KR102406286B1

KR102406286B1 - 낙지다리 추출물을 이용한 항균제

Info

Publication number: KR102406286B1
Application number: KR1020210186511A
Authority: KR
Inventors: 박재규; 박선민; 김창건; 장수진; 이윤미; 황주찬; 김형준; 이현정; 정용태; 황병수; 오영택; 이영경; 최근희
Original assignee: 국립낙동강생물자원관; 재단법인 한국파스퇴르연구소; 재단법인 포항테크노파크
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2022-06-13

Abstract

본 발명은 낙지다리 추출물을 이용한 항균제 및 이를 이용한 항균성 포장재에 관한 것이며 유효성분으로 낙지다리 추출물 특히, 극성 용매별 분획추출에 의해 수득되는 에틸아세테이트 분획추출물을 유효성분으로 함유하고 상기 유효성분이 황색포도상구균, 아시네토박터, 대장균에 대하여 항균활성을 갖는 항균제로 이루어진다.
본 발명의 항균제는 식중독을 유발하는 황색포도상구균, 아시네토박터, 대장균 등의 오염으로부터 보호하기 위한 포장재 특히 식품을 보호하여 식중독 예방과 함께 식품의 신선도를 유지하여 식품의 보과 및 유통기간을 보다 향상시키는 식품포장재에 적용할 수가 있다

Description

낙지다리 추출물을 이용한 항균제{Antibacterial composition using extract of Penthorum chinense}

본 발명은 낙지다리(Penthorum chinense) 추출물을 이용한 항균제에 관한 것이며, 구체적으로는 식중독 등을 유발하는 미생물에 대하여 항균활성을 갖는 낙지다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균제에 관한 것이다.

낙지다리는 학명으로 Penthorum chinense이며 쌍떡잎식물 장미목 돌나물과의 여러해살이 풀로 물가나 습지에서 전국적으로 자생하는 대표적인 다년생 초본으로 한국, 일본,중국 등지에 분포하고 있으며 낙지다리 뿌리에서 짜낸 물을 부스럼에 바르면 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 현재 낙지다리의 식물체를 대상으로 중국에서는 항산화, 항염, 간보호 효능이 밝혀졌으며(Hu 등, 2015; Lin 등, 2018; Xia 등, 2012), 국내에서도 알레르기 억제효과(Jo와 Kim, 2015)와 콜라겐 성분을 안정화시켜 피부노화 예방효능이 있다고 알려진 (-)-epicatechin gallate 성분의 존재가 보고되고 있다(Kwon 등, 2019).

낙지다리 추출물과 관련하여 이와 선행기술로 예를 들면, 특허문헌 1에 낙지다리(Penthorum chinense)의 줄기, 잎, 뿌리 및 종자 중 하나 이상으로부터 추출된 낙지다리 추출물 을 유효성분으로 포함하는 피부재생 촉진용 화장료 조성물을 개시하고 있고, 특허문헌 2에 낙지다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개시하고 있으며, 특허문헌 3에 작두콩 추출물, 소리쟁이 추출물, 족두리풀 추출물 및 낙지다리 추출물을 유효성분으로 포함하는 충치유발원인균 및 구취유발 원인균이 대하여 항균활성을 갖는 치약조성물을 개시하고 있다.

또 특허문헌 4에 낙지다리(Penthorum chinense Pursh) 추출물을 유효성분으로 10 내지 1000 mg/㎕의 농도로 함유하는 알레르기 질환 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 개시하고 있으나, 상기 선행기술에는 낙다리 추출물이 식중독을 유발하는 미생물에 대한 항균활성에 대하여 시사하는 바가 없다.

본 발명의 발명자는 식중독을 유발하는 미생물에 대하여 낙지다리 추출물의 항균활성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

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본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 낙지다리 추출물(Penthorum chinense)을 이용한 항균제의 제공에 관한 것이며, 구체적으로는 식중독을 유발하는 미생물에 항균활성을 갖는 낙지다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균제 및 이를 포함하는 항균성 포장재의 제공을 목적으로 하는 것이다.

본 발명에 따른 과제의 해결수단으로 낙지다리 추출물을 이용한 항균제는 낙지다리(Penthorum chinense) 추출물을 유효성분으로 함유하고 상기 유효성분이 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 아시네토박터(Acinetobacter baumannii), 대장균(Escherichia coli)에 대하여 항균활성을 갖는 항균제로 이루어진다.

본 발명에 따른 과제의 해결수단으로 낙지다리 추출물을 이용한 항균제의 일 실시형태는 낙지다리(Penthorum chinense) 에탄올 추출물을 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트의 순서로 분획추출하여 얻어지는 에틸아세테이트 분획추출물을 유효성분으로 함유하고, 상기 에틸아세테이트 분획추출물이 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 아시네토박터(Acinetobacter baumannii), 대장균(Escherichia coli)에 대하여 항균활성을 갖는 항균제로 이루어진다.

본 발명에 따른 상기 에틸아세테이트 분획추출물은 아래 [화학식 1]로 표시되는 Thonningianin B을 함유하는 추출물로 이루어지며 Thonningianin B은 공지된 물질이다.

[화학식 1]

본 발명에 따른 상기 항균제는 식중독을 유발하는 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 아시네토박터(Acinetobacter baumannii), 대장균(Escherichia coli)의 오염으로부터 보호하기 위한 포장재에 대하여 0.02 ~ 0.03중량% 함유하는 것으로 이루어지며, 상기 포장재는 합성수지 필름, 포장용기, 포장지, 식품포장필름 등에 사용되며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 상기 낙지다리 추출물, 상기 에틸아세테이트 분획추출물은 담체에 담지되는 것을 포함하며, 담체는 널리 사용되는 실리카, 제올라이트 또는 벤토나이트로부터 선택되는 것으로 이루진다.

항균제를 유효성분으로 함유하고 있는 본 발명의 낙지다리(Penthorum chinense) 추출물은 식중독을 유발하는 황색포도상구균, 아시네토박터, 대장균 등에 대하여 항균활성을 나타내므로, 상기 미생물의 오염으로부터 보호하기 위한 포장재로 합성수지필름, 포장용기 등에 사용되며, 특히, 식물포장재로 이용되는 경우 미생물로부터 식품을 보호하여 식중독 예방과 함께 식품의 신선도를 유지하여 식품의 보관 및 유통기간을 보다 향상시키는 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명의 낙지다리 추출물에 대한 항균효능에 대한 도표
도 2는 실시예 2에서 수득한 다섯종류의 낙지다리 줄기(지상부) 분획추출물의 항균효능에 대한 도표
도 3은 실시예 3에서 분리한 단일물질 들의 항균효능에 대한 도표
도 4는 시험예 4의 항균시험에 대한 세균성장 영상물 및 도표
도 5는 시험예 5의 독성시험에 대한 도표

이하에서는 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 실시예의 기재에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 낙지다리 추출물을 이용한 항균제는 낙지다리 추출물을 유효성분으로 함유하고, 상기 유효성분이 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 아시네토박터(Acinetobacter baumannii), 대장균(Escherichia coli)에 대하여 항균활성을 갖는 항균제로 이루어진다.

본 발명에 따른 상기 낙지다리(Penthorum chinense)는 한방에서는 꽃과 잎, 줄기 등을 수택란(水澤蘭)이라는 약재로 사용하고 있으며, 혈액순환을 촉진하고, 소변배설을 증진시키며, 방광염, 타박상 부종 및 임파선결절을 치료하는 것으로 알려져 있다.

상기 낙지다리 추출물은 낙지다리의 전초, 잎, 줄기, 지상부, 뿌리, 근경 및 지하부 로부터 선택되는 하나 또는 2 이상의 혼합물을 물 또는 유기용매로 추출하며 가열조건에서 추출하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산 등으로부터 선택되는 하나 또는 2 이상의 혼합 용매로 이루진다.

또한, 상기 항균활성 성분인 상기 낙지다리 추출물은 담체에 담지시키는 것으로 이루어지며, 상기 담체는 실리카, 제올라이트 또는 벤토나이트로부터 선택되며 벤토나이트가 바람직하고, 낙지다리 추출물과 상기 담체는 중량기준으로 1 : 6의 비율로 배합된다.

본 발명에 따른 상기 낙지다리(Penthorum chinense) 추출물은 낙지다리 에탄올 추출물을 극성별로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물(DW)의 순서로 분획추출하여 얻어지는 5종류의 분획추출물 중에서 에틸아세테이트 분획추출물이 선택되는 것으로 이루어진다.

상기 5종류의 분획추출물은 구체적으로 낙지다리 에탄올 추출물을 n-헥산으로 추출한 헥산 분획추출(Hx 분획물)을 분리한 후 잔유물(증류수 층)을 클로로포름으로 추출하여 얻어지는 클로로포름 분획추출물(CHCl₃ 분획물)을 분리한 후 잔유물(증류수 층)을 에틸아세테이트로 진탕 추출하여 얻어지는 에틸아세테이트 분획추출물(EA분획물)을 분리한 후 잔유물(증류수 층)에 부탄올로 추출하여 얻어지는 부탄올 분획추출물(BtOH 분획물)을 분리하고 남은 증류수 분획추출물(DW 분화물)로 이루어진다.

상기 및 아래 [화학식1]으로 표시되는 Thonningianin B는 에틸아세테이트 분획추출물로부터 분리하였으며, Thonningianin B은 공지된 물질이다.

[화학식 1]

본 발명에 따른 상기 항균제는 식중독을 유발하는 황색포도상구균, 아시네토박터, 대장균 등의 오염으로부터 보호하기 위한 포장재에 조합하여 사용되며 포장재로는 합성수지 포장필름, 포장용기, 식품포장용 합성수지 필름 등에 사용된다.

본 발명에 따른 상기 항균제는 상기 포장재 총 중량기준으로 0.02 ~ 0.03중량% 조성되며, 0.025중량%로 조성되는 것이 바람직하며, 포장용 필름은 통상적으로 포장용으로 사용되는 폴리염화비닐 수지, 폴리에틸렌 수지 또는 폴리프로필렌 수지로부터 선택되며 통상적인 필름성형 방법에 의해 필름으로 성형하는 것으로 이루어진다.

이하에서는 <실시예> 및 <시험예>를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

<실시예 1 및 시험예 1>

본 발명에 따른 낙지다리 추출물에 대한 항균시험을 위하여 낙지다리 지상부를 70% 에탄올로 추출한 에탄올 추출물을 시료로 하여 실험대상 세균으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 아시네토박터 (Acinetobacter baumannii), 대장균 (Escherichia coli)을 Mueller-Hinton broth Ⅱ(MHB Ⅱ)에 접종하여 37℃에서 24시간 진탕 배양하였다.

상기 배양물은 MHB Ⅱ에 600nm(OD600)에서 0.05가 되도록 재접종되었고 중간 대수기(mid-logarithmic phase)까지 37℃에서 호기성으로 성장시켰다.

효능검사를 위한 균주는 600nm에서 흡광도 0.005로 준비하였으며, 20mg/㎖의 농도로 DMSO에 녹여진 낙지다리 추출물을 MHB Ⅱ에 1/10로 희석한 농도인 2000㎍/㎖을 시작으로 순차적으로 2배씩 희석하여 총 10 포인트의 용량반응 효능평가를 위한 추출물을 준비하였다.

항균효능 검사는 384 microwell plate의 각 well당 준비된 세균 45㎕과 추출물 5㎕를 넣어 추출물이 1/10 희석된 농도인 200 ~ 0.39㎍/㎖ 범위에서 수행되었으며, 37℃에서 24시간동안 배양된 세균의 성장을 600nm의 흡광도에서 측정함으로써 항균효능이 측정되었다. 대조군 대비 각 농도의 추출에서 측정된 세균의 성장을 퍼센트로 나타내어 추출물의 효능을 200㎍/㎖의 단일농도에 검색한 [도 1]로 나타내었다.

첨부한 [도 1]로부터 본 발명에 따른 낙지다리 추출물이 황색포도상구균, 아시네토박터, 대장균에 대한 항균효능을 확인할 수 있었다.

<실시예 2>

낙지다리 추출물 및 하위 분획추출물 분리를 위하여 낙지다리 지상부를 70% 에탄올로 추출한 추출물을 극성별 용매로 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 선택하고 분획추출하여 아래 기재한 다섯종류의 분획추출물을 수득하였다.

먼저, 상기한 에탄올 추출물을 물로 현탁시킨 후, 동량의 n-헥산으로 진탕 추출하여 n-헥산 분획추출물(Hx분획물)을 얻은 다음, 상기 헥산 분획추출물(Hx분획물)을 분리한 후 잔류하는 증류수층을 다시 동량의 클로로포름으로 진탕 추출하여 클로로포름 분획추출물(CHCl₃ 분획물)을 얻는다.

상기 클로로포름 분획추출물(CHCl₃ 분획물)을 분리한 후 잔류하는 증류수층을 다시 동량의 에틸아세테이트로 진탕 추출하여 에틸아세테이트 분획추출물(EA분획물)을 얻는다.

상기 에틸아세티르 분획추출물(EA분획물)을 분리한 후 잔류하는 증류수 층을 위 방법과 동일하게 n-부탄올로 진탕 추출하여 n-부탄올 분획추출물(BtOH 분확물)을 얻었으며, 나머지 증류수층(DW 분획물)으로 다섯 종류의 분획추출물을 수득하였다.

<실시예 3>

상기 <실시예 2>에서 얻은 에틸아세테이트 분획추출물(EA 분획물)로부터 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatogramphy)와 254nm 파장의 다이오드어레이(Diode array) 검출기를 이용하여 상기한 [화학식 1]의 Thonningianin B을 분리하였다.

분리조건은 역상 실리카 컬럼(C18, 250 x 21.2mm, 5㎛), 0.1 % 개미산(formic acid)이 첨가된 증류수(A)와 아세토니트릴(B) 용매에 기울기(0 ~ 2분은 10% B; 2 ~ 7분은 10% ~ 35% B, 7 ~ 35분은 35% ~ 50% B)를 주었으며 유속은 20㎖/분, 머무름시간은 19분이었다. 분리된 Thonningianin B는 500MHz NMR과 LC-MS를 이용하여 화합물의 구조와 분자량을 확인하였다.

에틸아세테이트 분획추출물(EA 분획물)로부터 동일한 방법으로 상기 Thonningianin B외에 유도체 화합물로 아래 [화학식 a] 및 [화학식 b]로 표시되는 화합물도 분리하였다.

[화학식 a]

[화학식 b]

<시험예 2>

상기<실시예 2>에서 얻은 다섯종류의 분획추출물에 대한 항균시험을 위하여 실험대상 세균으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 아시네토박터 (Acinetobacter baumannii), 대장균 (Escherichia coli)을 Mueller-Hinton broth Ⅱ(MHB Ⅱ)에 접종하여 37℃에서 24시간 진탕 배양하였다.

항균시험방법은 <시험예 1>과 같은 방법으로 수행하였으며 항균활성에 대한 결과를 [도 2]로 나타내었다.

첨부한 [도 2]로부터 상기 다섯종류의 낙지다리 분획추출물 중 DW분획추출물을 제외하고 4종의 분획추출물에서 활성을 확인할 수가 있었다.

<시험예 3>

상기<실시예 3>에서 분리한 단일물질인 상기 [화학식 1]로 표시되는 Thonningianin B과 대조군a, 대조군b로 상기 [화학식 a] 및 [화학식 b]로 표시되는 2종의 대조군 화합물에 대한 항균시험을 위하여 실험대상 세균으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 Mueller-Hinton broth Ⅱ(MHB Ⅱ)에 접종하여 37℃에서 24시간 진탕 배양하였다.

항균시험방법은 <시험예 1>과 같은 방법으로 수행하였으며 항균활성에 대한 결과를 [도 3]로 나타내었다.

그리고 상기 항균활성시험으로 부터 산출한 MIC₅₀(㎍/㎖) 값의 결과를 [표 1]로 나타내었다.

구분	화학식 1	대조군a	대조군b
SAU WT MIC₅₀(㎍/㎖)	11	27	24

첨부한 [도 3]으로부터 낙지다리 유래 Thonningianin B, 대조군a 및 대조군b 모두에서 유의미한 항균효능을 확인할 수 있었다.

상기 [표 1]에 나타난 바와같이 Thonningianin B, 대조군a 및 대조군b 모두 세균 성장 저해효능이 확인되었으며, 상기 [화학식 1]로 표시되는 Thonningianin B의 MIC₅₀(㎍/㎖) 값이 11㎍/㎖로 가장 높은 활성을 갖는 것을 확인할 수가 있다.

<실시예 4>

본 발명에 따른 항균성 포장용 필름에 대한 항균성 시험을 위하여 낙지다리 에탄올 추출물 140g을 에탄올에 용해시킨 다음, 벤토나이트 약 100g을 가하여 준 뒤 플라스크와 evaporator를 이용하여 용매를 날려주는 동시에 벤토나이트를 추가하면서 최종적으로 벤토나이트는 700g을 투입하였다.

이후 용매를 증발시키면서 파우더들이 뭉치는 경우 조금씩 부셔주면서 용매 제거하고 입자의 크기를 감안하여 용매 제거가 충분히 되었다고 판단될 때, evaporator에서 플라스크를 분리하고 용기에 보관한다.

상기 제조한 낙지추출물이 담지된 벤토나이트 담체가 수지조성물 총 중량 기준으로 0.025중량% 함유되도록 염화비닐수지에 배합하고 통상의 필름성형방법에 의해 폴리염화비닐 필름을 제작하였다.

<시험예 4>

상기 <실시예 4>에서 제작한 필름 및 대조군(염화비닐수지 필름)에 대한 항균시험을 위하여 실험대상 세균으로 형광단백질(Red fluorescence protein)을 발현하는 황색포도상구균을 10㎍/㎖의 Chloramphenicol이 포함된 Mueller-Hinton broth(MHB)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다.

상기 배양된 균주를 1/100로 MHB에 희석하여 37℃ 에서 4시간 동안 추가 배양 후 흡광도 600㎚에서 0.05인 균주를 준비하고 다시 1/10000로 추가 희석하였다. 희석된 균주 100㎕를 LB(Luria-Berani) 한천배지에 도말하고 그 위에 각 필름을 얹어 37℃에서 배양하였다. 16시간 후 필름을 제거 하고 다시 37℃에서 6 ~ 8시간 배양 후 성장한 세균을 WSE-6200 LuminoGraph II(ATTO)로 촬영하고, 대조군(염화비닐수지 필름) 대비 항균활성 대비 결과를 [도 4]로 나타내었다.

첨부한 [도 4]로부터 포장필름 총중량 기준으로 낙지다리 추출물을 0.025중량% 함유한 필름의 항균활성이 대조군 대비 24시간 노출된 후 세균의 성장이 평균 50% 정도 유의미하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 5>

상기 <실시예 4>에서 제작한 필름 및 대조군(염화비닐수지 필름)에 대한 독성평가를 위하여 제브라피시(zebrafish)에서의 독성평가를 아래와 같이 하였다.

성숙 제브라피시 암수를, 알 채취 전날 알 채취용 수조에 넣고 다음날 광주기 시기 1 ~ 2시간 이후에 알을 채취하였다.

채취된 알은 제브라피시 배아 발생용 배지(0.137M NaCl, 5.4mM KCl, 0.25mM Na₂H·PO4, 0.44mM KH₂·PO₄, 1.3mM CaCl₂, 1.0mM Mg·SO₄, 4.2mM NaH·CO₃, pH 7.2)에 넣고 24시간 발생시킨 후, 각 필름을 6 well 크기로 재단하여 각 well에 넣어 제브라피시 배아와 같이 배양하였다.

필름 처리 시 배아를 보호하는 막의 일종인 코리온(chorion)의 샘플 통과 정도를 알 수 없어 각 알의 코리온에 구멍을 내어 처리하였으며, 필름 처리 후 1일, 2일, 7일째 제브라피시 배아의 생존율을 측정하고, 그 결과를 [도 5]로 나타내었다.

첨부한 [도 5]로부터 낙지다리추출물 함유 포장용 필름 및 대조군에서 제브라피시에 대한 독성이 나타나지 않은 것을 확인할 수가 있다.

본 발명에 따른 상기 <실시예> 및 <실험예>의 결과로부터 낙지다리 추출물 및 용매 극성별로 분획추출하여 수득한 에틸아세테이크 분획추출물이 황색포도상구균, 아시네토박터, 대장균에 대한 항균활성을 나타내며, 특히 에틸아세테이크 분획추출물로부터 분리한 [화학식 1]인 Thonningianin B의 항균활성이 높은 것으 확인할 수 있으므로 본 발명의 낙지다리 추출물 내지 [화학식 1]인 Thonningianin B를 유효성분으로 함유하는 항균제가 식중독을 유발하는 황색포도상구균, 아시네토박터, 대장균 등의 오염으로부터 보호하기 위한 포장재에 조합하여 사용될 수 있는 것을 예상할 수가 있다.

Claims

낙지다리 분획추출물과 벤토나이트가 중량대비 1 : 7의 비율로 벤토나이트에 담지된 낙지다리 추출물을 유효성분으로 함유하고, 상기 낙지다리 추출물은 낙지다리의 전초, 잎, 줄기, 지상부, 뿌리, 근경 및 지하부로부터 선택되는 하나 또는 2 이상의 혼합물의 에탄추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 순서로 분획추출하여 얻어지는 분획추출물로 유효성분은 하기 [화학식1]으로 표시되는 Thonningianin B인 것을 특징으로 하는 항균활성을 갖는 항균제.
[화학식 1]
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청구항 1에 기재된 항균제를 포장재 총중량 기준으로 0.02 ~ 0.03중량% 도포하는 것을 특징으로 하는 항균성 포장재.
청구항 7에 있어서,
포장재가 포장용 합성수지 필름인 것을 특징으로 하는 항균성 포장재.