JP4675048B2 - 硫酸糖ライブラリー - Google Patents
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Description
本発明は、硫酸化剤による非選択的な硫酸化、および、６位選択的脱硫酸化剤による脱硫酸化を用い、硫酸化の全ての組合せを網羅した硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を合成する硫酸糖誘導体の製造法に関するものである。
硫酸基を持つ糖鎖には、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸等の様に様々な生理作用を有するものが知られている。例えば、造血が行われている器官である骨髄中には種々の細胞外マトリックス成分と共にヘパリンなどの硫酸糖が多量に含まれている。これら硫酸糖は、生体内で極微量で種々の生理活性を示す多くのサイトカインや増殖因子と親和性が高く、これらの因子の局在化を生じ、造血作用などの種々の生理作用を促進していると言われている。
こうした硫酸糖の機能を代替する新たな生理活性物質を探索する試みが種々行われている。例えば、ヒト造血細胞の培養液にサイトカインを添加する際にヘパリンを共存させるとサイトカインの造血細胞増殖促進作用が大幅に増強されることが知られており、これはサイトカインとヘパリンとの間に親和性があるためとされている（非特許文献１参照）。そこで、遊離のヘパリンを用いるのではなく、動物細胞が接着する基質表面にヘパリンを固定化することにより、動物細胞近傍にサイトカインを局在化させ、より効果的に細胞培養を促進しようとする試みもなされてきた（非特許文献２参照）。また、細胞の接着基質であるポリエステル表面に酸素プラズマ放電で水酸基を導入し、これに続く数段の反応でヘパリンを共有結合により固定化する方法も開発された（非特許文献３参照）。
こうした硫酸糖の機能を代替する新たな生理活性物質を探索する試みが種々行われている。例えば、ヒト造血細胞の培養液にサイトカインを添加する際にヘパリンを共存させるとサイトカインの造血細胞増殖促進作用が大幅に増強されることが知られており、これはサイトカインとヘパリンとの間に親和性があるためとされている（非特許文献１参照）。そこで、遊離のヘパリンを用いるのではなく、動物細胞が接着する基質表面にヘパリンを固定化することにより、動物細胞近傍にサイトカインを局在化させ、より効果的に細胞培養を促進しようとする試みもなされてきた（非特許文献２参照）。また、細胞の接着基質であるポリエステル表面に酸素プラズマ放電で水酸基を導入し、これに続く数段の反応でヘパリンを共有結合により固定化する方法も開発された（非特許文献３参照）。
我々はこれまでに、簡単な構造を持つ低分子である、各種の糖脂質アナログを合成し（特許文献１参照）、その脂質類似構造の疎水性を利用して、細胞培養素材に固定化することにより、単糖誘導体でも肝臓細胞の培養等に有効に利用できることを示してきた（特許文献２、非特許文献４、５参照）。また、参考例１に示す様に、ガラクトース−６−硫酸誘導体を合成して、参考例２に示す様に、造血細胞の培養に有効であることが示された（特願２００３−４７１４４）。つまり、ヘパリン等の天然由来の複雑な多糖の混合物を用いずに、簡単に合成できる単糖誘導体を用いて、従来よりも簡便な工程で動物細胞培養素材が得られることが明らかになった。さらに、参考例３に示す様に、硫酸化剤の当量を増すことにより、ガラクトース−２，６−二硫酸誘導体、ガラクトース−３，６−二硫酸誘導体、および、ガラクトース−４，６−二硫酸誘導体が得られることを明らかにした（特願２００３−４８４９９）。
しかし、参考例に示したランダム硫酸化は、短工程で多くの硫酸糖誘導体を得る優れた方法ではあるが、６位が硫酸化された誘導体の生成が優先するために、６位が遊離の水酸基である硫酸糖誘導体が得られないので、短工程で、硫酸化の全ての組合せを網羅した硫酸化ヘキソピラノシル誘導体が得られる硫酸糖誘導体の製造法が望まれていた。
特開２００１−１２２８８９号公報
特開２００２−２７９７７号公報
ブラッド（Blood）、２０００年、９５巻、ｐ．１４７−１５５
ステムセルズ（Stem Cells）、１９９９年、１７巻、ｐ．２９５−３０５
バイオマテリアルズ（Biomaterials）、２０００年、２１巻、ｐ．１２１−１３０
ジャーナル・オブ・アーティフィシャル・オーガンズ（J. Artif. Organs）、２００１年、４巻、ｐ．３１５−３１９
ジャーナル・オブ・バイオサイエンス・アンド・バイオエンジニアリング（J. Biosience Bioengineering）、２００２年、９３巻、ｐ．４３７−４３９
しかし、参考例に示したランダム硫酸化は、短工程で多くの硫酸糖誘導体を得る優れた方法ではあるが、６位が硫酸化された誘導体の生成が優先するために、６位が遊離の水酸基である硫酸糖誘導体が得られないので、短工程で、硫酸化の全ての組合せを網羅した硫酸化ヘキソピラノシル誘導体が得られる硫酸糖誘導体の製造法が望まれていた。
本発明の目的は、２、３、４および６位の水酸基が無保護のヘキソピラノシル誘導体を原料として、短工程で、６位が遊離の水酸基である硫酸糖誘導体を含む、全ての硫酸化の場合を尽くした硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を得ることを特徴とした硫酸糖誘導体の製造法を提供することにある。
上記課題を鋭意検討した結果、本発明者らは、まず、当量と反応条件を変化させることで、６位の水酸基のみが硫酸化されたヘキソピラノシル誘導体、あるいは６位を含む水酸基が硫酸化された二、三または四硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を合成し、次に、この６位を含む水酸基が硫酸化された二、三または四硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を原料として、６位選択的脱硫酸化剤を反応させ、６位が遊離の水酸基である一、二または三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を合成することにより、硫酸化の全ての組合せを網羅した硫酸化ヘキソピラノシル誘導体が調製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、２、３、４および６位の水酸基が無保護のヘキソピラノシル誘導体を原料として、硫酸化剤を反応させ、６位の水酸基のみが硫酸化されたヘキソピラノシル誘導体、あるいは６位を含む水酸基が硫酸化された二、三または四硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を合成し、次に、この６位を含む水酸基が硫酸化された二、三または四硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を原料として、６位選択的脱硫酸化剤を反応させ、６位が遊離の水酸基である一、二または三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を合成することにより、硫酸化の全ての組合せを網羅した硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を得ることを特徴とした硫酸糖誘導体の製造法、および、この製造法によって調製される全ての硫酸化ヘキソピラノシル誘導体の内、６位が遊離の水酸基である硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を１つ以上含み、６位が硫酸化された硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を含んでいてもよい、複数の硫酸化ヘキソピラノシル誘導体からなる硫酸糖ライブラリー、および、式（１）で示される硫酸化ガラクトース誘導体である。
（ただし、式中で、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4は、Ｘ1＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｈ、Ｘ4＝Ｈ、または、Ｘ1＝Ｈ、Ｘ2＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ3＝Ｈ、Ｘ4＝Ｈ、または、Ｘ1＝Ｈ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ4＝Ｈ、または、Ｘ1＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ2＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ3＝Ｈ、Ｘ4＝Ｈ、または、Ｘ1＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ4＝Ｈ、または、Ｘ1＝Ｈ、Ｘ2＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ3＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ4＝Ｈ、または、Ｘ1＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ2＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ3＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ4＝Ｈ、または、Ｘ1＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ2＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ3＝Ｈ、Ｘ4＝ＳＯ3Ｈ、または、Ｘ1＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ4＝ＳＯ3Ｈ、または、Ｘ1＝Ｈ、Ｘ2＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ3＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ4＝ＳＯ3Ｈ、または、Ｘ1＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ2＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ3＝ＳＯ3Ｈ、Ｘ4＝ＳＯ3Ｈのいずれかの組み合わせを表し、ＲはＨまたはＯ（ＣＨ2）nＣＨ3を、ｍは２から６の整数を、ｎは１１から１７の整数を表す。）
以下に、本発明を詳細に説明する。なお、ＤＭＦはジメチルホルムアミド、ＭＴＳＴＦＡはＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド、ＢＴＳＡはＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミドの略号である。
本発明の原料である２、３、４および６位が無保護のヘキソピラノシル誘導体の合成は如何なる方法によっても構わない。また、ヘキソピラノシル基とそれ以外の構造は、酸素を介する通常のグリコシド結合で結ばれていても、炭素を介するＣグリコシド結合で結ばれていても、あるいは、それ以外のヘテロ化合物を介する結合で結ばれていても構わない。
２、３、４および６位の水酸基が無保護のヘキソピラノシル誘導体を原料として、硫酸化剤を、例えばＤＭＦ等の適当な溶媒中、適当な当量（１から１００当量）、適当な反応温度（０から１００℃）および反応時間（１０分から２日間）の下に反応させ、６位の水酸基のみが硫酸化された６−硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、あるいは６位を含む水酸基が硫酸化された２，６−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、３，６−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、４，６−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、２，３，６−三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、２，４，６−三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、３，４，６−三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、および、２，３，４，６−四硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を合成する。得られた化合物は、必要に応じてシリカゲル等を用いた高性能薄層クロマトグラフィー、あるいは、アミドカラム等を用いた高性能液体クロマトグラフィー等を用いて分離・精製する。
硫酸化剤としては、糖質化合物の硫酸化に用いられるものであれば何でもよいが、例えば、三酸化イオウ−ピリジン錯体、三酸化イオウ−トリメチルアミン錯体、クロロスルホン酸−ピリジン錯体、ジシクロヘキシルカルボジイミド−硫酸等を挙げることができ、好ましくは、三酸化イオウ−ピリジン錯体、三酸化イオウ−トリメチルアミン錯体が挙げられる。
２、３、４および６位の水酸基が無保護のヘキソピラノシル誘導体を原料として、硫酸化剤を、例えばＤＭＦ等の適当な溶媒中、適当な当量（１から１００当量）、適当な反応温度（０から１００℃）および反応時間（１０分から２日間）の下に反応させ、６位の水酸基のみが硫酸化された６−硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、あるいは６位を含む水酸基が硫酸化された２，６−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、３，６−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、４，６−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、２，３，６−三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、２，４，６−三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、３，４，６−三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、および、２，３，４，６−四硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を合成する。得られた化合物は、必要に応じてシリカゲル等を用いた高性能薄層クロマトグラフィー、あるいは、アミドカラム等を用いた高性能液体クロマトグラフィー等を用いて分離・精製する。
硫酸化剤としては、糖質化合物の硫酸化に用いられるものであれば何でもよいが、例えば、三酸化イオウ−ピリジン錯体、三酸化イオウ−トリメチルアミン錯体、クロロスルホン酸−ピリジン錯体、ジシクロヘキシルカルボジイミド−硫酸等を挙げることができ、好ましくは、三酸化イオウ−ピリジン錯体、三酸化イオウ−トリメチルアミン錯体が挙げられる。
次に、上記の反応で得られた６位を含む水酸基が硫酸化された２，６−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、３，６−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、４，６−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、２，３，６−三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、２，４，６−三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、３，４，６−三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、および、２，３，４，６−四硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を原料として、６位選択的脱硫酸化剤を、例えばピリジン等の適当な溶媒中、適当な当量（４から１００当量）、適当な反応温度（２０から１００℃）および反応時間（１分から１時間）の下に反応させ、水を含む溶液で後処理することにより、２，６−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、３，６−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、および、４，６−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体からは、それぞれ、２−硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、３−硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、および、４−硫酸化ヘキソピラノシル誘導体が、２，３，６−三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、２，４，６−三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、および、３，４，６−三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体からは、それぞれ、２，３−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、２，４−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体、および、３，４−二硫酸化ヘキソピラノシル誘導体が、２，３，４，６−四硫酸化ヘキソピラノシル誘導体からは２，３，４−三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体が、単体または混合物として得られる。得られた化合物は、必要に応じてシリカゲル等を用いた高性能薄層クロマトグラフィー、あるいは、アミドカラム等を用いた高性能液体クロマトグラフィー等を用いて分離・精製する。
６位選択的脱硫酸化剤としては、硫酸糖の６位選択的脱硫酸化に用いられるものであれば何でもよいが、例えば、ＭＴＳＴＦＡ、ＢＴＳＡ、Ｎ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）アセトアミド、ヘキサメチルジシラザン、ペプタメチルジシラザン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノトリメチルシラン等を挙げることができ、好ましくは、ＭＴＳＴＦＡ、ＢＴＳＡが挙げられる。
以下に、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
６位選択的脱硫酸化剤としては、硫酸糖の６位選択的脱硫酸化に用いられるものであれば何でもよいが、例えば、ＭＴＳＴＦＡ、ＢＴＳＡ、Ｎ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）アセトアミド、ヘキサメチルジシラザン、ペプタメチルジシラザン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノトリメチルシラン等を挙げることができ、好ましくは、ＭＴＳＴＦＡ、ＢＴＳＡが挙げられる。
以下に、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（Ｎ−（Ｏ―β―（２−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（３−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（４−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドの合成）
参考例３に従って合成した、Ｎ−（Ｏ―β―（２，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（３，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（４，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドの混合物（8.4mg, 8.8μmol） をピリジン(4ml)に溶解し、アルゴン気流下、室温にて５時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をピリジン(2ml)に溶解し、MTSTFA（0.14ml, 0.71mmol）を加え、アルゴン気流下、６０℃で２時間撹拌した。反応液に、水（8ml）と 5mM酢酸アンモニウム／メタノール溶液（2ml）を加え、アルゴン気流下、室温で０．５時間撹拌した。反応終了後溶媒を留去し、シリカゲル（イアトロビーズ）カラムクロマトグラフィー（クロロホルム：5mM酢酸アンモニウム／メタノール溶液：水=130：50：9）にて精製し、目的物（3.7mg, 48％）を混合物として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（400MHz, DMSO-d6/D2O=98:2, 60℃）により、δ 4.22、4.14および4.08に、それぞれのガラクトース部分の１位のプロトンシグナルが観測され、Ｎ−（Ｏ―β―（２−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（３−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（４−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドの生成を確認した。
参考例３に従って合成した、Ｎ−（Ｏ―β―（２，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（３，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（４，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドの混合物（8.4mg, 8.8μmol） をピリジン(4ml)に溶解し、アルゴン気流下、室温にて５時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をピリジン(2ml)に溶解し、MTSTFA（0.14ml, 0.71mmol）を加え、アルゴン気流下、６０℃で２時間撹拌した。反応液に、水（8ml）と 5mM酢酸アンモニウム／メタノール溶液（2ml）を加え、アルゴン気流下、室温で０．５時間撹拌した。反応終了後溶媒を留去し、シリカゲル（イアトロビーズ）カラムクロマトグラフィー（クロロホルム：5mM酢酸アンモニウム／メタノール溶液：水=130：50：9）にて精製し、目的物（3.7mg, 48％）を混合物として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（400MHz, DMSO-d6/D2O=98:2, 60℃）により、δ 4.22、4.14および4.08に、それぞれのガラクトース部分の１位のプロトンシグナルが観測され、Ｎ−（Ｏ―β―（２−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（３−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（４−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドの生成を確認した。
[参考例１]
（Ｎ−（Ｏ−β−（６−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドの合成）
Ｎ−（Ｏ−β−ガラクトピラノシル−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド（51.7mg, 0.0687mmol）をＤＭＦ2mlに溶解し、三酸化硫黄・トリメチルアミン錯体（336mg, 2.41mmol）を加え、アルゴン雰囲気下、２時間撹拌した。反応液をそのままゲルろ過（ＬＨ−２０、クロロホルム−メタノール，１：１）し、目的物を含む画分を濃縮した。さらに、シリカゲルカラムクロマトフィー（クロロホルム−メタノール，2：1）により精製し、目的物（14.2mg, 0.0171mmol）を得た。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マトリックス、ジヒドロキシ安息香酸）：ｍ/ｚ 831.53 （Ｃ43Ｈ77ＮＯ12Ｓとして計算：831.52，[M−H]-）
（Ｎ−（Ｏ−β−（６−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドの合成）
Ｎ−（Ｏ−β−ガラクトピラノシル−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド（51.7mg, 0.0687mmol）をＤＭＦ2mlに溶解し、三酸化硫黄・トリメチルアミン錯体（336mg, 2.41mmol）を加え、アルゴン雰囲気下、２時間撹拌した。反応液をそのままゲルろ過（ＬＨ−２０、クロロホルム−メタノール，１：１）し、目的物を含む画分を濃縮した。さらに、シリカゲルカラムクロマトフィー（クロロホルム−メタノール，2：1）により精製し、目的物（14.2mg, 0.0171mmol）を得た。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マトリックス、ジヒドロキシ安息香酸）：ｍ/ｚ 831.53 （Ｃ43Ｈ77ＮＯ12Ｓとして計算：831.52，[M−H]-）
[参考例２]
（硫酸糖脂質アナログが臍帯血前駆細胞増殖に及ぼす影響）
Ｎ−（Ｏ−β−（６−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド3.5mgを200 mlのエタノールに溶かし−20℃で保存した。使用時に、この保存溶液1.8mlにエタノール8.2mlを加えて希釈した後に、２４穴プレートと同じ断面積で厚さ100μmに裁断したポリエステル不織布（旭化成製Y-15050、）を1枚入れた２４穴プレートに1 mlずつ加え揮発させた。また、濃度による影響を検討するため、この溶液をエタノールでさらに10倍希釈して同様にポリエステル不織布にコーティングした。
動物細胞として、ヒト臍帯血からフィコール密度勾配遠心分離により得られた単核造血細胞を用いた。
予め、ヒト臍帯血単核造血細胞1×105cellsとヒト骨髄初代ストローマ細胞5×105cellsとを、無血清無サイトカイン培地X-VIVO10(BioWhittaker，Walkersville，USA)を用いて、24ウェルプレート中で37℃，5%CO2雰囲気下で１週間共培養した後、その培養上清を得た。
上記のＮ−（Ｏ−β−（６−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドをコーティングした不織布、同じく１０倍希釈した溶液でコーティングした不織布、または、コーティングしていない不織布、いずれかの不織布を入れた２４穴プレートに、上記の培養上清を用いて、ヒト臍帯血単核造血細胞1×105 cellsを播種し、37℃、5%CO2雰囲気下で１週間培養した。
その後、培養後の不織布および培養液の両方から回収した造血細胞を集め、コロニーフォーミングユニットアッセイを行い、培養後の造血前駆細胞の濃度を計数した。
表１に示すように、培養後の造血前駆細胞濃度は、無処理の不織布に比べ、Ｎ−（Ｏ−β−（６−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドを１０倍希釈してコーティングしたものでもほぼ同等、Ｎ−（Ｏ−β−（６−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドを１倍濃度でコーティングしたもので約１．６倍であり、明らかな増殖活性を示した。
（硫酸糖脂質アナログが臍帯血前駆細胞増殖に及ぼす影響）
Ｎ−（Ｏ−β−（６−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド3.5mgを200 mlのエタノールに溶かし−20℃で保存した。使用時に、この保存溶液1.8mlにエタノール8.2mlを加えて希釈した後に、２４穴プレートと同じ断面積で厚さ100μmに裁断したポリエステル不織布（旭化成製Y-15050、）を1枚入れた２４穴プレートに1 mlずつ加え揮発させた。また、濃度による影響を検討するため、この溶液をエタノールでさらに10倍希釈して同様にポリエステル不織布にコーティングした。
動物細胞として、ヒト臍帯血からフィコール密度勾配遠心分離により得られた単核造血細胞を用いた。
予め、ヒト臍帯血単核造血細胞1×105cellsとヒト骨髄初代ストローマ細胞5×105cellsとを、無血清無サイトカイン培地X-VIVO10(BioWhittaker，Walkersville，USA)を用いて、24ウェルプレート中で37℃，5%CO2雰囲気下で１週間共培養した後、その培養上清を得た。
上記のＮ−（Ｏ−β−（６−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドをコーティングした不織布、同じく１０倍希釈した溶液でコーティングした不織布、または、コーティングしていない不織布、いずれかの不織布を入れた２４穴プレートに、上記の培養上清を用いて、ヒト臍帯血単核造血細胞1×105 cellsを播種し、37℃、5%CO2雰囲気下で１週間培養した。
その後、培養後の不織布および培養液の両方から回収した造血細胞を集め、コロニーフォーミングユニットアッセイを行い、培養後の造血前駆細胞の濃度を計数した。
表１に示すように、培養後の造血前駆細胞濃度は、無処理の不織布に比べ、Ｎ−（Ｏ−β−（６−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドを１０倍希釈してコーティングしたものでもほぼ同等、Ｎ−（Ｏ−β−（６−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドを１倍濃度でコーティングしたもので約１．６倍であり、明らかな増殖活性を示した。
[参考例３]
（Ｎ−（Ｏ―β―（２，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（３，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（４，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドの合成）
Ｎ−（Ｏ―β―（ガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド（30.0mg, 0.040mmol）をＤＭＦ（2.2ml）に溶解させ、三酸化硫黄・ピリジン錯体（32.4mg, 0.20mmol, ５当量）を加え、アルゴン気流下、室温にて2.5時間撹拌した。反応終了後、メタノール（20ml）を加え、溶媒を留去した。残渣をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（クロロホルム:メタノール：水=108：58：1、トリエチルアミン1%）にて分取し、さらに、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝4：1、トリエチルアミン1%）にて精製し、目的物（27.8mg, 84%）を混合物として得た。
これらの化合物がエタノールに可溶であることを確認した。
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6/D2O=98:2, 60℃)
（Ｎ−（Ｏ―β―（２，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（３，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド、および、Ｎ−（Ｏ―β―（４，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミドの合成）
Ｎ−（Ｏ―β―（ガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド（30.0mg, 0.040mmol）をＤＭＦ（2.2ml）に溶解させ、三酸化硫黄・ピリジン錯体（32.4mg, 0.20mmol, ５当量）を加え、アルゴン気流下、室温にて2.5時間撹拌した。反応終了後、メタノール（20ml）を加え、溶媒を留去した。残渣をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（クロロホルム:メタノール：水=108：58：1、トリエチルアミン1%）にて分取し、さらに、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝4：1、トリエチルアミン1%）にて精製し、目的物（27.8mg, 84%）を混合物として得た。
これらの化合物がエタノールに可溶であることを確認した。
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6/D2O=98:2, 60℃)
Ｎ−（Ｏ―β―（２，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド
δ 6.96 (t, J = 2.4 Hz), 6.55 (bs), 4.22 (d, J = 8.3 Hz), 4.09 (dd, J = 8.3, 9.3 Hz), 3.98 (t, J = 6.5 Hz), 3.86 (dd, J = 6.2, 10.3 Hz), 3.76 (dd, J = 6.2, 10.3 Hz), 3.70 (m), 3.64 (dd, J = 2.0, 8.6 Hz), 3.58 (t, J = 6.2 Hz), 3.50 (m), 3.47 (m), 3.20 (m), 1.69 (m), 1.53 (m), 1.41 (m), 1.29 (m), 0.85 (t, J = 6.9 Hz)
δ 6.96 (t, J = 2.4 Hz), 6.55 (bs), 4.22 (d, J = 8.3 Hz), 4.09 (dd, J = 8.3, 9.3 Hz), 3.98 (t, J = 6.5 Hz), 3.86 (dd, J = 6.2, 10.3 Hz), 3.76 (dd, J = 6.2, 10.3 Hz), 3.70 (m), 3.64 (dd, J = 2.0, 8.6 Hz), 3.58 (t, J = 6.2 Hz), 3.50 (m), 3.47 (m), 3.20 (m), 1.69 (m), 1.53 (m), 1.41 (m), 1.29 (m), 0.85 (t, J = 6.9 Hz)
Ｎ−（Ｏ―β―（３，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド
δ 6.96 (t, J = 2.4 Hz), 6.55 (bs), 4.15 (d, J = 7.6 Hz), 3.98 (t, J = 6.5 Hz), 3.95 (dd, J = 3.4, 9.6 Hz), 3.87 (bd, J = 3.4 Hz), 3.86 (dd, J = 6.2, 10.3 Hz), 3.76 (dd, J = 6.2, 10.3 Hz), 3.58 (t, J = 6.2 Hz), 3.47 (m), 3.43 (dd, J = 7.6, 9.6 Hz), 3.20 (m), 1.69 (m), 1.53 (m), 1.41 (m), 1.29 (m), 0.85 (t, J = 6.9 Hz)
δ 6.96 (t, J = 2.4 Hz), 6.55 (bs), 4.15 (d, J = 7.6 Hz), 3.98 (t, J = 6.5 Hz), 3.95 (dd, J = 3.4, 9.6 Hz), 3.87 (bd, J = 3.4 Hz), 3.86 (dd, J = 6.2, 10.3 Hz), 3.76 (dd, J = 6.2, 10.3 Hz), 3.58 (t, J = 6.2 Hz), 3.47 (m), 3.43 (dd, J = 7.6, 9.6 Hz), 3.20 (m), 1.69 (m), 1.53 (m), 1.41 (m), 1.29 (m), 0.85 (t, J = 6.9 Hz)
Ｎ−（Ｏ―β―（４，６−ジ−Ｏ−スルホガラクトピラノシル）−６−オキシヘキシル）−３，５−ビス（ドデシロキシ）ベンズアミド
δ 6.96 (t, J = 2.4 Hz), 6.55 (bs), 4.34 (d, J = 3.4 Hz), 4.06 (d, J = 7.6 Hz), 3.98 (t, J = 6.5 Hz), 3.94 (m), 3.76 (dd, J = 6.2, 10.3 Hz), 3.70 (m), 3.47 (m), 3.34 (dd, J = 3.4, 9.6 Hz), 3.20 (m), 1.69 (m), 1.53 (m), 1.41 (m), 1.29 (m), 0.85 (t, J = 6.9 Hz)
δ 6.96 (t, J = 2.4 Hz), 6.55 (bs), 4.34 (d, J = 3.4 Hz), 4.06 (d, J = 7.6 Hz), 3.98 (t, J = 6.5 Hz), 3.94 (m), 3.76 (dd, J = 6.2, 10.3 Hz), 3.70 (m), 3.47 (m), 3.34 (dd, J = 3.4, 9.6 Hz), 3.20 (m), 1.69 (m), 1.53 (m), 1.41 (m), 1.29 (m), 0.85 (t, J = 6.9 Hz)
本発明は、２、３、４および６位の水酸基が無保護のヘキソピラノシル誘導体を原料として、硫酸化剤を反応させ、６位の水酸基のみが硫酸化されたヘキソピラノシル誘導体、あるいは６位を含む水酸基が硫酸化された二、三または四硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を合成し、次に、この６位を含む水酸基が硫酸化された二、三または四硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を原料として、６位選択的脱硫酸化剤を反応させ、６位が遊離の水酸基である一、二または三硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を合成することにより、硫酸化の全ての組合せを網羅した硫酸化ヘキソピラノシル誘導体を得ることを特徴とした硫酸糖誘導体の製造法を提供するものであり、各種の細胞培養材料等の医療材料、血液抗凝固剤等の医薬品の製造に用いることができる。
Claims (3)
- ２、３、４および６位の水酸基が、遊離の水酸基または硫酸化された水酸基のいずれかである、全ての組合せを網羅した硫酸化ヘキノピラノシルの１位に、３，５−ビス（ドデシロオキシ）ベンゾイルアミノヘキシルオキシが結合した硫酸化ヘキソピラノシル誘導体からなる硫酸糖ライブラリー。
- 請求項１に記載の硫酸糖ライブラリーを表面に固定化してなる細胞培養素材。
- 式（１）で示される硫酸化ガラクトース誘導体。
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