JPH03135993A - グリコシル―エトポシドプロドラツグ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグリコシルーエトポシドプロドラッグ、その製
造方法及び癌を治療するための機能化された腫瘍特異的
酵素複合体と組み合わせるその使用方法、及び特に腫瘍
特異的酵素複合体の作用により分解して細胞毒素性活性
物質を生成することができるプロドラッグの４’−０−
グリコシルーエトポシドに関し、遊離した活性物質はそ
の細胞毒素活性により癌の治療に適している。

プロドラッグと腫瘍特異的抗体−酵素複合体の組み合わ
せの治療剤としての使用は専門家の文献に記述されてい
る。この必然的に伴う特定の組織を指向し、プロドラッ
グ分解酵素に共有結合した抗体を移植組織を含む動物に
注射し、次いでプロドラッグ化合物を投与すると化合物
は酵素により活性化されることができる。プロドラッグ
は組織に固定された抗体−酵素複合体の作用により細胞
毒素に変換され、このものは移植組織に対して細胞毒素
的効果を及ぼす。

二成分を含み、抗体−酵素成分と酵素によって活性化さ
れることができるプロドラッグ成分とからなる治療シス
テムのＷＯ第８８１０７３７８号に記述されている。こ
の場合、非哺乳動物酵素を抗体−酵素複合体の製造に使
用することが記述されており、活性化合物が非特異的に
遊離されることから内生酵素の使用は除外されている。

外生酵素は体により外来抗原として認識されるので、そ
の使用は非内生物質に応答する免疫の不利益を伴い、こ
の理由から抗体上に固定化された酵素は不活性化され、
適当な場合全体の複合体が除去される。更に、この場合
においてはｐ−ビス−Ｎ−（２−クロロエチル）アミノ
ベンジルグルタミン酸とその誘導体がプロドラッグとし
て使用されており、それらの化学的半減期は僅かに５，
３〜１６．５時間である。化学的に不安定なことは副作
用が予想されることからプロドラッグとしては不便であ
る。

二成分を含み、腫瘍組織上に載っている抗体−酵素複合
体がプロドラッグ化合物を細胞毒素性活性化合物に分解
する治療システムは同様にＥＰＡ第０３０２４７３　Ａ
２号に記述されている。二トポシト４′−ホスフェート
とその誘導体をプロドラッグとして、及び特徴的にそこ
に記述されているエトポシドを遊離するための抗体固定
化アルカリホスファターゼとを組み合わせる使用は、血
清中に内生アルカリホスファターゼが強力に存在するこ
とより不便である。ＤＥ第３８２６５６６２Ａ１号に記
述されているようにエトポシド４′−ホスフェートは既
に腫瘍治療剤として単独に使用されており、この場合血
清中に存在するホスファターゼがエトポシドをプロドラ
ッグから遊離する。

驚くべきことに、合成的に製造されこれまで得られたこ
とのない化合物４′−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー
エトボシドはインビトロで酵素ａ−グルコシダーゼ並び
に腫瘍特異的抗体−グルコシダーゼ複合体によりエトポ
シドとＤ−グルコースに分解できることが明らかになつ
Ｉこ　。

この発見に基づき、並びに上述のプロドラッグと抗体−
酵素複合体の組み合わせの不便を考慮にいれて、本発明
の目的は合成の酵素分解性４′−〇−グルコシルーエト
ポシド並びに機能化された腫瘍特異的酵素を製造するこ
と、及び二成分の組み合わせの薬理学的有用性を適当な
哺乳動物試験モデルで試験することであった。この目的
は式Ｉの化合物と機能化された腫瘍特異的酵素を製造し
、それらを組み合わせて使用した場合細胞毒素性活性試
験で効果を示したことにより達成された。

本発明は弐Ｉ （式中、 Ｒ１はメチル基、ベンジル基又は２−チエニル基であり
、 Ｒ２は水素原子、アシル又はトリー０１〜Ｃ４−アルキ
ルシリル保護基であり、 Ｒｓはヒドロキシル基、酸素原子を介して結合するアシ
ル又はトリー〇、−Ｃ，−アルキルシリル保護基、アミ
ノ基、アセチルアミノ基、ベンジルオキシカルボニルア
ミノ基又はジメチルアミノ基であり、 Ｒ４は水素原子又はメチル基であり、 Ｒ６は水素原子、ヒドロキシル基、酸素原子を介して結
合するアシル又はトリーＣ１〜Ｃ４−アルキルシリル保
護基、又はアミノ基、ベンジルオキシカルボニルアミノ
基、アジド基又はアセチルアミノ基であり、 Ｒ＠はヒドロキシル基、酸素原子を介して結合するアシ
ル又はトリーＣ１〜Ｃ，−アルキルシリル保護基、又は
アミノ基、ベンジルオキシカルボニルアミノ基又はアジ
ド基であり、 Ｒ７は水素原子、アシル基又はトリーＣ１〜ｃ、−アル
キルシリル保護基であり、 Ｒ８はメチル基又はヒドロキシメチル基又はメチレンオ
キシ基を介して結合するアシル保護基、又はベンジルオ
キシカルボニル基であり、この場合、アシル基はアセチ
ル基、ハロゲンがフッ素又は塩素のモノ、ジ又はトリハ
ロゲノアセチル基を意味する式■の４′−〇−グリコシ
ルーエトポシドに関する。

機能化された腫瘍特異的酵素は本発明の範囲内において
式■ Ａ−５ｐ−Ｅ　　　　　　Ｉ［ 〔式中、 Ａは腫瘍関連抗原に対する特異性を持つ抗体又はその断
片の一つであるか、もしくはＥＧＦ（上皮成長因子）、
ＴＧＦ−ｇ（形質転換成長因子ａ）、ＰＤＧＦ　（血小
板由来増殖因子）、ＩＧＦＩ＋ＩＩ（インシュリン様成
長因子Ｉ＋ｌり又はａ＋ｂＦＧＦ（酸性＋塩基性繊維芽
細胞成長因子）のような腫瘍に蓄積する生体分子であり
、 Ｅはａ−又はβ−グルコシダーゼ、ａ−ガラクトシダー
ゼ、σ−又はβ−マンノシダーゼ、α−７コシダーゼ、
Ｎ−アセチル−α−ガラクトサミニダーゼ、Ｎ−アセチ
ル−β−／Ｎ−アセチルーａ−グルコサミニダーゼ又は
β−グルクロニダーゼのような免疫原的でないか又は低
免疫原性のグリコシダーゼ、好ましくは哺乳動物グリコ
シダーゼであり、 Ｓｐ（スペーサー）は弐■又は■ ｘ（ｓ）ｎｙ　　　　　　　ｍ Ｘ（Ｓ）ｎ　　　　　　　　Ｎ 〔式中、 Ｘ又はＹは−Ｃｏ−Ｒ’−（Ｎ−サクシンイミド）−又
は−Ｃ（−Ｒ”）−ＣＨ，−Ｃ）Ｉ、−（式中Ｒうは−
ＣＨ，−ＣＨｆｆｌ−１１，４−シクロへキシリデン、
１．３−又は１．４−）ユニしン又はメトキシカルボニ
ル基又はクロロ−１，４−フ二二しン、及びＲ２Ｏは０
又はＮＨである）であり、及び更に Ｙは−Ｃ（−Ｒ”）−ＣＨ！−ＣＨ，−（式中Ｒ目は前
述の意味を持つ）であり、及び ｎはｌ又は２である）の二官能性スルフィド又はジスル
フィド含有基、もしくはポリペプチドスペーサーである
〕の酵素を意味する。

ＶＨ１ＣＨＩヒンジと酵素遺伝子からなる結合遺伝子を
真核細胞中での発現に適し選択用マーカーを持つ発現用
プラスミド中にクローン化する。結合遺伝子を持つ発現
用プラスミドを抗体に属する軽鎖遺伝子を含む発現用プ
ラスミドと共に真核発現用細胞にトランスフェクション
する０次いで適当な抗生物質を使用する選択により発現
用プラスミドを含むトランスフェクト−マクローンを確
認する。適当な検出法（ＢｉｏＤｏｔ。

ＥＬＩＳＡ）を使用して抗体と酵素からなる式■の結合
タンパク質を分泌するトランスフェクト−マクローンを
確認する。

本発明の範囲内にある好ましい化合物はＲ１はメチル基
、ベンジル基又は２−チエニル基であり、 Ｒ１は水素原子、アセチル又はクロロアセチル基又はト
リー〇、〜Ｃ６−アルキルシリル保護基であり、 Ｒ３はヒドロキシル基、酸素原子を介して結合するアセ
チル、クロロアセチル又はトリー〇ｌ〜Ｃ１−アルキル
シリル保護基、又はアミノ基、アセチルアミノ基、ベン
ジルオキシカルボニルアミノ基又はジメチルアミノ基で
あり、 Ｒ４は水素原子又はメチル基であり、 Ｒ６は水素原子、ヒドロキシル基、酸素原子を介して結
合するアセチル、クロロアセチル又はトリーＣ８〜Ｃ１
−アルキルシリル保護基、又はアミノ基、ベンジルオキ
シカルボニルアミノ基、アジド基又はアセチルアミノ基
であり、Ｒ・はヒドロキシル基、酸素原子を介して結合
するアセチル、りａロアセチル又はトリー〇、〜Ｃ４−
アルキルシリル保護基、又はアミノ基、ベンジルオキシ
カルボニルアミノ基又はアジド基であり、 Ｒ１は水素原子、アセチル、クロロアセチル又はトリー
Ｃ１−Ｃ，−アルキルシリル保護基であり、及び Ｒａはメチル基、ヒドロキシメチル基、アセチルオキシ
又はクロロアセチルオキシメチル基又はベンジルオキシ
カルボニル基である式Ｉの化合物、並びに、 Ａは腫瘍関連抗原に対する特異性を持つ抗体又はその断
片の一つであるか、もしくはＥＧＦ（上皮成長因子）、
ＴＧＦ−ａ（形質転換成長因子ａ）、ＰＤＧＦ　（血小
板由来増殖因子）、ＩＧＦＩ＋ＩＩ（インシュリン様成
長因子Ｉ＋Ｉ［）又はａ＋ｂＦＧＦ（酸性＋塩基性繊維
芽細胞成長因子）のような腫瘍に蓄積する生体分子であ
り、 Ｅは免疫原的でないか又は低免疫π性のグリコシダーゼ
、好ましくは哺乳動物グリコシダーゼ、例えばα−又は
β−グルコシダーゼ、σ−ガラクトシダーゼ、α−又は
β−マンノシダーゼ、α−７コシダーゼ、Ｎ−アセチル
−ａ−ガラクトサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−β−／Ｎ
−アセチルーσ−グルコサミニダーゼ又はβ−グルクロ
ニダーゼであり、 Ｓｐは弐■又は■〔式中、Ｘ又はＹは−Ｃｏ−Ｒ・−（
Ｎ−サクシンイミド）−又は−Ｃ（−Ｒ”）−ＣＨ，−
ＣＨ，−（式中Ｒ１は一〇〇、−Ｃ）１．−又は１．４
−フェニレン、及びＲ１″はＯ又はＮＨである）であり
、Ｙは−Ｃ（−Ｒ１１′）−ＣＩ！−ＣＩ、−（式中Ｒ
１は前述の意味を持つ）であり、及び ｎはｌ又は２である）の二官能性ジスルフィド含有基、
又はポリペプチドスペーサーでアル〕の式■の機能化さ
れた腫瘍特異的酵素である。

グリコシダーゼにより分解することができる弐Ｉ（式中
　Ｒ１はメチル基、ベンジル基又は２−チエニル基であ
り　Ｒ１は水素原子であり、Ｒｓはヒドロキシル基、ア
ミノ基又はジメチルアミノ基であり、Ｒ４は水素原子又
はメチル基であり、ＲＩは水素原子、ヒドロキシル基、
アミノ基又はアセチルアミノ基であり、Ｒ・はヒドロキ
シル基又はアミノ基であり、Ｒ１は水素原子であり　Ｒ
１はメチル基又はヒドロキシメチル基又はカルボキシル
基又はメチレンオキシ基を介して結合するアシル保護基
、又はベンジルオキシカルボニル基であり、この場合、
アシル保護基はアセチル基、ハロゲンがフッ素又は塩素
のモノ、ジ又はトリハロゲノアセチル基である）の化合
物の本発明による製造方法は、溶媒中で促進剤及び適当
な場合酸トラップ又は乾燥剤の存在下で、−５０℃〜６
０℃で式Ｖ （式中、 Ｒ１はメチル基、ベンジル基又は２−チエニル基であり
、 Ｒ１は水素原子、アシル又はトリー０１〜Ｃ４−アルキ
ルシリル保護基であり、 Ｒ３はヒドロキシル基、酸素を介して結合するアシル又
はトリーＣ８〜Ｃ４−アルキルシリル保護基、又はアセ
チルアミノ基、ベンジルオキシカルボニルアミノ基又は
ジメチルアミノ基であり、及び Ｒ６は水素原子又はメチル基である）のエトポシド化合
物を式■ Ｄ口 （式中、 Ｒ１は水素原子、ヒドロキシル基、酸素原子を介して結
合するアシル保護基、又はベンジルオキシカルボニルア
ミノ基、アジド基又はアセチルアミノ基であり、 Ｒ″は酸素原子を介して結合するアシル保護基、又はベ
ンジルオキシカルボニルアミノ基又はアジド基であり、 Ｒ１はアシル保護基であり、 Ｒ口はメチル基、メチレンオキシ−アシル保護基又はベ
ンジルオキシカルボニル基であり、及び ２はハロゲン原子好ましくはフッ素、塩素又は臭素、ヒ
ドロキシル基、トリーＣ１〜Ｃ２−アルキルシリル万キ
シ基、又は酸素原子を介して結合するアシル保護基であ
り、 この場合、アシル保護基はアセチル基、モノ、ジ又はト
リハロゲノアセチル基であって好ましくはハロゲン原子
はフッ素又は塩素である）の炭水化物成分と反応させて
式Ｉの４′−〇−グリコシルーエトポシド誘導体（式中
、基ＲＩ−Ｒａのすべては下で定義するそれらの意味を
保持している）を得、及びこれらの化合物に存在する保
護基を水素化分解又は加水分解により除去し、及び適当
な場合、生成するアミノ基を含む化合物の一つを還元的
アルキル化法によりジメチルアミノ基を含む式Ｉの他の
化合物に変換することからなる。

このための特別な方法は次の通りである。すなわち 式Ｖのエトポシド誘導体のグリコシド化は典型的にはＯ
−２，０−３，０−４及び適当な場合、０−６ｊＫ子が
アシル保護基で保護されている式■の機能化された炭水
化物ユニットを使用して実行する。好ましいアシル保護
基はアセチル基、クロロアセチル基又はトリフルオロア
セチル基である。アミノ糖の場合、アミノ基はベンジル
オキシカルボニル基で一時的に、又はアセチル基で永久
的に保護する。アジド糖はそれらが水素化分解によりア
ミノ糖に簡単に変換できることから同様に使用すること
が可能である。

炭水化物成分はアノマー中心が適当に機能化されていな
ければならない。この目的のためフルオリド、クロリド
又はプロミドのようなハロゲン化グリコジルが使用され
、これらは１−０−アシル誘導体から出発して例えばＨ
Ｆ％ＨＣＱ％ＨＢｒ又はＴｉＢｒａを使用して製造する
ことができる。

アノマー中心に０−アシル基又はヒドロキシル基を持つ
グリコシド化成分は炭水化物化学における通常の方法に
より製造される。

式Ｖのエトポシドの式■の炭水化物ユニットによるグリ
コシド化は促進剤の存在下で実行する。グリコジルクロ
リドとその１−ヒドロキシ又はｌ−アセチルオキシアナ
ログを使用する場合の促進剤はＢＦ、ｘエーテル又はト
リーＣ１〜Ｃ１−アルキルシリルトリプルオロメタンス
ルホネートである。グリコジルクロリド又はプロミドの
場合に使用する促進剤は銀又は水銀の塩である。

グリコシド化はアセトン、酢酸エチル、二一チル、トル
エン、ジクロロメタン又はジクロロエタンのような非極
性有機溶媒もしくはそれらの混合物中で実行する。反応
中生成する酸又は水を捕集するため、適当な場合分子ふ
るい又は硫酸マグネシウムのような酸トラップ又は乾燥
剤を添加する。反応温度はグリコジルクロリドと１−ヒ
ドロキシアナログを使用する場合−５０℃〜０℃、及び
グリコジルクロリド又はプロミドを使用する場合θ℃〜
６０℃の範囲内にある。反応中生成するグリコジルエト
ポシドは次の方法により保護基を除去する。すなわち、
アシル保護基は亜鉛（ＩＦ）塩により接触されるメタツ
リシス、又はクロロホルム、ジクロロメタン又はエーテ
ルと共にメタノール、エタノール又はそれらの混合物中
アルカリイオン交換剤により除かれる。ベンジル又はベ
ンジルオキシカルボニル基又はアジド基はパラジウム炭
素又はパラジウム／硫酸バリウムを使用する水素化分解
により除かれるか、もしくはアジド基の場合アミノ基に
変換される。アミノ糖を含む式■の化合物は更にホルム
アルデヒド／ナトリウムシアノポロヒドリドを使用する
還元的アルキル化によりジメチルアミノ誘導体に変換す
ることができる。

Ａ−Ｓｐ−Ｅを製造するため、スペーサー（Ｓｐ）をア
ミノ基を介して酵素に、及び導入したか又はジスルフィ
ド結合の分解により生成したＨ５基を介して抗体又は生
体分子に連結させることができ、もしくは部分Ａ、Ｓｐ
及びＥをコードする核酸配列を分子生物学的方法により
共有結合により連結して結合遺伝子を生成させ、Ａ−Ｓ
ｐ−Ｅが遺伝子工学的方法により製造される。これは種
々な方法で実行することができる。

Ａ）制限切断部位Ａを特異的変異により免疫グロブリン
の重鎮の遺伝子のＣＨ１エクソンの３′末端に導入する
。同様な制限切断部位Ａをスペーサーとして作用するオ
リゴペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの５′末
端に生成させる。２つの制限切断部位Ａは免疫グロブリ
ン遺伝子が読み枠を妨害することなく制限切断部位Ａを
介してオリゴヌクレオチドに連結することができるよう
に位置している。

制限切断部位Ｂをオリゴヌクレオチドの３′末端に生成
させる。この制限切断部位Ｂを酵素をコードする遺伝子
の成熟タンパク質をコードする核酸配列が始まる位置に
導入する。次いで酵素遺伝子を制限切断部位Ｂを介して
免疫グロブリン遺伝子連結構造に連結する。制限切断部
位Ｂは読み枠が連結で妨害されないように位置している
。免疫グロブリンｖ８の重鎮とＣエ　ｌリンカ−酵素の
ための部分からなる結合遺伝子を真核細胞中での発現に
適し選択マーカーを持つ発現用プラスミド中にクローニ
ングする。

結合遺伝子を持つ発現用プラスミドを抗体に属する軽鎖
の遺伝子を持つ発現用プラスミドと共に真核細胞（例え
ば骨髄腫細胞）中にトランスフェクシ四ンする。適当な
抗生物質による選択を実行して結合遺、伝子と軽鎖の遺
伝子を持つプラスミドを含む細胞クローン（トランスフ
エフトーマ）を分離する。適当な検出法（ＢｉｏＤｏｔ
　；ＥＬＩＳＡ）を使用してＭＡｂ　Ｆａｂ部分、リン
カ−ポリペプチド及び酵素からなる式Ａ−Ｓｐ−Ｈの結
合タンパク質を分泌するトランスフエフトーマを確認す
る。

Ｂ）制限切断部位Ａを免疫グロブリンの重鎮の遺伝子の
ヒンジエクソンの３′末端に導入する。

制限切断部位Ａを酵素遺伝子の成熟タンパク質をコード
するヌクレオチド配列が始まる位置に導入する。ｖＨｌ
Ｃ）Ｉｌ及びヒンジエクソンを持つ免疫グロブリンの重
鎮の遺伝子断片を制限切断部位Ａを介して酵素遺伝子に
連結する。

制限部位Ａは読み枠が連結で妨害されないように位置し
ている。抗体のヒンジ部分はこの構造においてポリペプ
チドスペーサーとして機能する。

Ｖｗ、Ｃａｌヒンジ及び酵素遺伝子からなる結合遺伝子
を真核細胞中での発現に適し選択マーカーを持つ発現用
プラスミド中にクローニングする。結合遺伝子を持つ発
現用プラスミドを抗体に属する軽鎖遺伝子を含む発現用
プラスミドと共に真核発現用細胞中にトランスフェクシ
ョンする。適当な抗生物質による選択に続き、発現用プ
ラスミドを含むトランスフェクト−マクローンを確認す
る。適当な検出法（ＢｉｏＤｏｔ。

ＥＬＩＳＡ）を用いて抗体と酵素からなる式■の結合タ
ンパク質を分泌するトランス７エクトーマクローンを確
認する。

酵素と抗体、その断片又は生体分子との結合は文献（ニ
ー・エッチ・ブレア（Ａ、Ｈ，Ｂｌａｉｒ）及びティー
・アイ・ゴース（Ｔ、１．　　Ｇｈｏｓｅ）　　ｒアイ
・イムノログ・メソッズ（＋、　　Ｉｎｍｕｎｏｌｏｇ
。

Ｍｅｔｈｏｄｓ）Ｊ　　（１９８３年）５９巻、１２９
〜１４３頁：ティー・アイ・ゴース（Ｔ、１．　　Ｇｈ
ｏｓｅ）等「メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　　ｉｎｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）Ｊ　（１９
８３年）９３巻、２８０〜３３３頁）に記述された方法
により実行される。

これは必然的にそのアミノ基を介し、サクシンイミジル
、Ｎ−マレイミドアルキリデン−シクロアルキリデン−
又はアリーレン−１−カルボキシレートを使用する酵素
の最初の機能化を伴い、この場合マレイミド基の二重結
合は機能化された抗体、その断片又は生体分子のＨ５基
と反応してチオエーテル機能性を形成する。

抗体−酵素複合体の製造のためＥＰ−Ａ第０１４１０７
９号に記述されたモノクローナル抗体、好ましくは抗体
４３１／２６．２５０／１８３．７０４／１５２及び４
９４／３２を使用することが可能である。腫瘍関連抗原
のための抗体の特異性は免疫シンチグラフィー及び免疫
組織化学の方法により動物とヒトで既に証明されている
。

これらのモノクローナル抗体のＶ遺伝子のヌクレオチド
配列はドイツ特許願第３９０９７９９．４号に記述され
ている。

腫瘍特異的酵素複合体を製造するため、以下に述べる文
献記載の方法で確認された分離源から精製する酵素を使
用することが可能である。

ヒト肝臓からのσ−ガラクトシダーゼ（ａｌｐ−ｈａ−
ｇａｌａｃＬｏｓｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　
１ｉｖｅｒ）、ディーン拳ケー・ジー（Ｄｅａｎ、　Ｋ
、Ｇ、）及びスイーレー・シー・シー（Ｓｗｅｅｌｅｙ
、　Ｃ，Ｃ，）　　ｒジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋ａ、）　Ｊ　（１９７９年）２５４巻、９９４
−１０００頁ヒト肝臓からのβ−グルクロニダーゼ（ｂ
ｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｈｕ
ｍａｎ　１ｉｖｅｒ）、ホ・ケー・ジェー（Ｈｏ、　Ｋ
、Ｊ、）　　ｒビオキミカ・工・ビオフィジ力・アクタ
（Ｂｉｏｃｈｉａ＋、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ）Ｊ　（１９８５年）８２７巻、１９７〜２０
６頁ヒト肝臓からのａ−Ｌ−フコシダーゼ（ａｌｐ−ｈ
ａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｈｕａ＋ａ
ｎ　１ｉｖｅｒ）、ドーソン・ジー（Ｄａｗｓｏｎ、　
　Ｇ、）及びツエイ・ジー（↑ｓａｙ　。

Ｇ、）「アーカイプス・オブ・バイオケミストリー・ア
ンド・バイオフィジックス（＾ｒｃｈ、　Ｂｉｏ−ｃｈ
ｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、）Ｊ　（１９７７年）１８４
巻、１２〜２３頁ヒト肝臓からのσ−マンノシダーゼ（
ａｌｐｈａ−ｔｎａｎｎｏｓｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｈ
ｕｍａｎ　１ｉｖｅｒ）　、グラポウスキー・ジー−ニ
ー（Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ、　Ｇ、Ａ、）　、イシンヌ・
ジェー・ニー（Ｉｋｏｎｎｅ、　Ｊ、Ｕ、）　、デスニ
ック・アール・ジｚ　−（Ｄｅｓｎｉｃｋ、　Ｒ，Ｊ、
）　　ｒ　ｘンザイム（Ｅｎｚｙａ＋ｅ）ｊ（１９８０
年）２５巻、１３〜２５頁ヒト胎盤からのβ−マンノシ
ダーゼ（ｂｅＬａ−ａ＋ａｎｎｏｓｉｄａｓｅ　ｆｒｏ
ｍ　ｈｕ＋＋＋ａｎ　ｐｌａｃｅｎｔａ）　、ネースケ
書シー（Ｎｏｅｓｋｅ、　Ｃ６）及び？−ｘマンｅジー
（Ｍｅｒｓｗ＋ａｎｎ、　Ｇ、）　　ｒホッペ・セイラ
ース・ツァイトシュリフト・フェア・フイジオロギッシ
ェ・ヘ　　ミ　−　（Ｈｏｐｐｅ　　５ｅｙｌｅｒｓ　
　Ｚ　　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、）Ｊ（１９８
３年）３６４巻、１６４５〜１６５１頁ヒト消化管粘膜
からのσ−グルコシダーゼ（ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓ
ｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｈｕｎ＋ａｎ　ｇａｓＬｏｒｏ
ｎｔｅｓ−ｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａ）　、アスプ・エフ
・ジー（Ａｓｐ、　Ｎ。

−Ｃ，）　、グドマンドーヘーヤー・イー（Ｇｕｄｍａ
ｎｄ−Ｈｏｅｙｅｒ＋　Ｅ、）　、クリスチャンセン・
ビー・エム（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ、　Ｐ、Ｍ、）
ダールクイスト・ニー（Ｄａｈｌｑｕｉｓｔ、　　Ａ、
）　　ｒスカンドφジェー・タリフ・ラブ・インベスト
（Ｓｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｌａｂ。

Ｉｎｖｅｓｔ、）　Ｊ　（１９７４年）３３巻、２３９
〜２４５頁ヒト肝臓からのβ−グルコシダーゼ（ｂｅｔ
ａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓａ　　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ
　　１ｉｖｅｒ）　、ダニエルス・エル・ビー（Ｄａｎ
ｉｅｌｓ、　Ｌ、Ｂ、）　％コイル・ビー・ジｚ−（Ｃ
ｏｙｌｅ、　Ｐ、Ｊ−）　、チアオー７４−ビー　（Ｃ
ｈｉａｏ、　Ｙ、−Ｂ、）　、グルー・アール・エッチ
（Ｇｌｅｖ、　Ｒ，Ｈ，）　　ｒジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリーＪ（１９８１年）２５６巻
、１３００４〜１３０１３頁 ヒト胎盤からのβ−グルコセレブロシダーゼ（ｂｅｔａ
−ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　
ｈｕｍａｎ　ｐｌａｃｅ−ｎｔａ）　、ファーピッシュ
・エフ−ニス（Ｆｕｒｂｉｓｈ。

Ｆ、Ｓ、）、ブレア・エッチ・イー（Ｂｌａｉｒ、　Ｈ
，Ｅ、）、シローチ・ジｘ−（Ｓｈｉｒｏａｃｈ、　Ｊ
、）　ｓペンチュー・ビー・ジー（Ｐｅｎｔｃｈｅｕ、
　Ｐ、Ｇ、）　、ブラディーｅアール・オー（Ｂｒａｄ
ｙ、　Ｈ，Ｅ、）　　ｒプロシーディング・才グ・ナシ
３ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ニ
ー・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）Ｊ　（１９７７年）７４巻、３５
６０〜３５６３頁 ヒト胎盤からのａ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（
ａｌｐｈａ−Ｎ−ａｃｅＬｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉ
ｄａｓｅｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｃｅｎｔａ）、
レールボーン畢ダブリュー（Ｒｏｅｈｒｂｏｒｎ、　Ｗ
、）　％　フｆンー７４ダラーケ−（ｖｏｎ　Ｆｉｇｕ
ｒａ、　Ｋ、）　ｒホツペ・セイラース・ツァイトシュ
リフト・フェア・フィジオロギッシェ・ヘミ−Ｊ　（１
９７８年）３５９巻、１３５３〜１３６２頁ヒト羊膜か
らのβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ｂｅｔａ−
Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａａｉｎｉｄａｓｅｆｒ
ｏｙａ　ｈｕｍａｎ　ａ＋５ｎｉｏｔｉｃ　ｍｅｗ＋ｂ
ｒａｎｅ）　、オルラッキオ・ニー（Ｏｒｌａｃｃｈｉ
ｏ、　Ａ、）　、二ミリアニ・シー（Ｅｍｉｌｉａｎｉ
、　　Ｃ，）　、ジ・レンジ・ジー・シー（Ｄｉ　　Ｒ
ｅｎｚｏ、　　Ｇ、Ｃ，）　、コスミ・イー・ブイ（Ｃ
ｏｓ＋ｍｉ、　Ｅ、Ｖ、）　ｒクリソ・キム・アクタ（
ＣＩｉｎ。

Ｃｈｉｍｅ、　Ａｃｔａ）Ｊ　　（１９８６年）１５９
巻、２７９〜２８９７９〜２８９頁ミーＮ−アセチルガ
ラクトサミニダーゼ−Ｎ−ａｃｅｔｙ１ｇａｌａｃｔｏ
ｓａ＋１ｉｎｉｄａｓｅ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏ）　
、サルペイル・アール（５ａｌｖａｙｒｅ、　Ｒ，）、
ネグル・ニー（Ｎｅｇｒｏ、　　Ａ、）　、マレット・
ニー（Ｍａｒａｔ、Ａ、）、トウースト−ブラシー−２
，ル（Ｄｏｕｓｔｅ−Ｂｌａｚｙ、　Ｌ、）　　ｒパド
ル・ビオル（パリス）　　（Ｐａｔｈｏｌ、　Ｂｉｏｌ
、　（Ｐａｒｉｓ））Ｊ　　（１９８４年）３２巻、２
６９〜２８４頁。

機能化・された腫瘍特異的酵素の解糖活性を特定の至適
ｐＨにおけるｐ−ニトロフェニルグリコシドを使用する
比較試験で求めた。

本発明は更に本発明のグリコジルエトポシドと機能化さ
れた腫瘍特異的酵素複合体と組み合わせた機能化された
腫瘍特異的酵素複合体とを含むパックに関する。

組み合わせた連続的使用の効果を試験するため移植した
マウスに機能化された酵素を与え、次いで酵素の血漿中
水準が事実上０に落ちるのヲ待ってグリコジルエトポシ
ドを与え、増殖の停止と退化が起こるか否かを観察した
。

実施例　ｌ グリコジル化成分の製造 ベンジル・Ｄ−グルクロネート（化合物ｌ）ベンジルプ
ロミド（４，８９ｇ、２８．５９＋ｕ＋ｏＱ）をＤＭＦ
（３００ＩＩＩ４）中Ｄ−グルクロン酸ナトリウム（５
ｇ、２３　、１３ｍ＊ｏ１２）の溶液に添加した。反応
混合物を４０℃で２時間、次いで８０℃で１６時間撹拌
し、真空下で蒸発した。残留物を８０：２０：ｌ　　ク
ロロホルム／メタノール／水を使用するシリカゲル（１
３ｈ）のカラムクロマトグラフィーにより精製した。

収得量：　４．８７ｇ（７４％）。

表題化合物を”ＣＮＭＲで確認した。

ベンジル・１．２．３．４−テトラ−０−クロロアセチ
ル−ａ　及びβ−Ｄ−グルクロネート（化合物２ａと２
ｂ） ベンジル・Ｄ−グルクロネート（３，８０９，１３，３
６ｍｍｏＩ２）をジクロロメタン（２００＋１２）に懸
濁シタ。クロロアセチルクロリド（７，９０９，６９，
９４＋＊ｍｏ１２）を添加し、次いで混合物を一３０°
Ｃに冷却し、ジクロロメタン（５０＋ｍｆｆ）に溶解し
たピリジン（４，３３ｇ、５４．７４ｍｍｏ（１）を添
加した。反応混合物を一３０℃で１６時間撹拌し、次い
でクロロアセチルクロリド（７，９０９）とピリジン（
４，３３９）を添加した。混合物を１６時間撹拌し、次
いで冷ジクロロメタン（１５０ｍ１２）を添加し、混合
物を５％１１度のクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，
６０ｍ１２×２）と氷水（５０＋ａＱＸ　２　）で洗浄
した。得られる生成物（７，９２９）は表題化合物の外
に約３０％のベンジル・２．３．４−トリー〇−クロロ
アセチル−σ、β−Ｄ−グルクロネートを含み、これを
更に精製することなく次工程で使用した。

ベンジル・２．３．４−トリー〇−クロロアセチル−α
、β−〇−グルクロネート（化合物３ａ、　３ｂ）化合
物２ａ／２ｂの粗生成物（７，９２ｇ）を３：ｌメタノ
ール／クロロホルム（３２０＋ｍＱ）に溶解し、アミノ
化シリカゲル（１１，０９ｇ）を添加した。反応混合物
を室温で６時間撹拌し濾過した。炉液を蒸発し、次いで
残留物を２：１石油エーテル／酢酸エチルを使用するシ
リカゲル（２２０ｇ）のクロマトグラフィーにより精製
した。

収得量：　４．９４ｇ（化合物２ａ／　２ｂ基準で７２
％）。

ベンジル・１−デオキシ−１−フルオロ−ａ　−Ｄ−グ
ルクロネート（化合物４） ナトリウム・ｌ−デオキシ−１−フルオロ−σ−Ｄ−グ
ルクロネー）　（６，２２ｇ、２８．５１＋ｖ＋ｏＱ）
をＤＭＦ　（３５０＋ｍ１２）に懸濁し、ベンジルプロ
ミド（４，８９９，２８，５９ｍｌＩｏｇ）を添加した
。反応混合物を６０℃で２４時間撹拌し、次いで蒸発し
た。残留物ヲ３：ｌ　　クロロホルム／メタノールに溶
解し、硫酸マグネシウム（１２ｇ）を添加しＩ；。懸濁
液を２時間撹拌し、次いで枦遇し、炉液を蒸発した。

残留物を４＝１　ジクロロメタン／アセトンを使用する
シリカゲル（１６０ｇ）のカラムクロマトグラフィーに
より精製した。

収得量：　５．９５９　（７３％）。

ベンジル・ｌ−デオキシ−１−フルオロ−２，３，４−
）ソー０−ａ−Ｄ−グルクロネート（化合物５） 化合物４　（５，０９，１７，４６ｍｍｏ（２）をジク
ロロメタン（１２０ｍＱ）に懸濁し、０℃でベンジルプ
ロミド（９，８５９，５７，６１ｍｍｏ（２）と酸化銀
（１１，２９）を添加した。反応混合物を０℃で５時間
、次いで室温で２８時間撹拌した。反応混合物を濾過し
、炉液を真空下で蒸発した。残留物を３＝１　石油エー
テル／酢酸エチルを使用するシリカゲル（２４０夕）の
クロマトグラフィーにより精製した。

収得量：　６．６０９　（６８％）。

ベンジル・１−デオキシ−１−ｙｔレオロー２．３．４
−　トリー〇−クロロアセチル−σ−〇−グルクロネー
ト（化合物６） 化合物４　（５，０ｇ、１７．４６ｍｍｏＱ）ヲジクロ
口メタン（２６０ｍ４）に懸濁し、−３０℃でクロロア
セチルクロリド（９，８６９，８７，３０ｍｍｏＱ）を
添加した。ｌＯ：ｌ　ジクロロメタン／ピリジン（ｌｏ
ｏｍ（１）を添加後、反応混合物を一３０℃で１８時間
撹拌した。冷ジクロロメタン（８０ｍｆｆ）を混合物に
添加し、これをクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５゜０
．８０＋ｘＱｘ　３　）、次いで水で洗浄した。有機相
を硫酸ナトリウムで乾燥し蒸発した。残留物を５：ｌ　
石油エーテル／酢酸エチルを使用するシリカゲル（２６
０９）のカラムクロマトグラフィーにより精製した。

収得量：　７．５８９　（９２％）。

２．３．４．６−テトラ−０−クロロアセチル−ａ−Ｄ
−ガラクトビラノシルフルオリド（化合物７） ａ−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオリド（２，３０ｇ、
１２．６２ｍｍｏ１２）を乾燥ジクロロメタン（１００
＊Ｉ２）に溶解し、−２５℃でクロロアセチルクロリド
（９，０ｇ、７９．６８ｍ＋ｍｏ（２）とｌ：ｌ　ジク
ロロメタン／トリエチルアミン（５５ｍ１２）を添加し
た。

反応混合物を１６時間撹拌し、次いでクロロアセチルク
ロリド（９，０９）と１：ｌ　ジクロロメタン／トリエ
チルアミン（５５ｍ（２）を添加した。反応混合物を更
に２４時間撹拌し、次いでクエン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ５，０，５０＋ＩＩＱ×３）、次いで水で洗浄した
。有機相を乾燥（硫酸ナトリウム）し、真空下で蒸発し
た。残留物を４０：８：１ジクロロメタン／石油エーテ
ル／酢酸エチルを使用するシリカゲル（３００ｇ）のカ
ラムクロマトグラフィーにより精製した。

収得量：　５．１９９　（８２％）。

〔α〕ゎ　＋６４．２°（ｃ＝１．ジクロロメタン）。

２．３．４．６−チトラーＯ−ベンジル−α−Ｄ−ガラ
クトビラノシルフルオリド（化合物８）ａ−Ｄ−ガラク
トピラノシルフルオリド（２，３０９，１２，６２ｍｍ
ｏ１２）を乾燥Ｉ＞ＭＦ　（４０＋ａ（１）に溶解し、
−２０℃でベンジｌレブロミド（１２，９５ｇ、７５．
７２ｍｍｏｆｆ）と酸化銀（１０９）を添加した。反応
混合物を一２０℃で５時間、次いで室温で２４時間撹拌
した。次いで塩を濾過し、炉液を真空下で蒸発した。残
留物を１５：ｌ　　石油エーテル／酢酸エチルを使用す
るシリカゲル（３５０９）のカラムクロマトグラフィー
により精製した。

収得量：　５．２０９　（７６％）。

実施例　２ グリコシドの合成 ４′−〇−デメチルー４−０−　（２，３−ジーＯ−ク
ロロアセチル−４，６−０−エチリデン−β−Ｄ−グル
コビラノシル）−４−二ビーボドフイ口トキシン（化合
物９） ４’−〇−ベンジルオキシカルボニルー４−０−デメチ
ル−４−０−（２，３−ジーＯ−クロロアセチル−４，
６−０−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシル）−４
−二ビ−ポドフィロトキシンＣｌ０ｙ、１１．４２ｍｍ
ｏ１２）を１０％Ｐｄ、／ｃ　（５，０ｇ）の存在下で
、２：１　酢酸エチル／メタノール（２００Ｉ１１２）
中で２時間水素添加しｊ；。反応混合物を濾過し、が液
を真空下で蒸発した。残留物をシリカゲル（５０ｇ）の
層で濾過した。得られる生成物をメタノール／酢酸エチ
ルで結晶化した。

収得量：　７．５０９　（８８，６％）。

融点２０１〜２０３℃。

Ｃａ　）ｏ　　−７３−４’　（ｃ　−１−りｏｏホル
ム）ベンジル・４′−〇−デメチルー４−０−　（ジー
Ｏ−クロロアセチル−４，６−０−エチリデン−β−Ｄ
−グルコピラノシル）−４−エビ−４′−〇　−（２，
３，４−１−ソー０−ベンジルーβ−〇−グルコピラノ
シル）−ウロネートーボドフイロトキシン（化合物９） ベンジル・１−フルオログルクロネー）（化合物５．４
．２３ｇ、７．６０禦ｒａｏＱ）と２＃、３’−ジー〇
−クロロアセチルーエトポシド（化合物９．５．６３ｇ
、７．６０ｍｒｚｏＱ）をジクロロメタン（２２０ｎＱ
）に溶解し、４人の分子ふるい（１０９）を添加した。

ＢＦ、−エーテル（２，５ｍＱ）を−４０℃で反応混合
物に添加し、次いでこれを一３０’Ｃで２０時間撹拌し
た。トリエチルアミン（７，０＋１Ｉ２）を添加し、次
いで混合物を濾過しだ。炉液をクエン酸緩衝液（ｐＨ５
，８０ｍＱ×３）と水（１２０ａｆｆＸ　３　）で洗浄
し、乾燥（硫酸ナトリウム）シ、真空下で蒸発した。残
留物を５：５：１　　ジクロロメタン／石油エーテル／
アセトンを使用するシリカゲル（３６０ｇ）のカラムク
ロマトグラフィーにより精製した。

収得量：　６．４９９　（６７％）。

４′−〇−デメチルー４−０−（ジー０−クロロアセチ
ル−４，６−０−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシ
ル）−４−エビ−４’−０−（２，３，４，６−チトラ
ーＯ−ベンジル−ａ−及びβ−Ｄ−ガラクトピラノシル
）−ポドフィロトキシン（化合物１０ａと１０ｂ） テトラ−０−ペンジルーガラクトビラノシルフルオリド
（化合物８．３．６０ｇ、６　、６５ｍ＋１ｏＱ）とエ
トポシド誘導体（化合物９．４．９３９．６．６５ｍｍ
ｏＩ２）をジクローロメタン（２５０ｍｄ）に溶解した
。４人の分子ふるい（７，２ｇ）を添加し、次いで反応
混合物を一４０℃に冷却し、３０％濃度のＢＦ３−エー
テル（２，２＋＋＋Ｉ２を滴下添加した。混合物を一３
０°Ｃで２０時間撹拌し、次いでトリエチルアミン（５
，５＋ｆｆ）を添加後濾過した。炉液をクエン酸緩衝液
（ｐＨ５，７５ｒｓＱ×３　’）と水（７０ｍＱＸ　２
　）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発した。残
留物を５二５；ｌ　石油エーテル／ジクロロメタン／ア
セトンを使用するシリカゲル（３７０ｇ）のカラムクロ
マトグラフィーにより予備精製しｔ；。更にカラムクロ
マトグラフィーにより分離して表題化合物１０ａ　（ａ
−グリコシド：　４．３６ｇ（５２％））と１０ｂ（β
−グリコシド：　１．４２ｇ（１７％））を得た。

実施例　３ グリコジルエトポシドの保護基の除去反応ベンジル・４
′−〇−デメチルー４−エビー４−〇　−（４，６−０
−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシル）　−４’−
０−（２，３，４−トリー〇−ベンジルーβ−Ｄ−グル
コピラノシル）−ウロネート・ポドフィロトキシン（化
合物１１）グルクロニド誘導体（化合物９．４　、５６
ｇ、３．５７１１０１２）を４：ｌ　メタノール／りｃ
ｔａホルＡ　（１２０峠）ニ溶解シ、ＤＯＷＥＸ　Ｉ　
Ｘ　８　（６，２１？）を添加した。反応混合物を室温
で３時間撹拌し、次いでｔＡした。クロロホルム（１５
０ｍ１２）をか液に添加し、次いでこれを硫酸ブグネシ
ウム（１０ｇ）と共に撹拌した。塩を濾過し、炉液を真
空下で蒸発した。残留物を５＝２＝１　ジクロロメタン
／石油エーテル／アセトンを使用する２００ｇのシリカ
ゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製しｔこ　。

収得量：　３．２９ｇ（８２％）０ ４′−〇−デメチルー４−エビー４−０−　（４，６−
０−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシル）−４’−
０−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−ウロン酸・ポドフ
ィロトキシン（化合物１２）デアシル化グルクロニド誘
導体（化合物１１゜３　、６２ｇ、３．２２ｍｍｏＱ）
を４：ｌ　メタノール／酢酸エチル（１８０ＩＩＩｇ）
に溶解し、ｌＯ％ｐａ／Ｃ（２，７６ｇ）の存在下で水
素添加した。触媒を濾過し、次いでか液を真空下で蒸発
した。残留物をメタノール／ヘキサン（グラジェント）
を使用するＲＰ−１８シリカゲルのカラムクロマトグラ
フィーにより精製した。

収得量：　１．８２９　（八％）。

４′−〇−デメチルー４−エビー４−０−　（４，６−
０−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシル）−４’　
−０−（２，３，４，６−チトラーＯ−ベンジルーａ−
Ｄ−ガラクトピラノシル）−ポドフィロトキシン（化合
物１３） ポドフィロトキシンガラクトピラノシド（化合物ＩＱａ
、　３．０９．２．３７ｍｍｏＱ）を３：ｌ　メタノー
ル／クロロホルムに溶解し、Ｄｏｖｅｘ　ｌ　Ｘ　８を
添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し濾過した。

炉液を真空下で蒸発した。残留物をクロロホルムに溶解
し、リン酸緩衝液（ｐＨ７、３０ｍＱ×３）、次いで水
で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し蒸発した
。残留物を５：３：１　ジクロロメタン／石油エーテル
／アセトンを使用するシリカゲル（８５ｇ）のカラムク
ロマトグラフィーにより精製した。

収得量：　２．２７ｇ　（８６％）。

４′−〇−デメチルー４−エビー４’−０−（σ−Ｄ−
ガラクトピラノシル）−４−０−（４，６−０−エチリ
テンーβ−Ｄ−グルコピラノシル）ポドフィロトキシン
（化合物１４） デアシル化ポドフィロトキシンガラクトピラノシド（化
合物１３．２．０ｇ、１．８０ｍｍｏ１２）を３＝１メ
タノール／酢酸エチルに溶解し、ｌＯ％Ｐｄ／Ｃ（２，
５９）の存在下で２４時間水素添加した。混合物を硫酸
マグネシウムと共に撹拌し濾過した。

炉液を真空下で蒸発しｔ；。残留物をメタノール／酢酸
エチル（グラジェント）を使用するＲＰ−１８シリカゲ
ルのカラムクロマトグラフィーにより精製した。

収得量：　１．３７ｇ（７２％）。

結果： 実験条件下でａ−ガラクトシダーゼとβ−グルクロニダ
ーゼの酵素活性をまったく検出することができなかった
。

実施例　５ β−グルクロニダーゼ複合体の酵素活性の測定 上述の方法で精製したβ−グルクロニダーゼを抗体／生
体分子に結合させ、酵素と複合体の活性を次のように測
定した。

測定する酵素溶液の５００ｕａを１００ｍＭのＨＥＰＥ
Ｓ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ′−２
−エタンスルホン酸ＸｐＨ５）中２．５ｍＭのｐ−ニト
ロフェニル・β−Ｄ−グルクロニド溶液の５００μＱに
添加した。試験混合物を３７″でインキユベートシ、６
分後３００μＱの０．４Ｍグリシン溶液（ｐＨ１０，８
）で停止した。次いで遊離したｐ−ニトロフェノールを
４０５ｎｍの吸光度を測定して求めた。

結果： 複合体は酵素活性の減少がわずかであった。

実施例　９ グリコシルーエトポシドグロドラッグシステムのインビ
ボ抗腫瘍効果 ３０匹のＮＭＲＩ　ｎｕ／ｎｕマウスが０日目に動物当
たり約５ｍ１１３の大きさのＣｏＣａ　４ヒト腫瘍片の
皮下移植を受けた。ヒト腫瘍組織がマウスで増殖した（
７〜１４日）後、各群５匹の動物の内ａ、ｂ、ｃ群は５
Ｘ５００μ９のＭＡｂ　ＢＷ　４９４／３２一グルクロ
ニダーゼ複合体、 ｄ　ｎ　ハ５　Ｘ　５００ｊｌｕｃ７）　ＭＡｂ　ＢＷ
　４９４／　３２、ｅ群は５ｘｓｏｏμ９のグルクロニ
ダーゼ、及びｆ群は５　ｘ　５００Ｉｉ４ノＰＢＳノ、
ｌ［ａ！　５　ａ　間０）ｌＩｌ脈内注射による投与を
受けた。ＭＡｂ　ＢＷ　４９４／３２−グルクロニダー
ゼ、ＭＡｂ　ＢＷ　４９４／３２、グルクロニダーゼ又
はＰＢＳ注射後５．６及び７日目に、ａｌｄ及びｅ群の
マウスは動物当たり及び１日当たりグルコシル−エトポ
シドの最大許容用量（ＭＴＤ）の１八景の静脈内注射に
よる投与を受けた。６群のマウスは各々ＭＴＤの’／Ｉ
ｌｌ量、及び０群のマウスはＭＴＤのＩ／３．量の投与
を同じ日に受けた。

結果： ｄとｅ群はｆ群と大きく相違しない腫瘍増殖を示しｔ；
。ａ％ｂ及び０群は顕著な腫瘍増殖の抑制を示し、効果
は３群でもつとも顕著であっに。

ＣｏＣａ　４外来組織移植系においてＭＡｂｓ　　ＢＷ
　４３１／２６とＢ１１２５０／１８３（Ｆ）投与、及
びＭ２１外来１１１Ｎ移植系においてＭＡｂ　ＢＷ　７
０４の投与を受けた場合間等な結果が得られた。

実施例　１Ｏ ａ）　　４’−０−ａ−Ｄ−ガラクトピラノシル−エト
ポシドのＣ−ガラクトシダーゼ（生のコーヒー豆由来）
による分解 ４’−０−ａ−Ｄ−ガラクトピラノシル−エトポシドを
２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に１＋＋ｎ
／ｍｅの濃度に溶解し、０．３Ｕ／ｍ１２のａ−ガラク
トシダーゼ（生のコーヒー豆；シグマ・コンパニー　（
Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、）　；　ｌ　Ｕ　−ｐＨ６，５及び
２５＠で１分間当たりｌｔｔｍｏＱのｐ−ニトロフェニ
ル・ａ−Ｄ−ガラクトシドを分解）を添加し、混合物を
３７６でインキュベートした。４’−０−ａ−Ｄ−ガラ
クトピラノシル−エトポシドの分解と遊離エトポシドの
出現を１（ＰＬＣで調べた。半減期は１５分であった。

ｂ）４’−０−α−Ｄ−ガラクトビラノシルーエトボシ
ドのα−ガラクトシダーゼＡ（ヒト胎盤由来）による分
解 ４’−０−ａ−Ｄ−ガラクトピラノシル−エトポシドを
２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に１０７又
は１０．７１１９／ＩＩ（ｌの濃度に溶解し、０．３６
Ｕ／ｙａＱのσ−ガラクトシダーゼＡ（ヒト胎盤から分
離；ｌＩＪ”ｐＨ５及び３７°で１分間当たり１ｐｒａ
ｏＱの４−メサムベリフェリル（ｍｅｔｈｕｍｂｅｌｌ
ｉ−ｆｅｒｙｌ）・ａ−Ｄ−ガラクトシドを分解）を添
加し、混合物を３７＠でインキュベートした。４′０−
ａ−Ｄ−ガラクトピラノシル−エトポシドの分解と遊離
エトポシドの出現をＨＰＬＣで調べた。

半減期はそれぞれ４又は７時間であった。

実施例　１１ Ａ、エトポシドのグリコジル化 一般的方法 分子ふるい（１，４ｇ）　、炭酸銀（０，３１１５７ｇ
）及び過塩素酸銀をジクロロメタン（５０ｍｃ）中２＃
、３＃−ジー０−クロロアセチル−エトポシド（０，６
７ｍｒａｏＱ）とハロゲン化グリコジル（プロミド又は
クロリド、１．２ｍｍｏｆｆｉ）の溶液に一２０℃で添
加し、反応混合物を遮光して６０時間撹拌した。ジクロ
ロメタン（５０＋ｍ（２）を混合物に添加し、次いでこ
れを濾過した。炉液を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで
乾燥した。残留物のクロマトグラフィーによりａ−及び
β−０−グリコシド連結化合物を得た。

２’、３’−ジー０−クロロアセチル−４’　−０−（
２，３，４，６−テトラ−０−ベンジルーａ−Ｄ−ガラ
クトピラノシル）−エトポシド ２．３．４．６−テトラ−０−ベンジル−６−Ｄ−ガラ
クトピラノシルクロリド（又はプロミド）と２′、３＃
−ジー０−クロロアセチル−エトポシドから出発して上
述の方法により表題化合物を製造した。

σ−グリコシドＣａ　）ｏ　　＋　１１．８’（ｃ　＝
　ｌ　１　りｏ。

ホルム）。

２＃、３“−ジー０−クロロアセチル−４’−０−（２
，３，４，６−チトラーＯ−ベンジルーβ−Ｄ−ガラク
トピラノシル）−エトポシド ２．３．４．６−テトラ−ｏ−ベンジル−６−］）　−
ガラクトピラノシルプロミドと２’、３”−ジーＯ−ク
ロロアセチルーエトポシドから出発して上述の方法によ
り表題化合物を製造した。

β−グリコシドＣａ”Ｊ、　　−３９，８°（ｃ＝１１
りｏ。

ホルム）。

２”、３’−ジー０−クロロアセチル−４’−０−（２
，３，４，６−チトラーＯ−ベンジルーσ−Ｄ−グルコ
ピラノシル）−エトポシド ２．３．４．６−テトラ−０−ベンジルーα−Ｄ−グル
コピラノシルクロリド（又はプロミド）と２′、３“−
ジー０−クロａアセチルーエトボシドから出発して上述
の方法により表題化合物を製造した。

σ−グリコシドＣａ　）ｏ　　＋　１６．２’（ｃ　＝
　１　、クロロホルム）。

２”、３”−ジーＯ−クロロアセチル−４’　−０−（
２，３，４，６−テトラ−０−ベンジルーβ−Ｄ−グル
コピラノシル）−エトポシド ２．３．４．６−テトラ−０−ベンジルーα−〇−グル
コピラノシルブロミドと２”、３”−ジー〇−クロロア
セチルーエトポシドから出発して上述の方法により表題
化合物を製造した。

β−グリコシド（α）。４４−５６（ｃ　−１、クロロ
ホルム）。

２”、３”−ジー０−クロロアセチル−４’　−０−（
２，３，４，６−テトラ−０−ベンジルーβ−Ｄ−グル
クロニル）−エトポシド ベンジル・２，３．４−　トリー〇−ベンジルーｌ−ク
ロロ（又は−ブロモ）−１−デオキシ−ａ−Ｄ−グルコ
ビラヌローネートと２”、３”−ジーＯ−クロロアセチ
ルーエトポシドから出発して上述の方法により表題化合
物を製造した。

β−グリコシドＣσ）、−５２，４°（ｃ−１，クロロ
ホルム）。

Ｂ、　グリコシルーエトポシドにおけるクロロアセチル
保護基の除去 一般的方法 ３：２　メタノール／ジクロロメタン（２００ｍ（１）
中２＃、３”−ジー０−クロロアセチル化グリコシルー
エトポシド（０，７５ｍｍｏ１２）とＤｏｗｅｘ　Ｉ　
Ｘ　８イオン交換剤（３，０ｇ）の混合物を室温で１時
間撹拌した。樹脂を濾過して除き、次いでか液をリン酸
緩衝液（ｐＨ６）で洗浄し、乾燥（硫酸ナトリウム）シ
、真空下で蒸発した。残留物をカラムクロマトグラフィ
ーにより精製した。次の化合物を製造した。

４’　−０−（２，３，４，６−テトラ−０−ベンジル
ーａ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−エトポシドａ−グリ
コシド（σ）ｏ　　＋６−０６（ｃ−１，クロ。

ホルム） ４’−０−（２，３，４，６−テトラ−０−ベンジルー
β−Ｄ−ガラＰトピラノシル）−エトポシド４’　−０
−（２，３，４，６−チトラーＯ−ベンジルーσ−Ｄ−
グルコピラノシル）−エトポシドａ−グリコシド（ａ　
）ｏ　　＋　１４．９＠（ｃ　＝　１、クロロホルム） １４’−０−（２，３，４，６−テトラ−０−ベンジル
ーβ−Ｄ−グルコピラノシル）−エトポシドβ−グリコ
シドＣａ　）ｏ　　５３”（ｃ　”　ｌ　１　クロロホ
ルム） ４’　−０−（２，３，４，６−テトラ−０−ベンジル
ーβ−Ｄ−グルクロニル）−エトポシド。

グリコシルーエトポシドにおけるベンジル保護基の水素
化分解による除去 一般的方法 氷酢酸（１０謂１２）中ベンジル化グリコシルーエトポ
シド（０，６４ｍｍｏα）の混合物をｌＯ％Ｐｄ／Ｃ（
１，０ｇ）の存在下で２４時間水素添加した。触媒を濾
過して除き、次いで炉液を約Ｏ℃で真空下で蒸発した。

残留物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより
精製して次のグリコシルーエトポシドを得た。

４’−０−（ｇ−Ｄ−ガラクトピラノシル）エトポシド α−グリコシド（ｒ）ｏ　　＋６．２°（ｃ＝１．クロ
ロホルム） ４’−０−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）エトポシド β−グリコシド〔σ〕。−７３，１”（ｃ　＝　１、ク
ロロホルム） ４’−〇−Ｃａ−Ｄ−グルコピラノシル）−エトポシド ４’−０−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−二トポシト β−グリコシド〔σ〕。

−７６，６°（Ｃ −〇、９、 クロ ロホルム） ４’−〇− （β−Ｄ−グルクロニル） 一エトポ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）溶媒中で促進剤及び適当な場合酸トラップ又は乾燥
   剤の存在下で、−５０℃〜６０℃で式Ｖ ▲数式、化学式、表等があります▼Ｖ （式中、 Ｒ＾１はメチル基、ベンジル基又は２−チエニル基であ
   り、 Ｒ＾２は水素原子、アシル又はトリ−Ｃ＿１〜Ｃ＿４−
   アルキルシリル保護基であり、 Ｒ＾３はヒドロキシル基、酸素を介して結合するアシル
   又はトリ−Ｃ＿１〜Ｃ＿４−アルキルシリル保護基、又
   はアセチルアミノ基、ベンジルオキシカルボニルアミノ
   基又はジメチルアミノ基であり、そして Ｒ＾４は水素原子又はメチル基である）のエトポシド化
   合物を式VI ▲数式、化学式、表等があります▼VI （式中、 Ｒ＾５は水素原子、ヒドロキシル基、酸素原子を介して
   結合するアシル保護基、又はベンジルオキシカルボニル
   アミノ基、アジド基又はアセチルアミノ基であり、 Ｒ＾６は酸素原子を介して結合するアシル保護基、又は
   ベンジルオキシカルボニルアミノ基又はアジド基であり
   、 Ｒ＾７はアシル保護基であり、 Ｒ＾８はメチル基、メチレンオキシ−アシル保護基又は
   ベンジルオキシカルボニル基であり、そして Ｚはハロゲン原子好ましくはフッ素、塩素 又は臭素、ヒドロキシル基、トリ−Ｃ＿１〜Ｃ＿４−ア
   ルキルシリルオキシ基、又は酸素原子を介して結合する
   アシル保護基であり、 この場合、アシル保護基はアセチル基、モ ノ、ジ又はトリハロゲノアセチル基であって好ましくは
   ハロゲン原子はフッ素又は塩素である）の炭水化物成分
   と反応させて式 I の４′−Ｏ−グリコシル−エトポシ
   ド誘導体（式中、基Ｒ＾１〜Ｒ＾８のすべては下で定義
   するそれらの意味を保持している）を得、及びこれらの
   化合物に存在する保護基を水素化分解又は加水分解によ
   り除去し、及び適当な場合、生成するアミノ基を含む化
   合物の一つを還元的アルキル化法によりジメチルアミノ
   基を含む式 I の他の化合物に変換することからなる式
   I ▲数式、化学式、表等があります▼ I （式中、 Ｒ＾１はメチル基、ベンジル基又は２−チエニル基であ
   り、 Ｒ＾２は水素原子であり、 Ｒ＾３はヒドロキシル基、アミノ基又はジメチルアミノ
   基であり、 Ｒ＾４は水素原子又はメチル基であり、 Ｒ＾５は水素原子、ヒドロキシル基、アミノ基又はアセ
   チルアミノ基であり、 Ｒ＾６はヒドロキシル基又はアミノ基であり、Ｒ＾７は
   水素原子であり、 Ｒ＾８はメチル基又はヒドロキシメチル基又はカルボキ
   シル基又はメチレンオキシ基を介して結合するアシル保
   護基、又はベンジルオキシカルボニル基であり、 この場合、アシル保護基はアセチル基、ハ ロゲンがフッ素又は塩素のモノ、ジ又はトリハロゲノア
   セチル基である）の化合物の製造方法。 ２）アシル保護基はアセチル基、クロロアセチル基又は
   トリフルオロアセチル基である請求項１記載の方法。 ３）Ｒ＾１はメチル基、ベンジル基又は２−チエニル基
   であり、 Ｒ＾３は水素原子、アシル又はトリ−Ｃ＿１〜Ｃ＿４−
   アルキルシリル保護基であり、 Ｒ＾３はヒドロキシル基、酸素原子を介して結合するア
   シル又はトリ−Ｃ＿１〜Ｃ＿４−アルキルシリル保護基
   、アミノ基、アセチルアミノ基、ベンジルオキシカルボ
   ニルアミノ基又はジメチルアミノ基であり、 Ｒ＾４は水素原子又はメチル基であり、 Ｒ＾５は水素原子、ヒドロキシル基、酸素原子を介して
   結合するアシル又はトリ−Ｃ＿１〜Ｃ＿４−アルキルシ
   リル保護基、又はアミノ基、ベンジルオキシカルボニル
   アミノ基、アジド基又はアセチルアミノ基であり、 Ｒ＾６はヒドロキシル基、酸素原子を介して結合するア
   シル又はトリ−Ｃ＿１〜Ｃ＿４−アルキルシリル保護基
   、又はアミノ基、ベンジルオキシカルボニルアミノ基又
   はアジド基であり、 Ｒ＾７は水素原子、アシル又はトリ−Ｃ＿１〜Ｃ＿４−
   アルキルシリル保護基であり、及び Ｒ＾８はメチル基又はヒドロキシメチル基又はメチレン
   オキシ基を介して結合するアシル保護基、又はベンジル
   オキシカルボニル基であり、 この場合、アシル保護基はアセチル基、ハ ロゲンがフッ素又は塩素のモノ、ジ又はトリハロゲノア
   セチル基である式 I の４′−Ｏ−グリコシル−エトポ
   シド。 ４）Ｒ＾１はメチル基、ベンジル基又は２−チエニル基
   であり、 Ｒ＾２は水素原子、アセチル又はクロロアセチル基又は
   トリ−Ｃ＿１〜Ｃ＿４−アルキルシリル保護基であり、 Ｒ＾３はヒドロキシル基、酸素原子を介して結合するア
   セチル、クロロアセチル又はトリ−Ｃ＿１〜Ｃ＿４−ア
   ルキルシリル保護基、又はアミノ基、アセチルアミノ基
   、ベンジルオキシカルボニルアミノ基又はジメチルアミ
   ノ基であ り、 Ｒ＾４は水素原子又はメチル基であり、 Ｒ＾５は水素原子、ヒドロキシル基、酸素原子を介して
   結合するアセチル、クロロアセチル又はトリ−Ｃ＿１〜
   Ｃ＿４−アルキルシリル保護基、又はアミノ基、ベンジ
   ルオキシカルボニルアミノ基、アジド基又はアセチルア
   ミノ基であり、 Ｒ＾６はヒドロキシル基、酸素原子を介して結合するア
   セチル、クロロアセチル又はトリ−Ｃ＿１〜Ｃ＿４−ア
   ルキルシリル保護基、又はアミノ基、ベンジルオキシカ
   ルボニルアミノ基又はアジド基であり、 Ｒ＾７は水素原子、アセチル、クロロアセチル又はトリ
   −Ｃ＿１〜Ｃ＿４−アルキルシリル保護基であり、そし
   て Ｒ＾８はメチル基、ヒドロキシメチル基、アセチルオキ
   シ又はクロロアセチルオキシメチル基又はベンジルオキ
   シカルボニル基である請求項３記載の化合物。 ５）請求項３記載の化合物と式II Ａ−Ｓｐ−ＥII の機能化された腫瘍特異的酵素とを含む医 薬。 ６）Ａ−Ｓｐ−Ｅは遺伝子工学により製造され、ＡとＥ
   は請求項５記載の意味を持ち、及びＳｐはオリゴ又はポ
   リペプチドである請求項５記載の医薬。 ７）グリコシダーゼを含む請求項５又は請求項６記載の
   式IIの機能化された腫瘍特異的酵素又は遺伝子工学生成
   物。