccinimide)와 같은 활성제(activator)는 단독으로 사용되거나, 테트라플루오로메탄술폰산 및 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트와 같은 루이스 산과 조합하여 사용된다. 활성제가 루이스 산과 조합하여 사용되는 경우, 사용 비율은 예를 들면 당류 공여체에 대하여 루이스 산 약 0.1 내지 2 당량 및 활성제 약 1 내지 5 당량일 수 있다.
축합 반응에 사용하는 용매는 반응에 불활성인 용매이면 특별히 제한되지않는다. 이의 예는 헥산, 헵탄 및 펜탄과 같은 지방족 탄화수소; 사이클로헥산과 같은 지환식 탄화수소(alicyclic hydrocarbon); 벤젠, 톨루엔 및 자일렌과 같은 방향족 탄화수소; 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 1,1,1-트리클로로에탄, 테트라클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 사염화탄소, 클로로벤젠 및 o-디클로로벤젠과 같은 할로겐화 탄화수소; 디에틸에테르, 이소프로필에테르, 테트라하이드로퓨란, 디옥산(dioxane) 및 모노글림(Monoglyme)과 같은 에테르; N,N-디메틸포름 아미드(N,N-dimethylformamide), N,N-디메틸아세트아미드(N,N-dimethylacetamide), 1,3-디메틸이미다졸리디논(1,3-dimethylimidazolidinone)과 같은 아미드; 디메틸설폭사이드와 같은 설폭사이드; 아세토니트릴 및 프로판니트릴과 같은 니트릴; 및 이들의 혼합 용매를 포함한다.
축합 반응에 사용되는 온도는 -80 ℃ 내지 40 ℃, 예를 들면 -40 ℃ 내지 25 ℃의 범위이다.
본 발명의 제조방법에서, 하기 실시예에서와 같이 축합 반응 시 반응 온도를 제어함으로써 생산되는 당류의 입체 구조를 제어할 수 있다. 구체적으로, 축합 반응시의 온도가 상기 온도 범위 내 보다 낮은 경우에는 β-글리코시드 결합(β-glycosidic linkage)으로 결합된 당류 또는 상기 당류를 포함하는 화합물이 수득되는 경향이 있고, 축합 반응시의 온도가 상기 온도 범위 내 보다 높은 경우에는 α- 글리코시드 결합으로 결합된 당류 또는 상기 당류를 포함하는 화합물이 수득되는 경향이 있다.
축합 반응에 앞서, 계(system) 내의 물, 할로겐화 수소산(hydrohalic acid) 등을 제거하는 것이 바람직하다. 이를 위해, 예를 들면, 분자 체(sieve)와 같은 포착체(trapping material)를 사용할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 임의로 "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류" 또는 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"에 이탈기를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용되는 이탈기는 당류 공여체와 당류 수용체 사이의 축합 반응 조건 하에서 치환되는 원자 또는 원자단(atomic group)보다 낮은 친핵성을 갖고, 제거될 수 있는 능력을 갖는 한 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 사용되는 이탈기의 구체적인 예는 할로겐 원자, 치환 또는 치환되지않은 -O-알킬기, 치환 또는 치환되지않은 -O-알케닐기, 치환 또는 치환되지않은 -O-알키닐기, 치환 또는 치환되지않은 -O-아릴기, 치환 또는 치환되지않은 -O-헤테로아릴기, 치환 또는 치환되지 않은 -S-알킬기, 치환 또는 치환되지않은 -S-알케 닐기, 치환 또는 치환되지않은 -S-알키닐기, 치환 또는 치환되지않은 -S-아릴기 및 치환 또는 치환되지않은 -S-헤테로 아릴기를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
이탈기의 도입은 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 할로겐화 제(halogenating agent)와의 할로겐화 반응, 산 또는 염기의 존재 하에서 티올 화합물과의 반응에 의해 수행할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 할로겐화 제의 예는 염소, 브롬, 요오드, N-클로로숙신이미드(N-chlorosuccinimide), N-브로모숙신이미드(N-bromosuccinimide) 및 브롬화수소(hydrogen bromide)를 포함한다.
할로겐화 반응에 사용되는 용매의 예는, 염화 메틸렌(methylene chloride), 1,2-디클로로에탄(1,2-dichloroethane), 클로로포름 및 사염화탄소(carbon tetrachloride)와 같은 할로겐화 탄화수소계 용매(halogenated hydrocarbon-based solvent); 디에틸에테르, 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran) 및 1,4-디옥산과 같은 에테르계 용매(ether-based solvent); 아세트산 및 물을 포함할 수 있다. 이러한 용매는 단독으로 사용할 수 있거나 이의 복수 종을 혼합하여 사용할 수 있다.
티올 화합물의 예는 메틸티올, 이소프로필티올, 티오페놀 및 p-톨루엔티올 을 포함한다.
산의 예는 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테르(boron trifluoride diethyl ether:BF3-OEt2)와 같은 루이스 산을 포함한다. 또한 염기의 예는 1,3-디메틸이미 다졸륨 클로라이드(1,3-dimethylimidazolium chloride) 및 트리에틸아민(triethylamine)을 포함한다.
티올 화합물과의 반응에 사용되는 용매의 예는 디클로메탄(dichloromethane), 아세토니트릴(acetonitrile) 및 톨루엔을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 용매는 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 임으로 "비-보호된 설페이트기 및/또는 비-보호된 포스페이트기를 갖는 당류" 또는 "설페이트기 및/또는 포스페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물" 내 측쇄의 히드록시기, 아미노기 등을 보호 및 탈보호하는 단계를 포함할 수 있다.
당업자는 선택된 반응 경로에 따라 당 업계에 공지된 보호기 중에서 적절한 보호기를 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, 히드록시기의 보호기의 예는 메틸기, 벤질기, 벤조일기, 아세틸(Ac)기, 트리메틸실릴(TMS)기, 트리에틸실릴(TES)기 및 tert-부틸디메틸실릴(TBS 또는 TBDMS)기를 포함할 수 있다. 아미노기의 보호기의 예는 9-플루오레닐메톡시카보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl: Fmoc)기, t-부틸옥시카보닐(t-butyloxycarbonyl: Boc)기, 벤질기, 알릴옥시카보닐(allyloxycarbonyl: Alloc)기, 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐(2,2,2-trichloroethoxycarbonyl: troc)기, 알릴옥시카보닐(allyloxycarbonyl)기 및 아세틸기와 같은, 카보네트계 또는 아미드계의 지용성 보호기를 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의하면, 종래의 합성법과 달리, 설페이트기 또는 포스페이트기를 보호/탈보호할 필요가 없기 때문에, 제어된 구조를 가진 설페이트화 당류, 포스포릴화 당류 및 설페이트화/포스포릴화 당류를 더 쉽게 생산할 수 있다. 또한, 설페이트기 또는 포스페이트기를 보호/탈보호할 필요가 없기 때문에, 설페이트기 또는 포스페이트기의 보호를 고려하지 않고 반응 경로를 설계할 수 있다. 이에 따라, 반응 경로에서 사용할 수 있는 보호기 및 반응 경로가 극적으로 증가하기 때문에, 설페이트화 당류, 포르포릴화 당류 및 설페이트화/포스포릴화 당류, 또는 이를 포함하는 화합물을 종전보다 더 용이하고 효율적으로 제조할 수 있고, 종래에는 합성하기 어려웠던 설페이트화 당류, 포르포릴화 당류 및 설페이트화/포스포릴화 당류, 또는 이를 포함하는 화합물의 종류를 합성할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법은 장쇄의 균일한 구조를 갖는 설페이트화 당류, 포스포릴화 당류 및 설페이트화/포스포릴화 당류, 또는 이를 포함하는 화합물을 합성하는데 매우 유용하다.
본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명하기 위해 사용되는 것이고, 발명을 제한하는 것은 아님을 주목해야 한다.
또한, 본 명세서에 사용되는 용어 "포함"은 기술된 항목(구성원(member), 단계, 요소(element), 도면 등)이 존재한다는 것을 의미하며, 문맥이 분명히 다른 이해를 필요로하지 않는 한, 기술되지 않은 항목(구성원, 단계, 요소, 도면 등)의 존재를 배제하지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술용어 및 과학용어 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 특별히 정의되지 않는 한 이 설명 및 관련 기술 분야의 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되어서는 안된다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 요소를 나타내기 위해 사용될 수 있지만, 이들 요소는 이들 용어에 의해 제한되어서는 안됨을 이해해야 한다. 이들 용어는 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위해서만 사용되며, 예를 들어, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 제1 구성 요소가 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 마찬가지로 제2 구성 요소가 제1 구성 요소로 명명될 수 있다
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 여러가지 양태로 실시할 수 있는 것은 물론이고, 여기에 기재된 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
[실시예]
실시예 1 (설페이드화 단당류의 축합에 의한 설페이트화 당류의 제조)
하기 반응식에 나타내는 바와 같이, 5-위치 탄소 원자의 위치에 비-보호된 설페이트기를 갖고 1-위치 탄소 원자의 위치에 이탈기를 갖는 단당류를 제조하였다. 제조예에서 화합물명 뒤에 표시된 화합물 번호는 하기 반응식에 나타낸 화합물 번호를 나타낸다.
[화학식 12]
Figure 112018091824007-pct00012
티오글리코시드 2(Thioglycoside 2)
아르곤 대기 하에서, 원료 1 (4.0 g, 8.4 mmol)을 무수(dry) DCM에 용해시켰다. 그 다음, 용액을 얼음으로 냉각시켰다. BF3-OEt2 (3.5 mL, 28 mmol) 및 p-톨루엔티올(1.4 g, 11 mmol)을 첨가하고, 용액을 실온으로 되돌려 20 시간 반응시켰다. Et3N (3.5 mL, 25 mmol)을 첨가하여 반응을 중단시키고, 반응 용액을 DCM으로 희석시키고, NaHCO3의 포화 수용액 및 NaCl의 포화 수용액으로 세척하였다. 유기층(organic layer)을 설페이트나트륨상에서 건조시킨 후 여과하고 농축시켰다. 실리카 겔 컬럼 (AcOEt/Hex = 1/2 내지 AcOEt/Hex = 2/1)을 사용하여 시약을 제거하고, 뜨거운 에탄올로부터 재결정화하여 티오글리코시드 2를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR(400MHz CDCl3)7.87(m, 2H), 7.76(m, 2H), 7.30(d, 2H, J=7.8Hz), 7.08(d, 2H, J=7.8Hz), 5.78(t, 1H, J=9.7Hz), 5.65(d, 1H, J=10.7Hz), 5.12(5, 1H, 9.7Hz), 4.36-4.25(m, 2H), 4.20(dd, 1H, J=1.3Hz, J=12.2Hz), 3.88(m, 1H), 2.33(s, 3H), 2.11(s, 3H), 2.02(s, 3H), 1.83(s, 3H), ESI-MS[M+Na]+ 에 대한 계산치: C27H27NO9SNa에 대한 계산치: 564.1 실측치 564.1.
1-STol-2-NPhth-글루코스 3 (1-STol-2-NPhth-Glucose 3)
아르곤 대기 하에서, 티오글리코시드 2 (462 mg, 0.85 mmol)를 메탄올에 용해시켰다. 여기에 나트륨 메톡사이드(Sodium methoxide) (10.3 mg, 0.19 mmol)를 넣고, 혼합물을 60 분간 교반하였다. DOWEX 50Wx8을 첨가하여 반응을 중단시키고, DOWEX 50Wx8을 여과로 제거하였다. 여과액을 농축시켜 백색 고체로서 목적물 3을 수득하였다. 추가 정제를 수행하지 않고 동일한 반응을 다음 반응에 사용하였다. 1H NMR(400MHz MeOD)7.94-7.82(m, 4H), 7.28(d, 2H, J=8.2Hz), 7.05(d, 2H, J=8.2Hz), 5.52(d, 1H, J=10.4Hz), 4.24(dd, 1H, J=8.1Hz, J=10.2Hz), 4.08(t, 1H, J=10.2Hz), 3.94(dd, 1H, J=1.8Hz, J=12.0Hz), 3.75(dd, 1H, J=5.3Hz, J=12.0Hz), 3.48-3.39(m, 2H), 2.28(s, 3H), ESI-MS[M+Na]+ C21H21NO6SNa에 대한 계산치: 438.1 실측치 438.1.
1-Stol-2-NPhth-6-OSO3Na-글루코스 4(1-Stol-2-NPhth-6-OSO3Na-Glucose 4)
아르곤 대기 하에서, 1-STol-2-NPhth-글루코스 3 (186 mg, 0.45 mmol) 및 SO3-Py (76.6 mg, 0.48 mmol)를 DMF (9.6 mL)에 용해시키고, 용액을 3.5 시간 동안 교반하였다. 과량의 NaHCO3의 포화 수용액을 첨가하고, 혼합물을 1 시간 동안 격렬하게 교반한 다음, 반응 용액을 농축시켰다. 실리카겔 컬럼 정제(AcOEt/MeOH/H2O = 6/2/1)를 수행하여 원료 3 (82.5 mg, 44 %) 및 목적물 4 (88.9 mg, 38 %)를 수득하였다. 1H NMR(400MHz D2O)7.95-7.75(m, 4H), 7.25(d, 2H, J=8.1Hz), 7.08(d, 2H, J=8.1Hz), 5.64(d, 1H, J=10.2Hz), 4.42(dd, 1H, J=1.8Hz, J=11.4Hz), 4.33-4.36(m, 2H), 4.13(t, 1H, 10.28Hz), 3.93(m, 1H), 3.62(t, 1H, J=9.55Hz), 2.23(s, 3H), ESI-MS[M-Na]- C21H20NO9S2에 대한 계산치: 494.1 실측치 493.7.
하기 반응식에 나타낸 바와 같이 설페이트화 당류 4로부터 설페이트화 이당류 5를 제조하였다.
[화학식 13]
Figure 112018091824007-pct00013
중합(polymerization)
아르곤 대기 하에서, 설페이트화 당류 4 (117 mg, 0.23 mmol)를 아세토니트릴에 용해시키고, 분자 체(molecular sieve) 3A를 첨가하고, 혼합물을 얼음으로 냉각시켰다. TfOH (1.9 mL) 및 N-아이오도숙신이미드 (51.2 mg)를 아세토니트릴 (1 mL)에 용해시켜, 이전의 당류 용액에 적하(dropped)하고, 용액을 30 분간 교반하였다. 상온으로 되돌려 밤 새 교반한 후, 반응 용액을 그대로 실리카 겔 컬럼(AcOEt/MeOH = 3/1)에 가하여 원료와 시약을 제거하였다. 그 후, 설페이트화 이당류 5를 HPLC로 분리하였다. 1H NMR(400MHz D2O)7.97-7.60(m, 8H), 5.34(d, 1H, J=8.42Hz), 5.27(d, 1H, J=8.60Hz), 4.59(dd, 1H, J=8.4Hz, J=10.9Hz), 4.46-4.21(m, 4H), 4.10(dd, 1H, J=8.7Hz, J=10.6Hz), 4.05-3.93(m, 2H), 3.86(m, 2H), 3.70(t, 1H, J=9.0Hz), 3.58(t, 1H, J=9.3Hz), ESI-MS[M-2Na+H]- C28H27N2O19S2 -에 대한 계산치: 759.1 실측치: 758.7.
실시예 2 (설페이트화 이당류의 축합에 의한 설페이트화 당류의 제조)
하기 반응식에 나타낸 바와 같이, 환원 말단의 6-위치 탄소 원자의 위치에 비-보호된 설페이트기를 갖고, 1-위치 탄소 원자의 위치에 이탈기를 갖는 이당류를 제조하였다. 제조예에서 화합물명 뒤에 표시된 화합물 번호는 하기 반응식에 나타낸 화합물 번호를 나타낸다.
[화학식 14]
Figure 112018091824007-pct00014
콘드로사민 아세테이트 1(Chondrosamine acetate 1)
콘드로사민 1은 이전의 보고 (Jean-Claude Jacquinet, et al., Angew. Chem. Int. Ed 2006, 45, 2574-2578)에 따라 제조되었다.
2-NHTroc 콘드로사민 메틸 에스테르 퍼아세테이트 2(2-NHTroc Chondrosamine methyl ester peracetate 2)
아르곤 대기 하에서, 메탄올 (13 mL)에 아세틸 클로라이드 (120 ㎕, 1.6 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 빙욕(ice bath)에서 30 분 동안 교반하였다. 콘드로사민 아세테이트 1 (340 mg, 0.82 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 20 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축시키고, 메탄올을 첨가하고, 농축을 다수 회 반복하였다. 농축 잔류물 및 NaHCO3 (240 mg, 2.85 mmol)를 물 (7.4 mL)에 용해시키고, 용액을 30 분 동안 격렬하게 교반하였다. 2,2,2-트리클로로에틸 클로로포르메이트(2,2,2-Trichloroethyl chloroformate) (260 μL, 1.9 mmol)를 천천히 적하하고, 혼합물을 2 시간 동안 교반하였다. 여기에 DOWEX 50Wx8을 첨가하여 반응을 중단시키고, DOWEX 50Wx8을 여과로 제거하였다. DOWEX 50Wx8을 메탄올로 3 회 세척하였다. 여과액을 농축하고 실리카 겔 컬럼 정제(AcOEt/MeOH/H2O = 6/2/1)하여 N-Troc 콘드로사민 메틸 에스테르 (353 mg, 79 %)를 수득하였다. 아르곤 대기 하에서, N-Troc 콘드로사민 메틸 에스테르 (350 mg, 0.65 mmol)를 Ac2O/피리딘 (1/1, 7 mL)에 용해시켰다. N,N-디메틸-4-아미노피리딘(N,N-Dimethyl-4-aminopyridine) (7.9 mg, 0.065 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 용액을 얼음으로 냉각시키고, 과량의 메탄올을 서서히 첨가하여 반응을 종결(quenching)시켰다. 반응 용액을 농축하고, 실리카 겔 정제(AcOEt/Hex = 1/1)에 의해 목적물 2 (470 mg, 3 단계, 72 %, α/ β는 거의 1:1)를 얻었다. 1H NMR(400Hz CDCl3)6.57(d, J=6.8Hz, β-아노머(anomer)), 6.32(d, J=3.04, a-아노머), 5.80(t, J=8.6Hz), 5.44-4.96(m), 4.89-4.54(m), 4.34(dt, J=3.5Hz, J=10.5Hz), 4.30-3.95(m), ESI-MS[M+Na]+ C28H36 35Cl3NO19Na에 대한 계산치: 818.1 실측치 818.1.
1-Stol-2-NHTroc 콘드로사민 메틸 에스테르 퍼아세테이트 3(1-STol-2-NHTroc chondrosamine methyl ester peracetate 3)
아르곤 대기 하에서, N-Troc 콘드로사민 메틸 에스테르 퍼아세테이트 2 (717 mg, 0.90 mmol) 및 p-톨루엔티올(p-toluenethiol) (111 mg, 0.89 mmol)을 DCM에 용해시키고, 용액을 얼음으로 냉각시켰다. BF3-OEt2 (338 μL, 2.7 mmol)를 적하하고, 혼합물을 30 분간 교반하였다. 그 후, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. Et3N (375 μL, 2.7 mmol)을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 반응 용액을 DCM을 첨가하여 희석시키고, NaHCO3의 포화 수용액 및 NaCl의 포화 수용액으로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨상에서 건조시킨 후 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 정제 (AcOEt/Hex = 1/2 내지 AcOEt/Hex = 1/1)하여 표적 화합물 3을 백색 고체로서 수득하였다 (436 mg, 56 %). 1H NMR(400MHz CDCl3) 7.41(d, 2H, J=8.0Hz), 7.11(d, 2H, J=8.0Hz), 5.41(d, 1H, J=7.9Hz), 5.38(d, 1H, J=2.7Hz), 5.22-5.13(m, 2H), 4.99-4.93(m, 2H), 4.86(d, 1H, J=12.1Hz), 4.73(d, 1H, J=7.9Hz), 4.64(d, 1H, J=12.1Hz), 4.31(dd, 1H, J=3.1Hz, J=10.5Hz), 4.19-3.95(m, 3H), 3.86(t, 1H, J=6.42Hz), 3.75(s, 3H), 3.65(m, 1H), 2.34(s, 3H), 2.08(s, 3H), 2.05(s, 3H), 2.04(s, 3H), 2.01(s, 3H), 1.99(s, 3H)ESI-MS[M+Na]+ C33H40 35Cl3NO17SNa에 대한 계산치 882.1 실측치 882.1.
1-Stol-2NHTroc 콘드로사민 메틸 에스테르 4(1-STol-2NHTroc chondrosamine methyl ester 4)
아르곤 대기 하에서, 1-Stol-2-NHTroc 콘드로사민 메틸 에스테르 퍼아세테이트 3(510 mg, 0.59 mmol)을 건조 메탄올에 용해시켰다. 나트륨 메톡사이드를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. DOWEX 50Wx8을 첨가하여 반응을 종결시키고, 혼합물을 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 정제 (AcOEt/MeOH = 50/3)하여 목적 화합물 4를 백색 고체로 수득하였다. 1H NMR(400MHz D2O)7.36(d, 2H, J=8.1Hz), 7.16(d, 2H, J=8.1Hz), 4.89(d, 1H, J=12.4Hz), 4.74(d, 1H), 4.59(d, 1H, J=12.4Hz), 4.54(d, 1H, J=8.15Hz), 4.07(d, 1H, J=2.56Hz), 3.96(d, 1H, J=9.7Hz), 3.73(s, 3H), 3.71-3.57(m, 3H), 3.48(t, 1H, J=9.2Hz), 3.41(t, 1H, J=9.1Hz), 3.28(dd, 1H, J=7.92Hz, J=8.79Hz), 2.24(s, 3H), ESI-MS[M+Na]+ C23H30 35Cl3NO12SNa에 대한 계산치: 672.0 실측치 672.0.
1-Stol-2NHTroc-6-OSO 3 Na 콘드로사민 메틸 에스테르 5(1-STol-2NHTroc-6-OSO 3 Na chondrosamine methyl ester 5)
아르곤 대기 하에서, 1-Stol-2NHTroc 콘드로사민 메틸 에스테르 4 및 SO3-Py를 DMF에 용해시키고, 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 그 후, 과량의 포화 NaHCO3를 첨가하고, 혼합물을 30 분 동안 격렬히 교반하였다. 반응 용액을 농축하고, 실리카 겔 컬럼 정제(AcOEt/MeOH/H2O = 6/1/1)하여, 목적물 5를 수득하였다. 1H NMR(400MHz MeOD)7.42(d, 2H, J=8.1Hz), 7.13(d, 2H, J=8.1Hz), 4.90(d, 1H, J=12.1Hz), 4.73(d, 1H, J=10.3Hz), 4.67(d, 1H, J=12.1Hz), 4.52(d, 1H, J=7.5Hz), 4.20(dd, 1H, J=5.9Hz, J=10.7Hz), 4.16(dd, 1H, J=6.4Hz, J=10.6Hz), 4.09(d, 1H, 2.7Hz), 3.91(t, 1H, J=10.3Hz), 3.86-3.74(m, 6H), 3.55(5, 1H, J=9.1Hz), 3.40-3.26(m, 2H), 2.31(s, 3H), ESI-MS[M-H]- C23H29 35Cl3NO15S2에 대한 계산치: 728.0 실측치 727.8.
1-Stol-2-NHTroc-6-OSO 3 Na-2',3'-O-이소프 콘드로사민 메틸 에스테르 6(1-STol-2-NHTroc-6-OSO 3 Na-2',3'-O-isop chondrosamine methyl ester 6)
아르곤 대기 하에서, 1-Stol-2NHTroc-6-OSO3Na 콘드로사민 메틸 에스테르 5를 DMF에 용해시켰다. 2-메톡시프로펜(2-Methoxypropene) 및 피리디늄 p-톨루엔설포 네이트(pyridinium p-toluenesulfonate)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 포화 NaHCO3를 첨가하여 반응을 종결시킨 다음, 용액을 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 정제(AcOEt/MeOH/H2O = 6/1/1)하여 목적물 6을 얻었다. 1H NMR(400MHz DMSO)7.32(d, 2H, J=8.2Hz), 7.11(d, 2H, J=8.2Hz), 5.77(d, 1H, J=5.6Hz), 4.93(d, 1H, J=7.9Hz), 4.86(d, 1H, J=12.1Hz), 4.77(d, 1H, J=4.8Hz), 4.68-4.60(m, 2H), 3.88-3.58(m, 11H), 3.43(t, 1H, J=9.1Hz), 3.26(t, 1H, J=8.3Hz), 2.27(s, 3H), ESI-MS[M+Na] C26H33Cl3NO15S2에 대한 계산치: 768.0 실측치 767.8.
이어서,하기 반응식에 나타낸 바와 같이, 설페이트화 당류 6을 중합시켰다.
[화학식 15]
Figure 112018091824007-pct00015
아르곤 대기 하에서, 1-Stol-2-NHTroc-6-OSO3Na-2',3'-O-이소프 콘드로사민 메틸 에스테르 6을 아세토니트릴에 용해시켰다. 활성 분자 체 3A를 여기에 첨가하였다. DMTST를 첨가하여 반응을 시작하였다. 10 분 후, 용액의 일부를 꺼내어 Et3N으로 반응을 종결시킨 후, ESI-MS로 측정하였다. ESI-MS [M-2Na + H] C38H51Cl6N2O30S2 -에 대한 계산치: 1289.0, 실측치 : 1288.6.
ESI-MS의 결과를 바탕으로, 중합 반응에 의해 합성된 생성물은 다음과 같은 구조를 갖는 것으로 추측된다.
[화학식 16]
Figure 112018091824007-pct00016
(실시예 3) 설페이트화 이당류(글리코실 o-헥시닐벤조에이트) 공여체의 합성
환원 말단의 6-위치 탄소 원자의 위치에 비-보호된 설페이트기를 갖고 1-위치 탄소 원자의 위치에 이탈기를 갖는 설페이트화 이당류 공여체 6은 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 제조예에서 화합물명 뒤에 표시된 화합물 번호는하기 반응식에 나타낸 화합물 번호를 나타낸다.
[화학식 17]
Figure 112018091824007-pct00017
p-톨릴(메틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-2-데옥시-1-티오-2- (2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-6-O-트리페닐메틸-β-D-갈락토피라노사이드 2(p-Tolyl(methyl-b-D-glucopyranosyluronate)-(1®3)-2-deoxy-1-thio-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)-6-O-triphenylmethyl-b-D-galactopyranoside 2)
p-톨릴(메틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈락토피라노사이드 1 (p-Tolyl(methyl-b-D-glucopyranosyluronate)-(1→3)-2-deoxy-1-thio-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)-b-D-galactopyranoside 1) (72 mg, 0.11 mmol) 및 트리페닐메틸 클로라이드(triphenylmethyl chloride) (34 mg, 0.12 mmol)를 아르곤 대기 하에서 피리딘 (1.16 mL)에 용해시켰다. 50 ℃에서 밤새 교반한 후, 반응 용액을 농축시켰다. 농축 잔류물을 실리카 겔 컬럼 (AcOEt:MeOH = 50:3)으로 정제하여 목적물 2 (90 mg, 0.09 mmol, 77 %)를 수득하였다.
1H NMR(400Hz CDCl3)7.45-7.37(m, 7H), 7.31-7.19(m, 10H), 7.04(d, J=8.0Hz, 2H), 5.51(d, J=8.1Hz, 2H), 5.40(d, J=2.85Hz, 2H), 5.22-5.12(m, 2H), 4.99-4.91(m, 2H), 4.85(d, J=12.2Hz, 1H), 4.73(d, J=7.9Hz, 1H), 4.64(d, J=12.2Hz, 1H), 4.24(dd, J=2.8Hz, J=10.8Hz, 1H), 3.99(d, J=9.3Hz, 1H), 3.76-3.61(m, 5H), 3.31(dd, J=6.9Hz, J=9.9Hz, 1H), 3.04(dd, J=5.7Hz, J=9.9Hz, 3H), 2.30(s, 3H) ESI-MS[M+Na]+ C42H44 35Cl3NNaO12S에 대한 계산치 : 914.2, 실측치 914.5
p-톨릴(메틸-2,3,4-트리-O-아세틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-4-O-아세틸-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노) -6-O-트리페닐메틸-β-D-갈락토피라노사이드3 (p-Tolyl(methyl-2,3,4-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranosyluronate)-(1→3)-4-O-acetyl-2-deoxy-1-thio-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)-6-O-triphenylmethyl-β-D-galactopyranoside 3)
p-톨릴(메틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-6-O-트리페닐메틸-β-D-갈락토피라노사이드 2 (150mg, 0.168mmol)을 아르곤 대기 하에서 피리딘/아세트산 무수물(acetic anhydride) 1:1 (3.3mL)에 용해시켰다. 실온에서 밤 새 교반한 후, 반응 용액을 얼음으로 냉각시키고, 과량의 메탄올을 서서히 첨가하여 반응을 종결시켰다. 반응 용액을 농축하고, 실리카 겔 컬럼(AcOEt:Hex = 2:3)으로 정제하여 목적물 3 (177 mg, 0.167 mmol, 99 %)을 수득하였다.
1H NMR(400Hz CDCl3) 7.41(d, J=7.8Hz, 8H), 7.31-7.20(m, 9H), 7.04(d, J=7.7Hz, 2H), 5.43-5.38(m, 2H), 5.22-5.12(m, 2H), 4.99-4.91(m, 2H), 4.85(d, J=12.1Hz, 1H), 4.73(d, J=7.8Hz, 1H), 4.63(d, J=12.1Hz, 1H), 4.24(dd, J=3.0Hz, J=10.5Hz, 1H), 3.99(d, J=9.4Hz, 1H), 3.70-3.61(m, 4H), 3.31(dd, J=7.0Hz, J=9.8Hz, 1H), 3.04(dd, J=5.4Hz, J=9.5Hz, 1H), 2.31(s, 3H), 2.04(s, 3H), 2.01(s, 3H), 2.00(s, 3H), 1.88(s, 3H) ESI-MS[M+Na]+ C50H52 35Cl3NNaO16S에 대한 계산치: 1082.2, 실측치: 1082.2
(메틸-2,3,4-트리-O-아세틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-4-O-아세틸-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-6-O-트리페닐메틸-β-D-갈락토피라노즈 4 ((Methyl-2,3,4-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranosyluronate)-(1→3)-4-O-acetyl-2-deoxy-1-thio-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)-6-O-triphenylmethyl-β-D-galactopyranose 4)
p-톨릴(메틸-2,3,4-트리-O-아세틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3) -4-O-아세틸-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-6-O-트리페닐메틸-β-D-갈락토피라노사이드 3 (230 mg, 217 mmol)을 H2O/아세톤 1:10 (2.3 mL)에 용해시켰다. 상기 용액을 얼음으로 냉각시키고, N-브로모숙신이미드(N-bromosuccinimide) (116 mg, 0.65 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 20 분 동안 교반하였다. 반응 용액을 AcOEt로 희석하고, 유기상(organic phase)을 포화 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate) 용액 및 포화 식염수로 세척한 후, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 황산나트륨을 여과를 통해 제거한 후, 감압 농축 하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 (AcOEt:Hex = 1:1)으로 정제하여 목적물 4 (159 mg, 0.166 mmol, 77 %)를 수득하였다.
1H NMR α-아노머(400Hz CDCl3)7.44-7.35(m, 6H), 7.31-7.19(m, 9H), 5.71(d, J=9.0Hz, 1H), 5.49(d, J=2.2Hz, 1H)5.27-5.14(m, 3H), 4.88-4.70(m, 2H), 4.70-4.60(m, 1H), 4.33(t, J=6.6Hz, 1H), 4.21(dd, J=3.1Hz, J=10.5 1H), 4.15-3.97(m, 2H), 3.74-3.65(m, 4H), 3.17(dd, J=6.6Hz, J=9.2Hz, 1H), 3.08-2.99(m, 1H), 2.10-2.00(m, 12H) ESI-MS[M+Na]+ C43H46 35Cl3NNaO17에 대한 계산치: 976.2 실측치 976.7
(메틸-2,3,4-트리-O-아세틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-4-O-아세틸-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-6-O-트리페닐메틸-β-D-갈락토피라노실 o-헥시닐벤조에이트 5((Methyl-2,3,4-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranosyluronate)-(1→3)-4-O-acetyl-2-deoxy-1-thio-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)-6-O-triphenylmethyl-β-D-galactopyranosyl o-hexynylbenzoate 5)
(메틸-2,3,4-트리-O-아세틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-4-O-아세틸-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-6-O-트리페닐메틸-β-D-갈락토피라노즈 4 (159 mg, 0.166 mmol) 및 o-헥시닐벤조산(o-hexynylbenzoic acid) 7 (101 mg, 0.499 mmol)을 아르곤 대기 하에서 DCM (1.7 mL)에 용해시켰다. N,N-디메틸아미노피리딘(N,N-dimethylaminopyridine) (2 mg, 0.02 mmol) 및 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide) (78 μL, 0.499 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 DCM으로 희석하고, 포화 탄산수소나트액 용액 및 포화 식염수로 세척한 후, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 황산나트륨을 여과하여 제거한 후, 감압 농축하였다. 잔류 물을 실리카 겔 컬럼(AcOEt:Hex = 2:3)으로 정제하여 목적물 5 (126 mg, 0.11 mmol, 67 %)를 수득하였다.
1H NMR α-아노머 (400Hz CDCl3)8.02(d, J=8, 2Hz, 1H), 7.63(d, J=7.9Hz, 1H), 7.53(dt, J=1.3Hz, J=7.5Hz 1H), 7.47-7.41(m, 1H)7.40-7.35(m, 7H), 7.29-7.26(m, 4H), 7.21-7.15(m, 4H), 6.45(d, J=3.3Hz, 1H), 6.02(d, J=8.7Hz, 1H), 5.63(b, 1H), 5.26-5.19(m, 2H), 4.87(d, J=7.6Hz, 1H), 4.81(d, J=12.0Hz, H), 4.54-4.49(m, 2H), 4.38-4.32(m, 1H), 4.29-4.24(m, 1H), 4.09(d, J=9.3Hz, 1H), 3.43(s, 3H), 3.31(dd, J=5.5Hz, J=9.1Hz, 1H), 2.97(t, J=9.1Hz, 1H), 2.67-2.49(m, 2H), 2.16(s, 3H), 2.06(s, 6H), 1.85(s, 3H), 1.66-1.57(m, 2H), 1.51-1.47(m, 2H), 0.89(t, J=7.3Hz, 3H) ESI-MS[M+Na]+ C56H58 35Cl3NNaO18에 대한 계산치: 1160.3 실측치 1160.9
(메틸-2,3,4-트리-O-아세틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-4-O-아세틸-2-데옥시-6-O-설포-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈락토피라노실 o-헥시닐벤조에이트, 모노나트륨 염 6 ((Methyl-2,3,4-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranosyluronate)-(1→3)-4-O-acetyl-2-deoxy-6-O-sulfo-1-thio-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)-β-D-galactopyranosyl o-hexynylbenzoate, monosodium salt 6)
(메틸-2,3,4-트리-O-아세틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-4-O-아세틸-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-6-O-트리페닐메틸-β-D-갈락토피라노실 o-헥시닐벤조에이트 5 (50.0 mg, 0.044 mmol)를 DCM (440 μL)에 용해시켰다. 트리플루오로 아세트산(Trifluoroacetic acid ) (44 ㎕) 및 트리이소프로필 실란(triisopropylsilane) (45 ㎕)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3 분 동안 교반하였다. 과량의 포화 탄산수소나트륨 용액을 첨가하여 반응을 종결시킨 다음, AcOEt로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척한 후, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 황산나트륨을 여과하여 제거한 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 아르곤 대기 하에서 DMF (440 μL)에 용해시키고, SO3-Py (14 mg, 0.088 mmol)를 첨가하고, 용액을 교반하였다. 2 시간 후, 포화 탄산수소나트륨 용액 (1.0 mL)을 반응용액에 첨가하고, 혼합물을 30 분 동안 더 교반하였다. 반응용액을 감압 농축한 후, 실리카 겔 컬럼 (AcOEt:MeOH = 10:1)으로 정제하여 목적물 6 (29.8 mg, 0.030 mmol, 68 %)을 수득하였다.
1H NMR(α 아노머)(400Hz MeOD)8.06-8.00(m, 1H), 7.55-7.49(m, 2H), 7.45-7.40(m, 1H), 6.50(d, J=2.47Hz, 1H), 5.60(b, 1H), 5.26(t, J=9.2Hz 1H), 5.09(t, J=9.8Hz, 1H), 4.96-4.87(m, 3H), 4.65-4.58(m, 2H), 4.32-4.28(m, 2H), 4.20(d, J=9.8Hz, 1H), 4.13-4.07(m, 1H), 3.99-3.93(m, 1H), 3.73(s, 3H), 2.48(t, J=6.8, 2H), 2.15(s, 3H), 2.02(s, 3H), 1.99(s, 3H), 1.97(s, 3H), 1.67-1.50(m, 4H), 0.99(t, J=7.2Hz, 3H) ESI-MS[M-H]- C37H43 35Cl3NO21S에 대한 계산치: 974.1 실측치 973.9
이당류 수용체의 합성
이당류 수용체 11은 하기 반응식에 따라 제조하였다. 제조예에서 화합물명 뒤에 표시된 화합물 번호는 하기 반응식에 나타낸 화합물 번호를 나타낸다.
[화학식 18]
Figure 112018091824007-pct00018
p-톨릴(메틸 2,3-O-이소프로필리덴-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-2-데옥시-4,6-O-이소프로필리덴-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈락토피라노사이드 8 (p-Tolyl(methyl 2,3-O-isopropylidene-β-D-glucopyranosyluronate)-(1→3)-2-deoxy-4,6-O-isopropylidene-1-thio-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)-b-D-galactopyranoside 8)
p-톨릴(메틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈락토피라노사이드 1(332 mg, 0.51 mmol)을 아르곤 대기 하에서 DMF (5.1 mL)에 용해시켰다. PPTS (64 mg, 0.25 mmol) 및 2-메톡시프로펜 (490 μL, 5. mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15 분 동안 교반하였다. 반응계(reaction system)를 에틸아세테이트로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 용액 및 포화 식염수로 세척한 후, 황산나트륨으 상에서 건조시켰다. 황산나트륨을 여과하여 제거한 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 (AcOEt:Hex = 2:3)으로 정제하여 목적물 8 (204 mg, 0.279 mmol, 55 %)을 수득하였다.
1H NMR(400Hz CDCl3)7.56(d, J=8.0Hz, 2H), 7.10(d, J=8.0Hz, 2H), 5.58(d, J=6.5Hz, 1H), 5.28(d, J=10.0Hz, 1H), 4.88(d, J=7.66Hz 1H), 4.74(d, J=12.0Hz, 1H), 4.69(d, J=12.0Hz, 1H), 4.08-4.00(m, 3H), 3.84(s, 3H), 3.68(d, J=8.8Hz, 1H), 3.49-3.42(m, 3H), 3.37(dd, J=7.7Hz, J=9.1Hz 1H), 2.33(s, 3H), 1.44-1.39(m, 12H) ESI-MS[M+Na]+ C29H38 35Cl3NNaO12S에 대한 계산치: 752.1, 실측치 752.1
p-톨릴(메틸 2,3-O-이소프로필리덴-4-O-레불리노일-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-2-디옥시-4,6-O-이소프로필리덴-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈락토피라노사이드 9 (p-Tolyl(methyl 2,3-O-isopropylidene-4-O-levulinoyl-β-D-glucopyranosyluronate)-(1→3)-2-deoxy-4,6-O-isopropylidene-1-thio-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)-b-D-galactopyranoside 9)
p-톨릴(메틸 2,3-O-이소프로필리덴-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-2-데옥시-4,6-O-이소프로필리덴-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈락토피라노사이드 8 (63 mg, 0.086 mmol)을 아르곤 대기 하에서 DCM (862 μL)에 용해시켰다. DMAP (2 mg, 0.02 mmol), LevOH (26 μL, 0.26 mmol) 및 DIC (40 μL, 0.26 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응용액을 에틸아세테이트로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 용액 및 포화 식염수로 세척한 후, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 황산나트륨을 여과하여 제거한 후, 감압 농축 하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 (AcOE:Hex = 3:2)으로 정제하여 목적물 9 (50 mg, 0.060 mmol, 70 %)를 수득하였다.
1H NMR(400Hz CDCl3)7.55(d, J=8.0Hz, 2H), 7.11(d, J=8.0Hz, 2H), 5.32-5.16(m, 3H), 4.83-4.78(m, 2H), 4.62(d, J=12.1Hz 1H), 4.46(d, J=9.8Hz, 1H), 4.37(d, J=2.8Hz, 1H), 4.05-3.95(m, 2H), 3.88-3.78(m, 2H), 3.72(s, 3H), 3.58-3.47(m, 2H), 3.42(b, 1H), 2.79-2.59(m, 4H), 2.33(s, 3H), 2.20(s, 3H), 1.15(s, 6H), 1.13(s, 6H) ESI-MS[M+K]+ C34H44 35Cl3KNO14S에 대한 계산치: 866.1, 실측치 866.0
p-톨릴(메틸 2,3-디-O-아세틸-4-O-레불리노일-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-4,6-디-O-아세틸-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈락토피라노사이드 10 (p-Tolyl(methyl 2,3-di-O-acetyl-4-O-levulinoyl-β-D-glucopyranosyluronate)-(1→3)-4,6-di-O-acetyl-2-deoxy-1-thio-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)-β-D-galactopyranoside 10)
p-톨릴(메틸 2,3-O-이소프로필리덴-4-O-레불리노일-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-2-데옥시-4,6-O-이소프로필리덴-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈락토피라노사이드 9 (227 mg, 0.274 mmol)를 80 % 아세트산 수용액 (2.74 mL)에 용해시키고, 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응후, 반응 용액을 포화 탄산수소나트륨 용액 (약 3 mL)으로 중화시키고, 에틸 아세테이트로 3 회 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 황산나트륨을 여과하여 제거한 후, 감압 농축하였다. 아르곤 대기 하에서, 잔류물을 무수 아세트산 (1.4 mL) 및 피리딘 (1.4 mL)에 용해시키고, DMAP (3 mg, 0.03 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반하였다. 반응 용액을 얼음에서 냉각시키고, 과량의 메탄올을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 감압 농축 후, 실리카 겔 컬럼 (AcOEt:Hex = 1:1)으로 정제하여 목적물 10 (201 mg, 0.219 mmol, 80 %)을 수득하였다.
1H NMR(400Hz CDCl3) 7.36(d, J=8.0Hz, 2H), 7.05(d, J=8.0Hz, 2H), 5.59(d, J=8.3Hz, 1H), 5.33(d, J=3.0Hz, 1H), 5.17-5.09(m, 2H), 4.96-4.87(m, 2H), 4.79(d, J=12.1Hz, 1H), 4.71(d, J=7.8Hz, 1H), 4.63(d, J=7.8Hz, 1H), 4.23(dd, J=3.0Hz, J=10.3Hz, 1H), 4.09(dd, J=5.3Hz, J=11.8Hz, 1H), 4.00-3.90(m, 2H), 3.81(dd, J=5.7Hz, J=6.8Hz, 1H), 3.72-3.61(m, 4H), 2.70-2.62(m, 2H), 2.47-2.40(m, 2H), 2.29(s, 3H), 2.10(s, 3H), 2.03(s, 3H), 2.01(s, 3H), 2.00(s, 3H), 1.99(s, 3H) ESI-MS[M+Na]+ C36H44 35Cl3NNaO18S에 대한 계산치: 938.1 실측치 938.1
p-톨릴(메틸 2,3-디-O-아세틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-4,6- 디-O-아세틸-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈 락토피라노사이드 11 (p-Tolyl(methyl 2,3-di-O-acetyl-β-D-glucopyranosyluronate)-(1→3)-4,6-di-O-acetyl-2-deoxy-1-thio-2-(2,2,2-trichloroethoxycarbonylamino)-β-D-galactopyranoside 11)
p-톨릴(메틸 2,3-디-O-아세틸-4-O-레불리노일-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-4,6-디-O-아세틸-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈락토피라노사이드 10 (201 mg, 0.219 mmol)을 아르곤 대기 하에서 피리딘 (1.09 mL) 및 아세트산 (1.09 mL)에 용해시켰다. 히드라진 일수화물(Hydrazine monohydrate) (13 ㎕, 0.263 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 반응 용액을 에틸아세테이트로 희석하고, 포화 탄산수소 나트륨 용액 및 포화 식염수로 세척한 후, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 황산나트륨을 여과하여 제거한 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 (AcOEt:Hex = 3:2)으로 정제하여 목적물 11 (121 mg, 0.148 mmol, 68 %)을 수득하였다. 1H NMR(400Hz CDCl3)7.41(d, J=8.0Hz, 2H), 7.11(d, J=8.0Hz, 2H), 5.44(d, J=2.8Hz, 1H), 5.05-4.99(m, 2H), 4.89-4.80(m, 2H), 4.71-4.65(m, 2H), 4.37-4.32(m, 1H), 4.18-4.02(m, 2H), 3.96-3.83(m, 6H), 3.62-3.52(m, 1H), 2.34(s, 3H), 2.07(s, 3H), 2.06(s, 3H), 2.05(s, 3H), 2.04(s, 3H) ESI-MS[M+K]+ C31H38 35Cl3KNO16S에 대한 계산치: 856.6 실측치 : 856.0
(합성예 1) (설페이트화 사당류의 합성)
상기와 같이 제조된 설페이트화 이당류 공여체 6 및 이당류 수용체 11을 하기 반응식에 따라 축합하여 목적하는 설페이트화 사당류(sulfated tetrasaccharide) 12를 제조하였다. 제조예에서 화합물명 뒤에 표시된 화합물 번호는 하기 반응식에 나타낸 화합물 번호를 나타낸다.
[화학식 19]
Figure 112018091824007-pct00019
p-톨릴(메틸 2,3-디-O-아세틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-4,6- 디-O-아세틸-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈 락토피라노사이드 11 (12.0 mg, 0.015 mmol) 및 (메틸-2,3,4-트리-O-아세틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-4-O-아세틸-2-데옥시-6-O-설포-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈락토피라노실 o-헥시닐벤조에이트, 모노나트륨 염 6 (12.6 mg, 0.013 mmol)을 아르곤 대기 하에 MeCN (126 μL)에 용해시켰다. 활성화된 MS-300 (12 mg)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 얼음으로 냉각한 후, PPh3AuNTf2-0.5 톨루엔 (6 mg, 3.7 mmol)을 첨가하여 반응을 개시시켰다. 혼합물을 0 ℃에서 15 분 동안 교반하고, 반응 용액을 그대로 실리카 겔 컬럼에 적용하였다. 질량 분석에서 사당류 12의 이온 피크가 관찰되었다(수율 약 5 %). 또한, NMR 분석에 의해, 이 반응에 의해 형성된 글리코시드 결합 부위의 아노머 부위(anomeric site) (위치 1)의 CH 커플링 상수(J 값)가 JCH = 178 Hz인 것으로부터, 수득된 사당류가 α 결합에 의해 연결된 화합물 12임을 확인하였다. ESI-MS [M-H]- C55H67 35Cl6N2O35S2에 대한 계산치: 1589.1, 실측치 1589.1.
(합성예 2) (설페이트화 사당류의 합성)
상기와 같이 제조된 설페이트화 이당류 공여체 6 및 이당류 수용체 11을 하기 반응식에 따라 축합하여 목적하는 설페이트화 사당류 13을 제조하였다. 제조예에서 화합물명 뒤에 표시된 화합물 번호는 하기 반응식에 나타낸 화합물 번호를 나타낸다.
[화학식 20]
Figure 112018091824007-pct00020
p-톨릴(메틸 2,3-디-O-아세틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-4,6- 디-O-아세틸-2-데옥시-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈 락토피라노사이드 11 (28.0 mg, 0.034 mmol) 및 (메틸-2,3,4-트리-O-아세틸-β-D-글루코피라노실우로네이트)-(1→3)-4-O-아세틸-2-디옥시-6-O-설포-1-티오-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-β-D-갈락토피라노실 o-헥시닐벤조산, 모노나트륨 염 6 (28.0 mg, 0.028 mmol)을 아르곤 대기 하에 MeCN (280 ㎕)에 용해시켰다. 활성화된 MS-300 (12 mg)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 -5 ℃로 냉각시킨 후, PPh3AuNTf2-0.5 톨루엔 (13 mg, 8.4 μmol)을 첨가하여 반응을 시작하였다. 혼합물을 -5 ℃에서 3 시간 동안 교반하고, 반응 용액을 그대로 실리카 겔 컬럼에 적용하였다. 질량 분광분석법에서 사당류 12의 이온 피크가 관찰되었다(수율 약 10 %). 또한, NMR 분석에 의해, 이 반응에 의해 형성된 글리코시드결합 부위의 H-1 및 H-2의 J 값은 J1,2 = 8.3 Hz인 것으로부터, 수득된 사당류는 β 결합으로 연결된 화합물 13임을 확인하였다. ESI-MS [M-H]- C55H67 35Cl6N2O35S2에 대한 계산치: 1589.1, 실측치 1589.1.

Claims (23)

  1. (a) "비-보호된 설페이트기(non-protected sulfate group)를 갖는 제1 당류(first saccharide)" 및 "비-보호된 설페이트기를 갖는 제2 당류"를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 제조된 제1 당류 및 제2 당류를 산의 존재하에서 서로 축합시키는 단계;
    를 포함하고,
    상기 제1 당류 및 상기 제2 당류는 하기 화학식 1로 표시되는 것인, 설페이트기를 갖는 당류의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure 112022053143846-pct00024

    상기 식에서,
    L은 이탈기이고;
    A는 수소 원자, 보호 또는 비-보호된 카르복실기, 보호 또는 비-보호된 아미드기, 및 -CH2-R4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소 원자, 비-보호된 설페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기, 보호 또는 비-보호된 아미노기, 보호 또는 비-보호된 티올기 및 당류 잔기(residue)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R1 내지 R4 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기이며;
    R1 내지 R4 중 하나 이상은 히드록시기, 아미노기 및 티올기로부터 선택되는 친핵성기이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 당류 및 상기 제2 당류는 동일한 당류인, 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 식에서,
    A는 -CH2-R4이고;
    R2 내지 R4는 비-보호된 설페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기, 및 당류 잔기로부터 선택되고,
    단, R2 내지 R4 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기이며;
    R1은 보호 또는 비-보호된 아미노기인, 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 당류 잔기는 글루쿠론산 잔기(glucuronic acid residue)인, 제조방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 당류 잔기는 상기 당류의 2-위치 탄소 원자에 설페이트기를 갖는 글루쿠론산 잔기인, 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 당류 및 상기 제2 당류는 하기 화학식 2로 표시되는 것인, 제조방법:
    [화학식 2]
    Figure 112022053143846-pct00022

    상기 식에서,
    L은 이탈기이고;
    A 및 B는 각각 독립적으로 수소 원자, 보호 또는 비-보호된 카르복실기, 보호 또는 비-보호된 아미드기, 및 -CH2-R6로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R1 내지 R6은 각각 독립적으로 수소 원자, 비-보호된 설페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기, 보호 또는 비-보호된 아미노기, 보호 또는 비-보호된 티올기, 및 당류 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R1 내지 R6 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기이며;
    R1 내지 R6 중 하나 이상은 히드록시기, 아미노기 및 티올기로부터 선택되는 친핵성기이다.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식에서,
    A는 -CH2-R6이고;
    B는 보호 또는 비-보호된 카르복실기이고;
    R2 내지 R6은 각각 독립적으로 비-보호된 설페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기 및 당류 잔기로부터 선택되고,
    단, R2 내지 R6 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기이며;
    R1은 보호 또는 비-보호된 아미노기인, 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 2개의 당 내지 100개의 당의 다당류(polysaccharide)의 제조방법인, 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate) 또는 헤파란 설페이트(heparan sulfate)의 제조방법인, 제조방법.
  10. (a1) "비-보호된 설페이트기를 갖는 제1 당류"를 제조하는 단계; 및
    (b1) 상기 단계 (a1)에서 제조된 제1 당류를 "친핵성기를 갖는 화합물"과 산의 존재하에서 축합시키는 단계;
    를 포함하고,
    상기 제1 당류는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조를 갖는 화합물인, 설페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물의 제조방법:
    [화학식 3]
    Figure 112022053143846-pct00025

    상기 식에서,
    L은 이탈기이고;
    A는 수소 원자, 보호 또는 비-보호된 카르복실기, 보호 또는 비-보호된 아미드기, 및 -CH2-R4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소 원자, 비-보호된 설페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기, 보호 또는 비-보호된 아미노기, 보호 또는 비-보호된 티올기 및 당류 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R1 내지 R4 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기이며;
    R1 내지 R4 중 하나 이상은 히드록시기, 아미노기 및 티올기로부터 선택되는 친핵성기를 갖고;
    상기 "친핵성기를 갖는 화합물"은 히드록시기, 아미노기 및 티올기로부터 선택되는 친핵성기를 갖는 당류, 아미노산, 펩타이드 및 단백질로부터 선택된다.
  11. 제10항에 있어서,
    (c1) 상기 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"을
    제2 당류 및 상기 단계 (b1)에서 제조된 "설페이트기를 갖는 당류를 포함하는 화합물"로부터 선택된 화합물과 추가로 축합시키는 단계;
    를 포함하고,
    상기 제2 당류는 하기 화학식 4로 표시되는 구조를 갖는 화합물인, 제조방법:
    [화학식 4]
    Figure 112022053143846-pct00026

    상기 식에서,
    L은 이탈기이고;
    A는 수소 원자, 보호 또는 비-보호된 카르복실기, 보호 또는 비-보호된 아미드기, 및 -CH2-R4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소 원자, 비-보호된 설페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기, 보호 또는 비-보호된 아미노기, 보호 또는 비-보호된 티올기 및 당류 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R1 내지 R4 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기이며;
    R1 내지 R4 중 하나 이상은 히드록시기, 아미노기 및 티올기로부터 선택되는 친핵성기를 갖는다.
  12. 제11항에 있어서, 상기 식에서,
    A는 -CH2-R4이고;
    R3은 비-보호된 설페이트기, 보호 또는 비-보호된 히드록시기 및 당류 잔기로부터 선택되고;
    R4는 비-보호된 설페이트기 및, 보호 또는 비-보호된 히드록시기로부터 선택되고;
    단, R4 및 R3 중 하나 이상은 비-보호된 설페이트기이고;
    R1은 보호 또는 비-보호된 아미노기이며;
    R2는 비-보호된 히드록시기 또는 당류 잔기인, 제조방법.
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